吡啶類衍生物(E)‑MSTC在製備治療卵巢癌藥物中的用途的製作方法
2023-11-04 15:31:12
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及吡啶類衍生物(e)-mstc（(e)-methyl4-styryl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline-2-carboxylate，（e）-4-苯乙烯基-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸甲酯，簡稱（e）-mstc）在製備治療卵巢癌藥物中的用途。
背景技術：
據相關統計研究發現，卵巢癌是導致全球女性死亡率最高的婦科疾病。2012年，全球有239000例病人被確診為卵巢癌，其中152000例死亡。在我國的婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發病率位居第三位，但死亡率卻列居首位。導致卵巢癌高死亡率和低存活率的主要原因是其早期臨床症狀不明顯以及晚期治療失敗率較高。卵巢癌的傳統治療手段為腫瘤細胞減滅術配合紫杉烷類(如紫杉醇)及鉑類（卡鉑、順鉑等）藥物進行化療。然而，長期使用傳統的化療手段除了會出現耐藥性之外，還會因其缺乏專一性而對正常組織細胞造成極大的傷害，這使得超過70%的患者術後壽命少於5年，嚴重威脅患者生命健康。目前，對卵巢癌治療呈現多元化的發展趨勢，除主要的手術治療，化療，放療外，還有分子靶向和免疫療法等，但上述治療方法大多不是毒副作用太大就是技術不成熟，無法有效的應用於臨床。因此，開發出一種能夠對卵巢癌細胞具有高效殺傷能力而對人體正常組織細胞無傷害的化合物，從而提高患者存活率是生物醫藥工作者努力的方向。
本發明涉及的化合物（e）-mstc為吡啶類衍生物。吡啶類化合物的研究應用範圍十分廣泛，主要運用於醫藥、農藥、飼料、染料等領域，其中在醫藥領域內的應用十分重要，如結核病藥異煙肼，中樞興奮藥尼可剎米等。本發明所涉及的化合物的製備方法已在2016年報導與tetrahedron雜誌上。本發明所涉及的化合物為白色粉末，熔點為123-124℃，呈弱鹼性。本發明所涉及的化合物的生物學效應，尤其在抗卵巢癌活性方面的活性尚未見到相關研究報導。因此本發明就該化合物在製備治療卵巢癌的藥物時，抗卵巢癌方面的活性進行研究。研究表明，該化合物對正常人成纖維細胞無明顯影響，但可以影響卵巢癌細胞的細胞周期及凋亡，使其無法進行正常的生長，並促使卵巢癌細胞的凋亡。因此，本發明涉及的吡啶類衍生物在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，並對今後卵巢癌的治療具有很大的價值。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術中的缺陷，為更好的治癒或為資料卵巢癌提供一種可行的選擇，本發明的發明人經過大量創造性的勞動，篩選出一種化合物（e）-mstc，在抗卵巢癌活性方面的具有很好的抑制作用，進而為治療卵巢癌或誘導卵巢癌細胞的凋亡提供了新的療法或手段。
本發明首先提供一種吡啶類衍生物在製備治療癌症藥物中的應用，其中所述的吡啶類衍生物為(e)-methyl4-styryl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline-2-carboxylate，（e）-4-苯乙烯基-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸甲酯，簡稱（e）-mstc，其化學結構式如下：
。
其中，上面所述的癌症為卵巢癌；
其中所述應用為抑制癌細胞增殖，具體的，所述應用為阻滯細胞周期；
其中所述應用還有促進癌細胞凋亡；具體的，所述的應用為促進卵巢癌細胞晚期凋亡。
本發明還提供一種治療癌症的藥物，所述藥物中的有效成分為吡啶類衍生物為7-methyl-2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉,簡稱7-mdt。
其中所述的藥物還包括藥學上可接受的載體或輔料，所述載體和/或輔料為本領域技術人員所知曉，在此不做贅述。
其中所述藥物為抑制癌細胞增殖的藥物，具體的，所述藥物為阻滯癌細胞周期的藥物；
其中所述藥物還可以為促進癌細胞凋亡的藥物；具體的，所述的藥物為促進卵巢癌細胞晚期凋亡的藥物。
本發明通過對一系列化合物進行生物學活性篩選，篩選出候選化合物，並研究其在抗卵巢癌活性方面的相關作用。本發明所涉及的篩選細胞為卵巢癌a2780細胞。通過篩選，得到對卵巢癌細胞具有明顯抑制作用的化合物（e）-mstc。
本發明篩選出的化合物（e）-mstc進一步通過體外mtt抗腫瘤活性實驗和細胞周期檢測進行凋亡活性測定，得到其對卵巢癌細胞和人正常成纖維細胞的增殖、細胞周期凋亡和的影響。結果表明，該化合物的抗癌活性非常顯著。
本發明篩選出的化合物（e）-mstc可以有效抑制卵巢癌細胞生長，且對正常人成纖維細胞生長影響較小。
