一種影響水稻根系發育和稻穀產量的基因及其應用的製作方法
2023-11-05 03:56:42
專利名稱：一種影響水稻根系發育和稻穀產量的基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，特別涉及一種提高水稻根系發育和稻穀產量的基因、真核重組質粒及其製備方法與應用。
背景技術：
隨著我國社會經濟的快速發展，人均耕地逐年減少，糧食安全問題日益突出，水稻單產的進一步提高成為備受關注的重大課題。在水稻的高產育種理論上，20世紀90年代提出了塑造水稻新株型的理念(Dingkuhn M, et al. , 1991, Concepts for a new plant type fordirect seeded flooded tropical rice. International Rice Research Conference, 27-31)。按照這一概念，更高產的水稻品種集中表現為少櫱、大穗、矮稈和根系強壯這4個方面。水稻根系是植株吸收水分、營養物質和感受土壤環境的橋梁，又是胺基酸、多種激素等物質同化、合成的場所，根系狀況直接影響著地上部分的生長發育及產量的形成， 是制約水稻產量潛力進一步發揮的關鍵因素。同時，根系的強壯與水稻抗倒伏能力、機械收割效率也有密切關係。但由於植物根系隱藏於地下，其發育的形態和生理學觀察不易進行，相應分子機制的研究也較其他植物器官滯後。雖然，近年在雙子葉模式植物擬南芥根的發育方面有了比較大的進展(Benfey PN, et al.，2010，Getting to the root of plant biology-impactof the Arabidopsis genome sequence on root research. Plant Journal, 61 :992-1000)，但由於單、雙子葉植物根系的不同，如在擬南芥中有主根，然後順序分生出側根，而水稻、玉米等則是形成龐大而複雜的不定根系。所以，穀類作物還沒有一套具體的根系形態、生理特徵改良指標，對根系發育的分子調控機制也所知甚少。在已知的水稻根發育相關基因研究中，OsWOXII通過介導生長素、細胞分裂素的信號傳遞調控水稻不定根的生長發育，它的過量表達可以使不定根數量明顯增加(aiao Y,etal. ,2009, The WUSCHEL-related homeobox gene WOXll is required to activate shoot-bornecrown root development in rice. Plant Cell, 21 :736-748) ；OsRMC 通過茉莉酸信號途徑促進水稻根的發育、彎曲和捲曲(Jang J, et al. ,2007, RNAi knockdown of Oryza sativa root meandercur1ing gene led to altered root development and coiling which were mediated by jasmonic acidsignalling in rices. Plant, cell & Environment, 30 :690-699)。但總體來說，對於如何利用根系改良在水稻這種重要糧食作物的生產實踐中克服水分、養分和氣象條件限制，充分發揮水稻增產潛力，人們已發現和掌握的知識、技術手段還極為有限。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種新的基因、重組真核質粒及其製備方法，本發明的目的之二是將所述基因和真核重組質粒應用於促進水稻根系生長和提高稻穀產量。本發明的技術方案如下
利用生物信息學方法分析本發明所述提高水稻根系和稻穀產量的基因，預測其具有液泡ATP酶A亞基(Vacuolar H+_ATPase subunit Α)結構特徵，命名為OsVHA。序列分析顯示OsVHA基因的mRNA包含1863個鹼基的開放閱讀框，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示，其胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。本發明所述真核重組質粒，由序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表達載體構成，所述基因片段是位於起始密碼子下遊1815bp至2152bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向和反向插入真核表達載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內含子序列。