肝癌生物標誌物的製作方法

2023-11-05 05:44:17 3

專利名稱：肝癌生物標誌物的製作方法
本申請要求享有2003年11月3日提交的美國臨時申請No.60/516,853的優先權。以上申請的全部教導經引用併入本文。
1.發明領域本發明涉及在肝癌中差異表達的新生物標誌物的鑑定和選擇與在肝癌中差異表達的新生物標誌物組合的鑑定和選擇，以及選擇所述新生物標誌物組合的方法。本發明還涉及與本發明生物標誌物的產物特異性雜交的多核苷酸和/或蛋白質以診斷肝癌的用途及其試劑盒。本發明還涉及監測治療方案效果、鑑定治療肝癌的治療靶點和鑑定與肝癌相關的單核苷酸點突變的篩選方法。
2.發明背景肝癌是一種具有高死亡率的癌症。肝癌或者開始於肝本身，或者來源於另一種來源(當癌症從身體的一些其它部位擴散到肝時)。
起始於肝內的肝癌在美國是相當少見的疾病，佔所有惡性腫瘤的約2％和新診斷癌症的4％。
成年人中開始於肝組織自身的多數肝癌屬於兩種類型之一肝瘤或肝細胞癌(HCC)；和膽管瘤或膽管癌，這是在肝中的膽管發生的癌症。
約80％-90％起始於肝的肝癌是肝瘤。在美國，每20萬人中約5個人發生肝瘤(原發性肝癌病例的70％-75％是HCC)。在非洲和亞洲，每20萬人中超過40人將發生這種形式的癌症(原發性肝癌病例的超過90％是HCC)。肝細胞癌是世界上最常見的8種癌症之一。然而，它在美國以外更常見，佔非洲和部分亞洲的惡性腫瘤的10％-50％。HCC在男性中的發生率至少比女性高2到3倍。在高危地區(東亞和東南亞、撒哈拉以南非洲)，男性比女性甚至更可能發生HCC。
發生起始於另外部位的肝癌在美國是起始於肝內的肝癌的約20倍。因為身體所有部位的血必須經肝濾過，其它器官和組織的癌細胞容易到達肝，它們可以在此定居並生長為繼發性腫瘤。結腸、胃、胰、直腸、食管、乳房、肺或皮膚的原發癌最可能轉移(擴散)到肝。轉移到肝中的癌經常是開始於另一個器官的癌症的首先注意到的症候。肝硬化以後，轉移性肝癌是致死性肝病的最常見原因。
肝癌的診斷肝癌的早期症狀經常不明顯，並且不是肝臟疾病獨有的。腫瘤開始生長與首次出現徵兆之間的長時間是疾病具有如此高死亡率的主要原因。
可以用血測試測試肝功能或評估患者歷史的風險因素。本領域已知50％-75％的原發性肝癌患者具有異常高的甲胎蛋白(AFP)血清水平。然而AFP測試不能單獨用於確認肝癌診斷，因為肝硬化或慢性肝炎也能產生高甲胎蛋白水平。測試鹼性磷酸酶、膽紅素、乳酸脫氫酶和其它化學物指示肝不能正常發揮功能。約75％的肝癌患者表現出肝炎感染的跡象。然而，同樣地，異常肝功能測試結果不是肝癌特異性的。
影像研究可以用於定位肝中異常組織的具體面積。一英寸小的肝腫瘤現在可以經超聲或計算機斷層掃描(CT掃描)檢測到。然而，影像研究不能區分肝瘤和肝中組織(結節)的其它異常團或塊。
當前的技術限制要求肝組織樣品進行活組織檢查以明確診斷肝癌。CT或超聲可用於指導醫生選擇獲得組織活檢樣品的最佳部位。胸X射線可用於觀察肝腫瘤是原發性還是從肺的原發性腫瘤轉移而來。對於肝組織活檢，用細針取肝臟或組織液的樣品並在顯微鏡下檢查是否存在癌細胞。約70％病例中活組織檢查是癌症陽性。多數情況下，活組織檢查操作對患者很少有風險。然而約0.4％的病例中，患者由於活組織檢查而發生致死性出血，因為一些腫瘤有大量血管，非常容易出血。
由於這些限制，需要簡單的非侵入性診斷測試以檢測肝癌。
3.發明內容本發明涉及新生物標誌物的鑑定和選擇與新生物標誌物組合的鑑定和選擇，所述新生物標誌物在血液中差異表達並可用於診斷肝癌以及監測治療效果。本發明生物標誌物和生物標誌物組合的產物表達的測定結果被用於診斷肝癌。為了測定本發明生物標誌物的產物的表達，與本發明的生物標誌物的產物特異性和/或選擇性雜交的多核苷酸和蛋白質、以及含所述多核苷酸和蛋白質的試劑盒也包括在本發明範圍內。本發明還包括所述多核苷酸和蛋白質用於監測治療方案效果的用途。本發明還提供使用本發明的生物標誌物的產物鑑定肝癌的新治療靶點的鑑定方法。
4.


參考以下詳細說明和附圖可以更好理解本發明的目的和特徵。
圖1是選擇可用於診斷肝癌的生物標誌物的列表。
圖2表示用QRT-PCR分析，與正常個體相比較，假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)、BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)和受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)在肝癌患者血樣中的差異基因表達。
圖3的表表示在本發明的一個實施方案中，已被鑑定為本發明生物標誌物的SNP。
圖4的表表示在本發明的一個實施方案中，本發明的兩種生物標誌物的多種選擇。
圖5的表表示在本發明的一個實施方案中，本發明的三種生物標誌物的多種選擇。
圖6是ROC＞0.9的分類符的一個實例。
圖7是ROC＞0.9的分類符的一個實例。
5.具體實施方式
本發明涉及從血液中鑑定和選擇在肝癌患者與正常患者之間差異表達和可單獨和聯合用於診斷的基因。如此，本發明涉及能用於檢測和監測生物標誌物和生物標誌物組合的差異基因表達以診斷和監測治療性處理的多核苷酸和多肽。本發明還涉及鑑定特別有用的生物標誌物組合的方法。此外，本發明涉及本發明的生物標誌物用於篩選治療靶點和鑑定本發明基因內的單核苷酸多態性的用途，所述單核苷酸多態性可以被監測以確定診斷個體中肝癌的其他手段。
5.1定義除非另外指明，本發明的實施將利用分子生物學、微生物學和重組DNA技術的常規技術，它們在本領域技術人員能力範圍內。這些技術在文獻中已被解釋。例如見Sambrook，Fritsch Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harnes S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide toMolecular Cloning(B.Perbal，1984)；和叢書Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)；Short Protocols In Molecular Biology(Ausubel et al.，ed.，1995)。本文提及的所有專利、專利申請和公開出版物，包括在此之前和之後，其全部內容經引用併入本文。
對用於以下書面說明中的具體術語提供以下定義。本文所用「5』端」表示從mRNA的第一個核苷酸開始的mRNA的末端，可達mRNA的前1000個核苷酸或前1/3(mRNA的全長不包括多聚A尾)。基因的「5』區」表示位於基因的5』端內或5』端處的多核苷酸(雙鏈或單鏈)，包括但不限於基因的5』非翻譯區(如果存在)和5』蛋白質編碼區。5』區長度不短於8個核苷酸，不長於1000個核苷酸。5』區的其它可能長度包括但不限於10、20、25、50、100、200、400和500個核苷酸。
本文所用「3』端」表示mRNA的末端，可達mRNA的最後1000個核苷酸或mRNA的最後1/3，其中3』末端核苷酸是臨近多聚A尾(如果存在)的編碼或非翻譯區的末端核苷酸。也就是說，mRNA的3』端不包括多聚A尾(如果存在)。基因的「3』區」表示位於基因的3』端內或3』端處的多核苷酸(雙鏈或單鏈)，包括但不限於基因的3』非翻譯區(如果存在)和3』蛋白質編碼區。3』區長度不短於8個核苷酸，不長於1000個核苷酸。3』區的其它可能長度包括但不限於10、20、25、50、100、200、400和500個核苷酸。如本文所用，基因的「內部編碼區」表示位於本文定義的基因的5』區和3』區之間的多核苷酸(雙鏈或單鏈)。「內部編碼區」長度不短於8個核苷酸，不長於1000個核苷酸。「內部編碼區」的其它可能長度包括但不限於10、20、25、50、100、200、400和500個核苷酸。5』、3』和內部區是非重疊的，可以但不必是連續的，可以但不必合計達相對應基因的全長。
本文所用多肽的「氨基端」區表示位於基因5』端內或5』端處的多核苷酸序列(雙鏈或單鏈)編碼的多肽序列，所述多核苷酸序列包括但不限於基因的5』蛋白質編碼區。本文所用「氨基端」區表示從多肽的第一個胺基酸開始的多肽的氨基末端，可達多肽的前300個胺基酸或前1/3。多肽的「氨基端」區長度不短於3個胺基酸，不長於350個胺基酸。多肽的「氨基端」區的其它可能長度包括但不限於5、10、20、25、50、100和200個胺基酸。
本文所用多肽的「羧基端」區表示位於基因3』端內或3』端處的多核苷酸序列(雙鏈或單鏈)編碼的多肽序列，所述多核苷酸序列包括但不限於基因的3』蛋白質編碼區。本文所用「羧基端」區表示多肽的羧基末端，從多肽的最後一個胺基酸開始可達多肽的300個胺基酸或1/3。「3』端」不包括多聚A尾(如果存在)。多肽的「羧基端」區長度不短於3個胺基酸，不長於350個胺基酸。多肽的「羧基端」區的其它可能長度包括但不限於5、10、20、25、50、100和200個胺基酸。
如本文所用，多肽的「內部多肽區」表示位於本文定義的多肽的氨基端區和羧基端區之間的多肽序列。「內部多肽區」長度不短於3個胺基酸，不長於350個胺基酸。多肽的「內部多肽區」的其它可能長度包括但不限於5、10、20、25、50、100和200個胺基酸。多肽的氨基端、羧基端和內部多肽區是非重疊的，可以但不必是連續的，可以但不必合計達相對應多肽的全長。
本文所用術語「擴增」當用於核酸序列時，表示從模板核酸產生一個或多個拷貝的特定核酸序列的過程，優選用聚合酶鏈式反應的方法產生(Mullis and Faloona，1987，Methods Enzymol.，155335)。「聚合酶鏈式反應」或「PCR」表示擴增特異性核酸模板序列的體外方法。PCR反應涉及一系列重複的溫度循環，典型的在50-100μl體積中進行。反應混合物包含dNTP(四種脫氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一種)、引物、緩衝劑、DNA聚合酶和核酸模板。PCR反應包括提供一組多核苷酸引物，其中第一種引物含有與核酸模板序列的一條鏈中區域互補的序列並引發互補DNA鏈的合成，第二種引物含有與靶核酸序列的第二條鏈中區域互補的序列並引發互補DNA鏈的合成；和在允許PCR循環步驟的條件下用一種核酸聚合酶作為模板依賴的聚合劑擴增核酸模板序列，所述PCR循環步驟為(i)使擴增需要的引物退火到模板序列中的靶核酸序列上，(ii)延伸引物，其中核酸聚合酶合成引物延伸產物。「一組多核苷酸引物」或「一組PCR引物」可以包含兩個、三個、四個或更多個引物。在一個實施方案中，exo-Pfu DNA聚合酶用於在PCR反應中擴增核酸模板。其它擴增方法包括但不限於連接酶鏈式反應(LCR)、基於多核苷酸特異性的擴增(NSBA)或任何本領域已知的其它方法。
根據本發明，「陣列」包括固定到固相支持物上的一組特異性基因，或一組對應的5』端或一組對應的3』端或一組對應的內部編碼區。當然，一種基因的5』端混合物可用作靶或探針與另一種基因的3』端組合以獲得肝癌診斷的相同結果。
本文所用的術語「類似物」對於蛋白質物質(例如蛋白質、多肽、肽和抗體)而言表示與第二種蛋白質物質具有相似或相同功能但未必包含與第二種蛋白質物質相似或相同胺基酸序列、或具有第二種蛋白質物質相似或相同結構的蛋白質物質。具有相似胺基酸序列的蛋白質物質表示滿足以下至少一條的第二種蛋白質物質(a)具有與第二種蛋白質物質的胺基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性的胺基酸序列的蛋白質物質；(b)在嚴謹條件下與編碼第二種蛋白質物質中至少5個連續胺基酸殘基、至少10個連續胺基酸殘基、至少15個連續胺基酸殘基、至少20個連續胺基酸殘基、至少25個連續胺基酸殘基、至少40個連續胺基酸殘基、至少50個連續胺基酸殘基、至少60個連續胺基酸殘基、至少70個連續胺基酸殘基、至少80個連續胺基酸殘基、至少90個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基或至少150個連續胺基酸殘基的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的蛋白質物質；(c)與編碼第二種蛋白質物質的核苷酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致性核苷酸序列編碼的蛋白質物質。與第二種蛋白質物質具有相似結構的蛋白質物質表示與第二種蛋白質物質具有相似的二級、三級或四級結構的蛋白質物質。蛋白質物質的結構可通過本領域技術人員已知的方法確定，這些方法包括但不限於肽測序、X-射線晶體衍射、核磁共振、園二色性分析和晶體衍射電鏡分析。
為確定兩種胺基酸序列或兩種核酸序列的百分一致性，根據最優比較目的(如，為了與第二種胺基酸或核酸序列最優匹配，可以向第一種胺基酸或核酸序列中引入間隙)進行序列比對。然後比較相對應胺基酸位置或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列中的位置被與第二種序列中相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，那麼分子在該位置是相同的。這兩種序列之間的百分一致性是兩種序列共有的相同位置數目的函數(即，％一致性＝相同重疊位置數/總位置數×100％)。在一個實施方案中，這兩種序列是相同的長度。
也可以用數學算法確定兩種序列之間的百分一致性。用於比較兩種序列的數學算法的優選的、非限制性的實例是Karlin and Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872264-2268中的算法，並在Karlin and Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.905873-5877中改進。這種算法整合到Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST核苷酸程序參數組進行，例如評分＝100(score＝100)、字長＝12(wordlength＝12)，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可用XBLAST核苷酸程序參數組進行，例如評分-50、字長＝3，以獲得與本發明的蛋白質分子同源的胺基酸酸序列。為比較目的獲得帶間隙的匹配，可以使用Altschul et al.，1997，NucleicAcids Res.253389-3402描述的Gapped BLAST。作為替代方案，可以使用PSI-BLAST進行疊代搜索以檢測分子之間的遠相關性(Id.)。當使用BLAST、GappedBLAST和PSI-BLAST程序時，可以使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默認參數(例如見NCBI網址)。用於序列比較的數學算法的另一種優選非限制性實例是Myers and Miller，1988，CABIOS 411-17的算法。這種算法整合入ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比對軟體包的一部分。當使用ALIGN程序比較胺基酸序列時，可以使用PAM120重量殘基表、間隙長度罰分12和間隙罰分4。
可用與上述技術相似的技術確定兩種序列之間的百分一致性，可以允許或不允許間隙。計算百分一致性時，通常只計算確切匹配。
本文所用術語「類似物」對於非蛋白質類似物而言表示與第一種有機或無機分子具有相似或相同功能、並且與第一種有機或無機分子結構相似的第二種有機或無機分子。術語「類似物」包括核心結構與第一種分子相同或緊密相關、但具有化學或物理修飾的分子。術語「類似物」包括可以連接到其它原子或分子上的第一種分子的共聚物。「生物活性類似物」和「類似物」在本文可以互換使用，表示表現出與第一種有機或無機分子基本相同的激動或拮抗作用的有機或無機分子。
本文所用的「核苷酸類似物」表示戊糖和/或一個或多個磷酸酯被各自的類似物替換的核苷酸。磷酸酯類似物的實例包括但不限於烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioates、phosphoroanilidates、氨基磷酸鹽(phosphoroamidates)、硼磷酸酯等，包括可能存在的任何相關的反離子。在「核苷酸類似物」定義內還包括能聚合成多核苷酸類似物的核酸鹼基(nucleobase)單體，其中DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯骨架被不同類型的連接鍵替換。「核苷酸類似物」還包括具有非常規即不同於G、A、T、U或C之一的核酸鹼基結構的核苷酸。非常規核酸鹼基一般具有與相鄰反向多核苷酸鏈上的至少一個核酸鹼基結構形成氫鍵的能力，或提供非相互作用、非幹擾的鹼基。
術語「抗體」還包括抗體的抗原結合片段。本文所用的術語抗體的「抗原結合片段」(或簡稱「抗體部分」或「片段」)表示保留特異性結合多肽能力的全長抗體的一個或多個片段，所述多肽由本發明生物標誌物的基因之一編碼。在術語抗體的「抗原結合片段」範圍內，結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab』)2片段，包含通過鉸鏈區的二硫橋連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH結構域組成，(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature341544-546)，由VH結構域組成；和(vi)分離的互補性決定區(CDR)。而且，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，它們可以用重組方法通過合成使它們成為單個蛋白質鏈的連接子而連接，所述單個蛋白質鏈中VL和VH區成對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；例如見Bird et al.(1988)Science 242423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這種單鏈抗體也包含在術語抗體的「抗原結合片段」之內。用本領域技術人員已知的常規技術獲得這些抗體片段，並篩選以和完整抗體相同方式使用的片段。抗體優選是單特異性的，例如單克隆抗體，或其抗原結合片段。術語「單特異性抗體」表示對特定靶如表位顯示單結合特異性和親和性的抗體。該術語包括「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」，用於本文中表示單分子組成的抗體或其片段的製劑。
本文所用術語「附著」和「點斑」表示將核酸沉積到基質上形成核酸陣列使得核酸通過共價鍵、氫鍵或離子相互作用而穩定結合到基質上的過程。
本文所用術語「生物標誌物」表示在肝癌個體和正常個體(無肝癌個體)之間受差異調節的基因。
本文所用「血核酸樣品」表示來自血液的核酸，可以包括來自全血、離心裂解血、無血清全血或外周血白細胞(PBL)的核酸。全血是指未分離的全血，例如一滴全血。離心裂解血或「裂解血」是指與裂解緩衝液混合併如本文所述離心的全血(見實施例2)。無血清血是指經本文所述離心除去血清或血漿的全血(見實施例2)。血核酸樣品優選是全血或離心裂解血，並可以是總RNA、mRNA或是對應mRNA的核酸，例如從所述血分離的cDNA。核酸樣品還可以包括來自總RNA、mRNA或cDNA的PCR產物。
本文所用術語「離心」表示在4℃以2000rpm(800g)離心無血清全血或裂解血5分鐘。
本文所用術語「分類符」用於描述根據區分兩種或更多種表型性狀例如患有或不患有肝癌的能力而產生的數學模型的輸出。
本文所用術語「化合物」和「劑」可互換使用。
本文所用「基本由……組成」表示使用生物標誌物鑑定肝癌所需要的基因的最大數目。在一個實施方案中，診斷肝癌的生物標誌物基本由本發明的生物標誌物中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個或全部組成。在一個實施方案中，診斷肝癌的生物標誌物基本由圖1所示的至少3個基因組成。
本文所用術語「對照」或「對照樣品」在本發明中表示從被分類為患有肝癌或不患有肝癌的一個個體或一組個體分離的一種或多種組織核酸樣品和/或血核酸樣品，對「對照」或「對照樣品」的診斷已經被確認。術語對照或對照樣品也可以表示來自已被確診為正常(沒有肝癌)的一個或多個個體或已被確診為肝癌的一個或多個個體的樣品的數據彙編。
「編碼區「表示編碼mRNA的DNA序列。
本文所用術語「化合物」和「劑」可互換使用。
本文所用術語「衍生物」對於蛋白質物質(如蛋白質、多肽、肽和抗體)而言表示包含通過引入胺基酸殘基替換、缺失和/或添加而被改變的胺基酸序列的蛋白質物質。本文所用術語「衍生物」還表示修飾的蛋白質物質，即通過將任何類型的分子共價連接到所述蛋白質物質上而修飾的蛋白質物質。例如但不限於，抗體可以被修飾，例如通過糖基化、乙醯化、PEG化、磷酸化、醯胺化、經已知保護/封閉基團衍生化、蛋白質水解性切割、與細胞配體或其它蛋白質連接等而被修飾。蛋白質物質的衍生物可以用本領域技術人員已知的技術經化學修飾產生，所述化學修飾包括但不限於化學切割、乙醯化、甲醯化、衣黴素代謝合成等。而且，蛋白質物質的衍生物可以含有一個或多個非典型胺基酸。蛋白質物質的衍生物與所來源的蛋白質物質具有相似或相同功能。
本文所用術語「衍生物」對於非蛋白質性衍生物而言表示基於第一種有機或無機分子的結構而形成的第二種有機或無機分子。有機分子的衍生物包括但不限於例如通過添加或刪除羥基、甲基、乙基、羧基或氨基而修飾的分子。有機分子還可以被酯化、烷基化和/或磷酸化。
