一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法
2023-11-30 08:53:26
專利名稱：一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法。
背景技術：
α -乳白蛋白是一種天然乳清蛋白，是必需胺基酸和支鏈胺基酸的極好來源，是一種能結合鈣的乳清蛋白，其成分接近人乳，不易過敏。α-乳清蛋白含有豐富的色氨酸，大量實驗表明食用較高色氨酸含量的蛋白有助於提高血液中複合胺的釋放，在動物實驗中發現其有抗焦慮的作用。目前測定乳製品中α-乳白蛋白含量的方法有很多，如酶聯免疫法、電泳和毛細管電泳等幾種方法。但以上各種方法在測定α -乳白蛋白時都有一定的局限性，如酶聯免疫法對試劑的選擇性高，牛乳中蛋白質種類很多，很難有效的準確檢測；電泳技術在定量方面有很大的局限性；毛細管電泳重複性差，容易堵塞。以上技術上的局限性限制了這些方法在實踐中推廣應用。因而，探尋一種成本低廉、檢測快速、準確、適用於複雜體系，如乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法是研究的首要問題。高效液相色譜法(HPLC)是定量分析的有效測試方法之一，與其他方法相比具有解析度和回收率高、重複性好、操作簡便等優勢。但是，目前關於高效液相色譜法分析 α-乳白蛋白含量的檢測方法還存在著色譜峰較多，難以進行定量分析以及分析時間過長等缺點。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服了現有測定乳製品中α-乳白蛋白含量方法的成本高，準確性較差，分析時間長，樣品中α-乳白蛋白含量低時測定不準確的缺陷，提供了一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法。本發明的檢測方法目標物出峰時間短， 峰形尖銳對稱，分離度好，準確性高。本發明提供了一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法，其包括如下步驟按照本領域常規方法提取乳製品中的α-乳白蛋白，再通過高效液相色譜法測定含量；所述高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱為C18色譜柱，等度洗脫，檢測波長為 210-230nm,洗脫液由流動相A和流動相B組成，所述流動相A和所述流動相B的體積比為80 20-82 18 ；所述流動相A是體積分數0.05-0. 15%的三氟乙酸的超純水溶液； 所述流動相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液；所述流動相B中所述乙腈和超純水的體積比為320 100-480 100，優選400 100 ；所述超純水和三氟乙酸的體積比為 100 0.4-100 0.6。其中，所述的C18色譜柱可為現有的各種型號和規格的C18色譜柱，如 4. 6mmX 250mm和4. 6mmX 150mm等徑長規格均可適用。本發明優選Agilent ZORBOX ECLIPSEXDB-C18 柱(4. 6mm X 250mm)。其中，所述的檢測波長較佳地為215nm。其中，所述高效液相色譜法的其他色譜條件為本領域常規條件，優選條件為流動相總流速較佳地為0. 5-1. OmL/min,更佳地為0. 8mL/min ；柱溫較佳地為30_40°C，更佳地為 35 "C。其中，所述的乳製品是指本領域各種常規的乳製品，一般為液體乳或乳粉。所述的液體乳可以為鮮乳、殺菌乳、酸乳或配方乳。所述的乳粉可以為全脂乳粉、脫脂乳粉或配方乳粉。其中，所述的提取乳製品中的α-乳白蛋白的方法優選下述操作方式進行①離心脫脂將所述的乳製品離心，去除脂肪得脫脂樣品；②淨化將ρΗ值為4. 6的醋酸鹽緩衝液和所述的脫脂樣品混合均勻，離心後取上
清液；③過濾過濾所述的上清液，得上機液。步驟①中，所述離心的條件和方法為本領域常規的離心條件和方法。所述離心的溫度較佳地為1-4°C。所述離心的速度較佳地為3500-4500轉/分鐘。所述離心的時間較佳地為10-15min。步驟①中，根據本領域常規方法，所述的乳製品以液態形式進行離心，即當所述的乳製品為液態乳時，可直接將所述的液態乳進行離心；當所述的乳製品為乳粉時，需將所述的乳粉與水混合得乳液，再進行離心，乳粉與水的混合比例較佳地為Ig乳粉5mL水-Ig 乳粉15mL水。按本領域常識，步驟①中所述的脫脂樣品可於_20°C保存，在M小時內進行步驟 ②即可。步驟②中，所述醋酸鹽緩衝液中醋酸的濃度為本領域常規濃度，較佳地為 0.08-0. 12mol/Lo步驟②中，所述的醋酸鹽緩衝液和所述的脫脂樣品的體積比較佳地為 4 1-6 1。