本發明所述真核重組質粒的製備方法，其特徵在於製備步驟如下(1)在序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基因片段是位於起始密碼子下遊1815bp至2152bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到質粒PSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK 中間載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內含子序列；(2)利用限制性內切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段的部分，然後連接到真核表達載體上，即獲真核重組質粒。本發明所述真核重組質粒及其製備方法中，所述真核表達載體為pHB、 pCAMBIA1301、pTCK303 中的一種。將本發明所述重組質粒轉化水稻，獲得水稻轉基因植株。實驗表明所述轉基因水稻植株可以促進水稻根系生長發育，使水稻的根長增加；與野生型水稻相比，轉基因稻穀粒長、粒寬也增大，千粒重明顯增加。因此，本發明所述的基因和真核重組質粒可在水稻根系發育和產量改良中應用。本發明具有以下有益效果1、本發明克隆了 OsVHA基因，並從該基因的核苷酸序列中選擇了一段基因片段與真核表達載體構建真核重組質粒，為促進水稻根系生長發育和提高稻穀產量提供了一種新的基因資源和重組質粒製備方法，有利於水稻的增產增收。2、本發明所用的基因為水稻本身自有的基因，所以轉基因水稻的安全性能高。3、本發明所述基因的克隆和水稻轉基因均為常規方法，所需材料易於獲取。
圖1是本發明所述OsVHA基因的擴增產物電泳圖。圖中，M泳道分子量標記 (DL2000plus) ；1泳道0sVHA基因全長序列。圖2是本發明所述真核重組質粒(pHB-VHARi)的結構示意圖。其中，標註VHARi 為OsVHA基因選擇片段。圖3是轉基因水稻植株中抗性篩選標記潮黴素抗性基因(HPT)的PCR擴增產物電泳圖。圖中，1泳道陽性對照，PCR模板為真核重組質粒pHB-VHARi ；2泳道陰性對照，PCR 模板為野生型水稻植株DNA ；3-8泳道PCR模板為轉基因水稻陽性植株DNA。圖4是轉基因水稻陽性植株RT-PCR鑑定。圖中，WT 野生型水稻植株；1泳道 pHB-VHARi轉基因水稻1號植株(VHARi-I) ；2泳道pHB-VHARi轉基因水稻2號植株 (VHARi-2) ；3 泳道pHB-VHARi 轉基因水稻 3 號植株(VHARi_3)。
圖5是pHB-VHARi轉基因水稻穀粒生長情況。其中，A為野生型(WT)和1號轉基因(VHARi-I)水稻穀粒照片；B、C、D分別為野生型(WT)和轉基因(VHARi_l、VHARi-2, VHARi-3)水稻千粒重、粒長、粒寬統計結果。圖6是pHB-VHARi轉基因水稻植株根系生長情況。其中，A，B分別為野生型(WT) 和1號轉基因(VHARi-I)水稻生長10天、60天時的生長情況；C為野生型(WT)和轉基因 (VHARi-U VHARi-2, VHARi-3)水稻種子萌發後第6、8和10天時的根長統計結果。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作進一步說明。下述實施例中，凡未註明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 :0sVHA基因的克隆1、試劑與材料限制性內切酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18_T克隆載體等購自大連寶生物工程公司；PBLUNT-EASY克隆載體、質粒提取、DNA提取及DNA回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；反轉錄酶、反轉錄抑制劑購自Toyobo公司；大腸桿菌感受態製備試劑盒購自北京鼎國公司；PCR引物合成、測序由上海英駿生物公司完成；其餘試劑均為進口分裝或國產分析純產品。大腸桿菌克隆菌株為E. coli JM109，購自Clontech公司。水稻野生型品種為日本晴，由實驗室保存。2、培養基LB 培養基胰蛋白腖 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L。用 NaOH 調 pH 至 7. 0， 高壓滅菌。SOB 培養基胰蛋白腖 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 0. 58g/L，KCl 0. 19g/L, 100 XMg2+ 10mL。用NaOH調pH至7.0，高壓滅菌。SOC 培養基S0B+20mM 葡萄糖。3、實驗方法3. 1水稻RNA提取RNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司，RNA提取過程按照生產商建議程序進行。1)將50_100mg水稻葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ L RL (使用前加入 β -巰基乙醇)，渦旋劇烈震蕩混勻。在56°C孵育1-3分鐘使水稻組織裂解；2)將所有溶液轉移至過濾柱CS上，12000rpm離心5分鐘，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的離心管中，洗頭儘量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱；3)緩慢加入0. 5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉澱一起轉入吸附柱CR3中，12000rpm離心60秒，棄去收集液，將吸附柱CS3放回收集管中；4)向吸附柱CS3中加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111離心60秒，棄去收集液， 將吸附柱CS3放回收集管中；
