快速檢測糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌的方法

2023-11-05 00:01:42 1

專利名稱：快速檢測糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌的方法
技術領域：
本發明屬於生化檢測領域，具體涉及一種快速檢測糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌的方法。
背景技術：
沙門菌(Salmonella)是在公共衛生學上具有重要意義的常見人畜共患腸道病原菌，可引起食物中毒、胃腸炎、菌血症、腸熱症等疾病，因此世界衛生組織(WHO)將沙門菌列入具有嚴重危害和中等危害的食物傳播性病原菌；志賀菌(Shigella)是引起人類細菌性痢疾的病原菌，分別為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內志賀菌，可引起食源性暴發，臨床表現通常為帶血腹瀉，主要流行於發展中國家，全世界每年發病數超過2億；大腸桿菌0157:H7 Escherichia coli 0157:H7)是能引起人出血性腹瀉和腸炎的大腸桿菌， 易繼發溶血性尿毒綜合症和血栓性血小板減少性紫癜併發症，人群普遍易感，自美國1982 年首次爆發流行以來，全球各地均有發生，1997年世界衛生組織將大腸桿菌0157 :H7病列為新的食源性疾病。這三種腸道病原菌在感染者的糞便中大量存在，也可能出現於健康攜帶者糞便中，易汙染食品和水源，引起該類疾病的流行，因此，快速檢測糞便及其它樣品中這三種腸道病原菌，對預防和控制疾病發生和流行至關重要。但常規檢測這些致病菌需分離培養、生化和血清學鑑定等多個步驟，操作複雜，周期長(3 7天)，不利於衛生檢疫、食品安全的檢測監管，迫切需要開發快速、靈敏和特異的快速檢測技術，建立快速、敏感和多目標的病原菌檢測工具。國內外針對快速檢測技術的研究，主要包括以下幾個方面①檢測細菌某些專有的酶或產生的毒素的技術，②以檢測細菌生化反應為基礎的細菌自動鑑定系統，③檢測細菌所特有的抗原的技術，通過抗原-抗體特異性反應來檢測相應的病原菌，例如ELISA、膠體金技術等，④檢測細菌的核酸如核酸雜交、PCR(聚合酶鏈反應)、基因晶片、脈衝場電泳分型技術等。雖然這些技術或系統與常規檢驗方法相比，能夠在較短時間內鑑定病原菌，但仍存在局限性①這些技術和系統大多需要細菌的純培養物進行鑑定，而得到細菌純培養物， 一般要經過非選擇性和/或選擇性增菌培養、平板分離、純培養這幾個步驟，需要1 4天時間，仍然不能充分滿足病原菌快速檢測的需要。②某些技術或系統成本高，如全自動微生物分析系統、脈衝場電泳儀、細菌檢測晶片系統等，雖然能夠較快速和多目標檢測，但儀器設備和運行費用昂貴，不利於推廣，儘管已有研究致力於降低儀器設備和運行費用，如納米可視晶片的開發，但實驗時間和反應的信噪比有待進一步改善。③缺乏能分離富集多種目的菌的樣品前處理技術。為此，要建立快速、敏感和多目標的病原菌檢測平臺，必須解決樣品中病原菌的分離和富集以及同時檢測多目標微生物這兩個問題。雖然已有多重PCR檢測果汁類樣品中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌0157:H7的報導，但與糞便樣品比較，果汁類樣品成分簡單，其檢測體系難於適用於糞便樣品。因此，本領域急需解決糞便樣品中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌0157:H7難於快速
4檢測這一難題。

發明內容
