一種與中國對蝦生長相關的分子標記及應用的製作方法

2023-11-10 05:25:57

一種與中國對蝦生長相關的分子標記及應用的製作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種與中國對蝦生長相關的分子標記及應用，即在中國對蝦FaMeT基因中的一個與中國對蝦生長性狀相關的SNP位點，該SNP位點是核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1的FaMeT基因的第364位，其鹼基為G或T。本發明篩選的SNP位點為GG型的中國對蝦，其體重和頭胸甲寬度均顯著高於GT基因型個體，在中國對蝦的生長選育過程中，可針對該位點，優先選擇GG型的個體作為育種親本，以提高選種的效率。
【專利說明】一種與中國對奸生長相關的分子標記及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子標記遺傳育種【技術領域】，具體涉及一種與中國對蝦生長相關的分子標記及應用。
【背景技術】
[0002]中國對奸(Fenneropenaeu chinensis)是黃渤海的主要經濟奸類,養殖區主要集中在我國北方的黃渤海沿岸，作為久負盛名的海中珍品，在國內外市場具有較高的聲譽，受到消費者的青睞。1990年曾佔到我國對蝦養殖產量的70%。但1993年以後，由於種質、病害和環境因素的影響，養殖產量急劇下降，目前產量僅佔我國對蝦產量的10%左右。培育生長快速、經濟性狀良好、抗逆性強的優良品種已成為保障中國對蝦養殖業持續發展的基礎。[0003]選育目前是中國對蝦品種改良的最重要、最有效的手段之一，而傳統育種技術與現代生物技術的交融，正在從深度與廣度上推進動植物育種科學的發展。分子標記輔助選育是利用現代分子生物學技術從基因水平進行加速選育的方法，可大大縮短選育世代，降低成本，大大提高選育效率和效益，已受到越來越多的重視。
[0004]利用分子標記開展重要經濟性狀的定位，是分子育種的重要基礎研究。SNPs是Single Nucleotide Polymorphisms的縮寫，即單核苷酸多態性，它是指基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A，T，C，G)的替換而引起的多態性。在動植物的基因組中，存在著大量的SNPs,在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，是基因組中分布最廣泛而穩定的點突變，對於大規模的研究而言，它比微衛星標記和其他的重複序列更可靠。
[0005]大多數動植物的生長、品質、抗逆性等都是數量性狀，數量性狀不僅受微效多基因控制，而且還受一個或幾個主效基因的影響。主基因是相對微效多基因而言的，它是指能對數量性狀產生巨大效應的單個基因或位點。通過關聯分析鑑定某一群體內目標性狀與遺傳標記或候選基因的關係，即尋找出與數量性狀關聯的候選功能SNP位點。
[0006]如今，這部分工作在牛、羊、豬、雞等畜牧類動物的育種研究中已廣泛開展，利用主效基因序列多態性進行分子標記輔助育種，培育生長加快，生產性能提高的新品種已日益得到育種界的重視。例如，Zhou(2005)和Sadeghi等(2008)採用PCR-RFLP方法分別分析荷斯坦種公牛生長激素基因和STAT5A基因的多態性，發現分別位於生長激素基因第三內含子和位於STAT5A第七外顯子中的一個鹼基突變與產奶性狀呈顯著相關(P〈0.01，P〈0.082)；趙文清等(2008)採用PCR-SSCP對籽鵝生長激素基因多態性進行了分析，認為第三內含子的鹼基突變與早期增重和屠體性狀存在關聯性。但在中國對蝦中，還缺少與生長性狀相關標記的報導。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種與中國對蝦生長相關的分子標記及應用，即在中國對蝦FaMeT基因中的一個與中國對蝦生長性狀相關的SNP位點，該SNP位點可用於進行中國對蝦生長性狀的標記輔助選擇及應用。[0008]本發明的與中國對奸生長相關的分子標記，是核苷酸序列為SEQ ID NO:1的FaMeT基因的第364位，其鹼基為G或T。
[0009]本發明的分子標記用於中國對蝦生長性狀的標記輔助遺傳育種；
[0010]用於檢測上述標記的引物，為G364和364CP ;或T364和364CP ;具體引物信息如下:
[0011]G364:GCTACAGCACTGGCTTAGG (SEQ ID NO:2)
[0012]T364:GCTACAGCACTGGCTTAGT (SEQ ID NO:3)
[0013]364CP:ACATGGGTGTGGTCTCCTCAGG (SEQ ID NO:4) [0014]本發明的中國對蝦生長相關的分子標記的篩選方法，包括如下的步驟:
[0015]I)利用擴增引物Pl (SEQ ID N0:5)和P2 (SEQ ID NO:6)從中國對蝦基因組DNA中進行擴增獲得長度為716bp的片段；
[0016]2)將從不同中國對蝦獲得的擴增片段進行測序，篩選出鹼基突變位點；
