一種快速檢測偽狂犬病病毒的試劑盒及其檢測方法與流程
2023-11-10 10:04:42
本發明涉及病原微生物檢測技術領域，特別涉及一種快速檢測偽狂犬病病毒的試劑盒及其檢測方法。
（二）
背景技術：
目前，檢測偽狂犬病病毒的傳統方法是採集生病動物的組織，經組織勻漿器研磨、離心機高速離心，再對離心後的上清液進行病毒核酸DNA提取，或者是直接採集生病動物血液樣本病理新後進行核酸DNA提取，最後是進行PCR反應和電泳檢測。整個過程不僅費時費力，而且採集的病料組織或血液樣本需要低溫冷凍或冷藏保存，運輸成本增加，不符合環保要求；其次，病料組織或血液，還有核酸提取用到的郵寄溶劑等都容易對實驗人員和環境造成二次汙染或威脅，不利於生物安全要求。如果是購買試劑盒進行核酸提取的話，更是增加了檢測成本，還有操作流程要求實驗人員具備較高的專業技術水平和業務素養，對於一線養殖場或基層實驗室來說不易普及。
（三）
技術實現要素：
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種省時省力、減少二次汙染的快速檢測偽狂犬病病毒的試劑盒及其檢測方法。
本發明是通過如下技術方案實現的：
一種快速檢測偽狂犬病病毒的試劑盒，其特徵為，包括如下內容：棉棒、EP管、病毒保存液、病毒提取液Ⅰ、病毒提取液Ⅱ、PCR mix、PCR引物、滅菌雙蒸水、PCR反應管、陰性對照與陽性對照、瓊脂糖、50×TAE 核酸電泳緩衝液，操作說明書。
所述棉棒為不同規格大小的若干個。
所述病毒保存液為1×PBS緩衝液；配置方法為稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶於800ml蒸餾水中，用鹽酸調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可；在15lbf/in2高壓下蒸氣滅菌，保存於室溫或4℃冰箱中。
所述50×TAE 核酸電泳緩衝液，每個試劑盒裝量1瓶，20mL/瓶；Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g，加入800mL的去離子水，攪拌溶解後加入57.1mL醋酸，攪拌，定容至1L，室溫保存。
所述PCR引物為根據偽狂犬基因序列Genbank號：KX147097保守區域設計而來。
所述陰性對照為雙蒸水，陽性對照為豬偽狂犬病病毒感染BHK-21細胞後收穫的細胞毒提取的核酸DNA。
本發明的試劑盒不僅省時省力，大大縮短了等待結果的時間，而且不需要對生病動物採集血液或剖檢取病料組織等繁瑣複雜的操作，減少對操作人員和環境的二次汙染；只需用棉棒沾取動物的鼻試子即可，節約動物成本；鼻試子進入專用病毒保存溶液中後，可常溫保存6-7天，不像病料組織和血液樣本那樣需要低溫冷凍或冷藏保存運輸，常溫運輸即可，節約資源成本，符合環保要求，省去了提取病毒核酸DNA繁瑣的步驟，鼻試子病毒液採用專用的病毒提取溶液，只需要兩步離心即可，上清液可直接進行後續PCR檢測等步驟，不需要購買核酸提取試劑盒等，節約檢測成本和時間，操作簡單易學，尤其適用於基層技術人員熟練掌握和推廣。
本發明所述的快速檢測偽狂犬病病毒的試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：
（1）採樣時，選擇合適大小的棉棒，伸入待測動物鼻腔中旋轉一圈，即可取出；
（2）掐斷長柄後，將棉棒頭放入EP管中，加入病毒保存液，蓋上EP管蓋，即可常溫保存運輸或放置在4℃下保存，即為鼻拭子樣本；
（3）按照操作說明書，進行鼻拭子樣本的核酸提取試驗；
（4）進行PCR反應及核酸電泳檢測，觀察結果；
（5）當陽性對照出現800bp大小條帶，而陰性對照沒有出現800bp大小條帶時，本次試驗結果成立；如待測樣品出現與陽性對照大小一致條帶則為偽狂犬病毒感染，否則為未感染偽狂犬病毒的樣品。
步驟（3）中，核酸提取試驗的步驟為，在40μlAD1 Buffer 中加入10μl的AD2 Buffer，用槍頭吸打均勻，將10μl鼻試子樣本直接加入AD1和AD2的混合液中，用槍頭吸打均勻；室溫孵育10min，之後95℃孵育3min；加入40uμl AD3 Buffer，混勻後可直接作為PCR模板使用。
本發明檢測方便快速，省時省力，簡單易學，最大程度上保護了實驗人員和環境的生物安全，降低了採樣成本和運輸成本，符合環保要求，易於在基層實驗室推廣使用。
（四）附圖說明
下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
圖1為豬偽狂犬病病毒快速檢測試劑盒檢測豬鼻試子的PCR結果示意圖；
圖2為牛偽狂犬病病毒快速檢測試劑盒檢測牛鼻試子的PCR結果示意圖。