本文所用「診斷」表示確定個體是否受疾病或小病影響的過程。「肝癌診斷」或「肝癌的診斷」表示確定個體是否受肝癌影響的過程，包括診斷肝癌的傳統醫學診斷技術，以及本發明涉及的診斷方法。傳統醫學診斷技術包括檢查一般健康體徵的身體檢查和病史，包括檢查疾病症候、如腫塊或看起來不尋常的任何其它症候，確定血紅細胞、白細胞和血小板數目、血紅細胞中血紅蛋白量，和血紅細胞組成的樣品的部分；腹腔鏡檢查，觀察腹內器官以檢查疾病症候；肝活檢；CT掃描(CAT掃描)；MRI(磁共振成像)或核磁共振成像(NMRI)；和超聲。在一個具體實施方案中，「肝癌的診斷」或「肝癌診斷」表示在兩個選項之間確定，即個體患有肝癌或個體不患有肝癌。在另一個實施方案中，「診斷」還可以表示在三個選項之間確定，即個體患有肝癌、個體不患有肝癌或不能以足夠確定的程度確定個體是否患有肝癌。本領域技術人員理解，在此處「足夠確定的程度」依賴於診斷靈敏度核特異性的醫學需要。足夠確定的程度更具體地包括大於50％靈敏度和/或特異性、大於60％靈敏度和/或特異性、大於70％靈敏度和/或特異性、大於80％靈敏度和/或特異性、大於90％靈敏度和/或特異性，以及100％靈敏度和/或特異性。根據本發明，是指確定個體是否受原發性或轉移性肝癌影響。
本文所用「正常」或「非肝癌」對於不依賴於本發明生物標誌物的常規診斷而言表示不表現任何肝癌症狀並且已知不患有肝癌的個體或一組個體。所述正常個體優選不接受影響肝癌的藥物。如果可能，所述個體或個體組不被診斷為具有任何其它疾病。正常個體更優選具有與測試樣品相似的性別和年齡。根據本發明，「正常」還表示從正常個體分離的樣品，包括從正常個體分離的血、總RNA或mRNA。從正常個體獲取的樣品可以包括從血樣分離的RNA，其中所述血樣是全血、裂解血或外周血白細胞(PBL)，並且其中所述血來自在分離血的時候診斷為不患有肝癌並且不表現任何肝癌症狀的個體。
本文所用「肝癌」是指癌症開始於肝中的原發性肝癌。原發性肝癌包括開始於肝中的肝瘤或肝細胞癌(HCC)和癌症在肝中膽管中發生的膽管瘤。
肝癌症狀包括胸廓正下方右側有硬塊，右側上腹部不適、右肩胛周圍疼痛、不明原因體重降低、黃疸、不正常勞累、噁心和食慾減退。
本文所用術語「差異表達」表示與第二種樣品中相同的一種或多種本發明生物標誌物的表達水平比較，經測定mRNA的量或水平，在一個樣品中本發明的一種或多種生物標誌物的RNA和/或所述生物標誌物mRNA的一種或多種剪接變體表達水平的差異。「差異表達的」還可以包括與第二種樣品或樣品群中蛋白質表達量或水平比較，對樣品或樣品群中本發明生物標誌物編碼的蛋白質的測定。差異表達可以如本文所述和本領域技術人員理解的方法確定。術語「差異表達」或「表達水平的變化」表示與第二種樣品中給定生物標誌物的可測定表達水平比較，經測定RNA的量和/或蛋白質的量，樣品中給定生物標誌物可測定表達水平的增加或降低。術語「差異表達」或「表達水平的變化」還可以表示與第二個樣品群中生物標誌物的可測定表達水平比較，樣品群中給定生物標誌物可測定表達水平的增加或降低。本文所用「差異表達」可以用給定生物標誌物的表達水平相對於對照中給定生物標誌物的平均表達水平的比率進行測定，其中比率不等於1.0。還可以用p值測定差異表達。當使用p值時，當p值小於0.1時生物標誌物被鑑定為在第一和第二群體之間差異表達。更優選p值小於0.05。甚至更優選p值小於0.01。還更優選p值小於0.005。最優選p值小於0.001。當基於比率確定差異表達時，如果第一種和第二種樣品中表達水平的比率大於或小於1.0，則RNA或蛋白質是差異表達的。舉例來說，大於1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小於1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本發明的另一個實施方案中，如果第一群體的平均表達水平與第二群體的平均表達水平的比率大於或小於1.0，則核酸轉錄本是差異表達的。舉例來說，大於1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小於1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本發明的另一個實施方案中，如果第一個樣品中表達水平與第二個群體中平均表達水平的比率大於或小於1.0，例如包括比率大於1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小於1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，則核酸轉錄本是差異表達的。
「表達差異增加」或「上調」表示基因相對於對照而言，基因表達(以RNA表達或蛋白質表達測定)顯示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。
「表達差異降低」或「下調」表示基因相對於對照而言，基因表達(以RNA表達或蛋白質表達測定)顯示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少於1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上調基因包括與從正常個體分離的mRNA或蛋白質的表達相比，從以患有肝癌為特徵的個體分離的血中mRNA或蛋白質表達水平增加的基因。例如，下調基因包括與從正常個體分離的血相比，從以患有肝癌為特徵的個體分離的血中mRNA或蛋白質表達水平降低的基因。
本文所用術語「差異雜交」表示與不具有互補性核酸的一種性狀的第二個個體或第二組個體的核酸樣品與互補性核酸靶的雜交比較，具有所述性狀的第一個個體或第一組個體的核酸樣品與相同互補性核酸靶的雜交的定量水平差異。「差異雜交」是指第一種樣品的雜交水平與第二種樣品的比率不等於1.0。例如，第一種樣品與靶的雜交水平相對於第二種樣品的比率大於或小於1.0，包括大於1.7和小於0.7，大於2和小於0.5。如果在一個樣品中檢測到雜交而在另一個樣品中未檢測到，也存在差異雜交。
本文所用術語「藥物效果」表示藥物的有效性。「藥物效果」通常由已經或正在用藥物治療的患者的臨床反應測定。如果獲得預期臨床結果，例如反映本文所述肝癌的基因表達和基因表達模式改變，藥物被認為具有高度效果。藥物吸收量可用於預測患者反應。一般規律是當藥物劑量增加時患者中可見更大效果，直至達到最大預期效果。如果在達到最大點以後施用更多藥物，一般將增加副作用。
本文所用術語「有效量」表示足以降低或改善肝癌或其一種或多種症狀的進程、嚴重程度和/或持續時間、預防肝癌或其一種或多種症狀的發生、復發或發作、預防肝癌或其一種或多種症狀惡化、或增強或改善另一種治療的預防或治療作用的化合物的量。
本文所用術語「片段」對於蛋白質物質而言表示肽或多肽，其中包含另一種多肽或蛋白質的胺基酸序列中至少5個連續胺基酸、至少10個連續胺基酸、至少15個連續胺基酸、至少20個連續胺基酸、至少25個連續胺基酸、至少40個連續胺基酸、至少50個連續胺基酸、至少60個連續胺基酸、至少70個連續胺基酸、至少80個連續胺基酸、至少90個連續胺基酸、至少100個連續胺基酸、至少125個連續胺基酸、至少150個連續胺基酸、至少175個連續胺基酸、至少200個連續胺基酸或至少250個連續胺基酸的胺基酸序列。在一個具體實施方案中，蛋白質或多肽的片段保留所述蛋白質或多肽的至少一種功能。在另一個實施方案中，蛋白質或多肽的片段保留所述蛋白質或多肽的至少二、三、四或五種功能。優選地，抗體的片段保留免疫特異性結合抗原的能力。
本文所用術語「融合蛋白」表示包含第一種蛋白質或多肽或其功能片段、類似物或衍生物的胺基酸序列和異源蛋白質、多肽或肽(即不同於第一種蛋白質或其片段、類似物或衍生物的第二種蛋白質或多肽或其片段、類似物或衍生物)的胺基酸序列的多肽。在一個實施方案中，融合蛋白包含與異源蛋白質、多肽或肽融合的預防或治療劑。根據該實施方案，所述異源蛋白質、多肽或肽可以是或不是不同類型的預防或治療劑。
本文所用「基因表達模式」或「基因表達譜」指兩種或更多種本發明生物標誌物(包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有的本發明生物標誌物)的表達水平分析結果的組合模式。基因表達模式或基因表達譜可以經測定本發明生物標誌物的產物的表達而得到，並可以使用任何已知技術。例如測定本發明生物標誌物的RNA產物表達的技術包括基於PCR的方法(包括RT-PCR)和不基於PCR的方法，以及微陣列分析。為測定本發明生物標誌物的蛋白質產物，技術包括Western印跡和ELISA分析。
本文所用術語「與……雜交」或「雜交」表示與互補性核酸的序列特異性非共價結合相互作用，例如靶核酸序列與陣列上核酸成員之間的相互作用。
本文所用術語「免疫球蛋白」表示基本由免疫球蛋白基因編碼的一種或多種多肽組成的蛋白質。已知的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恆定區基因，以及數量極大的免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白「輕鏈」(約25Kd或214個胺基酸)由位於氨基端(約110個胺基酸)的可變區基因和位於羧基端的κ或λ恆定區基因編碼。相似地，全長免疫球蛋白「重鏈」(約50Kd或446個胺基酸)由位於氨基端(約116個胺基酸)的可變區基因和其它前述恆定區基因之一例如γ(編碼約330個胺基酸)編碼。
本文所用術語「組合」當涉及治療性處理時表示使用超過一種類型的治療(例如超過一種預防劑和/或治療劑)。使用術語「組合」不限制向對象使用治療的順序。第一種治療(例如第一種預防或治療劑)可以在向對象施用第二種治療(例如第二種預防或治療劑)之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同時或之後(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之後)施用。
本文所用「疾病指標」當涉及表達模式時是指疾病診斷性的表達模式，使得所述表達模式在疾病患者中比在無所述疾病的患者中明顯更經常發現(如用常規統計方法設定置信水平在最小95％進行確定)。疾病指標的表達模式優選在至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的患有所述疾病的患者中發現，而在少於10％、少於8％、少於5％、少於2.5％或少於1％的不患有所述疾病的患者中發現。「疾病指標」還指疾病診斷性的表達模式，通過使用本領域技術人員理解並且例如見商業程序如Silicon Genetics提供的那些(例如GeneSpringTM)的類型預測統計算法，與沒有疾病的個體的對照表達模式比較，使得表達模式更恰當分類到患有疾病個體的對照表達模式。
本文所用「分離的」或「純化的」當用於核酸時是指天然存在的序列已經從其正常細胞(如染色體)環境中取出或者在非天然環境下合成(如人工合成)。因此，「分離的」或「純化的」序列可以是在無細胞溶液中或在不同的細胞環境中。術語「純化的」不隱含序列僅有核苷酸存在，而是它基本無(約90-95％純)與它天然結合的非核苷酸物質，從而不同於分離的染色體。
本文所用術語「分離的」和「純化的」對於蛋白質物質(如肽、多肽、蛋白質或抗體)而言表示基本無細胞物質的、有些實施方案中基本無所來源細胞或組織的異源蛋白質物質(即汙染蛋白質)的、或當化學合成時基本無化學前體或其它化學物的蛋白質物質。短語「基本無細胞物質」包括蛋白質物質的製備物，其中蛋白質物質與分離或重組生產它的細胞的細胞組分分離。因此，基本無細胞物質的蛋白質物質包括具有少於約30％、20％、10％或5％(乾重)異源蛋白質物質(如蛋白質、多肽、肽或抗體；也稱「汙染蛋白質」)的蛋白質物質的製備物。當重組生產所述蛋白質物質時，還優選基本無培養基的，即培養基佔蛋白質製備物體積的少於約20％、10％或5％。當化學合成蛋白質物質時，優選基本無化學前體或其它化學物，即與參與合成所述蛋白質物質的化學前體或其它化學物分離。因此，除了感興趣的蛋白質物質以外，蛋白質物質的這種製備物具有少於約30％、20％、10％、5％(乾重)的化學前體或其它化學物。本文公開的蛋白質物質優選是分離的。
本文所用術語「表達水平」當涉及RNA時表示經雜交測定或如實時RT-PCR測定給定核酸的可測定的量，所述實時RT-PCR包括使用SYBR綠和TaqMan技術並且它與基因表達程度成正比。核酸的表達水平經本領域技術人員公知的方法確定。對於微陣列分析，根據本領域公知方法，用對應從一或多個個體分離的RNA的標記核酸經雜交分析測定表達水平。用於雜交的核酸標記物可以是發光標記物、酶標記物、放射性標記物、化學標記物或物理標記物。靶核酸優選用螢光分子標記物。優選的螢光標記物包括但不限於螢光素、氨基香豆素乙酸、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)、德克薩斯紅、Cyanine 3(Cy3)和Cyanine 5(Cy5)。
本文所用「配體」是特異性結合本發明生物標誌物基因之一所編碼多肽的分子。配體可以是核酸(RNA或DNA)、多肽、肽或化合物。本發明的配體可以是肽配體，如骨架肽、線性肽或環肽。在一個優選實施方案中，多肽配體是抗體。抗體可以是人抗體、嵌合抗體、重組抗體、人源化抗體、單克隆抗體或多克隆抗體。抗體可以是完整免疫球蛋白，如IgA、IgG、IgE、IgD、IgM或其亞型。抗體可以與功能性結構(如具有生物或化學功能的化合物，它可以是第二種不同多肽、治療藥物、細胞毒性劑、可檢測結構或固相支持物)偶聯。本發明的多肽配體如抗體與生物標誌物基因之一所編碼的多肽以高親和性和特異性相互作用。例如，多肽配體結合生物標誌物基因之一所編碼的多肽，其親和常數為至少107M-1，優選至少108M-1、109M-1或1010M-1。
本文所用「肝癌」表示原發性肝癌和轉移性肝癌。原發性肝癌包括開始於肝中的肝瘤或肝細胞癌(HCC)；和癌症在肝中膽管中發生的膽管瘤或膽管癌。肝癌也包括轉移性肝癌，其中來自其它器官和組織的癌細胞定位於肝中並生長為繼發性腫瘤。
「mRNA」是指與基因互補的RNA；mRNA包括蛋白質編碼區，還可以包括5』端和3』非翻譯區(UTR)。
本文所用術語「大多數」表示佔組成總數的50％(如51％、60％、或70％、或80％、或90％或直至100％)以上的數目。術語「大多數」當用於陣列時，是指與陣列的固相基質穩定結合的核酸成員總數的50％(如51％、60％、或70％、或80％、或90％或直至100％)以上。
本文所用術語「控制」(」manage」、」managing」和」management」)表示不導致治癒肝癌的治療(如預防或治療劑)對象的有益作用。在某些實施方案中，向對象施用一種或多種「控制」肝癌的治療以改善肝癌症狀和/或預防和/或阻礙腫瘤大小的增加、腫瘤擴散到整個肝臟和/或轉移到肝臟以外。
肝癌預防在本文中定義為阻礙或阻止肝癌疾病的發作。肝癌改善在本文中定義為提供肝癌的物理或生理性緩解，可以包括緩解症狀以及減輕疾病本身(如腫瘤大小減小)。肝癌治療在本文中定義為提供對抗疾病自身、疾病症狀和/或肝癌進程的醫學輔助手段。這些治療可以作為幫助緩解症狀和改善生活質量的對症治療給予。
本文所用「mRNA完整性」表示來自組織樣品或血液樣品的mRNA提取物的質量。當用本領域公知方法檢查時，例如通過RNA瓊脂糖凝膠電泳(如Ausubel et al.，John Weley Sons，Inc.，1997，Current Protocols in Molecular Biology)檢查時，具有良好完整性的mRNA提取物不顯示降解。mRNA樣品優選具有良好完整性(如少於10％、優選少於5％、更優選少於1％的mRNA被降解)，以真實代表所提取來源的組織或血液樣品的基因表達水平。
本文所用術語「非反應性的」和「難治的」描述用當前可用的肝癌治療(如預防或治療劑)處理的患者，所述當前可用的肝癌治療在臨床上不適於改善與其相關的一種或多種症狀。這些患者通常患有嚴重的、持續活動的疾病，需要其它治療以改善與肝癌相關的症狀。
本文所用「核酸」可與術語「多核苷酸」互換使用，一般表示任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，它可以是未修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA，或其任何組合。「核酸」包括但不限於單鏈和雙鏈核酸。本文所用術語「核酸」還包括含一個或多個修飾鹼基的上述DNA或RNA。因此為了穩定性或其它原因而具有修飾骨架的DNA或RNA是「核酸」。本文所用術語「核酸」包括核酸的化學、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細胞特徵性的DNA和RNA的化學形式，所述細胞例如包括簡單和複雜細胞。「核酸」或「核酸序列」還可以包括單鏈或雙鏈RNA或DNA或其任意組合的區域，並且根據本發明的一些實施方案可以包括表達序列標籤(EST)。EST是基因的表達序列的一部分(即序列的「標籤」)，通過逆轉錄mRNA一個區域製備cDNA而得到。
本文所用「核酸陣列」表示附著於支持物上的多個核酸(或「核酸成員」)，其中每個核酸成員附著到支持物上獨特的預先選定的區域。在一個實施方案中，附著到支持物表面的核酸成員是DNA。在一個優選實施方案中，附著到支持物表面的核酸成員是cDNA或寡核苷酸。在另一個優選實施方案中，附著到支持物表面的核酸成員是經聚合酶鏈式反應(PCR)合成的cDNA。本文所用術語「核酸」可與術語「多核苷酸」互換。在另一個優選實施方案中，「核酸陣列」表示附著到硝酸纖維素或用於Southern和/或Northern印跡技術的其它膜上的多個獨特的核酸。
本文所用「用於和陣列雜交的核酸樣品」定義為能通過包括互補鹼基配對相互作用的一組非共價鍵合相互作用與結合到互補序列陣列上的核酸結合的核酸。用於和陣列雜交的核酸樣品可以是與樣品中分離的基因或其部分、總RNA或mRNA對應的分離核酸序列。用於和陣列雜交的核酸樣品優選來源於人血(包括全血、裂解血、離心裂解血或外周血白細胞(PBL))。核酸樣品更優選是單鏈或雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體，來自人血，優選來自RNA或mRNA提取物。
本文所用「陣列上的核酸成員」或「核酸成員」包括固定在陣列上並能通過包括互補鹼基配對相互作用的一組非共價鍵合相互作用與核酸探針或互補序列樣品結合的核酸。本文所用核酸成員或靶可以包括天然(即A、G、C或T)或修飾鹼基(7-去氮雜鳥嘌呤核苷、肌苷等)。此外，核酸中鹼基可以通過磷酸二酯鍵以外的連接鍵而連接，只要它不幹擾雜交(即，在標準嚴謹性或選擇性雜交條件下核酸靶仍然特異性結合其互補序列)。因此，核酸成員可以是肽核酸，其中組成的鹼基通過肽鍵而不是磷酸二酯鍵被連接起來。在一個實施方案中，與陣列結合的「靶」序列的常規核酸陣列可以代表人全基因組，例如Affymetrix晶片，並且由圖1所述3個基因或基因探針中2個或更多個組成或包含它們的生物標誌物或分離的生物標誌物被施加到該常規陣列上。在另一個實施方案中，與陣列結合的序列可以是根據本發明的生物標誌物或分離的生物標誌物，並且總細胞RNA被施加到陣列上。
本文所用術語「寡核苷酸」定義為包含兩個或更多並優選超過3個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子。其確切大小依賴於很多因素，這些因素又依賴於寡核苷酸的最終功能和用途。寡核苷酸可以長約8到約1,000個核苷酸。儘管8-100個核苷酸的寡核苷酸可用於本發明，優選地寡核苷酸長度範圍是約8-約15個鹼基，長約8-約20個鹼基，長約8-約25個鹼基，長約8-約30個鹼基，長約8-約40個鹼基，或長約8-約50個鹼基。
本文所用「患者」或「個體」表示被診斷為患有肝癌的哺乳動物，並且進一步包括被診斷為患有原發性或轉移性肝癌的哺乳動物。
本文所用短語「藥學上可接受的鹽」包括但不限於酸性或鹼性基團鹽，可以用本發明方法鑑定的化合物形式存在。鹼性化合物能與多種無機和有機酸形成各種鹽。可用於製備這些鹼性化合物的藥學上可接受的酸加成鹽的酸是可以形成無毒酸加成鹽的那些，即含有藥學上可接受的陰離子的鹽，包括但不限於硫酸、檸檬酸、馬來酸、乙酸、草酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸鹽、硫酸鹽、硫氫酸鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、單寧酸鹽、泛酸鹽、氫酒石酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、gentisinate、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、glucaronate、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、穀氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和pamoate(即1，1』-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘酸))鹽。除了上述酸以外，包括氨基結構的化合物還可以與各種胺基酸形成藥學上可接受的鹽。酸性化合物能與多種藥學上可接受的陽離子形成鹼式鹽。這些鹽的實例包括鹼金屬或鹼土金屬鹽，尤其是鈣鹽、鎂鹽、鈉鹽、鋰鹽、鋅鹽、鉀鹽和鐵鹽。
本文所用「多核苷酸」包括超過8個核苷酸長的雙鏈DNA、單鏈DNA和雙鏈或單鏈RNA。術語「多核苷酸」包括任意長度的聚合物形式的核苷酸，包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，其中包含嘌呤和嘧啶鹼基、或其它天然的、化學或生化修飾的、非天然的或衍生化的核苷酸鹼基。多核苷酸的骨架可以包含通常可以在RNA或DNA中發現的糖和磷酸基團，或者修飾或取代的糖或磷酸基團。多核苷酸可以包含修飾核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中斷。