步驟②中，所述混合均勻的條件和方法為本領域常規的條件和方法，較佳地用漩渦振蕩器振蕩1-aiiin。步驟②中，所述離心的條件和方法為本領域常規的離心條件和方法。所述離心的溫度較佳地為1-4°C。所述離心的速度較佳地為6000-8000轉/分鐘。所述離心的時間較佳地為8-10min。步驟③中，所述過濾的條件和方法為本領域常規的條件和方法，較佳地採用 0. 45 μ m的濾膜進行過濾。本發明中，α -乳白蛋白的含量可通過本領域常用的定量分析方法確定，較佳地選用外標法計算峰面積，從而確定α-乳白蛋白的含量。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在於
本發明解決了複雜乳製品體系中α -乳白蛋白的快速提取和準確定量分析的問題，該法與目前常用的酶聯免疫法相比，具有檢測費用低，目標物出峰時間短，峰形尖銳對稱，分離度好，準確程度高，受環境變化影響小，有利於α-乳白蛋白在乳製品中含量的檢測。
圖1為α -乳白蛋白標準品的HPLC曲線圖。 圖2為實施例2中檢測α -乳白蛋白的HPLC曲線圖。圖3為HPLC法測定α -乳白蛋白質量濃度的標準曲線圖。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述實施例中，α -乳白蛋白標準品購自於Sigma-Aldrich中國有限公司，批號為 905H9-0，純度≥ 85%。實施例1-2的高效液相色譜法條件色譜柱C18色譜柱(4. 6mmX250mm, Agilent公司，美國)；流動相A 體積分數 0. 三氟乙酸的超純水溶液，流動相B 乙腈、超純水和三氟乙酸以400 100 0.5的體積比混合的混合液，等度洗脫流動相A和流動相B的體積比為81 19，總流速0.8mL/min， 柱溫35°C，檢測波長215nm。工作曲線的繪製(外標法測定物質含量)準確稱取α-乳白蛋白標準品(其HPLC曲線見圖1)，製成α-乳白蛋白溶液，用高效液相色譜測定溶液，其在215nm處的吸收峰繪製標準曲線如下Y = 2. 0594Χ-28. Oil (R2 =0. 9977，見圖 3)。實施例1嬰幼兒奶粉中α-乳白蛋白的含量測定①離心脫脂準確稱取IOg嬰幼兒奶粉(市售)樣品，使其完全溶解於IOOmL水中，然後在4°C下以4000r/min速度離心lOmin，去除上層漂浮的脂肪得脫脂樣品；②淨化分別取5mL 0. lOmol/L、pH值為4. 6的醋酸鹽緩衝液和ImL脫脂樣品於 IOmL離心管中，用漩渦振蕩器振蕩anin混合均勻，於4°C溫度下8000r/min離心lOmin，取
上清液；③過濾上清液經0. 45 μ m濾膜過濾，得上機液；④取10 μ L上機液進高效液相色譜儀。測得嬰幼兒奶粉中α -乳白蛋白的含量為6. 8mg/g。實施例2乳飲料中α -乳白蛋白的含量測定①離心脫脂取乳飲料樣品(市售)500ml，在4°C下以4000r/min速度離心lOmin， 去除上層漂浮的脂肪得脫脂樣品；②淨化取5mL 0. lOmol/L、pH值為4. 6的醋酸鹽緩衝液和ImL脫脂樣品於IOmL 離心管中，用漩渦振蕩器振蕩anin混合均勻，於4°C溫度下SOOOr/min離心lOmin，取上清液；③過濾上清液經0. 45 μ m濾膜過濾，得上機液；④取10 μ L上機液進高效液相色譜儀。測得乳飲料中α -乳白蛋白的含量為0. 86mg/ml。效果實施例準確稱取3份實施例1的嬰幼兒奶粉10g，分別完全溶解於IOOmL水後，分別添加 500mg、lg和2g的α-乳白蛋白，其它步驟同實施例1。按實施例1_2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗，分別重複6次。測得實施例1的樣品加標回收率分別為92%、92%和 100%, RSD分別為3. 1%,2. 9%和3. 6%，結果見表1。準確稱取3份實施例2的乳飲料500mL，分別添加1. 0g、2. 5g和5g的α -乳白蛋白，其它步驟同實施例2。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗，分別重複 6次。測得實施例2的樣品加標回收率平均值分別為85%、92%和98%，RSD分別為4. 6%、 1.9%和1.8%，結果見表1。準確稱取實施例1的嬰幼兒奶粉10g，完全溶解於IOOmL水後，添加500mg的α -乳白蛋白，其它步驟同實施例1。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗，重複測定12次，回收率為93%，RSD為2.9%，結果見表2。準確稱取實施例2的乳飲料500mL，添加2. 5g的α -乳白蛋白，其它步驟同實施例 2。按實施例1-2的高效液相色譜法條件進行回收率試驗，重複測定12次，回收率為91%， RSD為1.9%，結果見表2。表1實施例1-2回收率試驗結果
