一種果蠅抗菌肽伏蠅素的製備方法
2023-11-04 16:55:47 2
專利名稱：一種果蠅抗菌肽伏蠅素的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的製備方法，特別是一種採用基因工程法製備果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的方法。
背景技術：
20世紀30年代，隨著Fleming發現青黴素之後，各種天然、合成、半合成的抗生素開始被應用於抵抗各種微生物的感染，廣泛使用在藥物、動物飼料等領域。此後的幾十年，抗生素對保護人類健康做出了巨大貢獻。但是，隨著它的長期大量應用，人們發現了多種產生耐藥性的菌株，導致一些過去可以被抗生素有效控制的傳染性疾病死灰復燃。抗感染治療再度陷入危機，使得尋找抗生素替代品成了亟需解決的問題。
抗菌肽(Antibacterial Peptide)作為一種具有抗感染活性的多肽類物質，具有以下特性性能穩定，抗菌譜廣泛，不易產生耐藥性和生理抵製作用。因此，抗菌肽越來越多地受到人們的關注，有望成為替代抗生素的藥物。
果蠅缺乏哺乳動物所具有的獲得性免疫系統，即體內沒有T細胞和B細胞，也沒有抗體和補體系統。但是成蟲果蠅卻能成為酵母、細菌和真菌的傳播載體，使有機體腐爛或變壞，這主要是因為果蠅具有天然的免疫系統，可以抵制各種病原微生物的侵染。果蠅免疫反應的一個重要特點就是在受到病原微生物侵染或損傷時，脂肪體細胞能快速合成一些抗菌肽，這些分子分泌到血淋巴後能殺死入侵的病原微生物。伏蠅素Diptericin就是其中的一個重要成員，它對革蘭氏陰性菌具有較強殺菌作用，推測其殺菌機制可能是增加了革蘭氏陰性菌細胞質內β-半乳糖苷酶的釋放，從而增加內膜和外膜的通透性，阻礙了細菌的生長。
目前抗菌肽的生產主要有以下渠道直接提取純化、化學合成以及通過基因工程合成的方法合成，但是，從生物體內直接提取的難度大，對技術和成本的要求高，難以實現規模化生產，化學合成法費用昂貴，限制了應用。因此，基因重組技術成為大量表達有活性抗菌肽的一條有效途徑。
大腸桿菌的原核表達系統是迄今在基因工程領域中應用最多、也最完善的系統，但是，運用該系統表達抗菌肽則遇到了很多困難，主要表現在1)抗菌肽對宿主細胞的毒性。陽性抗菌肽的抑菌作用會對宿主細胞產生抑制，從而影響抗菌肽的進一步表達。2)容易被降解。由於抗菌肽分子量小，本身帶有大量正電荷，因而對蛋白酶非常敏感，在表達細胞中容易被降解，難以實現大量表達。因此，本發明選用融合表達載體pGEX-4T-1，該載體本身含有編碼GST蛋白的序列，使表達出的抗菌肽N端融合一段GST序列，起到以下三個作用1)增加外源蛋白的穩定性；2)提高外源基因在宿主中的表達水平；3)有利於目的蛋白的分離純化。
發明內容
本發明的目的在於提供一種果蠅抗菌肽伏蠅素的製備方法。
為達到上述目的，本發明採用如下技術方案 一種果蠅抗菌肽伏蠅素的製備方法，其特徵在於該方法的具體步驟為 a.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因提取果蠅總RNA，然後以果蠅總RNA為模板，根據果蠅diptericin基因序列設計特異性引物 上遊引物D15′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3』； 下遊引物D25′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3』； 然後進行PCR擴增得到280bp的diptericin片段； b.重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建將用EcoR I和Xho I雙酶切後的diptericin片斷插入質粒pGEX-4T-1的EcoR I/Xho I之間，構成重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin；轉化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆；抽提質粒，用EcoR I和Xho I雙酶切，得到280bp左右的片段，即為重組質粒pGEX-4T-1-diptericin； c.融合蛋白的表達純化和伏蠅素Diptericin的獲得將上述的重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養基中培養至OD600值達到0.6，加入100mM IPTG儲液至終濃度為1.0mM；繼續培養4小時後離心，收集菌體，用緩衝液重懸菌體，超聲破菌後，離心收集上清，進行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應16小時，終止反應，再次進行親和層析，收集流出組分，冷凍乾燥，得到果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin。
與現有技術相比，本發明具有如下顯而易見的特點和顯著優點 1.採用基因工程方法生產果蠅伏蠅素Diptericin，比化學合成法成本低。
2.以大腸桿菌為表達宿主，表達量較高，達到了315.4mg/L。
3.以pGEX-4T-1為表達載體，易於融合蛋白的純化，只需經一次親和層析便可得到純度較高的融合蛋白。
4.只需經一次酶切便可得到純的伏蠅素Diptericin，純化簡便。
圖1重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建流程圖。
圖2Diptericin-GST蛋白的純化，1-純化得到的Diptericin-GST蛋白，2-marker。
圖3Diptericin-GST蛋白的酶切，1-marker；2，3-酶切後的Diptericin-GST；4-酶切前的Diptericin-GST。
圖4Diptericin對大腸桿菌的抑菌活性，0-加入PBS對照；1-加入20μl1mg/ml Diptericin溶液；2-加入20μl 0.5mg/ml Diptericin溶液；3-加入20μl 0.25mg/ml Diptericin溶液。
具體實施例方式 參見圖1、2、3、4，本發明具體方案敘述如下 1.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因 先提取果蠅總RNA，然後以果蠅總RNA為模板，根據果蠅diptericin基因序列設計特異性引物 上遊引物D15′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3』； 下遊引物D25′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3』； 30℃10min，47℃30min，5℃5min進行反轉錄，然後85℃1min，55℃1min，72℃1min，循環25次進行PCR擴增得到280bp左右大小的diptericin片段(包括編碼82個胺基酸殘基的Diptericin成熟肽基因序列246bp、終止密碼子3bp、引物設計增加24bp)，DNA序列測定表明擴增片段序列與果蠅diptericin序列相符。