本文所用「由……編碼的多肽序列」表示如本文所定義的基因的蛋白質編碼區翻譯之後獲得的胺基酸序列。本發明每個基因的mRNA核苷酸序列用其GenBank登記號識別(見表3)，對應的多肽序列用蛋白質登記號識別(見表3)。表3中識別的GenBank登記號提供本發明每個基因的mRNA核苷酸序列內的5』UTR、蛋白質編碼區(CDS)和3』UTR的位置。當蛋白質或蛋白質片段用於免疫宿主動物時，該蛋白質的很多區域可以誘導產生抗體，這些抗體可以與蛋白質上的給定區域或三維結構特異性結合，這些區域或結構被稱為表位或抗原決定簇。本文所用「抗原性片段」表示含一個或多個表位的多肽部分。表位可以是線性的，基本包含抗原的線性序列，或者是構象性的，包含被其它序列遺傳隔離但在多肽配體的結合位點處成一體結構的序列。「抗原性片段」可以長5000、1000、500、400、300、200、100、50或25或20或10或5個胺基酸。
本文所用術語「預防」(prevent，preventing和prevention)表示通過施用根據本發明方法鑑定的一種或多種化合物或者施用這種化合物和另一種治療的組合從而防止肝癌或其一種或多種症狀的發生、復發或發作。
本文所用術語「引物」表示寡核苷酸，不管是在純化的限制性消化物中天然存在還是合成產生，當置於誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物合成的條件下，即在存在核苷酸和誘導劑如DNA聚合酶並在合適溫度和pH下時它能作為合成起點。引物可以是單鏈或雙鏈，並且必須足夠長以在誘導劑存在下引發合成預期的延伸產物。引物的確切長度依賴於很多因素，其中包括溫度、引物來源和使用方法。例如，對於診斷應用，依賴於靶序列的複雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25個或更多核苷酸，儘管它可以含有更少核苷酸。參與確定引物適當長度的因素對於本領域技術人員容易知道。
本文所用術語「探針」是指寡核苷酸及其類似物，並涉及通過與靶序列的核苷酸鹼基的氫鍵相互作用而識別多核苷酸靶序列的一系列化學物質。探針或靶序列可以是單鏈或雙鏈RNA或單鏈或雙鏈DNA或DNA與RNA鹼基的組合。探針至少長8個核苷酸，並少於全基因的長度。探針可以長10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500和長至2000個核苷酸，只要小於靶基因全長即可。探針可以包括修飾寡核苷酸，以具有可通過螢光、化學發光等檢測的標籤。探針還可以被修飾以具有可檢測標籤和淬滅分子，例如Taqman和Molecular Beacon探針。
寡核苷酸及其類似物可以是RNA或DNA，或RNA或DNA的類似物，通常稱為反義寡聚物或反義寡核苷酸。這些RNA或DNA類似物包含但不限於2』-O-烷基糖修飾，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothiate)、二硫代磷酸酯、formacetal、3』-thioformacetal、碸、氨基磺酸酯和硝基氧骨架修飾，和其中鹼基結構已被修飾的類似物。此外，寡聚物的類似物可以是下述聚合物，其中糖結構已經被修飾或替換為另一個合適的結構而得到聚合物，包括但不限於嗎啉代類似物和肽核酸(PNA)類似物(Egholm，et al.Peptide Nucleic Acids(PNA)--Oligonucleotide Analogues with anAchiral Peptide Backbone，(1992))。
探針還可以是任何寡核苷酸類似物類型與天然DNA或RNA一起或組合的混合物。同時，寡核苷酸及其類似物可以單獨使用或與一種或多種另外的寡核苷酸或其類似物組合使用。
本文所用「多個」或「成組的」表示超過兩個，例如3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、或10個或更多等。
本文所用「預先選定的區域」、「預定區域」或「獨特位置」表示基質上的局部區域，該區域是、已經是或準備是用於沉積核酸，在本文中也被稱為「選定區域」或簡單稱為「區域」。預先選定的區域可以具有任何方便的形狀，如圓形、長方形、橢圓形、楔形等。在一些實施方案中，預先選定的區域小於約1cm2，更優選小於1mm2，還更優選小於0.5mm2，在一些實施方案中小於0.1mm2。「預先選定的區域」、「預定區域」或「獨特位置」的核酸成員可以通過在區域上的位置或獨特位置確定身份(例如序列)。
本文所用術語「生物標誌物的產物」或「本發明生物標誌物的產物」表示對應於本發明生物標誌物的基因表達的RNA和/或蛋白質。對於RNA，它表示由對應於本發明生物標誌物的基因轉錄的RNA轉錄本。對於蛋白質，它表示由對應於本發明生物標誌物的基因翻譯的蛋白質。「本發明生物標誌物的RNA產物」包括mRNA轉錄本、和/或mRNA的特定剪接變體，根據本文公開的教導其表達量可以用作生物標誌物。「本發明生物標誌物的蛋白質產物」包括從本發明生物標誌物的RNA產物翻譯的蛋白質。
本文所用術語「預防劑」表示可用於預防肝癌的任何化合物。在某些實施方案中，術語「預防劑」表示在本文所述篩選測試中鑑定的化合物。在某些其它實施方案中，術語「預防劑」表示本文所述篩選測試中所鑑定化合物以外的、已知可用於或已經或當前正用於預防或阻礙肝癌或其一種或多種症狀發作、發生和/或進程的藥劑。
本文所用短語「預防有效量」表示足以導致預防肝癌或其一種或多種症狀發生、復發或發作的治療(如預防劑)的量。
本文所用術語「蛋白質」和「多肽」可互換使用，用於表示由肽鍵連接在一起的胺基酸鏈。在具體的一個實施方案中，蛋白質由通過肽鍵連接在一起的少於200、少於175、少於150、少於125、少於100、少於50、少於45、少於40、少於35、少於30、少於25、少於20、少於15、少於10或少於5個胺基酸組成。在另一個實施方案中，蛋白質由通過肽鍵連接在一起的至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500或更多個胺基酸組成。
「蛋白質編碼區」表示mRNA中編碼多肽的部分。
本文所用「參考群體」或「測試群體」表示用於形成分類符以區分肝癌和非肝癌的「對照樣品」的群體。「參考群體」或「測試群體」由多個對照樣品組成，其中一些來自用常規診斷技術診斷為患有肝癌的個體，一些來自用常規診斷技術診斷為不患有肝癌的個體。在一個優選實施方案中，「參考群體」或「測試群體」由來自患有肝癌和不患有肝癌的相等數目的個體的「對照樣品」組成。在另一個實施方案中，「參考群體」根據患有或不患有肝癌的個體的狀態以外的表型進行匹配，所述表型例如相似年齡、性別、藥物狀態等。
本文所用術語「選擇性結合」對於本發明涉及的蛋白質而言表示任意兩種肽、蛋白質、多肽和抗體的特異性相互作用，其中與任意其它的肽、蛋白質、多肽和抗體比較，相互作用優先發生在任意兩種肽、蛋白質、多肽和抗體之間。例如，當所述兩個分子是蛋白質分子時，第一個分子上的結構識別並結合第二個分子上的結構，而不是其它蛋白質。如本文所用「選擇性結合」是指分子以比它結合非特異性分子至少2倍以上的親和力結合其特異性結合伴侶，優選以至少10倍、20倍、50倍、100倍或更高親和力結合其特異性結合伴侶。
本文所用「選擇性雜交」在本發明中表示發生在本發明涉及的多核苷酸和本發明生物標誌物的RNA或蛋白質產物之間的雜交，其中所述雜交使得所述多核苷酸相對於所研究基因組中其它基因的RNA產物而言優先結合本發明生物標誌物的RNA產物。在一個優選實施方案中，「選擇性雜交」的多核苷酸以大於70％、大於80％、大於90％和最優選100％的選擇性雜交(即與其它RNA的交叉雜交小於30％、小於20％、小於10％)。本領域技術人員理解，考慮到其長度和組成，可以確定與本發明生物標誌物的RNA產物「選擇性雜交」的多核苷酸。
本文所用「特異性雜交」表示當兩個核酸序列基本互補時(在至少14-25個核苷酸長度範圍內至少約65％互補，優選至少約75％互補，更優選至少約90％互補)發生的雜交。見Kanehisa，M.，1984，Nucleic Acids Res.，12203，經引用併入本文。因此期望耐受某種程度的錯配。這種錯配可以是小的，如單、二、或三核苷酸。作為替代方案，錯配區可以包括環(loop)，環被定義為存在不間斷的四個或更多個核苷酸錯配的區域。很多因素影響兩個核酸雜交的效率和選擇性，例如陣列上核酸成員與靶核酸序列雜交的效率和選擇性。這些因素包括核酸成員長度、核苷酸序列和/或組成、雜交溫度、緩衝液組成和核酸成員需要雜交區域的位阻能力。在核酸長度與核酸退火到靶序列上的效率和準確性之間存在正相關。具體而言，較長序列比較短序列具有更高融鏈溫度(TM)，並且更不可能在給定靶序列內重複，因此最小化非特異性雜交。雜交溫度隨核酸成員退火效率反向變化。相似地，雜交混合物中有機溶劑如甲醯胺濃度隨退火效率反向變化，而雜交混合物中鹽濃度增加有助於退火。在嚴謹性退火條件下，較長的核酸比較短核酸雜交更有效，所述較短核酸對於較寬鬆條件是足夠的。
本文所用「點斑」或「附著」表示將核酸成員沉積到固相基質上形成核酸陣列使得核酸通過共價鍵、氫鍵或離子相互作用而穩定結合到固相基質上的過程。
本文所用「穩定結合」表示核酸通過共價鍵、氫鍵或離子相互作用而與固相基質穩定結合從而形成陣列，使得在陣列通常被分析的條件下，所述核酸相對於與陣列穩定結合的所有其它核酸或相對於固相基質上所有其他預先選定的區域(即在一或多步驟的雜交、洗滌和/或掃描等期間)保持其獨特的預先選定的位置。
本文所用「基質」或「支持物」當用於陣列時表示具有剛性或半剛性表面的材料。支持物可以是生物、非生物、有機、無機或這些的任意組合，存在形式為顆粒、鏈(strand)、沉澱、凝膠、薄片(sheet)、管、球、珠、容器、毛細管、墊、切片、膜、板、載片(slide)、塊(chip)等。基質經常是矽或玻璃表面、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、帶電膜如尼龍66或硝酸纖維素，或其組合。在一個優選實施方案中，支持物是玻璃。基質的至少一個表面優選是基本上平的。固相支持物優選含有活性基團，包括但不限於羧基、氨基、羥基、硫羥基等。在一個實施方案中，固相支持物可選是透明的。
本文所用「特異性雜交」表示當兩個核酸序列基本互補時(在至少14-25個核苷酸長度範圍內至少約65％互補，優選至少約75％互補，更優選至少約90％互補)發生的雜交。見Kanehisa，M.，1984，Nucleic Acids Res.，12203，經引用併入本文。因此期望耐受某種程度的錯配。這種錯配可以是小的，如單、二、或三核苷酸。作為替代方案，錯配區可以包括環(loop)，環被定義為存在不間斷的四個或更多個核苷酸錯配的區域。很多因素影響兩個核酸雜交的效率和選擇性，例如陣列上核酸成員與靶核酸序列的雜交效率和選擇性。這些因素包括核酸成員長度、核苷酸序列和/或組成、雜交溫度、緩衝液組成和核酸成員需要雜交區域的位阻能力。在核酸長度與核酸退火到靶序列上的效率和準確性之間存在正相關。具體而言，較長序列比較短序列具有更高融鏈溫度(TM)，並且更不可能在給定靶序列內重複，因此最小化隨意性雜交。雜交溫度隨核酸成員退火效率反向變化。相似地，雜交混合物中有機溶劑如甲醯胺濃度隨退火效率反向變化，而雜交混合物中鹽濃度增加有助於退火。在嚴謹性退火條件下，較長的核酸比較短核酸雜交更有效，所述較短核酸對於較寬鬆條件是足夠的。
本文所用術語「標準嚴謹性條件」是指僅在序列之間具有至少95％、優選至少97％一致性時發生雜交，其中一致性區域包含至少10個核苷酸。在一個實施方案中，序列在嚴謹性條件下將雜交，包括序列在42℃孵育過夜，隨後進行嚴謹性洗滌(0.2×SSC，65℃)。可以通過改變溫度、pH、離子強度、二價陽離子濃度、洗滌體積和時間而改變洗滌嚴謹性程度。例如，通過在探針融鏈溫度以下的不同溫度雜交可以改變雜交嚴謹性。探針的融鏈溫度可以用下式計算對於長度在14-70個核苷酸之間的寡核苷酸探針，以攝氏度表示的融鏈溫度(Tm)可以用下式計算Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C比例)-(600/N)，其中N是寡核苷酸的長度。
例如，在含約1M的Na+濃度的雜交緩衝液中，雜交溫度可以以5℃間隔從68℃降低到42℃。雜交以後，可以用2×SSC，0.5％SDS在雜交溫度下洗膜。這些條件在50℃以上被認為是「中等嚴謹性」條件，在50℃以下被認為是「低嚴謹性」條件。「中等嚴謹性」雜交條件的具體實例是在55℃進行上述雜交的條件。「低嚴謹性」雜交條件的具體實例是在45℃進行上述雜交的條件。
如果在含甲醯胺的溶液中進行雜交，融鏈溫度可以用以下方程式計算Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C比例)-(0.63％甲醯胺)-(600/N)，其中N是寡核苷酸的長度。
例如，可以在含甲醯胺的緩衝液如6×SSC在42℃的溫度下進行雜交。在此情況下，雜交緩衝液中甲醯胺濃度可以以5％間隔從50％減少到0％以鑑定與探針具有遞減水平同源性的克隆。雜交以後，可以用6×SSC，0.5％SDS在50℃下洗膜。這些條件在25％甲醯胺以上時被認為是「中等嚴謹性」條件，在25％甲醯胺以下時被認為是「低嚴謹性」條件。「中等嚴謹性」雜交條件的具體實例是用30％甲醯胺進行上述雜交的條件。「低嚴謹性」雜交條件的具體實例是用10％甲醯胺進行上述雜交的條件。
本文所用術語「顯著匹配」當用於核酸序列時，是指使用本領公知的比較方法，兩種核酸序列表現出至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、優選至少90％一致性(即Altschul，S.F.et al.，1997，Nucl.Acids Res.，253389-3402；Schffer，A.A.et al.，1999，Bioinformatics 151000-1011)。本文所述「顯著匹配」包括非連續或散布的相同核苷酸，只要所述序列在使用本領域常規比對方法進行最大比對時表現出至少65％、優選至少70％、至少75％、至少80％、至少85％和優選至少90％一致性即可。
本文所用術語「協同」表示用本文所述方法之一鑑定的化合物和另一種治療(如劑)的組合比所述治療的疊加作用更有效。所述其它治療優選已經或當前正在預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。治療(如預防或治療劑)組合的協同作用允許施用更低劑量的一種或多種治療和/或所述治療向肝癌患者更低頻率給藥。使用更低劑量治療(如預防或治療劑)和/或更低頻率施用所述治療的能力降低與向患者施用所述藥劑相關的毒性，而不降低所述治療預防、治療、控制或改善肝癌的效果。此外，協同作用可以導致提高肝癌預防、治療、控制或改善的治療(如藥劑)效果。最後，治療(如預防或治療劑)組合的協同作用可以避免或降低與單獨使用治療相關的不利或不期望的副作用。
本文所用「治療劑」或「藥劑」表示增加或降低多核苷酸序列表達的化合物，與正常個體相比，所述多核苷酸序列在患有肝癌的個體來源的組織或血液樣品中差異表達。本發明提供這樣的「治療劑」，其在施用於患者時，1)預防肝癌發作；2)減輕、推遲或消除肝癌的惡化和/或轉移和/或3)恢復患者的一種或多種疾病指示性核酸的一種或多種表達譜為與正常個體更相似的譜。
本文所用術語「治療劑」表示能用於治療、控制或緩解肝癌或其一種或多種症狀的任意化合物。在一個具體實施方案中，術語「治療劑」表示增加或降低肝癌細胞或細胞系中差異表達的多核苷酸序列表達的化合物。本發明提供這樣的「治療劑」，其在施用於患者時，1)預防肝癌發作；2)減輕、推遲或消除肝癌症狀；3)減緩、推遲或消除腫瘤生長；和/或4)恢復患者的一種或多種疾病指示性核酸的一種或多種表達譜為與正常個體更相似的譜。在某些實施方案中，術語「治療劑」表示在本文所述篩選測試中鑑定的化合物。在另一些實施方案中，術語「治療劑」表示本文所述篩選測試中所鑑定化合物以外的、已知可用於或已經或當前正用於治療、控制或緩解肝癌或其一種或多種症狀的藥劑。
本文所用短語「治療有效量」表示足以導致緩解肝癌或其一種或多種症狀、預防肝癌惡化、引起肝癌消退或增強或提高另一種治療(如治療劑)的治療效果的治療(如治療劑)的量。在一個具體實施方案中，治療有效量表示降低肝癌細胞的細胞增殖的治療(如治療劑)的量。相對於對照如磷酸鹽緩衝液(「PBS」)，治療有效量的治療(如治療劑)優選降低細胞增殖至少5％、優選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
本文所用術語「治療」(treat，treatment and treating)表示通過施用一種或多種根據本發明方法鑑定的化合物或者一種或多種根據本發明方法鑑定的化合物與另一種治療的組合，從而降低或緩解肝癌或其一種或多種症狀的進程、嚴重性和/或時間。
本文所用「組織核酸樣品」表示來源於組織、優選肝組織、更優選癌性肝組織的核酸。組織核酸樣品優選是總RNA、mRNA或是對應RNA的核酸，例如cDNA。組織核酸樣品還可以包括來源於總RNA、mRNA或cDNA的PCR產物。
5.2小結本發明的實施部分利用分子生物學、微生物學和重組DNA技術的常規技術，它們在本領域技術人員的能力範圍內。這些技術在文獻中被全面解釋。例如見Sambrook，Fritsch Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harnes S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；和叢書Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Short Protocols InMolecular Biology，(Ausubel et al.，ed.，1995)。本文以上和以下提及的所有專利、專利申請和公開出版物的全部內容經引用併入本文。
本文公開的發明從血中鑑定可用於診斷肝癌的生物標誌物和生物標誌物組合。為了使用這些生物標誌物，本發明教導測定這些生物標誌物的RNA和/或蛋白質產物的表達。本發明進一步公開了與本發明生物標誌物的RNA產物特異性和/或選擇性雜交從而能測定所述生物標誌物的RNA產物表達的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產物、合成DNA、合成RNA或修飾核苷酸的其它組合。本發明還公開了與本發明生物標誌物的蛋白質產物特異性和/或選擇性雜交從而能測定本發明本發明蛋白質產物表達的蛋白質、肽、抗體、配體，還公開了含有這些多肽和/或多核苷酸的試劑盒。
通過使用特異性和/或選擇性針對本發明生物標誌物的RNA產物的那些多核苷酸定量RNA產物的表達，可以測定本發明生物標誌物和生物標誌物組合的RNA產物的表達。在本發明的具體實施方案中，特異性和/或選擇性針對所述RNA產物的多核苷酸是探針或引物。在一個實施方案中，這些多核苷酸是能點斑到陣列上從而測定待診斷個體血中RNA的核酸探針形式。在另一個實施方案中，可使用商品陣列測定所述RNA產物的表達，本發明教導分析哪種基因組合。在另一個實施方案中，特異性和/或選擇性針對本發明生物標誌物的RNA產物的多核苷酸以探針和引物形式使用於如定量實時RT PCR的技術中，其中使用例如SYBRGreen，或使用TaqMan或Molecular Beacon技術，其中所用多核苷酸以正向引物、反向引物、TaqMan標記探針或Molecular Beacon標記探針的形式使用。在一個具體實施方案中，可以將測定本發明RNA產物的表達水平產生的結果輸入用於鑑定如本文公開用於確診的生物標誌物組合的模型中。在一個優選實施方案中，使用相同方法產生表達數據，所述表達數據用於產生數學模型，該模型如用於診斷測試個體。
本發明還涉及本文公開的並且本領域技術人員將知道的蛋白質或多肽用於測定本發明生物標誌物的蛋白質產物的用途。然後可利用本領域技術人員已知的技術(例如，諸如Western印跡、免疫沉澱、ELISA、蛋白質微陣列分析等的技術)測定對應本發明生物標誌物的蛋白質產物的水平。本領域技術人員將會明白，測定本發明生物標誌物的蛋白質產物的表達水平要求一種蛋白質，這種蛋白質特異性和/或選擇性結合到對應本發明每種生物標誌物的蛋白質產物的一種或多種。然後可以將本發明生物標誌物的蛋白質產物的表達水平的代表性數據輸入模型，所述模型用於鑑定所述組合以確定所述模型定義的診斷。在一個優選實施方案中，使用相同方法產生表達數據，所述表達數據用於產生數學模型，該模型如用於診斷測試個體。