本發明要解決的技術問題是本領域目前難於快速檢測解決糞便樣品中沙門菌、志賀菌或大腸桿菌0157: H7。本發明解決上述技術問題的技術方案是提供一種用於檢測離體細菌中的上述細菌的多重PCR引物組及快速檢測方法。本發明提供的檢測離體糞便中沙門菌和志賀菌的多重PCR引物組，包含以下引物對針對沙門菌invA基因的引物對上遊引物5' -TATCGCCACGTTCGGGCAA-3『下遊引物5' -TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3『；以及針對志賀菌ipaH基因的引物對上遊引物5' -GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3'下遊引物5'-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3『。進一步的，上述多重PCR引物組還包括針對大腸桿菌0157:H7的rfbE基因的的引物對上遊引物5' -CACGAAAACGTGAAATTGCTGATATT-3『；下遊引物5'-TCGATGAGTTTATCTGCAAGGTGATTC-3『。本發明快速檢測離體糞便中沙門菌及志賀菌的方法包括以下步驟a、糞便樣本接種SS肉湯，37°C下進行增菌培養8 M小時，分離獲取其中的細菌並提取其DNA模板；b、將步驟a中獲得的DNA模板使用權利要求2中所述的多重PCR擴增引物組進行多重PCR擴增得到擴增產物；C、檢測擴增產物，判斷樣品中是否含有沙門菌或志賀菌。本發明提供的快速檢測離體糞便中沙門菌、志賀菌及大腸桿菌0157:H7的方法包括以下步驟a、糞便樣本分別接種SS肉湯和mEC肉湯，37°C下進行增菌培養8 M小時，分離獲取其中的細菌並提取其DNA模板；b、將步驟a中獲得的DNA模板使用權利要求2中所述的多重PCR擴增引物組進行多重PCR擴增得到擴增產物；C、檢測擴增產物，判斷樣品中是否含有沙門菌、志賀菌或大腸桿菌0157:H7。其中，上述方法中所述分離獲取細菌是採用鐵氧體裸磁珠吸附。進一步的，上述方法中所述分離獲取細菌的方法是取Iml糞便增菌培養物， 15000r/min離心2min，棄上清液，生理鹽水洗滌2次，加入濃度為100 μ g/μ 1鐵氧體裸磁珠50μ 1輕柔顛倒混勻，置搖床輕柔振搖15min，磁分離後棄上清液即得細菌。其中，上述方法中提取細菌DNA模板的方法為將吸附細菌的鐵氧體裸磁珠加入 300 μ 1 TE緩衝液及30 μ 1助懸劑，漩渦混勻器充分混勻後沸水浴15min，磁分離取上清液即得。
其中，上述方法中所述多重PCR擴增反應的反應體系為緩衝液1.5X，MgCl2 2. Ommol/L, dNTPs 0. 6 μ mol/L，沙門菌、志賀菌或大腸桿菌0157:H7的引物終濃度分別為 1. 2ymol/L、0. 75ymol/L 或 1. 6ymol/L，Taq DNA 聚合酶 0. 075U/μ 1，樣品模板按 50 μ 1 的體積計5 μ 1 ；其中，上述方法中所述多重PCR擴增反應的擴增反應條件為經95°C預變性5min 後，95°C變性50s、64°C退火60s、72°C延伸45s、進行；35個循環後，再72°C延伸7min即得。沙門菌、志賀菌以及大腸桿菌0157:H7的傳統檢測方法主要依賴細菌培養、生化鑑定等，準確度雖高但耗時耗力，難以滿足檢驗檢疫的實際需要，亟待研究新型的檢測方法，本研究從富集和快速檢測入手，基於裸磁珠的分離和濃縮效應，結合PCR高特異性、高靈敏度、簡便、快速等特點，建立「裸磁珠-多重PCR」檢測方法，能在12h內完成體檢糞便樣品中的沙門，志賀菌和大腸桿菌0157 H7。與傳統方法相比，「裸磁珠-多重PCR」檢測時間短，比國家標準檢測方法快數倍。 本發明方法具有快速、準確、廉價等特點，能在12小時內完成對糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌0157:H7的檢測，由於12小時體系需加班完成工作，為適應工作需要，可將肛拭培養時間由8小時培養延長為過夜培養。試驗證明，本發明引物組及檢測方法，特異性高，靈敏度強，含菌量在103CFU/g志賀菌，104CFU/g以上的沙門菌或大腸桿菌0157:H7，無需進行增菌培養，而含菌量在102CFU/g以下的，也只需增菌他，全程12h內即可獲得結果。此外，應用本方法可同時檢測3種菌，很大程度地減少試劑用量和試驗工作量，節省檢測成本。具有很好的應用前景。