本發明通過體外mtt抗腫瘤活性實驗證實，該化合物對正常人成纖維細胞的增殖影響不大，但對卵巢癌a2780和skov3細胞的增殖抑制十分明顯，其1c50值作用濃度分別為83.0μm和105.8μm(ibmspssstatistics19)，在同等實驗條件下，正常人成纖維imr90細胞無較大影響（細胞死亡率小於20%）。細胞周期檢測結果表明，該化合物作用於卵巢癌a2780細胞時，使其g0/g1期過程受阻，細胞在g1期明顯減少,並在g2/m期堆積，從而影響正常的細胞周期，抑制細胞增殖；細胞凋亡結果顯示，該化合物作用於a2780細胞時，可引起細胞的早期凋亡明顯增多，晚期凋亡也受到一定的影響，從而促進細胞的凋亡。以上研究證明化合物（e）-mstc具有明顯的抑癌活性，在對卵巢癌的研究和治療方面具有非常大的潛在價值，可以進一步對其進行抗卵巢癌藥物的製備。
本發明的有益效果：本發明中所述的化合物（e）-mstc在抑制卵巢癌細胞增殖的同時，對正常細胞的增殖影響很小或無影響。相比於傳統化療藥物對正常細胞的毒副作用（導致患者存活率低的一個主要因素），（e）-mstc對正常細胞的毒性大大減小。本發明所述化合物是通過改變卵巢癌細胞的細胞周期及促進細胞早期晚期凋亡來達到抑制卵巢癌細胞的增殖的。相對於紫杉醇主要作用於g2/m期及順鉑主要誘導細胞凋亡而言，本發明所述化合物可同時作用於細胞周期和細胞凋亡，具有明顯優勢。綜上所述，本發明具有明顯優於傳統治療的優勢，在未來研究製備抗卵巢癌藥物過程中具有更大的潛力。
附圖說明
圖1：不同化合物對卵巢癌a2780細胞的影響。
圖2：（e）-mstc作用於卵巢癌a2780細胞，三次平行實驗後統計所得的生長抑制曲線。其中，橫坐標為化合物作用濃度，單位為µm，縱坐標為細胞存活率。
圖3：（e）-mstc作用於卵巢癌skov3細胞，三次平行實驗後統計所得的生長抑制曲線。其中，橫坐標為化合物作用濃度，單位為µm，縱坐標為細胞存活率。
圖4：（e）-mstc作用於正常人成纖維imr90細胞後，三次平行實驗後統計所得的生長抑制曲線。其中，橫坐標為化合物作用濃度，單位為µm，縱坐標為細胞存活率。
圖5：分別用0µm、60µm劑量的（e）-mstc處理卵巢癌a2780細胞48h後pi染色的流式細胞檢測圖（圖5上半部分）及三次平行實驗後細胞周期統計圖（圖5下半部分）。
圖6：分別0µm、60µm劑量的（e）-mstc處理卵巢癌a2780細胞96h後經pi/annexinv染色的流式細胞檢測圖（圖6上半部分）及三次平行實驗後細胞凋亡統計圖（圖6下半部分）。
具體實施方式
本發明所涉及的具體化合物為吡啶類衍生化合物（e）-mstc，通過下面的實施例做進一步詳細的說明，下述非限制性實施例不以任何方式限制本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用材料、試劑等均可從化學試劑公司購買。
本發明所涉及的具體化合物（e）-mstc的製備方法請參見chunyinzhu*,benweibi,yading,tezhang,qiu-yunchen.iodine-catalyzedaerobicoxidativeformal[4+2]annulationfortheconstructionofpolyfunctionalizedpyridines.tetrahedron.2016,72(5),779.本發明涉及的化合物均由該論文作者提供。
實施例1.細胞的培養和傳代
卵巢癌a2780、skov3細胞(購於americantypeculturecollection)體外分別培養於含10%胎牛血清及青黴素（100u/ml）-鏈黴素（100μg/ml）的dmem(購於lifetechnologies公司，美國)培養基和含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的rmpi-1640培養基中；人成纖維imr90細胞(購於americantypeculturecollection)培養於含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的專用dmem培養基中。中。每天定期觀察細胞生長狀態，待長滿培養皿時及時傳代（一般在貼壁細胞表面積佔80%及以上時傳代）。當細胞培養和傳代效果良好時進行下一步實驗。
其中所述專用dmem培養基500ml=1ml維生素(100×，購於lifetechnologies，美國)+5ml丙酮酸酯(100nm，購於lifetechnologies，美國)+2ml胺基酸(50×，購於lifetechnologies，美國)+1ml非必需胺基酸(100×，購於lifetechnologies，美國)+491mldmem培養基。
實施例2.mtt檢測不同化合物對細胞存活率的影響