本發明還涉及蛋白質或多肽與多核苷酸組合用於測定本發明生物標誌物的一種或多種產物的用途。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與至少兩種本發明生物標誌物選擇性雜交，其中所述生物標誌物選自表1中列出的以下基因β-澱粉樣蛋白(A4)前體樣蛋白2(APLP2)；BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；補體成分5(C5)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；組織蛋白酶B(CTSB)；cortactin(CTTN)；ficolin(含有膠原/纖維蛋白原結構域)1(FCN1)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；IGF-II mRNA結合蛋白3(IMP-3)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；2』，5』-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)；2』-5』-寡腺苷酸合成酶3(OAS3)；RAR相關孤兒受體A(RORA)；相關的RAS病毒(r-ras)癌基因同源物2(RRAS2)；α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))；人絲氨酸蘇氨酸激酶17b(凋亡誘導型)(STK17B)；轉錄因子EC(TFEC)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，其中所述組合物用於測定所述生物標誌物的表達水平。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸選擇性結合到至少兩種生物標誌物的RNA產物上，其中所述生物標誌物選自表1中列出的以下基因β-澱粉樣蛋白(A4)前體樣蛋白2(APLP2)；BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；補體成分5(C5)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；組織蛋白酶B(CTSB)；cortactin(CTTN)；ficolin(含有膠原/纖維蛋白原結構域)1(FCN1)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；IGF-II mRNA結合蛋白3(IMP-3)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；2』，5』-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)；2』-5』-寡腺苷酸合成酶3(OAS3)；RAR相關孤兒受體A(RORA)；相關的RAS病毒(r-ras)癌基因同源物2(RRAS2)；α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))；人絲氨酸蘇氨酸激酶17b(凋亡誘導型)(STK17B)；轉錄因子EC(TFEC)。在一個方面中，所述組合物包含用於定量RT-PCR(QRT-PCR)的多核苷酸。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述蛋白質選擇性結合到至少兩種生物標誌物的蛋白質產物上，其中所述生物標誌物選自表1中列出的以下基因β-澱粉樣蛋白(A4)前體樣蛋白2(APLP2)；BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；補體成分5(C5)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；組織蛋白酶B(CTSB)；cortactin(CTTN)；ficolin(含有膠原/纖維蛋白原結構域)1(FCN1)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；IGF-II mRNA結合蛋白3(IMP-3)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；2』，5』-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)；2』-5』-寡腺苷酸合成酶3(OAS3)；RAR相關孤兒受體A(RORA)；相關的RAS病毒(r-ras)癌基因同源物2(RRAS2)；α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))；人絲氨酸蘇氨酸激酶17b(凋亡誘導型)(STK17B)；轉錄因子EC(TFEC)。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸選擇性結合到至少兩種生物標誌物上，其中所述生物標誌物選自表2中列出的以下基因BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；或α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述蛋白質選擇性結合到生物標誌物的蛋白質產物上，其中所述生物標誌物選自表2中列出的以下基因BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；或α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))。
本發明還涉及含有選擇性結合到生物標誌物的RNA產物上的分離多核苷酸集合的組合物，其中所述生物標誌物選自表2中列出的以下基因BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；或α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸選擇性結合到至少兩種生物標誌物的RNA產物上，其中所述RNA產物選自表3中列出的RNA轉錄本。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸選擇性結合到至少兩種生物標誌物的RNA產物上，其中所述RNA產物選自表4中列出的RNA轉錄本。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述蛋白質選擇性結合到至少兩種生物標誌物的蛋白質產物上，其中所述蛋白質產物選自表3中列出的RNA轉錄本。
本發明還涉及含有兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述蛋白質選擇性結合到至少兩種生物標誌物的蛋白質產物上，其中所述蛋白質產物選自表4中列出的RNA轉錄本。
本發明還涉及本發明任一種組合物的實施方案，其中所提到的分離蛋白質是配體。本發明還涉及本發明任一種組合物的實施方案，其中所提到的分離蛋白質是抗體的配體。本發明還涉及本發明任一種組合物的實施方案，其中所提到的分離蛋白質是單克隆抗體的配體。
本發明還涉及本發明任一種組合物的實施方案，其中所提到的分離寡核苷酸是單鏈或雙鏈RNA。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，其中步驟b)的比較中檢測到所述一種或多種RNA轉錄本的每種的差異表達是步驟a)的個體中肝癌的指標。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表2的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，其中步驟b)的比較中檢測到所述一種或多種RNA轉錄本的每種的相同水平是步驟a)的個體中癌症的指標。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，c)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，d)確定步驟a)的所述一種或多種RNA轉錄本的水平是否相對於步驟c)的所述轉錄本的水平而歸類於步驟b)中所述轉錄本的水平，其中所述確定是步驟a)的所述個體患有肝癌的指標。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，c)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，d)確定步驟a)的所述一種或多種RNA轉錄本的水平是否相對於步驟b)的所述轉錄本的水平而歸類於步驟c)中所述轉錄本的水平，其中所述確定是步驟a)的所述個體不患有肝癌的指標。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)用步驟a)的結果與分類符組合以確定對於肝癌的診斷。
本發明還涉及所提及血樣由全血組成的剛公開方法。本發明還涉及所提及血樣由一滴血組成的剛公開方法。本發明還涉及所提及血樣由裂解血組成的剛公開方法。
本發明也涉及下述特徵的剛公開方法，其中具有還包括從所述血樣分離RNA的步驟的步驟。
本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中確定所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平的所提及步驟包括定量RT-PCR(QRT-PCR)，其中所述一種或多種轉錄本來自以上所公開方法的步驟a)和/或步驟b)。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提及的QRT-PCR使用與所述一種或多種轉錄本或其互補物雜交的引物，其中所述一種或多種轉錄本來自以上公開方法的步驟a)和/或步驟b)。本發明還涉及所提及引物長15-25個核苷酸的本文所公開方法。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的確定所述一種或多種轉錄本的每種的水平的步驟包括使對應於所述一種或多種轉錄本的第一組分離核酸分子與包含第二組分離核酸分子的陣列雜交。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的第一組分離核酸分子包括RNA、DNA、cDNA、PCR產物或EST。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的陣列包含多種分離核酸分子，所述分離核酸分子包括RNA、DNA、cDNA、PCR產物或EST。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中多提到的所述陣列上的第二組分離核酸分子包括對應於表1的一種或多種生物標誌物的多核苷酸。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的所述陣列上的第二字分離核酸分子包括對應於表2的一種或多種生物標誌物的多核苷酸。
本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的所述陣列上的第二組分離核酸分子包括對應於表3的一種或多種RNA產物的多核苷酸。本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的所述陣列上的第二組分離核酸分子包括對應於表4的一種或多種RNA產物的多核苷酸。
本發明還涉及診斷或預測肝癌的試劑盒，其包含a)兩種生物標誌物特異性引發物，設計用於產生與選自表1的生物標誌物互補的雙鏈DNA；其中所述第一種引發物含有可以選擇性雜交到與所述生物標誌物互補的RNA、cDNA或EST上的序列，以產生延伸產物，所述第二種引發物能選擇性與所述延伸產物雜交；
b)具有逆轉錄酶活性的酶，c)具有熱穩定的DNA聚合酶活性的酶，和d)標記物質；其中所述引物用於檢測測試對象中所述生物標誌物的定量表達水平。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質由表1列出的一種或多種生物標誌物編碼，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體所得血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，其中步驟b)中的比較中檢測到所述一種或多種蛋白質的每種的水平的差異是步驟a)個體中肝癌的指標。
本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質由表1列出的一種或多種生物標誌物編碼，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體所得血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，其中步驟b)中的比較中檢測到所述一種或多種蛋白質的每種的相同水平是步驟a)個體中肝癌的指標。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質由表1列出的一種或多種生物標誌物編碼，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體所得血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，c)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體所得血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，d)確定步驟a)的所述一種或多種蛋白質的水平是否相對於步驟c)中所述蛋白質的水平而言歸類於步驟b)中所述蛋白質的水平，其中所述確定是步驟a)中所述個體患有肝癌的指標。
本發明還涉及診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質對應於表1列出的一種或多種生物標誌物，和b)使用步驟a)的結果與分類符組合以確定關於肝癌的診斷。
本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的確定所述一種或多種蛋白質的每種的水平的步驟包括使用一種或多種抗體，其中所述一種或多種抗體的每種對表1列出的生物標誌物的蛋白質產物特異。
本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，其中所提到的一種或多種抗體選自單克隆抗體、fv.scfv、dab、fd、fab和fab』2。
本發明還涉及篩選調節表1列出的生物標誌物的一種或多種產物的水平的試劑的方法，包括使表達所述產物的細胞與所述試劑接觸，其中相對於未接觸所述試劑的相同細胞檢測到所述產物的水平改變，指示所述化合物調節所述一種或多種產物的水平。
本發明還涉及所述肝癌生物標誌物基因的所提及產物是蛋白質的剛公開方法。
本發明還涉及所述肝癌生物標誌物的所提及產物是RNA轉錄本的剛公開方法。
本發明還涉及篩選與肝癌特異性相關的一種或多種SNP的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)分析個體群體內每個個體的DNA，以確定在對應於圖3中所鑑定SNP位置的位置上所述群體的每個個體的DNA的序列，其中所述群體包含兩個亞組，第一亞組診斷患有肝癌，所述第二亞組診斷為不患有肝癌。
(b)鑑定在所述第一亞組和所述第二亞組之間變化的步驟(a)中分析的DNA序列，其中所鑑定的那些DNA序列被確認是與肝癌相關的SNP。
(c)在表1列出的生物標誌物的一種或多種產物的調節水平之間進行區分，包括使表達所述產物的細胞與所述試劑接觸，其中相對於未接觸所述試劑的相同細胞檢測到所述產物水平的改變，指示所述化合物調節所述一種或多種產物的水平。
本發明還涉及產生用於診斷肝癌的分類符的方法，所述方法包括(a)測定訓練群體中表1鑑定的生物標誌物的產物的表達水平，其中所述訓練群體包括兩個亞組，第一亞組診斷為患有肝癌，而所述第二亞組診斷為不患有肝癌。
(b)將一種或多種數學模型應用於步驟(a)的表達水平，以產生區分所述第一亞組和所述第二亞組的一種或多種分類符。
本發明還涉及權利要求47的方法，進一步包括評價步驟(b)的一種或多種所述分類符正確表徵訓練群體中每個個體的分類能力。
本發明還涉及具有下列特徵的剛公開方法，它進一步包括評價步驟(b)的一種或多種所述分類符正確表徵不是訓練群體的群體的一個或多個個體的分類能力。
5.3用於本發明的樣品除非本文中另外指明，從任何對象獲得的血樣可以根據本發明方法使用。可以從中獲得這種樣品並根據本發明方法使用這些樣品的對象的實例包括但不限於無症狀的對象、呈現或表現肝癌的1、2、3、4個或更多個症狀的對象、臨床診斷為患有肝癌的對象、易患肝癌的對象(如患有肝癌家族史的對象、患有肝癌遺傳易感性的對象、懷疑患有肝癌的對象、正接受肝癌治療的對象、患有肝癌和至少一種其它疾病的對象(如具有2、3、4、5種或更多疾病的對象)、沒有正接受肝癌治療的對象、醫學從業者(如醫生)確定為健康或無肝癌的對象(即正常)、已治癒肝癌的對象、正控制其肝癌的對象和未診斷為肝癌的對象。
在進一步的實施方案中，可從中獲得樣品的對象是測試個體，其中不知道該人是否患有肝癌，和/或如果有的話，不知道測試個體可能患有哪個階段的肝癌。
5.3.1血在本發明的一個方面中，根據本領域公知的方法從對象中獲取血樣。血樣可以從對象獲得，例如患有肝癌或不患有肝癌的對象。在一些實施方案中，從對象皮膚的簡單針刺收集血滴。可以用本領域技術人員已知的技術，尤其是已知的採血方法，從對象的任何身體部位(如指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和頸)取血。
採血量將根據採血部位、本發明方法需要的量和對象的舒適性而變化。然而，本發明一個實施方案的優點是實施本發明方法所需要的血量可以很小，使得不需要更侵入性方法獲得樣品。例如，在一些實施方案中，全部需要量是一滴血。這滴血例如可以從簡單的針刺獲得。在一些實施方案中，收集任意量的血足以檢測表1所列的一、二、三、四、五、十、12、15、20個或更多個基因的表達。如此，在一些實施方案中，採血量是1μl或更少、0.5μl或更少、0.1μl或更少或0.01μl或更少。然而本發明不限於這些實施方案。在一些實施方案中可以獲得更多血，並且在一些實施方案中，更多血可用於實施本發明的方法。如此，在多種具體的實施方案中，從對象收集0.001ml、0.005ml、0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.5ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml或更多血。在另一個實施方案中，從對象收集0.001ml-15ml、0.01ml-10ml、0.1ml-10ml、0.1ml-5ml、1ml-5ml血。
在本發明的一些實施方案中，血保存於K3/EDTA管中。在另一個實施方案中，可以使用含穩定劑的血保存管，如公開於美國專利No.6,617,170(經引用併入本文)。在另一個實施方案中，可使用一個Qiagen/BD公司PreAnalytiX提供的PAXgeneTM血RNA系統收集血。在另一個實施方案中，可以使用由Applied Biosystems提供的TempusTM血RNA收集管。TempusTM收集管提供含RNA穩定劑的密閉真空塑料管用於全血收集。
收集的血優選立即使用，或在1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時以內使用，或任選地根據本發明方法在使用前保存於如4℃或-20℃的溫度。在一些實施方案中，一部分血樣根據本發明方法在第一時間使用，而一個或多個剩餘部分的血樣保存一段時間供以後使用。對於更長期的保存，可以使用本領域公知的保存方法，如保存於冷凍溫度(如低於-60℃)。在一些實施方案中，除了保存血以外或者代替血保存，根據本領域已知方法保存分離核酸或蛋白質一段時間供以後使用。
在一個方面，根據本領域公知的採血方法從個體取全血。全血包括可直接使用的血，並包括已經除去血清或血漿並且已經根據本領域公知的方法(例如優選在300-800×g溫和離心5-10分鐘)從剩餘血樣中分離RNA或mRNA的血。在一個具體的實施方案中，從對象獲取的全血(即未分級血)與裂解緩衝液(如裂解緩衝液(1L)0.6g EDTA；1.0g KHCO2，8.2g NH4Cl，用NaOH調節到pH7.4)混合，離心樣品並保留細胞沉澱，根據本領域公知的方法提取RNA或mRNA(「裂解血」)(例如見Sambrook et al.)。優選使用未分級全血，因為它避免了耗費成本和時間的分離血內細胞類型的步驟(Kimoto，1998，Mol.Gen.Genet 258233-239；Chelly J et al.，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 862617-2621；Chelly J et al.，1988，Nature 333858-860)。
在本發明的一些實施方案中，從對象收集的全血進行分級(即分離成成分)。在本發明的具體實施方案中，用本領域已知技術從收集自對象的全血分離血細胞。例如，可以對從對象收集的血進行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度離心。這種離心將紅細胞(血紅細胞)與各種類型的有核細胞和血漿分離開。具體而言，Ficoll-Hypaque梯度離心可用於分離外周血白細胞(PBL)，它們可用於根據本發明的方法。
通過實例而非限制，可以如下獲得巨噬細胞。通過注射器取血接著經Ficoll-Hypaque梯度離心，從對象的外周血分離單核細胞。用對象自己的血清或用AB+人血清預包被組織培養皿並在37℃孵育1小時。吸棄非貼壁細胞。向培養皿中存留的貼壁細胞加入含1mM EDTA的冷(4℃)磷酸鹽緩衝液，將培養皿在室溫保持15分鐘。收穫細胞，用RPMI緩衝液洗滌，並重懸於RPMI緩衝液中。通過在37℃與巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)一起孵育可以獲得更多數量的巨噬細胞。可以通過偶聯親合化合物到這種分子上標記抗巨噬細胞特異性表面標誌物如Mac-1的抗體，從而促進檢測和分離巨噬細胞。可以使用的親合化合物包括但不限於生物素、光生物素、螢光素異硫氰酸酯(FITC)或藻紅蛋白(PE)或本領域已知的其它化合物。然後用本領域已知技術，例如但不限於各種細胞分選方法、親合層析和淘選(panning)，將保留標記抗體的細胞與不結合這種抗體的細胞分離開。
可以用螢光激活細胞分選儀(FACS)分選血細胞。螢光激活細胞分選(FACS)是已知的分離顆粒物包括細胞的方法，它基於顆粒物的螢光特性。例如見Kamarch，1987，Methods Enzymol 151150-165。雷射激發單個顆粒上的螢光基團導致小電荷，這允許從混合物中電磁分離陽性和陰性顆粒。用螢光物質如FITC或藻紅蛋白標記用於檢測特定血細胞的細胞表面上存在的血細胞抗原決定簇的抗體或配體。細胞與螢光標記的抗體或配體充分孵育一段時間，使得標記抗體或配體與細胞結合。使細胞通過細胞分選儀，使得感興趣的細胞與其它細胞分離開。FACS分選的顆粒可直接存放於微滴定板的單個孔中以促進分離。