[0017]3)針對各突變位點設計AS-PCR基因型分型引物，採用聚丙烯醯胺凝膠電泳，對中國對蝦日照養殖群體中的個體進行基因型檢測，利用SPSS13.0軟體的廣義線性模型GLM對中國對蝦體重、體長、頭胸甲長、腹節長、尾節長、頭胸甲寬等生長性狀值與基因型間的關係進行最小二乘法估計。
[0018]4)採用最小二乘法和多重比較分析日照群體不同基因型間體重和形態性狀的差異，最終確定與對蝦體重、頭胸甲寬度間存在顯著相關(P < 0.05)的SNP位點。
[0019]本發明篩選的SNP位點為GG型的中國對蝦，其體重和頭胸甲寬度均顯著高於GT基因型個體，在中國對蝦的生長選育過程中，可針對該位點，優先選擇GG型的個體作為育種未本，以提聞選種的效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:本發明中由引物Pl和P2獲得長度為716bp的FaMeT基因部分片段的瓊脂糖電泳圖，M為Marker。
[0021]圖2:本發明中由特異性基因型分型引物檢測基因型的電泳結果。泳道1-2、3_4分別是135A/G位點的AA、AG基因型；5_6、7_8分別是364G/T位點的GG、TT基因型；9_10、
11-12、13-14分別是680A/G位點的AA、AG、GG基因型。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以藉助實施例更好地理解和掌握本發明。
[0023]一、中國對蝦FaMeT基因cDNA序列PCR擴增及多態性檢測
[0024]1.中國對蝦FaMeT基因DNA序列PCR擴增
[0025]利用NCBI 中中國對蟲下 FaMeT 基因 mRNA (GenBank Accession N0.:JQ315119)序列，設計特異擴增引物PI和P2，以30尾中國對蝦基因組DNA為模板，在Taq DNA聚合酶、緩衝環境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，利用引物Pl和P2在PCR條件下進行擴增，產物純化及測序，獲得長度為716bp片段。
[0026]所述的引物序列如下:
[0027]上遊引物P1: CCGATGAGAACAAGCAGTA (SEQ ID NO: 5 )
[0028]下遊引物P2:ATCGCTGTCCTGGTATCC (SEQ ID N0:6)
[0029]所述的PCR擴增的條件是:20yL反應體系，包括:50ng/yL DNA模板IyL;10XPCR Buffer2 μ L ;10 μ mol/L 的引物Ρ1、Ρ2 的上下遊引物各0.8 μ L ； 1.6 μ LdNTPC2.5mMeach), 0.2 μ L (5U/ μ L) Taq DNA polymerase ;超純水 15.6 μ L。
[0030]所述的PCR擴增反應程序如下:
[0031]95°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，共進行32個循環，最後72°C充分延伸10min，4°C保存。
[0032]2.序列回收、連接、轉化及測序
[0033]PCR產物回收採用小量DNA回收試劑盒，購自上海生工:
[0034]通過瓊脂糖凝膠電泳儘可能將目的DNA片段與其他片段分開，用乾淨的手術刀片將含目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1.5ml離心管中稱重；根據膠塊的重量和濃度，按每IOOmg瓊脂糖加3 00-600ul的比例加入Buffer B2 ;將離心管置於50°C水浴5-10min，間或混勻，直至膠塊完全融化；將溶化好的溶液全部移入吸附柱，SOOOg離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；向吸附柱中加入500ul WashSolution，9000g離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；重複上述步驟一次；將空吸附柱和收集管放入離心機，9000g離心Imin;在吸附膜中央加入15-40ulElution Buffer,室溫靜置 l_2min，9000g 離心 lmin，將所得的 DNA 溶液置於 _20°C保存。
[0035]連接反應:將純化PCR產物與pMD18-T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)連接，連接反應總體積是5 μ L，其中包括Solution 12.5 μ L，pMD18_T0.5 μ L，純化PCR產物2yL，4°C 過夜。
[0036]感受態細胞的製備:從37°C培養了 16_20h的新鮮平板上挑取一個DH5 α單菌落接種於2ml LB中，於37°C振蕩培養3h，轉接Iml菌液於含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續在37°C振蕩培養約4h，待0D600達到0.3-0.4時將鹽水瓶從搖床取出，冰浴冷卻10_15min，然後將菌液轉入離心管中於4°C 4000rpm離心IOmin,棄去培養液,用IOml冰預冷的0.1mol/I的CaC12重懸沉澱，冰浴30min,重複4°C 4000rpm離心IOmin,用4mI冰預冷的0.lmol/1的CaCl2重懸沉澱，置4°C保存備用。