圖1中，S1、S2、S3為豬鼻試子樣品1、2、3，N為陰性對照，P為陽性對照，M為2000 Marker；其中S1、S2、S3和陽性對照有一樣大小條帶，即為感染偽狂犬病病毒的樣品；
圖2中，S1、S2、S3為牛鼻試子樣品1、2、3，N為陰性對照，P為陽性對照，M為2000 Marker；其中S1、S2和陽性對照有一樣大小條帶，即為感染偽狂犬病病毒的樣品；S3和陰性對照結果相同，即為未感染偽狂犬病病毒的樣品。
（五）具體實施方式
附圖為本發明的一種具體實施例。該實施例包括如下內容：棉棒、EP管、病毒保存液、病毒提取液Ⅰ、病毒提取液Ⅱ、PCR mix、PCR引物、滅菌雙蒸水、PCR反應管、陰性對照與陽性對照、瓊脂糖、50×TAE 核酸電泳緩衝液，操作說明書。
實施例1：上述快速檢測豬、牛、羊、犬等偽狂犬病病毒的試劑盒的檢測方法，包括步驟：
（1）採樣時，選擇合適大小的棉棒，深入豬、牛、羊、犬等鼻腔中旋轉一圈，即可取出；
（2）掐斷長柄後將棉棒頭放入EP管中，加入適量病毒保存液，蓋上EP管蓋即可常溫保存運輸或放置4℃保存，即為鼻腔試子樣本；
（3）按照北京全式金生物技術有限公司Trans Direct Animal Tissue PCR Kit操作說明書，進行鼻試子樣本的核酸提取試驗，步驟如下：
A:在40μlAD1 Buffer 中加入10μl的AD2 Buffer，用槍頭吸打均勻（如需提取樣品過多，可將AD1 和AD2按照4:1的比例混合，兩個小時內使用）；
B:將10μl鼻試子直接加入AD1和AD2的混合液中，用槍頭吸打均勻；
C：室溫孵育10min，之後95℃孵育3min，加入40μlAD3 Buffer，混勻後可直接作為PCR模板使用。
（4）進行PCR反應及核酸電泳檢測，觀察結果；
（5）判斷：當陽性對照出現800bp左右大小條帶而陰性對照沒有出現800bp左右大小條帶時，本次試驗結果成立；如待測樣品出現與陽性對照大小一致條帶則為偽狂犬病毒感染，否則為未感染偽狂犬病毒的樣品。
所述試劑盒中的病毒保存液、PCR mix、PCR引物、瓊脂糖、50×TAE 核酸電泳緩衝液，其成分及配製方法如下：
（1）病毒保存液：1×PBS緩衝液；稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可；在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌（至少20分鐘），保存存於室溫或4℃冰箱中；
（2）PCR mix：購自大連寶生物公司，名稱Premix TaqTM (LA TaqTM Version 2.0),貨號為RR900A；置冰箱-20℃冷凍長期保存；
（3）PCR引物：通過對Genbank中登錄的國內不同偽狂犬病毒分離株的基因序列比較分析，設計一對特異性PCR引物，置冰箱-20℃冷凍長期保存；
（4）瓊脂糖：購自Amerasco公司，室溫保存；
（5）50×TAE 核酸電泳緩衝液：每個試劑盒裝量1瓶，20mL/瓶。Tris242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2g，加入800mL的去離子水，攪拌溶解後加入57.1mL醋酸，攪拌，定容至1L，室溫保存。
實施例2：偽狂犬病毒基因的克隆與擴增
（1）目的基因選擇
在試驗中選取偽狂犬病毒基因組上保守的gB基因全長上一段保守序列作為目的基因，選取目的基因大小為1300bp左右。
（2）引物設計
F：ATGGCGGCCGTGACGCGGGCCGCCTCGGCCT；
R：CTAGCTCCACCTGCTGGAAGCGCCCGGG；
由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
（3）PCR模板
陽性模板選取豬偽狂犬病病毒SA株基因組；樣品模板用病料提取基因組。
（4）PCR體系
Premix TaqTM(LA TaqTM Version 2.0) 5ul；
Forward Premier 0.5ul；
Reserve Premier 0.5ul；
模板 1ul；
ddH2O 3ul。
（5）PCR程序
96℃ 5min；
；
72℃ 10min；
10℃ forever。
（6）試驗結果
見附圖1和附圖2.
實施例3：快速檢測豬、牛、羊、犬等偽狂犬病病毒的試劑盒組裝
試劑盒的組裝：將棉棒、EP管、病毒保存液、AD1 Buffer、AD2 Buffer、AD3 Buffer、Premix TaqTM(LA TaqTM Version 2.0)、PCR引物、滅菌雙蒸水、PCR反應管、陰性對照與陽性對照、瓊脂糖、50×TAE 核酸電泳緩衝液、操作說明書組裝入試劑盒。
註：試劑盒4℃保存；Premix TaqTM(LA TaqTM Version 2.0) -20℃保存；50×TAE需用蒸餾水稀釋至1×TAE使用。