第一步：在底面直徑為6cm的培養皿中培養卵巢癌a2780細胞，傳代良好後，棄原培養液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem，取溶液200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem培養基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用移液槍吸取10µl於細胞計數板上計數或稀釋相應倍數後計數。每孔種2×104個細胞，一共11組孔，每組3個復孔，將細胞種到24孔板中，每孔吹打混勻。放入co2恆溫培養箱（thermoscientific，37℃）靜止培養24h，使其貼壁。
第二步：加入濃度約為100μm的表1所示化合物的dmso溶液。將一定量的化合物溶解於無菌乾淨的dmso溶液中，保持每孔所加的化合物溶液的體積保持不變，空白對照加等體積的培養液。放入co2恆溫培養箱（37℃）靜止培養48h。
表1中所示化合物分別為：
a：4-（2-氟苯基）-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸甲酯；
b：4-苯基吡啶-2,6-二羧酸2-乙基-6-甲酯；
c：正丁醛；
d：3，5-二甲基-1-甲苯磺醯基-1-氫-吡唑；
e：3,5-二甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯；
f：5-氨基-4-氰基-3-苯基-1h-吡唑-1-羧酸苄酯；
g：5-氨基-1-甲基-3-（4-硝基苯基）-1h-吡唑-4-甲腈；
h：5-氨基-1,3-二苯基-1h-吡唑-4-甲腈；
i：1-甲基-5-氧代-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-4-羧酸乙酯；
和（e）-mstc。各化合物的化學結構式如表1。所選化合物多為吡唑類和吡啶類化合物，這些化合物在醫藥領域的應用比較廣泛，並且所篩選化合物多數未進行生物學評價。
表1.各化合物的化學結構式
第三步：將培養48h後的細胞取出，吸去培養基，分別加入100µl含10%mtt的dmem培養基（mtt濃度為5mg/ml），放入co2恆溫培養箱（37℃）反應1.5~2h，待細胞染成藍紫色後吸去培養基，加入0.5ml的dmso並輕輕震蕩使結晶溶解。選擇550nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，並計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組od值/對照組od值）×100%。
不同化合物對卵巢癌a2780細胞作用後的吸光度值見表2所示。
表2.不同化合物對卵巢癌a2780細胞作用後的吸光度值
三次平行實驗後統計結果如圖1所示：不同的化合物對卵巢癌a2780細胞的增殖影響不同，在作用濃度約為100µm時，其中（e）-mstc化合物對卵巢癌a2780細胞的增殖抑制效果最明顯。
實施例3.mtt檢測細胞存活率
第一步：在底面直徑為6cm的培養皿中培養卵巢癌a2780、skov3細胞和正常人成纖維imr90細胞，傳代良好後，棄原培養液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem(或rmpi-1640,imr90專用dmem)培養基吹打混勻，取溶液200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem(或rmpi-1640，imr90專用dmem)培養基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用槍吸取10µl於細胞計數板上計數或稀釋相應倍數後計數。每孔種3500個細胞（imr90細胞每孔2000個），一共7組孔，每組3個復孔，將細胞種到96孔板中,每孔吹打混勻。並設立空白對照組，加等體積的細胞培養液。放入co2恆溫培養箱（thermoscientific，37℃）靜止培養24h，使其貼壁。
第二步：加不同濃度的（e）-mstc化合物dmso溶液。將化合物按不同比例稀釋於無菌乾淨的dmso溶液中，保持每孔所加的化合物稀釋液的體積保持不變，所加濃度分別為10µm、20µm、50µm、100µm、200µm、300µm，對照加等體積的dmso溶液。放入co2恆溫培養箱（37℃）靜止培養48h。
第三步：將培養48h後的加藥細胞取出，吸去培養基，分別加入10µlmtt（5mg/ml），放入co2恆溫培養箱（37℃）反應1.5~2h，待細胞染成藍紫色後吸去培養基，加入0.1ml的dmso並輕輕震蕩使結晶溶解。選擇550nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，並計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組od值/對照組od值）×100%，用spss軟體計算求出ic50值(細胞數量減少一半時所需化合物濃度)。
（e）-mstc作用於卵巢癌a2780、skov3細胞及人正常纖維imr90細胞後的mtt結果吸光度值分別如表3、4、5所示。