圖1、本發明多重PCR體系2檢測沙門菌、志賀菌、大腸桿菌0157:H7。1 2.檢測大腸桿菌0157:H7;3 4.檢測沙門菌；5 6.檢測志賀菌；7 8.檢測三種目的菌； 9. Marker I。圖2、本發明多重PCR體系檢測肛拭糞便樣本。1.空白對照；2. Marker I ；3 4.健康受試者肛拭擴增結果；5 6.含沙門菌的健康受試者肛拭擴增結果。圖3、本發明多重PCR體系檢測肛拭糞便樣本結果。1 3.含大腸桿菌0157:H7肛拭，每管加樣量依次為5 X IOOcfu, 5 X IOlcfu, 5 X 102cfu ；4 6.含沙門菌肛拭，每管加樣量依次為8. 5X IOOcfu, 8. 5X IOlcfu, 8. 5X102cfu ；7 9.含志賀菌肛拭，每管加樣量依次 % 2. 7 X IOOcfu, 2. 7 X IOlcfu, 2. 7X102cfu ； 10. Marker I ；11.陰性對照(健康人肛拭)。圖4、本發明兩重PCR方法檢測肛拭。1 10為含沙門菌肛拭，每管加樣量依次為 9.1XIOOcfu,9.1XIOOcfu,9.1XIOlcfu,9.1XIOlcfu,9.1X102cfu,9. 1X102cfu, 9. 1 X 103cfu, 9. 1 X 103cfu, 9. 1 X 104cfu, 9. 1 X 104cfu ； 11. Marker I ; 12 21 為含志賀菌肛拭，每管加樣量依次為 4. 3X IOOcfu,4. 3X IOOcfu,4. 3X IOlcfu,4. 3X IOlcfu， 4. 3X 102cfu,4. 3X 102cfu,4. 3X 103cfu,4. 3X 103cfu,4. 3X 104cfu,4. 3X 104cfu ； 22. Marker I。
具體實施例方式下面結合附圖通過實施例對本發明方法作進一步的描述。
實施例一鐵氧體裸磁珠的製備及樣品前處理條件的優化本發明中採用了化學沉澱法來製備鐵氧體裸磁珠，並通過優化和控制反應條件， 使磁性顆粒分布較為均勻，大小約為10nm，達到納米水平。分別稱取FeCl2 · 4H20和FeCl3 · 6H20,溶於去離子水，過濾後混勻；少量多次緩慢霧狀噴入25%氨水，生成的磁珠顆粒小，且磁珠細膩，懸浮時間長，穩定。製得的裸磁珠在氨水環境下存放，使用時用滅菌去離子水適當洗滌。通過對吸附條件的摸索，確定了裸磁珠對目的菌吸附的最佳條件為室溫(25°C ) 下震蕩吸附15min，裸磁珠用量為50μ l(100yg/y 1)。並在此基礎上，還首次探索了針對裸磁珠對糞便中的沙門菌、志賀菌、0157:H7這三種目的菌吸附的前處理條件。即通過在離心力15600Xg下離心洗滌1次，離心時間為2min，較大程度上降低了糞便殘渣對裸磁珠吸附率的影響。實施例二多重PCR體系檢測體系的建立和優化本發明首先通過查找國內外相關報導，篩選目的基因和相應的引物，並通過不同的組合和優化，探討其針對糞便樣品的適用性。選擇對比的基因包括大腸桿菌0157:H7的 uidA、rfbE保守基因和stx、eaeA、hly等毒力因子基因，沙門菌的invA基因，以及志賀菌的 ipaH、B、C、D等毒力因子基因。最後從中選出大腸桿菌0157:H7的uidA、rfbE基因，沙門菌的invA基因，志賀菌的ipaH基因，利用靶基因保守序列，篩選和設計5對引物，對其進行組合搭配構成不同的三重檢測體系，探討其檢測糞便中目的菌的靈敏度和特異性，以期最終篩選出適用於糞便樣品的引物組合。1試驗材料1. 1主要試劑見表1-1表1-1主要試劑
權利要求
1.檢測離體糞便中沙門菌和志賀菌的多重PCR引物組，其特徵在於包含以下引物對針對沙門菌invA基因的引物對上遊引物 5 『 -TATCGCCACGTTCGGGCAA-3 『下遊引物 5 『 -TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3 『；以及針對志賀菌ipaH基因的引物對上遊引物 5 『 -GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3 『下遊引物5 『 -GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3 『。