權利要求
1.一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法，其包括如下步驟提取乳製品中的 α-乳白蛋白，再通過高效液相色譜法測定含量；所述高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱為C18色譜柱，等度洗脫，檢測波長為210-230nm，洗脫液由流動相A和流動相B組成， 所述流動相A和所述流動相B的體積比為80 20-82 18 ；所述流動相A為體積分數 0. 05-0. 15%的三氟乙酸的超純水溶液，所述流動相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液，所述流動相B中所述乙腈和超純水的體積比為320 100-480 100，所述超純水和三氟乙酸的體積比為100 0. 4-100 0.6。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的Cw色譜柱為AgilentZORBOX ECLIPSE XDB-C18柱；和/或，所述的檢測波長為215nm。
3.如權利要求1或2所述的檢測方法，其特徵在於，所述高效液相色譜法的色譜條件還包括流動相總流速為0. 5-1. OmL/min，較佳地為0. 8mL/min ；柱溫為30_40°C，較佳地為 35 "C。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的乳製品為液體乳或乳粉。
5.如權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述提取乳製品中的α-乳白蛋白的方法按下述操作方式進行①離心脫脂將所述的乳製品離心，去除脂肪得脫脂樣品；②淨化將PH值為4.6的醋酸鹽緩衝液和所述的脫脂樣品混合均勻，離心後取上清液；③過濾過濾所述的上清液，得上機液。
6.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，步驟①中所述離心的溫度為1-4°C；所述離心的速度為3500-4500轉/分鐘；所述離心的時間為10-15min。
7.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，步驟①中所述的乳製品以液態形式進行離心，當所述的乳製品為乳粉時，需將所述的乳粉與水混合得乳液，再進行離心，乳粉與水的混合比例較佳地為Ig乳粉5mL水-Ig乳粉15mL水；和/或，步驟①中所述的脫脂樣品於_20°C保存，在M小時內進行步驟②即可。
8.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，步驟②中所述醋酸鹽緩衝液中醋酸的濃度為0. 08-0. 12mol/L ；和/或，步驟②中所述的醋酸鹽緩衝液和所述的脫脂樣品的體積比為 4 1-6 1。
9.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，步驟②中所述混合均勻採用漩渦振蕩器振蕩Ι-aiiin ；和/或，步驟②中所述離心的溫度為1-4°C ；所述離心的速度為6000-8000 轉/分鐘；所述離心的時間為8-lOmin。
10.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，步驟③中所述的過濾採用0.45μπι的濾膜進行。
全文摘要
本發明公開了一種乳製品中α-乳白蛋白含量的檢測方法提取乳製品中的α-乳白蛋白，高效液相色譜法測定含量；高效液相色譜法C18色譜柱，等度洗脫，檢測波長為210-230nm，洗脫液由流動相A和流動相B組成，該流動相A為體積分數0.05-0.15％三氟乙酸的超純水溶液，該流動相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液，流動相A和所述流動相B的體積比為80∶20-82∶18；流動相B中乙腈和超純水的體積比為320∶100-480∶100，超純水和三氟乙酸的體積比為100∶0.4-100∶0.6。本發明的檢測方法費用低，目標物出峰時間短，峰形尖銳對稱，分離度好，準確程度高，受環境變化影響小，有利於α-乳白蛋白在乳製品中含量的檢測。
文檔編號G01N30/06GK102565234SQ201210015949
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者何亞斌, 孟瑾, 樓飛, 鄭小平, 韓奕奕, 馬穎清 申請人:上海德諾產品檢測有限公司