在本發明的一些實施方案中也可以使用磁珠分離血細胞。例如，可以用磁性激活細胞分選(MACS)技術分選血細胞，這是一種基於顆粒結合磁珠(0.5-100m直徑)的能力分離顆粒的方法。可以對磁性微球進行多種有用的修飾，包括共價添加特異性識別細胞-固相表面分子或半抗原的抗體。然後施加磁場，以物理操作選擇的磁珠。在一個具體實施方案中，抗血細胞表面標誌物的抗體與磁珠偶聯。然後將磁珠與血細胞培養物混合以使之結合。再將細胞通過磁場以分離具有感興趣的血細胞表面標誌物的細胞。然後可以分離這些細胞。
在一些實施方案中，培養皿表面可以用抗體包被，並用稱為淘選的方法分離血細胞。不同的皿可以用特異性針對特定血細胞的抗體包被。首先將細胞加入包被感興趣的血細胞特異性抗體的培養皿中。徹底漂洗後，保持結合於皿上的細胞將是表達感興趣的血細胞標誌物的細胞。細胞表面抗原決定簇或標誌物的實例包括但不限於T淋巴細胞和自然殺傷細胞的CD2、T淋巴細胞的CD3、白細胞的CD11a、T淋巴細胞的CD28、B淋巴細胞的CD19、B淋巴細胞的CD20、B淋巴細胞的CD21、B淋巴細胞的CD22、B淋巴細胞的CD23、白細胞的CD29、單核細胞的CD14、血小板的CD41、血小板的CD61、粒細胞的CD66、粒細胞的CD67和單核細胞與巨噬細胞的CD68。
全血可以分離成諸如白細胞、血小板、紅細胞等的細胞類型，這些細胞類型可用於根據本發明的方法。白細胞可以用標準技術進一步分成粒細胞和無粒細胞，這些細胞可用於根據本發明的方法。粒細胞可以用標準技術分成諸如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞的細胞類型，這些細胞可用於根據本發明的方法。無粒細胞可以用標準技術分成淋巴細胞(如T淋巴細胞和B淋巴細胞)和單核細胞，這些細胞可用於根據本發明的方法。用標準技術可以將T淋巴細胞和B淋巴細胞分開，並將輔助性T細胞和細胞毒性T細胞分開，這些細胞可用於根據本發明的方法。可以在用於本發明方法之前用標準技術冷凍分離的血細胞(如白細胞)。
根據本發明可用的血樣的量應足以檢測根據本發明的一種或多種核酸或胺基酸序列。在一個具體實施方案中，根據本發明可用的血樣的量為1μl-100ml，優選10μl-50ml，更優選10μl-25ml，最優選10μl-1ml。
在本發明的一個方面中，從個體分離RNA以測定本發明的生物標誌物的RNA產物。從診斷患有肝癌的個體、不患有肝癌的個體或測試個體的血樣中分離RNA。
優選用以下方案從血中分離RNA。按3份裂解緩衝液比1份血的比例向血樣中加入裂解緩衝液(裂解緩衝液(1L)0.6g EDTA；1.0g KHCO2，8.2g NH4Cl，用NaOH調節到pH7.4)。將樣品混合併在冰上放置5-10分鐘直至透明。裂解後樣品在4℃於1000rpm離心10分鐘，並吸出上清液。將沉澱重懸於5mL裂解緩衝液，並再次在4℃於1000rpm離心10分鐘。按每10ml起始血樣約6ml TRIzol(GIBCO/BRL)的比例用TRIzol勻漿沉澱細胞並充分振蕩。樣品在室溫放置5分鐘。用1.2ml氯仿/1ml TRIzol提取RNA。樣品在4℃於12,000xg離心5分鐘並收集上層。按0.5ml/1ml TRIzol的比例向上層中加入異丙醇。樣品在-20℃放置過夜或在-20℃放置1小時。根據已知方法沉澱RNA，空氣乾燥RNA沉澱，並將沉澱重懸於DEPC處理的ddH2O中。也可以將RNA樣品保存於75％乙醇中，這樣的樣品在室溫下穩定以供運輸。
可以通過260/280nm吸光度和瓊脂糖凝膠電泳隨後在紫外光下檢查來評價RNA的純度和完整性。優選用更靈敏的技術如Agilent 2100 Bioanalyzer 6000 RNA NanoChip評價RNA完整性。
5.5本發明的生物標誌物在一個方面中，本發明提供生物標誌物和生物標誌物組合，其中所述生物標誌物的產物表達水平的測定是存在肝癌的指標。
表1提供本發明生物標誌物的基因名稱和相關locus link ID的列表，其中生物標誌物的表達水平的量，或者單獨或者組合，可用於診斷個體是否患有肝癌。
表1
表2表示本發明生物標誌物的一個選集，並根據其名稱、Hugo基因名稱和locus linkID識別這些基因。
表2
本領域技術人員將會理解，locus link ID可用於確定對應本發明生物標誌物的所有RNA轉錄本和所有蛋白質的序列。
在本發明的一個實施方案中，表3提供對應本發明生物標誌物的RNA產物的序列的選集，並且所述序列可使用本領域技術人員已知的技術用於測定本發明生物標誌物的表達水平。在本發明的一個實施方案中，表3還提供對應本發明生物標誌物的蛋白質的序列，所述序列可用於測定本發明生物標誌物的表達水平。
表3
表4表示在一個實施方案中對應於表2列出的本發明生物標誌物的mRNA轉錄本和蛋白質的登記號。
表4
本發明因此涉及本領域技術人員已知的那些方法用於為上列每個目的而測定這些生物標誌物和生物標誌物組合的表達的用途。
5.6生物標誌物的組合在一個實施方案中，本發明的生物標誌物的組合包括表1列出的生物標誌物中2、3、4、5、6、7、8、10、12個或全部的任意組合。例如，n個基因的子集m的可能組合的數目描述於Feller，Intro to Probability Theory，Third Edition，volume 1，1968，ed.J.Wiley，使用以下通式m！/(n)！(m-n)！
在一個實施方案中，其中n是2，m是10，有10！＝10×9×8×7×6×5×4×3×2×12！(10-2)！(2×1)(8×7×6×5×4×3×2×1)＝3,628,800/80640＝45個獨特的兩基因組合。測定這些兩基因組合的每種的基因表達可以獨立地用於確定患者是否有肝癌。在m是10、n是3的另一個實施方案中，有10！/3！(10-3)！個獨特的三基因組合。這些獨特的三基因組合的每一個可以獨立地用作確定患者是否患有肝癌的模型。
在本發明的另一個實施方案中，本發明生物標誌物的組合包括選自表1的列表的生物標誌物的任意組合。在本發明的另一個實施方案中，生物標誌物組合包括選自表2列表的生物標誌物的任意組合。在本發明的另一個實施方案中，生物標誌物組合包括選自圖1列表的生物標誌物的任意組合。
5.7用數學模型鑑定和評價生物標誌物組合在本發明的一個方面中，我們已經發現鑑定和評價組合區分患有肝癌的患者和不患有肝癌的患者的能力的手段。
為了鑑定生物標誌物的組合，使用數學模型生成「分類符」用於區分肝癌和非肝癌。輸入數學模型的數據可以是代表待評價生物標誌物的產物表達水平的任何數據。用本發明的數學模型生成的分類符有助於鑑定特別有用的生物標誌物組合以及應用於組合內每種生物標誌物的權重(weighting)。這些分類符基於參考群體生成，並且設計用來和開發該分類符的數學模型一起使用以區分兩種表型組。
根據本發明可用的數學模型包括使用有監督和無監督學習的模型。在本發明的一個優選實施方案中，所選數學模型使用有監督學習與「訓練群體」一起來評價本發明的每種可能的生物標誌物組合。在本發明的一個實施方案中，所用數學模型選自以下回歸模型、邏輯回歸模型、神經網絡、聚類模型、主成分分析、最近相鄰分類符分析、線性判別分析、二次判別分析、支持向量機、決策樹、遺傳算法、使用bagging的分類符優化、使用boosting的分類符優化、使用隨機子空間方法的分類符優化、投影追蹤(projection pursuit)和加權投票。在一個實施方案中，使用邏輯回歸模型。在另一個實施方案中，使用神經網絡模型。在又一實施方案中，可以組合使用數學模型。
數學模型的輸出是分類符；並且可以通過確定分類符正確判斷每個個體為有或無肝癌的能力進行評價。在一個優選實施方案中，用於獲得分類符的訓練群體中個體與用於測試分類符的訓練群體中個體不同。本領域技術人員將理解，這允許評價每個分類符正確診斷個體患有或不患有肝癌的能力。
所得分類符可用於診斷未知或測試個體患有或不患有肝癌。在本發明的一個實施方案中，診斷肝癌的答案可以是非確定性的答案。
在本發明的一個優選實施方案中，用以下一種或多種方法評價分類符交叉驗證、留一交叉驗證(leave one out cross validation)、n-倍交叉驗證、用標準統計學方法和公開的摺疊刀分析。在本發明的一個優選實施方案中，評價每個分類符正確表徵不用於產生分類符的訓練群體中個體的能力。
在一個實施方案中，用於評價分類符正確表徵訓練群體中每個個體的能力的方法是評價分類符的靈敏度(TPF、真陽性分數)和1-特異性(TNF，真陰性分數)的方法。在一個優選實施方案中，用於測試分類符的方法是接收器工作特性(receiveroperating characteristic)(「ROC」)，它提供評價所生成分類符的診斷結果靈敏度和特異性的幾個參數。在一個特別優選的實施方案中，ROC面積(曲線下的面積)用於評價方程。在一個優選實施方案中，ROC面積大於0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，最優選1.0。完美的ROC面積評分1.0指示分類符具有100％靈敏度和100％特異性。
本領域技術人員將會理解，數學模型鑑定的分類符的實用性依賴於用於產生輸入模型的數據的群體中個體的表型。
5.7.1輸入數學模型的群體用於輸入的群體應該如此選擇，使得導致統計學顯著的結果性生物標誌物組合。在一些實施方案中，參考或訓練群體包括10-30個對象。在另一個實施方案中，訓練群體含有30-50個對象。在另外的實施方案中，參考群體包括2個或更多個群體，其中每個群體含有50-100、100-500、500-1000或超過1000個對象。訓練群體優選包括大致相等數目的患有肝癌和不患有肝癌的個體。為了表徵個體群體為患有肝癌或不患有肝癌，可以使用任何傳統的肝癌診斷方法。在一個優選實施方案中，除了患有或不患有肝癌的表形特徵以外，用於訓練組的兩個群體的表形特徵儘可能相似。在另一個優選實施方案中，兩個群體是年齡和性別匹配的。
5.7.2用於輸入數學模型以鑑定診斷分類符的數據輸入數學模型的數據是代表本發明生物標誌物的產物的基因表達水平的數據。因此所述數據是本發明生物標誌物的產物包括mRNA和/或蛋白質表達的測定值。
在本發明的一個實施方案中，被測定的本發明生物標誌物的RNA產物是RNA產物的群體，其中包括mRNA和所有的mRNA剪接變體。在本發明的另一個實施方案中，測定的產物是血中表達的mRNA。在本發明的另一個實施方案中，測定的產物是血中表達mRNA的剪接變體。在本發明的另一個實施方案中，測定的產物是表2列出的RNA產物。
本發明生物標誌物的蛋白質產物也包括在本發明範圍內。為了實施本發明，本發明生物標誌物的蛋白質產物的測定可用於診斷目的。更具體地，生物標誌物的蛋白質產物中那些在肝癌期間差異表達的群體的測定可用於診斷目的，並包括在本發明內。
在本發明的一個實施方案中，蛋白質產物是從表1列出的生物標誌物翻譯的。在另一個實施方案中，蛋白質產物是血中表達的。在本發明的另一個實施方案中，蛋白質產物對應血中表達的RNA剪接變體。在另一個實施方案中，蛋白質產物是表3列出的那些。
在另一個實施方案中，使用反映生物標誌物的蛋白質產物和RNA產物組合的表達水平的數據。本領域技術人員理解，可以利用輸入數據的其它組合以產生可根據本發明使用的分類符。
5.7.3數學模型回歸模型在一些實施方案中，本發明鑑定的一些或全部生物標誌物的表達數據用於回歸模型，優選邏輯回歸模型中，以鑑定用於診斷肝癌的分類符。回歸模型用於測試表1鑑定的兩種或更多種生物標誌物的多種組合，以產生分類符。對於回歸模型，產生的分類符是方程的形式，其中代表方程中每種生物標誌物表達的數據乘以回歸模型產生的權重係數。產生的分類符可以用於分析測試個體的表達數據並提供診斷。一般來說，感興趣的多重回歸方程可以寫作Y＝α+β1X1+β2X2+…+βkXk+ε其中從屬變量Y表示與第一亞組相關的生物特徵(如缺少或存在肝癌)的存在(當Y為正)或缺少(當Y為負)。該模型顯示從屬變量Y依賴於k個解釋變量(對於參考群體中第一和第二亞組的對象的k個選擇基因(如生物標誌物)測定的特徵值)，加上涉及多種不明確的忽略因素的誤差項。在上述模型中，參數β1表示保持其它解釋變量為常數的條件下，第一解釋變量X1對從屬變量Y的影響(如權重因子)。相似地，參數β1表示保持其它解釋變量為常數的條件下，解釋變量X2對Y的影響。
邏輯回歸模型是線性回歸的非線性變換。邏輯回歸模型被稱為「分對數」(logit)模型並可以表達為ln[p/(1-p)]＝α+β1X1+β2X2+…+βkXk+ε或[p/(1-p)]=expexp1X1exp2X2expkXkexp]]>其中，ln是自然對數logexp，其中exp＝2.71828...，p是事件Y發生的概率，p(Y＝1)，p/(1-p)是「讓步比」(odds ratio)，ln[p/(1-p)]是讓步比的對數，或「分對數」，並且模型的所有其它成分與上述的一般回歸方程相同。本領域技術人員將會理解，α和ε項可以合併(fold)為相同常數。事實上，在優選的實施方案中，單一項用於代表α和ε。「邏輯」分布是S形分布函數。分對數分布限制估計概率(p)在0和1之間。
在本發明的一些實施方案中，邏輯回歸模型用最大可能性估計(MLE)擬合。換句話說，係數(如α，β1，β2，...)由最大可能性確定。可能性是條件概率(如P(Y|X)，給定X的Y的概率)。可能性函數(L)測定相同數據組中發生的具體組的從屬變量值(Y1，Y2，...，Yn)所觀察到的概率。它被寫作從屬變量的積的概率L＝Prob(Y1*Y2***Yn)可能性函數越高，在樣品中觀察到Ys的概率越高。MLE涉及發現這樣的係數(α，β1，β2，...)，所述係數使可能性函數(LL＜0)的對數儘可能大或者可能性函數的對數的-2倍(-2LL)儘可能小。在MLE中，進行參數α，β1，β2，...的一些初始估計。然後給定這些參數估計下計算數據的可能性。改善參數估計，重新計算數據的可能性。重複這個過程，直至參數估計不再有大改變(例如概率的改變小於0.01或0.001)。邏輯回歸和擬合邏輯回歸模型的實例可在Hastie，The Elements of Statistical Learning，Springer，New York，2001，pp.95-100中查到，其全部內容併入本文。
神經網絡在另一個實施方案中，測定的本發明每種生物標誌物的表達可以用於訓練神經網絡。神經網絡是兩階段回歸或分類模型。神經網絡具有分層結構，其中包括輸入單元層(和偏置)，它經權重層與輸出單元層連接。對於回歸，輸出單元層通常包括僅一個輸出單元。然而，神經網絡可以無縫方式處理多重定量應答。如此，神經網絡可應用於鑑定區分超過兩個群體的生物標誌物。在一個具體實施例中，可以用表1的生物標誌物的表達數據訓練神經網絡，以和不患有肝癌相比較鑑定肝癌特異性的生物標誌物的組合。結果，訓練後的神經網絡可以用於直接鑑定用作肝癌診斷性生物標誌物的生物標誌物組合。在一些實施方案中，使用含有十個神經元的單隱藏層(十個隱藏單元)的後向傳播神經網絡(例如見Abdi，1994，「A neural network primer」，J.BiolSystem.2，247-283)，它們可以發現於EasyNN-Plus version 4.0g軟體包(NeuralPlanner Software Inc.)。
神經網絡描述於Duda et al.，2001，Pattern Classification，Second Edition，JohnWiley Sons，New York；和Hastie et al.，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer-Verlag，New York，其全部內容引入本文。
其它數學模型上述模式分類和統計技術僅僅是可用於構建用於診斷肝癌的分類符的模型類型例子，例如描述於下文211-256頁的聚類分析Duda and Hart，Pattern Classificationand Scene Analysis，1973，John Wiley Sons，Inc.，New York，其全部內容經引用併入本文；主成分分析(見Jolliffe，1986，Principal Component Analysis，Springer，NewYork，經引用併入本文)；最近相鄰分類符分析(例如見Duda，Pattern Classification，Second Edition，2001，John Wiley Sons，Inc；和Hastie，2001，The Elements ofStatistical Learning，Springer，New York)；線性判別分析(例如見Duda，PatternClassification，Second Edition，2001，John Wiley Sons，Inc；和Hastie，2001，TheElements of Statistical Learning，Springer，New York；Venables Ripley，1997，Modern Applied Statistics with s-plus，Springer，New York)；支持向量機(例如見Cristianini and Shawe-Taylor，2000，An Introduction to Support Vector Machines，Cambridge University Press，Cambridge，Boser et al.，1992，″A training algorithm foroptimal margin classifiers，in Proceedings of the 5thAnnual ACM Workshop onComputational Learning Theory，ACM Press，Pittsburgh，PA，pp.142-152；Vapnik，1998，Statistical Learning Theory，Wiley，New York，經引用併入本文)。
5.8本發明的生物標誌物用於診斷的用途本領域技術人員可以理解，鑑定一種或多種生物標誌物可以用於通過測定待診斷個體(「測試個體」)中生物標誌物(基因)的產物表達而診斷肝癌。
在一個實施方案中，來自測試個體的結果與對照進行比較，其中對照可以是來自一個或多個患有肝癌的個體或者一個或多個不患有肝癌的個體。在另一個實施方案中，來自測試個體的結果既與患有肝癌的對照群體、也與不患有肝癌的對照群體進行比較。
在另一個實施方案中，可以將測試個體的生物標誌物的產物表達的表達數據輸入本發明的分類符中，從而確定所述測試個體是患有肝癌還是不患有肝癌。在一個優選實施方案中，將使用用於產生生物標誌物的相同分類符以診斷個體，但這不是必需的。代表本發明生物標誌物的RNA或蛋白質產物的數據被輸入本發明的分類符中以確定診斷。可以用測定本發明生物標誌物的RNA和蛋白質產物的表達水平的任何已知技術生成數據。
使用分類符導致確定測試個體是患有肝癌還是不患有肝癌。例如，使用邏輯回歸作為模型，Y用作肝癌的預測值，其中當Y＞0時人被診斷為患有肝癌，而當Y＜0時人被診斷為不患有肝癌。在另一個實施方案中，還可以包括其中診斷不能確定的第三類預測。例如，可以確定用於測定生物標誌物的基因表達的方法中固有的標準偏差(δ)。如果Y＜δ但＞0，或Y＞-δ但＜0，那麼診斷被認為不能確定。
5.9用於測定本發明生物標誌物的產物的多核苷酸使用能特異性或選擇性結合到本發明生物標誌物上的多核苷酸來測定本發明生物標誌物的RNA產物的表達水平。例如根據本發明，與本發明生物標誌物的一種或多種RNA產物特異性和/或選擇性雜交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產物、合成DNA、合成RNA或修飾核苷酸的天然存在的其它組合是有用的。
在一個優選實施方案中，使用與本發明生物標誌物的一種或多種RNA產物特異性且選擇性雜交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產物、合成DNA、合成RNA或修飾核苷酸寡核苷酸的天然存在的其它組合。
5.10測定本發明生物標誌物的RNA產物的技術5.10.1陣列雜交在本發明的一個實施方案中，用於測定本發明RNA產物的多核苷酸可以使用作與支持物穩定結合的核酸成員，以組成根據本發明的一個方面的陣列。核酸成員的長度範圍可以是8-1000個核苷酸長，並可以選擇特異性針對本發明生物標誌物的RNA產物。在一個實施方案中，這些成員對本發明生物標誌物的RNA產物是選擇性的。所述核酸成員可以是單鏈或雙鏈，和/或可以是寡核苷酸或從cDNA擴增的PCR片段。寡核苷酸優選是約20-30個核苷酸長。EST優選是100-600個核苷酸長。本領域技術人員將理解，可以使用本發明生物標誌物的部分表達區作為陣列上的探針。更具體地可以使用與本發明基因互補的多核苷酸和/或來源於本發明基因的cDNA或EST。對於基於寡核苷酸的陣列，選擇可用作探針的對應感興趣基因的寡核苷酸在本領域公知。更具體地，選擇允許雜交到靶核酸上的區域是重要的。諸如寡核苷酸的Tm、GC百分含量、二級結構程度和核酸長度的因素是重要的因素。例如見美國專利No.6,551,784。
構建核酸陣列在所述方法中，與實質性固相支持物的表面穩定結合的核酸成員的陣列與含有靶核酸的樣品在足以產生互補性核酸成員/靶複合物的雜交模式的雜交條件下接觸。在所述複合物中，陣列的獨特位置上的一個或多個互補性核酸成員特異性與靶核酸雜交。通過參考核酸成員在陣列上的位置可以確定雜交的所述靶核酸的身份。
可以用公認的技術如聚合酶鏈式反應(PCR)和逆轉錄(RT)產生核酸成員。這些方法與本領域當前已知的方法相似(例如見PCR Strategies，Michael A.Innis(Editor)，et al.(1995)和PCRIntroduction to Biotechniques Series，C.R.Newton，A.Graham(1997))。用本領域公知技術(如柱純化或醇沉澱)純化擴增的核酸。當核酸已經被分離使得基本無引物和合成期望核酸期間生成的不完全產物時，核酸被認為是純的。純化的核酸優選也是基本無汙染，這些汙染可能阻礙或掩蓋分子的特異性結合活性。