2.重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建 將用EcoR I和Xho I雙酶切後的diptericin片斷插入質粒pGEX-4T-1的EcoR I/XhoI之間，構成重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin。轉化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆。抽提質粒，用EcoR I和Xho I雙酶切，得到280bp左右的片段，與預期結果相符。
3.融合蛋白的表達純化和伏蠅素Diptericin的獲得 將構建好的重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養基中培養至OD600值達到0.6，加入100mM IPTG儲液至終濃度為1.0mM。繼續培養4小時後離心，收集菌體，用緩衝液重懸菌體，超聲破菌後，離心收集上清，進行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，經考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，表達量達到315.4mg/L。用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應16小時，終止反應，再次進行親和層析，收集流出組分，冷凍乾燥，得到果蠅伏蠅素Diptericin。
4.伏蠅素Diptericin的初步抑菌活性 將得到的Diptericin凍乾粉用500μl無菌水溶解，配成母液。考馬斯亮藍法測得蛋白濃度為8mg/ml。取100μl母液稀釋成1mg/ml、0.5mg/ml以及0.25mg/ml的Diptericin溶液。
採用瓊脂擴散法，以大腸桿菌為受試菌，經LB液體培養基37℃培養16～18h活化增菌，取0.1ml菌液置於LB瓊脂平板上，用滅菌的L形曲玻棒均勻塗布，略幹後用滅菌打孔器，在塗有細菌的平板培養基表面打孔，孔徑直徑為5mm，孔間中心距離≥24mm。孔內分別加入20μl 1mg/ml、0.5mg/ml以及0.25mg/ml的Diptericin溶液，及對照PBS，37℃培養過夜，用卡尺測量抑菌環直徑。實驗結果顯示，參見圖4，Diptericin對大腸桿菌有良好的抑殺作用，1mg/ml濃度時，抑菌圈直徑達20.00mm。
序列表
上海大學
一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的製備方法
1
1
20
DNA
人工合成
1
5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3』；
5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3』；
權利要求
1.一種果蠅抗菌肽伏蠅素的製備方法，其特徵在於該方法的具體步驟為
a.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因提取果蠅總RNA，然後以果蠅總RNA為模板，根據果蠅diptericin基因序列設計特異性引物
上遊引物D15′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3』；
下遊引物D25′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3』；
然後進行PCR擴增得到280bp的diptericin片段；
b.重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建將用EcoR I和Xho I雙酶切後的diptericin片斷插入質粒pGEX-4T-1的EcoR I/Xho I之間，構成重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin；轉化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆；抽提質粒，用EcoR I和Xho I雙酶切，得到280bp左右的片段，即為重組質粒pGEX-4T-1-diptericin；
c.融合蛋白的表達純化和伏蠅素Diptericin的獲得將上述的重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養基中培養至OD600值達到0.6，加入100mM IPTG儲液至終濃度為1.0mM；繼續培養4小時後離心，收集菌體，用緩衝液重懸菌體，超聲破菌後，離心收集上清，進行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應16小時，終止反應，再次進行親和層析，收集流出組分，冷凍乾燥，得到果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin。
全文摘要
本發明涉及一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的製備方法。該方法的具體步驟為果蠅伏蠅素Diptericin基因的獲得，重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建以及融合蛋白的表達純化和伏蠅素Diptericin的獲得。本發明方法採用基因工程方法生產果蠅伏蠅素Diptericin，比化學合成法成本低。以大腸桿菌為表達宿主，表達量較高，達到了315.4mg/L。以pGEX-4T-1為表達載體，易於融合蛋白的純化，只需經一次親和層析便可得到純度較高的融合蛋白。只需經一次酶切便可得到純的伏蠅素Diptericin，純化簡便。
文檔編號C07K14/435GK101280307SQ20081003773
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月20日 優先權日2008年5月20日
發明者陳宇光, 佳 徐, 沈彥萍 申請人:上海大學