5) DNase I工作液的配置取10 μ L DNase I儲存液於RNase-free離心管中，加入70 μ LRDD溶液，輕柔混勻；6)向吸附柱CS3中央加入80 μ L的DNase I工作液，室溫放置15分鐘；7)向吸附柱CR3加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111離心60秒，棄去收集液，將吸附柱CR3放回收集管中；8)向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW (使用前加入乙醇)。室溫靜置2分鐘， 12000rpm離心60秒，棄去收集液，將吸附柱CS3放回收集管中；9)重複步驟8 ；10) 12000rpm離心2分鐘，棄去收集液。將吸附柱CS3置於室溫數分鐘，徹底晾乾吸附材料中殘留的漂洗液；11)將吸附柱CR3放入一個新的RNase-free離心管，在柱的中央加入30-100 μ L 洗脫緩衝液，室溫放置2分鐘。12000rpm離心2分鐘，洗脫RNA。RNA樣品在_70°C中保存。3. 2RT-PCR3. 2. 1 第一鏈 cDNA 的合成1)取 1 μ g 總 RNA 與 1 μ L 25pmol oligo dT 引物混合，用 RNase-free ddH20 補足到12. 75 μ L，輕輕混勻；2) 65 0C保溫5分鐘，立即轉移至冰浴中，放置2分鐘；3)加入 5 X 反應緩衝液 4 μ L，IOmM dNTP 2 μ L, RNA 抑制劑 0. 25 μ L (40U/ μ L)， ReverTraAce 反轉錄酶 1 μ L (100U/μ L)，42°C保溫 30 分鐘，合成第一鏈 cDNA ；4) 95°C加熱5分鐘，失活反轉錄酶，終止合成反應。3. 2. 2PCR冰上在一個200 μ L EP管中加入以下組分
5 xPrimeStar Buffer10 (ΛdNTP Mixture(各2.5 mM )4 (ΛRT產物1 (ΛVHAF1 μLVHAR1 μLddH2032.5 μLPrimeStar0.5 μL按以下程序進行擴增:98°C 3min (預變性)；98°C IOs (變性)，57°C 15s (復性)， 72 0C 2min (延伸)，所述變性_復性_延伸30個循環；72 °C 5min (終延伸)。引物序列如下VHAF 5' -ATCGAGCGAGAGAGCCGTCT-3』VHAR 5' -GATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3』通過上述操作，獲得2278bp水稻OsVHA基因全長序列。3. 3PCR產物和克隆載體pBLUNT-EASY載體連接
PCR產物與克隆載體pBLUNT-EASY載體連接，反應體系如下PCR 產物( 150 μ g/μ L)3. 5 μ LpBLUNT-EASY 載體1 μ L25 °C 連接 15 分鐘。3. 4大腸桿菌轉化3. 4. 1感受態細胞的製備大腸桿菌感受態製備試劑盒購自北京鼎國公司，製備過程按照生產商建議程序進行。1)接種大腸桿菌單菌落於2mL SOB培養液中，37°C過夜培養；2)轉接0. 5mL過夜培養物至50mL SOB培養液中，18°C劇烈震蕩18- 小時，至A_ 約為0. 55 ；3)將培養液轉入50mL離心管中，冰浴10分鐘，4°C 4000rpm離心10分鐘；4)去上清，加入16mL預冷的TB緩衝液懸浮細胞，輕輕旋轉，冰浴10分鐘，然後 40C 4000rpm 離心 10 分鐘；5)去上清，加入4mL預冷的TB緩衝液懸浮細胞，然後加入280 μ L DMS0，輕輕混勻， 冰浴10分鐘；6)分裝於預冷的1. 5mL EP管中，液氮中凍存。3. 4. 2 轉化1)從液氮中取出一管大腸桿菌感受態細胞，冰浴解凍；2)將連接產物與感受態細胞輕輕混勻，冰浴30分鐘；3) 42°C熱激90秒，立即冰浴1_2分鐘；4)加入0. 8mL的S0C，混勻，37°C溫和振蕩培養1小時。5)室溫13000rpm離心1分鐘，棄去部分上清液，留約200 μ L，用槍頭將上清液與細胞混勻，塗布LB+Amp (50 μ g/mL)平板，37°C培養過夜。 3. 5細胞快速裂解法鑑定重組子1)挑取單個轉化子接種於500 μ L含相應抗生素的LB培養液中，37°C振蕩培養至 A600 為 0. 6-0. 8 ；2)取200 μ L菌液至0. 5mL EP管中，13000rpm離心1分鐘，棄去大部分上清，留約 20μ L ；3)加入 20 μ L 的 2Χ 快速裂解液(0. 2mol/L NaOH 50mL, SDS 0. 5g，蔗糖 27. 2g， 加雙蒸水至200mL)，劇烈振蕩；4) 13000rpm 離心 15 分鐘；5)取5 μ L上清直接進行瓊脂糖凝膠電泳。與陰性對照相比，電泳帶滯後的即可能是重組質粒。3. 6菌落PCR鑑定重組質粒經過快速裂解法鑑定的重組載體再進行菌落PCR以確定插入目標片段，反應體系及PCR程序如實施例1中3. 2. 2。對菌落PCR鑑定的重組載體進行測序，測序結果為序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。