根據本發明的一個方面，陣列包含以超過20種不同核酸/cm2的密度附著到固相支持物一個表面上的多個核酸，其中每個核酸附著在固相支持物表面上不相同的預選區域內(如微陣列)。陣列上每個結合的樣品包含已知身份、通常已知序列的核酸組成，如下更詳細描述。任何可以想到的基質可以用於本發明中。
在一個實施方案中，附著到固相支持物表面的核酸是DNA。在一個優選實施方案中，附著到固相支持物表面的核酸是cDNA或RNA。在另一個優選實施方案中，附著到固相支持物表面的核酸是經聚合酶鏈式反應(PCR)合成的cDNA。根據本發明，陣列中核酸成員優選是至少10、25或50個核苷酸長。在一個實施方案中，核酸成員至少150個核苷酸長。核酸成員優選長度小於1000個核苷酸。更優選核酸成員長度小於500個核苷酸。
在本發明陣列中，核酸成分與支持物表面穩定結合，其中支持物可以是柔性或剛性固體支持物。「穩定結合」是指每個核酸成員在雜交和洗滌條件下維持在相對於固相支持物的獨特位置上。這樣，樣品共價或非共價地與支持物表面穩定結合。非共價結合的實例包括非特異性吸附、基於靜電相互作用(如離子對相互作用)的結合、疏水相互作用、氫鍵相互作用、通過共價附著到固相表面的特異性結合對成員而特異性結合等。共價結合的實例包括核酸與剛性支持物表面上的官能團(如-OH)形成的共價鍵，其中官能團可以是天然存在的或作為引入連接基團的成員而存在，如下更詳細描述。
每種組成的核酸量將足以提供在使用陣列進行測試期間充分雜交和檢測靶核酸序列。一般來說，穩定結合到陣列的固相支持物上的每種核酸成員的量是至少約0.001ng，優選至少約0.02ng，更優選至少約0.05ng，在此所述量可以高達1000ng或更高，但通常不超過約20ng。當核酸成員「點斑」到支持物上整體圓形的斑點中時，「斑點」的直徑一般約10-5,000μm，通常約20-2,000μm，更通常約100-200μm。
對照核酸成員可以存在於陣列上，包括包含對應基因組DNA、管家基因、載體序列、植物核酸序列、陰性和陽性對照基因等的寡核苷酸或核酸的核酸成員。對照核酸成員是校準或對照基因，其功能不是顯示感興趣的特定「關鍵」基因是否表達，而是提供其它有用的信息，如表達的背景或基礎水平。
其它對照核酸點斑到陣列上並用作靶表達對照核酸和錯配對照核酸，以監測與樣品中探針所針對靶以外的其它核酸的非特異性結合或交叉雜交。因此錯配探針指示雜交是否是特異性的。例如，如果有靶存在，完全匹配的探針應該相應地比錯配探針更亮。此外，如果存在全部對照錯配，錯配探針用於檢測突變。
微陣列基質根據本發明的陣列包含柔性或剛性基質。柔性基質能被彎曲、摺疊或類似操作而不被破壞。本發明相關的柔性固體支持物的固體材料的實例包括膜，如尼龍、柔性塑料膜等。「剛性」是指支持物是固體並且不容易彎曲，即支持物不是柔性的。如此，所述陣列的剛性基質足以在使用陣列的測試條件下、尤其是在高通量處理條件下向其上結合的核酸提供物理支持和結構。
基質可以是生物的、非生物的、有機的、無機的或這些的任意組合，作為顆粒、鏈(strand)、沉澱、凝膠、薄片(sheet)、管、球、珠、容器、毛細管、墊、切片(slice)、膜、板、載片(slide)、塊等而存在。基質可以具有任何方便的形狀，如盤、方形、球形、圓形等。基質優選是平的或平面狀，但可以採用多種替代性表面構型。基質可以是聚合的LB膜、功能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SIN4、改性矽或各種凝膠或聚合物中的任一種，如聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯((poly)vinylidenedifluoride)、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其組合。通過閱讀本公開內容，其它基質材料對於本領域技術人員將是顯而易見的。
在一個優選實施方案中，基質是平玻璃或單晶矽。根據一些實施方案，基質表面用公知技術蝕刻以提供期望的表面特性。例如，通過形成溝、v-槽、臺面結構或其它，合成區可以更緊密地放置於入射光的焦點內，提供使收集自螢光源的光最大化的反射「鏡」結構等。
儘管不總是如此，固相支持物表面通常由與基質相同的材料組成。作為替代，表面可以由任意的各種材料組成，例如聚合物、塑料、樹脂、多糖、矽石或矽石基材料、碳、金屬、無機玻璃、膜或任意上述基質材料。在一些實施方案中，表面可以提供被罩起來的(caged)結合成員的使用，它們牢固附著於基質表面。表面優選含有活性基團，它們是羧基、氨基、羥基等。最優選地，表面是光學透明的，並且具有表面Si--OH官能團，例如這可以在矽石表面發現。
基質表面優選提供接頭分子層，儘管可以理解接頭分子不是本發明的必需的元件。接頭分子優選足夠長以允許本發明的基質上的核酸與其它核酸分子雜交並與暴露於基質的分子自由相互作用。
基質經常是矽或玻璃表面、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、帶電膜、如尼龍66或硝酸纖維素，或其組合。在一個優選實施方案中，固相支持物是玻璃。基質的至少一個表面優選是基本平的。固相支持物優選含有活性基團，包括但不限於羧基、氨基、羥基、硫羥基等。在一個實施方案中，表面可以是光學透明的。在一個優選實施方案中，基質是聚賴氨酸包被的載片或γ-氨基丙基矽烷包被的Corning Microarray Technology-GAPS或CMT-GAP2包被的載片。
核酸成員可以附著的任何支持物可以用於本發明。合適固體支持物材料的實例包括但不限於矽酸鹽如玻璃和矽膠、纖維素和硝酸纖維素紙、尼龍、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、乳膠、橡膠和氟碳樹脂如TEFLONTM。
支持材料可以使用各種形狀，包括但不限於載片和珠。載片提供幾種功能優點並因此是優選的固相支持物形式。由於其平的表面，使用載玻片使探針和雜交試劑被最小化。載片還使靶向應用試劑成為可能，容易保持在恆定溫度，容易洗滌並有助於直接觀察固定在固相支持物上的RNA和/或DNA。使用載片也有利於去除固定在固相支持物上的RNA和/或DNA。
選作支持物的具體材料對本發明不是關鍵的，只要它提供所述功能。正常情況下，製造或使用本發明的人將基於成本經濟性和可用性、最終產品的預期應用要求和整體製造工藝的需要而選擇最佳的商品材料。
點斑方法在一個方面中，本發明提供陣列，其中組成陣列的每個核酸成員點斑到固相支持物上。
優選的是，點斑如下進行。本發明生物標誌物的PCR產物(～40μl)，在用於擴增的相同96-孔管中，用4μl(1/10體積)3M乙酸鈉(pH5.2)和100μl(2.5體積)乙醇沉澱，並在-20℃保存過夜。然後將它們在4℃以3,300rpm離心1小時。所得沉澱用50μl冰冷的70％乙醇洗滌，然後再離心30分鐘。然後空氣乾燥沉澱並重懸於20μl 3×SSC中或50％二甲基亞碸(DMSO)中過夜。然後用機器人GMS 417或427陣列儀(Affymetrix，Ca)將樣品單次或重複點斑在載片上。
微陣列上斑點的邊界可以用鑽石刻刀(因為處理以後斑點不可見)標記。將載片懸於溫的無顆粒ddH2O皿中約1分鐘(斑點將輕微溶脹但將不互相接觸)以再水化陣列，在70-80℃倒置加熱塊上快速乾燥3秒。然後在雜交之前將核酸紫外交聯到載片上(Stratagene，Stratalinker，65mJ-設置顯示為「650」，表示650×100μJ)或者在80℃烘陣列2-4小時。陣列放置於片架上。準備空片室並充入以下溶液3.0g琥珀酸酐(Aldrich)溶於189ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(迅速加入試劑很關鍵)；最後的琥珀酸酐薄片溶解以後立即混合入21.0ml 0.2M硼酸鈉並將溶液倒入片室內。迅速且均勻地將片架置入片室並劇烈地上下搖幾秒，確保片絕不離開溶液，然後在水平迴轉式振蕩器(orbital shaker)上混合15-20分鐘。然後將片架輕輕置入95℃ ddH2O中2分鐘，隨後插入95％乙醇中5次。使過量乙醇滴到紙巾上，空氣乾燥載片。陣列室溫保存於片盒中備用。
很多方法可以用於將本發明的核酸成員附著到基質上(稱為「點斑」的過程)。例如使用例如美國專利5,807,522中的技術附著核酸，該專利經引用併入本文，其中教導聚合物附著的方法。
作為替代方案，可以用本領域已知的接觸印刷技術進行點斑。
微陣列用途根據本發明的核酸陣列可以用於測試包含一種或多種靶核酸序列的樣品中的核酸。本發明的陣列可發現多種應用，如診斷肝癌、篩選治療靶點等。
所述陣列還可用於藥物發現和研究中的大規模表達篩選，如特定活性劑對本發明生物標誌物的表達模式的影響，其中這些信息用於揭示藥物效果和毒性、環境監測、疾病研究等。
可使用至少一種、更優選這些序列的組合作為診斷肝癌的物質來製造陣列。
本領域技術人員完全明白標準樣品的選擇，它包括與從一個或多個正常個體分離的RNA互補的樣品，其中正常個體是不患有肝癌的個體。
製備用於與陣列雜交的核酸樣品用於與根據本發明的陣列雜交的樣品優選來源於血的總RNA。在另一個實施方案中，陣列的靶來源於血的mRNA。
核酸樣品能通過一種或多種類型的化學鍵、通常通過鹼基互補配對、通常通過形成氫鍵來結合互補序列的核酸成員。
本文所用「來源於mRNA轉錄本的核酸」或「對應mRNA的核酸」表示mRNA轉錄本或其子序列最終用作合成模板的核酸。因此，從mRNA逆轉錄的cDNA、從該cDNA轉錄的RNA、從該cDNA擴增的DNA、從該擴增DNA轉錄的RNA等都來源於或對應所述mRNA轉錄本，並且檢測到這種來源或相對應的產物可以指示樣品中初始轉錄本的存在和/或豐度或者與之成比例。因此，合適的核酸樣品包括但不限於基因的mRNA轉錄本、從該mRNA逆轉錄的cDNA、從該cDNA轉錄的cRNA、從基因擴增的DNA、從該擴增DNA轉錄的RNA等。用於此處的核酸樣品優選來源於血。核酸可以是單鏈或雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜合體，它們用本領域已知方法例如經逆轉錄或PCR從人血合成。
在最簡單的實施方案中，這種核酸樣品包含從血樣分離的總mRNA或對應mRNA的核酸樣品(如cDNA)。在另一個實施方案中，使用例如酸性胍-酚-氯仿提取法從給定樣品分離總mRNA，並用oligo dT柱層析或用(dT)n磁珠分離polyA+mRNA(例如見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)，或Current Protocols in MolecularBiology，F.Ausubel et al.，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1987))。在一個優選實施方案中，用TRIzol試劑(GIBCO/BRL，Invitrogen LifeTechnologies，Cat.No.15596)提取總RNA。用260/280nm吸光度和瓊脂糖凝膠電泳隨後紫外光檢查評價RNA純度和完整性。
在一些實施方案中，期望在雜交之前擴增核酸樣品，例如當僅有有限量的樣品可以使用時(例如血滴)。本領域技術人員知道無論使用何種擴增方法，如果期望定量結果，必須小心使用維持或控制所擴增核酸相對頻率的方法。「定量」擴增的方法對本領域技術人員是公知的。例如定量PCR涉及用相同引物同時共擴增已知量的對照序列。這提供可用於校準PCR反應的內部標準。高密度陣列因而可以包括對內部標準特異性的引物以定量所擴增核酸。定量PCR的詳細操作提供於PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，Innis et al.，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990)。
其它合適的擴增方法包括但不限於聚合酶鏈式反應(PCR)(Innis，et al.，PCRProtocols.A Guide to Methods and Application.Academic Press，Inc.San Diego，(1990))、連接酶鏈式反應(LCR)(見Wu and Wallace，1989，Genomics，4560；Landegren，et al.，1988，Science，2411077和Barringer，et al.，1990，Gene，89117)、轉錄擴增(Kwoh，et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173)和自支持的序列複製(Guatelli，et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874)。
在一個特別優選的實施方案中，用逆轉錄酶和由oligo dT與編碼噬菌體T7啟動子的序列組成的引物逆轉錄核酸樣品mRNA，以提供單鏈DNA模板。第二條DNA鏈用DNA聚合酶聚合。合成雙鏈cDNA以後，加入T7 RNA聚合酶，從cDNA模板轉錄RNA。從每個單個cDNA模板的連續轉錄循環得到擴增的RNA。體外轉錄方法對本領域技術人員是公知的(例如見Sambrook，同上)，這種具體的方法詳細描述於Van Gelder，et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871663-1667，其中證明根據這種方法的體外擴增保持各種RNA轉錄本的相對頻率。此外，Eberwine et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893010-3014提供了使用經體外轉錄的兩輪擴增以實現超過起始材料106倍擴增的操作方案，從而即使生物樣品有限時也允許表達監測。
標記核酸樣品或核酸探針標記核酸探針以允許檢測與本發明陣列的雜交。與分子結合或摻入分子中的任何分析檢測性標誌物可以用於本發明。分析檢測標誌物表示可以被分析性檢測和定量的任何分子、基團或原子。
適用於本發明的可檢測標記物包括可以通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電、光或化學手段檢測的任何組分。可用於本發明的標記物包括用標記的鏈親合素偶聯物染色的生物素、磁珠(如DynabeadsTM)、螢光染料(如螢光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色螢光蛋白等)、放射性標記物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶和其它常用於ELISA的酶)和比色標記物如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。教導這些標記物用途的專利包括美國專利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，它們的全部內容經引用併入本文。
檢測這些標記物的手段對本領域技術人員是公知的。因此，例如，可以用照相膠片或閃爍計數器檢測放射性標記物，可以用檢測發射光的光檢測器檢測螢光標記物。酶標記物通常通過向酶提供底物並檢測酶作用於底物生成的反應產物進行檢測，比色標記物通過簡單觀察有色標記物來檢測。
可以通過本領域技術人員公知的許多手段中的任意一種引入標記物。然而，在一個優選實施方案中，在製備核酸樣品中的擴增步驟期間同時引入標記物。因此，例如，使用標記引物或標記核苷酸的聚合酶鏈式反應(PCR)將提供標記的擴增產物。在一個優選實施方案中，使用標記核苷酸(如螢光素標記的UTP和/或CTP)的上述轉錄擴增將標記物摻入轉錄的核酸中。
作為替代方案，可以將標記物直接加入起始核酸樣品(如mRNA、polyA mRNA、cDNA等)或在完成擴增以後加入擴增產物中。將標記連接到核酸上的手段對於本領域技術人員是公知的，例如包括缺口翻譯或末端標記(如用標記RNA)，包括激酶處理核酸，隨後接合(連接)核酸接頭，將樣品核酸連接到標記(如螢光物質)上。
在一個優選實施方案中，通過花青染料如Cy-3/Cy-5 dUTP、Cy-3/Cy-5 dCTP(Amersham Pharmacia)或alexa染料(Khan，et al.，1998，Cancer Res.585009-5013)進行螢光修飾。
在一個優選實施方案中，用於比較的兩種核酸樣品用產生可區分檢測信號的不同的螢光染料標記，例如，從正常肝細胞製備的核酸樣品用Cy5標記，從輕度肝癌細胞製備的核酸樣品用Cy3標記。不同標記的靶樣品同時雜交到同一微陣列上。在一個優選實施方案中，標記核酸樣品用本領域公知方法純化，例如通過乙醇純化或柱純化。
在一個優選實施方案中，核酸樣品將包括一種或多種對照分子，它們與微陣列上的對照探針雜交以標準化微陣列產生的信號。優選的是，標記的標準化核酸樣品是與上述點到微陣列上的對照寡核苷酸完全互補的核酸序列。雜交以後從標準化對照獲得的信號提供對雜交條件、標記強度、「閱讀」效率和可能引起完全雜交信號在陣列之間變化的其它因素變異的控制。在一個優選實施方案中，從陣列中所有其它探針閱讀的信號(如螢光強度)除以從對照探針閱讀的信號(如螢光強度)，從而標準化測定。
選擇優選的標準化核酸樣品以反映樣品中存在的其它核酸樣品的平均長度，然後可以選擇它們覆蓋一個長度範圍。也可以選擇標準化對照以反映陣列中其它探針的(平均)鹼基組成，然而在一個優選實施方案中，僅使用一種或幾種標準化探針，並且它們的選擇使得它們良好雜交(即沒有二級結構並且不自雜交)並且不匹配陣列上任何核酸。
標準化探針位於陣列中任意位置或者陣列上的多個位置以控制雜交效率的空間變異。在一個優選實施方案中，標準化對照位於陣列的角落或邊緣以及中間。
雜交條件核酸雜交涉及在一定條件下提供核酸樣品，所述條件下樣品和互補性核酸成員能通過互補性鹼基配對形成穩定的雜合雙鏈。不形成雜合雙鏈的核酸然後被洗去，留下雜交的核酸進行檢測，通常通過檢測連接的可檢測標記物而進行檢測。一般認為增加溫度或降低含核酸的緩衝液的鹽濃度可以變性核酸。在低嚴謹性條件(如低溫和/或高鹽)下，甚至在退火序列不完全互補時也將形成雜合雙鏈(如DNADNA、DNARNA或RNARNA)。因此在較低嚴謹性下雜交特異性降低。相反，在較高嚴謹性(如較高溫度或較低鹽)時成功的雜交要求較少錯配。
本發明提供的雜交條件包括Dig雜交混合物(Boehringer)；或基於甲醯胺的雜交溶液，例如描述於Ausubel et al.，同上和Sambrook et al.，同上。
優化雜交條件的方法是本領域技術人員公知的(例如見Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.24Hybridization With Nucleic acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.，(1993))。
雜交以後，方便地通過洗滌從支持物表面除去未雜交標記或未標記核酸，從而在基質表面上產生雜交靶核酸的模式。本領域技術人員已知多種洗滌溶液並且可以使用。標記、雜交寡核苷酸和/或核酸的所得雜交模式可以用多種方式觀察或檢測，所選擇的具體檢測方式基於測試核酸的特定標記物，其中代表性檢測手段包括閃爍計數、放射自顯影、螢光測定、量熱測定、發光測定等。
圖像獲取和數據分析如上述，雜交和任何洗滌步驟和/或後續處理之後，檢測所得雜交模式。檢測或觀察雜交模式時，標記物的強度或信號值將不僅被檢測而且被定量，這意味著將測定每個雜交斑點的信號並與已知量末端標記靶核酸所發出信號對應的單位值進行比較，以獲得雜交模式中與陣列上特定斑點雜交的每種末端標記靶的拷貝數的計數或絕對值。
分析從與陣列的雜交所收集數據的方法在本領域公知。例如，當雜交檢測涉及螢光標記物時，數據分析可以包括下列步驟確定螢光強度作為所收集數據的基質位置的函數；去除異常值，即偏離預定統計分布的數據；和從剩餘數據計算測試核酸的相對結合親和力。所得數據顯示為圖像，其中每個區域中的強度根據結合的寡核苷酸和/或核酸與測試核酸之間的結合親和力而變化。
以下檢測操作用於同時分析兩種待比較樣品，其中每種樣品用不同的螢光染料標記。
針對第一種螢光顏色掃描微陣列的每個元素。每個陣列元素處的螢光強度與樣品中該基因的表達水平成比例。
對第二種螢光標記重複掃描操作。兩種螢光強度的比例提供兩種樣品中相對基因表達水平的高度精確和定量的測定。
在一個優選實施方案中，從裝備雷射激發源和適用於Cy3和Cy5螢光的幹涉濾光器的定製共聚焦顯微鏡獲取的圖像確定固定化核酸序列的螢光強度。每種螢光分別在解析度225μm2/像素和65,536灰階下進行掃描。圖像分割以識別雜交區域，標準化兩個螢光圖像之間的強度，並計算每個靶處標準化的平均螢光值，這些如文獻所述(Khan，et al.，1998，Cancer Res.585009-5013.Chen，et al.，1997，Biomed.Optics2364-374)。圖像之間的標準化用於調整兩種不同螢光的不同標記和檢測效率。這通過將點在陣列上的一組內對照基因的信號強度比平衡為1的值而實現。
在另一個優選實施方案中，在Cy3和Cy5通道掃描陣列並保存為獨立的16位TIFF圖像。引入圖像並用軟體分析，所述軟體包括格柵化處理以從陣列上每個點獲取雜交強度數據。收集每個點的螢光強度和背景扣除以後的雜交強度並計算測定的Cy5/Cy3平均強度比。使用線性回歸方法進行標準化並假設測定的Cy5/Cy3強度的散點圖的斜率為1。計算比率的平均值並用於重新衡量數據並調整斜率為1。表達比率不等於1用作差異基因表達的指標。