表3.（e）-mstc作用於卵巢癌a2780後的mtt結果吸光度值
表4.（e）-mstc作用於卵巢癌skov3細胞後的mtt結果吸光度值
表5.（e）-mstc作用於人正常纖維imr90細胞後的mtt結果吸光度值
三次平行實驗後統計所得的生長抑制曲線實驗結果顯示：化合物對卵巢癌細胞及正常人成纖維細胞的增殖影響不同。如圖2所示，化合物（e）-mstc對卵巢癌a2780細胞生長的抑制呈濃度依賴關係，ic50為83.0µm。如圖3所示，化合物（e）-mstc對卵巢癌skov3細胞生長的抑制也同樣呈濃度依賴關係，ic50為105.8µm。如圖4所示，該化合物對正常人成纖維imr90細胞生長無明顯影響。
實施例4.流式細胞儀檢測細胞周期
第一步：底面直徑6cm培養皿的卵巢癌a2780細胞培養和傳代良好後，棄原培養液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem培養基吹打混勻，200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem培養基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用槍吸取10µl於細胞計數板上計數或稀釋相應倍數後計數。取底面直徑6cm的細胞培養皿，每碟種1.5×105個細胞,每組3碟。放入co2恆溫培養箱（37℃）靜止培養24h，使其貼壁。
第二步：分別取0µm、60µm化合物（e）-mstc劑量加入實驗組細胞中，對照組加入等體積的dmso和培養基。放入co2恆溫培養箱（37℃）靜止培養48h。
第三步：將培養48h後的細胞取出，吸去培養基，分別取0.5ml的pbs清洗，吸去pbs，加0.5ml胰酶消化，加0.5ml相應培養基終止消化，延孔壁吹洗，轉至ep管，重複用0.5ml培養基洗一次，減少細胞殘餘。轉至4℃冰盒，並在4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管加300μl4℃預冷的pbs，混勻，4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管滴加0.5ml-20℃預冷的70%的乙醇，混勻，放入4℃冰箱保存至少24h。
第四步：從4℃取出待處理的細胞，4℃冷凍離心機中500g離心5min，棄上清，刮勻。每管加300μl4℃預冷的pbs,混勻，4℃冷凍離心機中500g離心5min。棄上清，刮勻，每管加500μlpi染色液（485μlpbs+10μl1mg/ml的pi+5μl1mg/ml的rnase），吹打4-5次混勻，轉至周期檢測管，避光中37℃水浴鍋中孵育1h。流式細胞儀檢測細胞周期。
實驗結果顯示：化合物（e）-mstc對卵巢癌a2780細胞周期有一定的阻滯作用，如圖5所示，在60µm濃度下，a2780細胞的g0/g1期略微受到阻滯，使其停留在g2/m期，證明該化合物對卵巢癌a2780細胞具有一定的周期阻滯能力，從而抑制細胞的增殖。
實施例5.流式細胞檢測細胞凋亡檢測
第一步：底面直徑6cm培養皿的卵巢癌a2780細胞培養和傳代良好後，棄原培養液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem培養基吹打混勻，200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素的dmem培養基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用槍吸取10µl於細胞計數板上計數或稀釋相應倍數後計數。取底面直徑6cm的細胞培養皿，每碟種1.5×105個細胞,每組3碟。放入co2恆溫培養箱（37℃）靜止培養24h，使其貼壁。
第二步：分別取0µm、60µm劑量的化合物（e）-mstc加入實驗組細胞中。放入co2恆溫培養箱（37℃）靜止培養96h。
第三步：將a2780細胞從6cm碟消化離心，收集所有的上清液。轉至4℃冰盒，並在4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。將上清離心後的細胞和相應消化下來的細胞全部合併，用0.5ml預冷pbs洗滌，4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管加500ul4℃預冷的pbs，混勻，重複上述操作。加入100μl1×bindingbuffer重懸細胞，加入5μlannexinv-fitc和5μlpistainingsolution，輕輕搖勻(細胞凋亡試劑盒，上海翊聖生物科技有限公司)。避光，室溫反應10min，加入400μl1×bindingbuffer，混勻，1h內送流式細胞儀檢測。
實驗結果顯示，化合物（e）-mstc對卵巢癌a2780細胞具有誘導凋亡的作用，如圖6所示，在60µm的化合物濃度下，誘導卵巢癌a2780細胞的早期凋亡及晚期凋亡，從而可以得出結論，該化合物是通過誘導細胞的晚期凋亡來抑制癌細胞生長的。