[0037]轉化:無菌狀態下取100-120 μ L感受態細胞於1.5ml離心管中，將5 μ L的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42 V熱激90s，其間不要搖動離心管，取出後冰浴3_4min，加入400 μ L無抗生素的LB液體培養基，37°C振蕩培養45min。取100 μ L塗布於已提前4h塗布了異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和X-gal的瓊脂平板上，37°C平放Ih後倒置培養。
[0038]克隆測序是挑取單個陽性克隆子用於測序，序列測定由北京奧科生物技術有限責任公司完成，每個基因片段至少測兩個克隆子。理論上，擴增片段的核苷酸序列為SEQ IDNO:1。
[0039]3.中國對蝦FaMeT基因鹼基突變位點檢測[0040]將由30尾中國對蝦獲得的FaMeT片段測序，對獲得的序列進行序列比對，查找單核苷酸突變位點。在30尾中國對蝦樣品中，共發現3個鹼基突變位點，分別位於序列SEQID NO:1 H 135位A/G，相應胺基酸由Ile-Val ;364位G/T，相應胺基酸由Gly-Val ;680位A/G，編碼的胺基酸沒有發生改變。
[0041]二、SNP分型引物設計
[0042]根據上述結果，設計基因型分型引物，作為探針，以便檢測更大數量的群體材料，並與中國對蝦生長性狀進行關聯分析。根據測序獲得的SNP位點，設計AS-PCR(allele-specific polymerase chain reaction,等位基因特異 PCR)引物。用來檢測 SNP位點時，針對兩個等位基因分別設計檢測引物。檢測(分型)引物的3』端最後一個鹼基一般與SNP的等位基因分別對應，從而擴增的條帶與相應的等位基因對應，達到SNP檢測的目的。在等位基因特異性擴增反應中，在PCR擴增引物的3』端引入不匹配鹼基，會部分降低擴增的效率，但可以選擇性地使目的基因型片段得到有效擴增。基於這一原理，在檢測每一個FaMeT基因突變位點的兩條特異性引物的3』端倒數第三或第四位均引入了一個不匹配鹼基，使得引物延伸的特異性大大提高，降低了用等位基因特異性PCR檢測FaMeT基因突變的假陽性。根據不同試驗情況，AS-PCR可分為單管和雙管兩種方法，本研究採用雙管AS-PCR:每個位點設計三條引物，兩條ASP分別與不同SNP模板互補，與一條CP對擴(表1 )，聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測PCR產物。此外，在全部PCR反應同時擴增了 FaMeT基因的一個IlObp的片段作為內對照，用以判斷樣品DNA的完整性和PCR的質量。針對各突變位點設計的分型引物如下:
[0043]表1:AS-PCR中所涉及的引物序列
[0044]`
【權利要求】
1.一種與中國對蝦生長相關的SNP位點，其特徵在於，所述的SNP位點位於核苷酸序列為SEQ ID NO:1的基因的第364位，其鹼基為G或T。
2.權利要求1所述的SNP位點在中國對蝦生長性狀的標記輔助遺傳育種中的應用。
3.一種用於檢測權利要求1所述的SNP位點的引物，其特徵在於，所述的引物的核苷酸序列為 SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:4;或 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4。
4.權利要求1所述的SNP位點的篩選方法，包括如下的步驟: 1)利用擴增引物Pl和P2從中國對蝦基因組DNA中進行擴增獲得長度為716bp的片段； 2)將從不同中國對蝦獲得的擴增片段進行測序，篩選出鹼基突變位點；
3)針對各突變位點設計AS-PCR基因型分型引物，採用聚丙烯醯胺凝膠電泳，對中國對蝦日照養殖群體中的個體進行基因型檢測，利用SPSS13.0軟體的廣義線性模型GLM對中國對蝦體重、體長、頭胸甲長、腹節長、尾節長、頭胸甲寬等生長性狀值與基因型間的關係進行最小二乘法估計。 4)採用最小二乘法和多重比較分析日照群體不同基因型間體重和形態性狀的差異，最終確定與對蝦體重、頭胸甲寬度間存在顯著相關(P < 0.05)的SNP位點。
5.如權利要求4所述的篩選方法，其特徵在於所述的擴增引物Pl的核苷酸序列為SEQID NO:5，擴增引物P2的核苷酸序列為SEQ ID NO:6。
【文檔編號】C12N15/11GK103725790SQ201410019807
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】李朝霞, 張豔, 王金葉, 董曉煜, 王春德, 方華華 申請人:青島農業大學