在一個特別優選的實施方案中，當期望定量樣品中一種或多種核酸序列的轉錄水平(及相應表達)時，核酸樣品中基因的mRNA轉錄本的濃度或來源於mRNA轉錄本的核酸的濃度與該基因的轉錄水平(及相應表達水平)成比例。相似地，雜交信號強度優選與雜交核酸的量成比例。儘管優選比例性相對嚴格(如轉錄速率加倍導致樣品核酸庫中mRNA轉錄本加倍和雜交信號加倍)，技術人員將知道比例性可以更寬鬆，甚至是非線性的，而仍然提供有意義的結果。因此，例如，樣品mRNA濃度的5倍差異導致雜交強度的3-到6-倍差異的分析對於多數目的是足夠的。當需要更精確定量時，使用適當對照以校正本文所述的樣品製備和雜交中引入的變異。此外，根據本領域技術人員公知的方法使用系列稀釋「標準」mRNA樣品製備標準曲線。當然，如果需要簡單檢測轉錄本的存在或缺少，則不需要精細的對照或校正。
例如，如果陣列上核酸成員在雜交以後未被標記，這指示包含該核酸成員的基因不在任一樣品中表達。如果核酸成員具有單色標記，這指示標記基因僅在一種樣品中表達。組成陣列的核酸成員被雙色標記指示該基因在兩種樣品中都表達。甚至檢測到每個細胞僅表達一次的基因(1/100,000靈敏度)。待比較的兩種樣品中表達強度的差異指示差異表達，兩種樣品的強度比不等於1.0，優選小於0.7或大於1.2，更優選小於0.5或大於1.5。
5.10.2RT-PCR在本發明的一個方面中，本發明生物標誌物的RNA產物表達水平可通過用逆轉錄(RT)結合聚合酶鏈式反應(PCR)從樣品中擴增生物標誌物的RNA產物來測定。根據本發明的一個實施方案，RT可以是定量的，正如本領域技術人員所知。
樣品的總RNA或mRNA用作模板，使用對本發明生物標誌物的轉錄部分特異的引物啟動逆轉錄。將RNA逆轉錄為cDNA的方法是公知的，描述於Sambrook et al.，1989，同上。可用商業軟體(如Primer Designer 1.0，Scientific Software等)進行引物設計。隨後逆轉錄產物用作PCR模板。
通過使用多循環的依賴於DNA的DNA聚合酶催化的DNA複製，PCR提供迅速擴增特定核酸序列的方法，從而擴增感興趣的靶序列。PCR要求存在待擴增核酸、兩種位於待擴增序列旁側的單鏈寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸、緩衝液和鹽。
PCR方法在本領域中公知。PCR如Mullis and Faloona，1987，Methods Enzymol.，155335中所述進行，其經引用併入本文。PCR使用模板DNA(至少1fg；更有用的是1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物進行。典型的反應混合物包括2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10H PCR緩衝液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl 1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5單位)Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)和去離子水加到總體積25μl。覆蓋礦物油並用可編程熱循環儀進行PCR。
根據實際需要的嚴謹性調整PCR循環每一步的長度和溫度以及循環數。退火溫度和時間都根據期望引物退火到模板上的效率和可耐受的錯配程度確定。優化引物退火條件嚴謹性的能力良好地在本領域技術人員的知識範圍內。使用30℃-72℃之間的退火溫度。模板分子的起始變性通常於92℃-99℃之間進行4分鐘，隨後是20-40個循環，由以下組成變性(94℃-99℃持續15秒-1分鐘)、退火(由上述討論確定；1-2分鐘)和延伸(72℃持續1分鐘)。最後延伸步驟一般在72℃進行4分鐘。並可以跟隨無限的4℃步驟(0-24小時)。
QRT-PCR(定量RT-PCR)本質是定量性的，也可以用於提供基因表達水平的定量測定。在QRT-PCR中逆轉錄和PCR可以分兩步進行，或者逆轉錄與PCR可以同時進行。這些技術之一，對此有商品試劑盒如TaqMan(Perkin Elmer，Foster City，CA)，使用轉錄特異性反義探針進行。這種探針對PCR產物(如來源於基因的核酸片段)是特異性的，並且在寡核苷酸的5』端複合有淬滅劑和螢光報告探針。不同的螢光標誌物連接到不同報告子上，允許在一個反應中測定兩種產物。當Taq DNA聚合酶被活化時，通過其5』-3』核酸外切酶活性將結合到模板上的探針的螢光報告子切除。無淬滅劑時，報告子發螢光。報告子顏色的改變與每種特異性產物的量成比例並可以用螢光計測定；因此，每種顏色的量得以測定，PCR產物得以定量。PCR反應在96孔板中進行，使得來源於很多個體的樣品可以同時處理和測定。TaqMan系統還具有不需要凝膠電泳的優點，允許在使用標準曲線時進行定量。
用於定量檢測PCR產物第二種技術是使用intercolating染料如可通過商業途徑獲得的QuantiTect SYBR Green PCR(Qiagen，Valencia California)。用SYBR Green作為螢光標記進行RT-PCR，染料在PCR期間摻入PCR產物並產生與PCR產物量成比例的螢光。
RNA逆轉錄之後TaqMan和QuantiTect SYBR系統都可以使用。可以在與CPR步驟相同的反應混合物中進行逆轉錄(一步法)，或者可以在用PCR擴增之前先進行逆轉錄(兩步法)。
此外，已知定量測定mRNA表達產物的其它系統，包括Molecular Beacons，它使用含螢光分子和淬滅分子的探針，該探針能形成髮夾結構使得當處於髮夾形式時，螢光分子被淬滅，而當雜交時螢光增加，從而定量測定基因表達。
定量測定RNA表達的其它技術包括但不限於聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應、Qbeta複製酶(例如見國際申請號PCT/US87/00880)、等溫擴增法(例如見Walker et al.(1992)PNAS 89382-396)、鏈置換擴增(SDA)、修復鏈反應、非對稱定量PCR(例如見美國公開號US200330134307A1)和多重微球珠測試，描述於Fuja et al.，2004，Journal of Biotechnology 108193-205。
可以通過用基於轉錄的擴增系統(TAS)從樣品擴增RNA來測定基因表達水平，包括核酸序列擴增(NASBA)和3SR。例如見Kwoh et al(1989)PNAS USA 861173；國際公開No.WO 88/10315；和美國專利No.6,329,179。在NASBA中，可以用傳統酚/氯仿提取、熱變性、裂解緩衝液和小離心柱處理分離DNA和RNA或鹽酸胍提取RNA來製備核酸用於擴增。這些擴增技術涉及具有靶特異性序列的引物退火。聚合之後，DNA/RNA雜合體用RNaseH消化，而雙鏈DNA分子再次熱變性。在每種情況下通過加入第二種靶特異性引物然後聚合將單鏈DNA製成雙鏈。然後用聚合酶如T7或SP6重複轉錄雙鏈DNA分子。在等溫循環反應中，RNA被逆轉錄為雙鏈DNA，並用聚合酶如T7或SP6轉錄一次。所得產物，無論截短或完全的所得產物，都指示靶特異性序列。
幾種技術可以用於分離擴增產物。例如，可以用瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯醯胺或聚丙烯醯胺凝膠電泳經常規方法分離擴增產物。見Sambrook et al.，1989。無需電泳定量檢測PCR產物的幾種技術也可以根據本發明使用(例如見PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，Innis et al.，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990))。例如，可以使用色譜技術進行分離。有很多種色譜可以用於本發明吸附、分配、離子交換和分子篩、HPLC和很多使用它們的專用技術，包括柱、紙、薄層和氣相色譜(Freifelder，Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and MolecularBiology，2nd ed.，Wm.Freeman and Co.，New York，N.Y.，1982)。
通過用多種類型的小分子配體共價標記用於PCR反應的寡核苷酸引物而實施分離方法的另一種實例。在一種這樣的分離中，每種寡核苷酸上帶不同配體。使用特異性結合一種配體的分子包被板如96孔ELISA板的表面，如果配體是生物素，則所述特異性結合配體的分子可能是抗體或親合素。當PCR反應體系施加到這樣製備的板的表面時，PCR產物與表面特異性結合。洗滌板去除未結合試劑以後，加入含結合第一配體的第二種分子的溶液。這第二種分子與一些類型的報告系統連接。如果PCR產物已經產生，其中兩種寡核苷酸引物都摻入最終的PCR產物中，則第二種分子僅結合到板上。然後用如檢測和定量ELISA反應中所使用的商品化讀板儀來檢測和定量PCR產物的量。諸如此處所述的一個ELISA樣系統由Raggio Italgene company開發，商品名為C-Track。
必須觀察擴增產物以確認感興趣核酸序列的擴增。一種典型的觀察方法涉及用溴化乙錠染色凝膠並在紫外光下觀察。作為替代方案，如果擴增產物用放射性或螢光標記的核苷酸整合標記，則分離以後可以將擴增產物對x射線膠片曝光或在適當的刺雷射譜下觀察。
在一個實施方案中，間接進行觀察。分離擴增產物以後，使標記的核酸探針與感興趣的擴增核酸序列接觸。探針優選與發色物偶聯，但也可以被放射性標記。在另一個實施方案中，探針偶聯到結合伴侶上，如抗體或生物素，而結合對的其它成員攜帶可檢測基團。
在另一個實施方案中，通過用標記探針經Southern印跡和雜交進行檢測。Southern印跡涉及的技術對本領域技術人員是公知的，並可以在很多關於分子操作的標準書籍中查到。見Sambrook et al.，1989，同上。簡單的說，經凝膠電泳分離擴增產物。然後使凝膠與膜如硝酸纖維素接觸，使核酸轉移和非共價結合。隨後，將膜與偶聯發色物的探針一起孵育，所述探針能與靶擴增產物雜交。通過膜對x射線膠片的曝光或離子發射檢測裝置進行檢測。
前述的一個實例描述於美國專利5,279,721中，該專利經引用併入本文，其中公開了自動化電泳和轉移核酸的裝置和方法。所述裝置允許電泳和印跡而無需外部操作凝膠，理想地適用於實施根據本發明的方法。
5.10.3核酸酶保護分析在本發明的另一個實施方案中，可以用核酸酶保護分析(包括核糖核酸酶保護分析和S1核酸酶分析)檢測和定量本發明生物標誌物的RNA產物。在核酸酶保護分析中，反義探針(例如用放射性標記或非同位素標記)在溶液中與RNA樣品雜交。雜交以後，單鏈、未雜交的探針和RNA被核酸酶降解。用丙烯醯胺凝膠分離剩餘的受保護片段。通常溶液雜交比基於膜的雜交更有效，並且它可以適用於高達100μg的樣品RNA，而印跡雜交最多為20-30μg。
核糖核酸酶保護分析是最常見的核酸酶保護分析，要求使用RNA探針。寡核苷酸和其它單鏈DNA探針只能用於含S1核酸酶的分析中。單鏈、反義探針通常必須與靶RNA完全同源，以防止核酸酶切割探針靶雜合體。
5.10.3 Northern印跡根據本領域普通技術人員已知的常規Northern雜交技術，標準Northern印跡分析還可以用於確認RNA轉錄本大小，鑑定選擇性剪接的RNA轉錄本和本發明生物標誌物的RNA產物的相對量。在Northern印跡中，首先在變性條件下經瓊脂糖凝膠電泳按大小分離RNA樣品。然後將RNA轉移到膜上，交聯，並與標記探針雜交。可以使用非同位素或高比活的放射性標記探針，包括隨機引發、缺口翻譯或PCR產生的DNA探針、體外轉錄的RNA探針和寡核苷酸。此外，僅具有部分同源性的序列(如不同物種的cDNA或可能含有外顯子的基因組DNA片段)可以用作探針。標記探針，如放射性標記的cDNA，其含有全長單鏈DNA或該DNA序列的片段，可以長至少20、至少30、至少50或至少100個連續核苷酸。可以用本領域技術人員已知的很多不同方法的任一種來標記探針。這些研究中最常用的標記物是放射性元素、酶、暴露於紫外光時發螢光的化學品等。多種螢光物質是已知的並可以用作標記物。這些包括但不限於螢光素、羅丹明、金胺、德克薩斯紅、AMCA藍和Lucifer黃。具體的檢測物質是山羊中製備並經異硫氰酸酯與螢光素偶聯的抗兔抗體。也可以用放射性元素或酶標記蛋白質。可以用當前可用的任何計數方法檢測放射性標記。同位素的非限制性實例包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。同樣可以使用酶標記物，並可以用當前使用的比色、光譜、螢光光譜、電流分析或氣體分析技術的任何技術進行檢測。通過與橋聯分子如碳二亞胺、二異硫氰酸酯、戊二醛等反應將酶偶聯到選定的顆粒上。可以使用本領域技術人員已知的任何酶。這種酶的實例包括但不限於過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶和鹼性磷酸酶。作為實例參考美國專利No.3,654,090、3,850752和4,016,043，其中公開了替代性標記物質和方法。
5.11測定本發明生物標誌物的蛋白質產物的技術5.11.1基於抗體的方法也可以用標準技術確定樣品中存在的感興趣蛋白質的量。例如可以使用標準技術，例如使用免疫測試如Western印跡、免疫沉澱隨後十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、免疫細胞化學等確定樣品中存在的感興趣蛋白質的量。檢測感興趣蛋白質的優選試劑是能結合感興趣蛋白質的抗體，優選帶可檢測標記的抗體。
對於這樣的檢測方法，可以用本領域技術人員公知的技術容易地分離待分析樣品中的蛋白質。蛋白質分離方法例如可以是Harlow和Lane(Harlow，E.and Lane，D.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold SpringHarbor，New York(1988))描述的那些。
檢測感興趣蛋白質的優選方法涉及通過與蛋白質特異性抗體的相互作用進行檢測。例如，如本文所述可使用針對感興趣蛋白質的抗體。可以用本領域技術人員公知的標準技術產生抗體。這些抗體產生技術的更詳細討論例如見本申請15.13.2節和美國公開號20040018200中5.2節，所述內容經引用併入本文。簡單的說，這些抗體可以是多克隆的，或更優選是單克隆的。例如，可以使用完整抗體或抗體片段(如Fab或F(ab』)2)。抗體優選是人抗體或人源化抗體。
表5表示在本發明的一個實施方案中，用於檢測本發明生物標誌物的蛋白質的抗體。
表5
例如，可以使用對感興趣蛋白質特異的抗體或抗體片段定量或定性檢測該蛋白質的存在。例如這可以通過免疫螢光技術實現。此外，抗體(或其片段)可用於組織學如免疫螢光或免疫電鏡分析，以原位檢測感興趣蛋白質。通過從患者取組織學樣品(如活組織檢查樣品)並向其使用針對一種蛋白質的標記抗體，從而可以實現原位檢測。優選通過將標記抗體(或其片段)覆蓋到生物樣品上來使用抗體(或其片段)。通過使用這種方法，不僅可以確定樣品內感興趣蛋白質的存在性，而且可以確定其分布、細胞(如肝癌細胞和淋巴細胞)內存在性。為了實現這種原位檢測可以使用各種公知組織學方法(如染色法)。
感興趣蛋白的免疫測試通常包括將生物樣品與能鑑定感興趣蛋白質的可標記檢測的抗體一起孵育，並通過任何的多種公知技術檢測結合抗體。下面將更詳細討論，術語「標記」可以表示直接標記抗體，例如通過將可檢測物質偶聯(即物理連接)至抗體上，並且還可以表示間接標記抗體，通過與直接標記的另一種試劑的反應性。間接標記的實例包括用螢光標記的第二抗體檢測第一抗體。
例如，可以使生物樣品與固相支持物或載體如硝酸纖維素或能固定細胞、細胞顆粒或可溶性蛋白質的其它固相支持物接觸並固定在其上。然後可以用合適緩衝液洗滌支持物，隨後用可檢測標記的指紋基因特異性抗體處理。然後可以用緩衝液第二次洗滌固相支持物以去除未結合抗體。然後可用常規手段檢測結合到固相支持物上的標記物量。
對於蛋白質物質而言，「固相支持物或載體」表示能結合抗原或抗體的任何支持物。公知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉、天然和改性纖維素、聚丙烯醯胺、輝長巖和磁石。根據本發明目的，載體的性質可以是一定程度可溶的或不溶性的。支持物材料可以具有幾乎任何可能的構型，只要偶聯分子能結合抗原或抗體即可。因此，支持物構型可以是球形，如珠；或圓柱形，如試管的內表面或棒的外表面。作為替代方案，表面可以是平的，如薄片、測試條等。優選的支持物包括聚苯乙烯珠。本領域技術人員知道很多其它的適用於結合抗體或抗原的載體，或者能使用常規實驗確認它們。
可檢測性標記特異性抗體的方式之一是將抗體與酶連接並用於酶免疫測試(EIA)(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″，1978，Diagnostic Horizons 21-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD)；Voller，A.et al.，1978，J.Clin.Pathol.31507-520；Butler，J.E.，1981，Meth.Enzymol.73482-523；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRCPress，Boca Raton，FL；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，KgakuShoin，Tokyo)。與抗體結合的酶將與適當的底物反應，優選與發色底物反應，以此方式產生例如通過光譜、螢光光譜或觀察手段檢測的化學結構。可用於可檢測性標記抗體的酶包括但不限於蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸、脫氫酶、三糖磷酸異構酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖澱粉酶和乙醯膽鹼酯酶。可以通過比色方法使用酶的發色底物進行檢測。還可以通過酶催化底物反應的程度與相似製備的標準品之間的觀察比較進行檢測。
還可以用多種其它免疫測試的任一種進行檢測。例如，通過放射性標記抗體或抗體片段，可以通過使用放射免疫測試(RIA)檢測感興趣蛋白質(例如見Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，March，1986，該文經引用併入本文)。放射性同位素(如125I、131I、35S或3H)可以通過諸如使用γ計數器或閃爍計數器或放射自顯影的方式進行檢測。
也可以用螢光化合物標記抗體。當螢光標記的抗體暴露於適當波長的光時，可以由螢光檢測其存在。最常用的螢光標記化合物中有螢光素異硫氰酸酯、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛(o-phthaldehyde)和螢光胺。
也可以用發螢光金屬如152Eu或其它鑭系元素可檢測性標記抗體。可以用金屬螯合基團如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)將這些金屬連接到抗體上。
還可以將抗體偶聯到化學發光化合物上可檢測性標記抗體。然後通過檢測是否存在化學反應期間產生的發光確定化學發光標記抗體的存在性。特別有用的化學發光標記化合物的實例是魯米諾、異魯米諾、theromatic acridinium ester、咪唑、acridinium鹽和草酸酯。
同樣，生物發光化合物可用於標記本發明的抗體。生物發光是一種在生物系統中發現的化學發光，其中催化性蛋白質增加化學發光反應的效率。對於標記目的，重要的生物發光化合物是螢光素、螢光素酶和水母發光蛋白。
5.11.2蛋白質陣列特異性和/或選擇性結合到本發明生物標誌物的蛋白質產物上的多肽可以被固定化到蛋白質陣列上。蛋白質陣列可以用作診斷工具，如用於篩選醫學樣品(如分離的細胞、血、滑液、血清、活組織樣品等)是否存在本發明生物標誌物的多肽蛋白質產物。蛋白質陣列還可以包括抗體以及其它配體，如結合到本發明生物標誌物編碼的多肽上的抗體或配體。
產生多肽陣列的方法已經描述，如見De Wildt et al.，2000，Nature Biotech.18989-994；Lueking et al.，1999，Anal.Biochem.270103-111；Ge，2000，Nuc.AcidsRes.28e3；MacBeath and Schreiber，2000，Science 2891760-1763；國際公開No.WO01/40803和WO 99/51773A1；和U.S.Patent No.6,406,921。用於陣列的多肽可以高速點斑，如使用商品機器人裝置，如來自Genetic MicroSystems和Affymetrix(SantaClara，California，USA)或BioRobotics(Cambridge，UK)的機器人裝置。陣列基質例如可以是硝酸纖維素、塑料、玻璃，如表面改性玻璃。陣列還可以包括多孔基質，如丙烯醯胺、瓊脂糖或另一種聚合物。
例如，陣列可以是抗體陣列，如De Wildt同上所述。產生多肽配體的細胞可以陣列格式生長在濾膜上。誘導多肽產生，並且表達的抗體被固定到濾膜的細胞位置處。關於陣列上每個地址的結合程度的信息可以作為譜圖例如保存於計算機資料庫中。
在一個實施方案中，陣列是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或全部或任何組合的本發明生物標誌物的蛋白質產物的陣列。在一個方面，本發明提供結合到陣列上的抗體，所述抗體選擇性結合到本發明生物標誌物的蛋白質產物上。