2.根據權利要求1所述的多重PCR引物組，其特徵在於還包括針對大腸桿菌0157:H7 的rfbE基因的的引物對上遊引物 5 『 -CACGAAAACGTGAAATTGCTGATATT-3 『；下遊引物5 『 -TCGATGAGTTTATCTGCAAGGTGATTC-3 『。
3.快速檢測離體糞便中沙門菌及志賀菌的方法，其特徵在於包括以下步驟a、糞便樣本接種SS肉湯，37°C下進行增菌培養8 M小時，分離獲取其中的細菌並提取其DNA模板；b、將步驟a中獲得的DNA模板使用權利要求1中所述的多重PCR擴增引物組進行多重 PCR擴增得到擴增產物；c、檢測擴增產物，判斷樣品中是否含有沙門菌或志賀菌。
4.快速檢測離體糞便中沙門菌、志賀菌及大腸桿菌0157:H7的方法，其特徵在於包括以下步驟a、糞便樣本分別接種SS肉湯和mEC肉湯，37°C下進行增菌培養8 M小時，分離獲取其中的細菌並提取其DNA模板；b、將步驟a中獲得的DNA模板使用權利要求2中所述的多重PCR擴增引物組進行多重 PCR擴增得到擴增產物；c、檢測擴增產物，判斷樣品中是否含有沙門菌、志賀菌或大腸桿菌0157:H7。
5.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述分離獲取細菌是採用鐵氧體裸磁珠吸附。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述分離獲取細菌的方法是取Iml糞便增菌培養物，15000r/min離心2min，棄上清液，生理鹽水洗滌2次，加入濃度為100 μ g/μ 1 鐵氧體裸磁珠50μ 1輕柔顛倒混勻，置搖床輕柔振搖15min，磁分離後棄上清液即得細菌。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述提取細菌DNA模板的方法為將吸附細菌的鐵氧體裸磁珠加入300 μ 1 TE緩衝液及30 μ 1助懸劑，漩渦混勻器充分混勻後沸水浴15 min，磁分離取上清液即得。
8.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述多重PCR擴增反應的反應體系 緩衝液1. 5X，MgCl22. (toimol/L，dNTPs 0. 6 μ mol/L，沙門菌、志賀菌或大腸桿菌0157:H7的引物終濃度分別為 1. 2 μ mol/L,0. 75 μ mol/L 或 1· 6 μ mol/L, Taq DNA 聚合酶 0. 075U/ μ 1， 樣品模板按50 μ 1的體積計5 μ 1。
9.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述多重PCR擴增反應的反應條件為經95°C預變性5min後，95°C變性50s、64°C退火60s、72°C延伸45s、進行35個循環後，再72°C延伸7min即得。
全文摘要
本發明要解決的技術問題是本領域目前難於快速檢測解決糞便樣品中沙門菌、志賀菌或大腸桿菌O157:H7。本發明解決上述技術問題的技術方案是提供一種用於檢測離體細菌中的上述細菌的多重PCR引物組及快速檢測方法。本發明提供的檢測離體糞便中沙門菌和志賀菌的多重PCR引物組，包含針對沙門菌invA基因的引物對以及針對志賀菌ipaH基因的引物對，另外還提供了使用上述引物組進行多重PCR擴增的方法。與傳統方法相比，本發明方法具有快速、準確、廉價等特點，能在12小時內完成對糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌O157:H7的檢測，具有很好的應用前景。
文檔編號C12R1/42GK102424839SQ201110429558
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者楊雨, 樊學軍, 田綠波, 石瑩, 陳肖瀟 申請人:楊雨, 樊學軍, 田綠波, 石瑩, 陳肖瀟