實施例2 真核重組質粒的構建1、試劑與材料常規試劑與實施例1相同。用於轉基因的農桿菌菌株為EHA105 (購自Clontech公司)；真核表達載體pHB由實驗室保存。2、培養基與實施例1相同。3、方法3. IOsVHA基因片段的獲得3. 1. IPCR根據SEQ ID NO=I所示核苷酸序列起始密碼子下遊1815bp至2152bp的基因片段設計構建真核重組質粒的引物如下VHARiFl :5』 -CTCGAGGATCCTGATGACCTCACAACCGGAT-3，VHARiRl :5，-AAGCTTGATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3，VHARiF2 :5』 -GAGCTCTGATGACCTCACAACCGGAT-3，VHARiR2 :5， -CTGCAGATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3，以VHARiFl和VHARiRl為正向擴增引物，以VHARiF2和VHARiR2為反向擴增引物， 按下面的PCR反應體系以及以下程序進行擴增預變性94°C %iin，變性94°C 30s，退火溫度 58°C 20s延伸72°C 21s，所述變性-復性-延伸30個循環；72°C IOmin (終延伸)。
權利要求
1.一種影響水稻根系發育和稻穀產量的基因，其特徵在於它具有序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種真核重組質粒，其特徵在於由序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表達載體構成，所述基因片段是起始密碼子下遊1815bp至2152bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表達載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內含子。
3.根據權利要求2所述的真核重組質粒，其特徵在於所述真核表達載體為pHB、 pCAMBIA1301、pTCK303 中的一種。
4.一種真核重組質粒的製備方法，其特徵在於步驟如下(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基因片段是起始密碼子下遊1815bp至2152bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到質粒pSK 載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的PSK中間載體， 正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內含子序列；(2)利用限制性內切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段的部分，然後連接到真核表達載體上，即獲真核重組質粒。
5.根據權利要求4所述的真核重組質粒的製備方法，其特徵在於所述真核表達載體為 pHB、pCAMBIA1301、pTCK303 中的一種。
6.一種影響水稻根系發育的方法，其特徵在於將上述2或3真核重組質粒轉化水稻，獲得轉基因植株。
7.一種提高水稻產量的方法，其特徵在於將上述2或3真核重組質粒轉化水稻，獲得轉基因植株。
8.權利要求1所述基因在水稻根系發育和產量改良中的應用。
全文摘要
一種影響水稻根系發育和稻穀產量的基因及其應用，該基因具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。將SEQ ID NO1所述基因片段正向和反向插入真核表達載體，獲得本發明所述真核重組質粒。將上述真核重組質粒轉化水稻，獲得轉基因植株。實驗表明本發明所述SEQ ID NO1基因的下調能夠促進水稻根系發育，提高水稻產量；與野生型水稻相比，轉基因水稻的根長增加，穀粒明顯增大粒重增加。因此，本發明所述的基因可在水稻根系發育和植株產量改良中應用。
文檔編號A01H5/00GK102242136SQ20111010549
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者劉永勝, 張惠瑩, 牛向麗 申請人:重慶大學