5.12蛋白質生成可以使用標準重組核酸方法表達本發明的多肽或抗體(如本發明生物標誌物的蛋白質產物)。一般來說，將編碼多肽的核酸序列克隆到核酸表達載體中。當然，如果蛋白質包括多條多肽鏈，每條鏈必須被克隆入表達載體中，如相同或不同載體中，在相同或不同細胞中表達。如果蛋白質足夠小，即蛋白質是小於50個胺基酸的肽，可以用自動有機合成方法合成蛋白質。從僅含有與生物標誌物的5』區、3』區或內部編碼區對應的核酸序列的核酸表達載體表達包含本發明生物標誌物的5』區、3』區或內部編碼區的多肽。產生針對本發明生物標誌物的蛋白質產物或由本發明生物標誌物的5』區、3』區或內部編碼區所編碼多肽的抗體的方法。
除了編碼多肽或其片段的部分以外，表達多肽的表達載體還可以包括與感興趣核酸可操作連接的調節序列，例如包括啟動子。大量合適的載體和啟動子對本領域技術人員已知，並且可以商業獲得，以產生本發明的重組構建體。示例性提供以下載體。細菌pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，California，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。一種優選類型的優選文庫是展示文庫，以下將描述。
本領域技術人員公知的方法可以用於構建含本發明多核苷酸和適當轉錄/翻譯控制信號的載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內重組/遺傳重組。例如見，描述於下文的技術Sambrook Russel，Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1989)。啟動子區可以選自任意期望的基因，使用CAT(氯黴素轉移酶)載體或其它帶選擇標記的載體。兩種適當的載體是pKK232-8和pCM7。具體名稱的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。真核啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉錄病毒的LTR、小鼠金屬硫蛋白-I和多種已知組織特異性啟動子。在具體實施方案中，啟動子是誘導型啟動子。在其它一些實施方案中，啟動子是組成型啟動子。在另外的一些實施方案中，啟動子是組織特異性啟動子。
一般來說，重組表達載體將包括複製起點和允許轉化宿主細胞的選擇標記，如大腸桿菌的氨苄青黴素抗性基因和釀酒酵母的營養缺陷標記(如URA3、LEU2、HIS3和TRP1基因)，和來源於高表達基因、指導下遊結構序列轉錄的啟動子。這種啟動子可以來源於編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油激酶(PGK)的操縱子、a-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白。本發明的多核苷酸以適當形式與翻譯起始和終止序列組裝，優選的是與能指導翻譯蛋白質分泌到周質區或細胞外介質中的前導序列組裝。任選地，本發明核酸可以編碼包括N-末端鑑定肽的融合蛋白，所述肽賦予期望的特性，如穩定或簡化純化所表達重組產物。通過插入本發明的多核苷酸以及合適的翻譯起始和終止信號，任選地與可操作閱讀形式的功能性啟動子，從而構建可用於細菌的表達載體。載體將包含一或多種表型選擇標記和複製起點，以確保載體維持，當期望時提供宿主內擴增。適用於轉化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和假單孢菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的多種物種，儘管其它物種也可以作為選擇。
作為代表性但非限制性的實例，可用於細菌的表達載體可以包含選擇標記和細菌複製起點，它們來源於商品化質粒，其中包含公知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件。這些商品化載體例如包括pKK223-3(Pharmacia Fine Chemical，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega，Madison，Wisconsin，USA)。
本發明提供含有本發明多核苷酸的基因工程化宿主細胞。例如，這樣的宿主細胞可以含有用已知轉化、轉染或感染方法導入宿主細胞的本發明核酸。本發明還提供表達本發明多核苷酸的基因工程化宿主細胞，其中這些多核苷酸與和宿主細胞異源的調節序列可操作連接，所述調節序列驅動所述多核苷酸在細胞中表達。
本發明還提供含有本發明載體的宿主細胞，其中所述核酸已經用已知轉化、轉染或感染方法導入宿主細胞中。宿主細胞可以是真核宿主細胞，如哺乳動物細胞、低等真核宿主細胞如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。例如，通過磷酸鈣轉染、DEAE、葡聚糖介導的轉染或電穿孔可以實現重組構建體向宿主細胞的導入(Davis，L.et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。也可以利用無細胞翻譯系統用來源於本發明的DNA構建體的RNA來產生這些蛋白質。
可用任何宿主/載體系統表達表2列出的一種或多種蛋白質。用於原核和真核宿主的適當克隆和表達載體描述於Sambrook et al.，in Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New York(1989)，其全部公開內容經引用併入本文。最優選的宿主細胞是正常不表達特定多肽或低天然水平表達所述多肽的細胞。
在一個具體實施方案中，宿主細胞被工程化以在誘導型調節元件控制下表達包含本發明多核苷酸的內源基因，該情況下所述內源基因的調節元件可以通過同源重組而置換。如本文所述，基因打靶可用於將基因的已存在調節區替換為從不同基因分離的調節序列或經基因工程方法合成的新調節序列。這些調節序列可以包含啟動子、增強子、骨架附著區、負調節元件、轉錄起始位點、調節性蛋白質結合位點或所述序列的組合。作為替代方案，影響所生成RNA或蛋白質的結構或穩定性的序列可以被替換、去除、添加或經靶向修飾，包括多聚腺苷酸化信號、mRNA穩定性元件、剪接位點、增強或修飾蛋白質轉運或分泌性質的前導序列，或者改變或提高蛋白質或RNA分子的功能或穩定性的其它序列。
本發明的宿主還可以是酵母或其它真菌。在酵母中，可以使用含組成型或誘導型啟動子的多種載體。綜述請見Ausubel et al.(eds)，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.2，Greene Publish.Assoc. Wiley Interscience，Ch.13(1988)；Grant etal.，1987，″Expression and Secretion Vectors for Yeast″，Methods Enzymol.153516-544；Glover，DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3(1986)；Bitter，1987，″Heterologous Gene Expression in Yeast″，Methods Enzymol.152673-684；和Strathern et al.(eds)，The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces，Cold Spring Harbor Press，Vols.I and II(1982)。
潛在適用的酵母菌株包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、克魯維酵母菌株、念珠菌或能表達異源蛋白質的任何酵母菌株。潛在適用的細菌株包括大腸桿菌、腸桿菌科如粘質沙雷氏菌、芽孢桿菌如枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單孢菌或能表達異源蛋白質的任何細菌株。如果在酵母或細菌中生產蛋白質，可能有必要修飾產生的蛋白質，例如通過磷酸化或糖基化適當的位點，以獲得功能性蛋白質。這些共價連接可以用已知化學或酶方法實現。
也可以用多種哺乳動物細胞培養系統表達重組蛋白質。哺乳動物表達系統的實例包括猴COS細胞如描述於Gluzman，1981，Cell 23175(1981)的COS-7猴腎成纖維細胞系、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人腎293細胞、人上皮A431細胞、人Colo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、正常二倍體細胞、來源於原代組織體外培養的細胞株，原代外植體、HeLa細胞、小鼠L細胞、BHK、HL-60、U937、HaK、C127、3T3或Jurkat細胞，以及能表達兼容性載體的其它細胞系。哺乳動物表達載體將包含複製起點、合適的啟動子以及任何必要的核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和5』旁側非轉錄序列。
用於表達蛋白質的微生物細胞可以用任何方便的方法破碎，包括反覆凍融、超聲、機械破碎或使用細胞裂解劑。通常通過從細胞沉澱中初步提取和隨後一或多步的鹽析、水性離子交換或體積排阻層析步驟，從而分離細菌培養物產生的重組多肽。在一些實施方案中，模板核酸還編碼多肽標籤，如五或六組氨酸。
可以用本領域公知技術分離重組蛋白質。例如，Scopes(Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-Verlag，New York(1994))提供了多種純化重組(和非重組)蛋白質的一般性方法。這些方法例如包括離子交換層析、體積排阻層析、親合層析、選擇性沉澱、透析和疏水相互作用層析。
不偏離本發明的實質和範圍，本領域技術人員將可以進行本文所述內容的變化、改進和其它實現方式。
為了所述本發明可以更全面理解，給出以下實施例。應該理解，這些實施例僅用於示例性目的，而不應認為以任何方式限制本發明。
5.13鑑定用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的化合物的方法5.13.1鑑定調節生物標誌物的表達或活性的化合物的方法本發明提供鑑定結合到本發明生物標誌物的產物上的化合物的方法。本發明還提供鑑定調節本發明生物標誌物的產物的表達和/或活性的化合物的方法。通過這些方法鑑定的化合物可用於建立研究肝癌的一種或多種動物模型。而且，通過這些方法鑑定的化合物可作為先導化合物用於開發預防、治療、控制和/或改善肝癌或其症狀的預防和治療性組合物。這些方法特別有用，因為它們使得體內測試潛在預防劑和治療劑相關的努力和支出高效率地集中於經本文所述體外和離體方法鑑定的化合物上。
本發明提供鑑定待測試化合物的預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，所述方法包括(a)使表達本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質產物或其片段或者本發明一種或多種生物標誌物的RNA產物或其片段的細胞與測試化合物接觸；和(b)確定測試化合物結合蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分的能力，使得如果化合物結合到所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物、RNA部分上，則鑑定到待測試化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。例如，所述細胞可以是酵母細胞或哺乳動物來源的細胞。例如，通過將測試化合物與放射性同位素或酶標記物偶聯，使得可以通過檢測複合物中的標記化合物來確定測試化合物與蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分的結合，從而可以確定測試化合物結合蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分的能力。例如，測試化合物可以用125I、35S、14C或3H直接或間接標記，通過直接計數放射活性或通過閃爍計數來檢測放射性同位素。作為替代方案，可以用酶標記測試化合物，例如用辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶標記，並通過確定適當底物向產物的轉化來檢測酶標記物。在一個具體實施方案中，測試包括使表達本發明的一或多種生物標誌物的蛋白質產物或其片段或者本發明的一或多種生物標誌物的RNA產物或其部分的細胞與結合所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分的已知化合物接觸，以形成測試混合物，將測試混合物與測試化合物接觸，並確定測試化合物與所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分相互作用的能力，其中確定測試化合物與所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分相互作用的能力包括確定測試化合物與所述已知化合物相比優先結合到所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分上的能力。
本發明提供鑑定待測化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，所述方法包括(a)使本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質產物或其片段、或者本發明一種或多種生物標誌物的RNA產物或其部分與測試化合物接觸；和(b)確定測試化合物結合蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分的能力，使得如果化合物結合到所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分上，則鑑定到待測試化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。可以直接或間接確定測試化合物與蛋白質產物或蛋白質片段的結合。在一個具體實施方案中，測試包括使本發明的一或多種生物標誌物的蛋白質產物或其片段或者本發明的一或多種生物標誌物的RNA產物或其部分與結合所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分的已知化合物接觸，以形成測試混合物，將測試混合物與測試化合物接觸，並確定測試化合物與所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分相互作用的能力，其中確定測試化合物與所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分相互作用的能力包括確定測試化合物與所述已知化合物相比優先結合到所述蛋白質產物、蛋白質片段、RNA產物或RNA部分上的能力。可使用本領域公知技術確定測試化合物與本發明的生物標誌物的蛋白質產物或其片段或者本發明的生物標誌物的RNA產物或其部分之間的結合。
在本發明以上測試方法的一些實施方案中，可能希望固定本發明的生物標誌物的RNA產物或其部分或者其靶分子，以促進複合形式與未複合形式的RNA產物或RNA部分、靶分子或二者的分離，並容許測試自動化。在本發明的以上測試方法的超過一種實施方案中，可能希望固定本發明的生物標誌物的蛋白質產物或其片段或者其靶分子，以促進複合形式與未複合形式的一種或全部兩種蛋白質的分離，並容許測試自動化。可以在適於含有反應物的任何容器中進行測試化合物與本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段的結合。這種容器的實例包括微滴定板、試管和微離心管。在一個實施方案中，可以提供融合蛋白質，其中增加一個結構域，允許一種或全部兩種蛋白質與基質結合。例如，穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白可以吸附到穀胱甘肽Sepharose珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或穀胱甘肽衍生化的微滴定板上，然後與測試化合物或者測試化合物與非吸附的靶蛋白或者本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段組合，並將混合物在有益於形成複合物的條件下(如生理鹽和pH條件)孵育。孵育以後，洗滌珠子或微滴定板孔以去除任何未結合成分，並例如上述直接或間接測定複合物的形成。作為替代方案，複合物可以從基質解離，並可以用標準技術確定本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段的結合水平。
固定蛋白質到基質上的其它技術也可以用於本發明的篩選測試中。例如，本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段或者靶分子可以用生物素和親合素的偶聯被固定化。可以用本領域公知的技術(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals；Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)製備生物素化的本發明生物標誌物的蛋白質產物或靶分子，並固定化到鏈親和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。作為替代方案，可以將與本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段反應的抗體衍生化到板孔中，蛋白質通過抗體偶聯被捕獲到孔中。除了對於GST固定化複合體所述的以外，檢測這些複合物的方法還包括用可與本發明生物標誌物的蛋白質產物反應的抗體免疫檢測複合物，以及依賴於檢測與本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段或靶分子相關的酶活性的酶聯測試。
本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段與測試化合物的相互作用或結合也可以用這些蛋白質或蛋白質片段作為「誘餌蛋白」在雙雜交測試或三雜交測試中進行確定(例如見美國專利號5,283,317；Zervos et al.(1993)Cell 72223-232；Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel et al.(1993)Bio/Techniques 14920-924；Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 81693-1696；和國際公開No.WO 94/10300)。
本發明提供鑑定待測化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，所述方法包括(a)使表達本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質或RNA產物的細胞與測試化合物接觸；(b)確定(a)中存在的蛋白質或RNA產物的量；和(c)將(a)中的量和未與測試化合物接觸的對應對照細胞中的存在量比較，使得如果蛋白質或RNA產物的量相對於對照中的量發生變化，則鑑定到待測化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。在一個具體實施方案中，用本文所述測試(如微陣列或RT-PCR)或本領域技術人員公知的測試確定表達水平相對於對照中的表達水平改變了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在替代性實施方案中，這種方法包括確定細胞中存在的本發明生物標誌物中至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、1-5種、1-10種、5-10種、5-25種、全部或任意組合的蛋白質或RNA產物的量，以及比較對照中存在的那些的量。
用於本文所述基於細胞的測試的細胞可以用本領域已知技術被工程化，以表達本發明的生物標誌物。例如見美國專利號6,245,527中標題為「重組表達載體和宿主細胞」的第三節，其內容經引用併入本文。作為替代方案，可以使用內源性表達本發明生物標誌物的細胞。例如，可以使用肝癌細胞。
在一個具體實施方案中，肝癌細胞分離自「正常」個體或患有肝癌的個體，並在存在和缺少測試化合物的條件下孵育不同時間(即30分鐘、1小時、5小時、24小時、48小時和96小時)。篩選預防或治療劑時，本發明生物標誌物的全序列或其功能部分的克隆被用於轉染肝癌細胞。轉染的肝癌細胞在存在和缺少測試化合物的條件下培養不同時間(即1、2、3、5、7、10或14天)。孵育以後，從肝癌細胞製備靶核酸樣品並與對應肝癌中差異表達的核酸序列的核酸探針雜交。根據本領域公知方法和本文所述標記核酸探針，例如使用放射性標記物標記。通過Northern印跡進行雜交，例如同上Ausubel et al或同上Sambrook et al中所述。如本文定義，相對於來自肝癌的RNA，靶與來自正常的陣列上的樣品的差異雜交指示對應於差異表達的特異性核酸序列的RNA表達水平。存在測試化合物下的孵育步驟導致靶序列表達水平的改變，指示為增加或降低相應的肝癌生物標誌物特異性核酸序列表達的化合物。
本發明還提供鑑定待測化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，所述方法包括(a)使無細胞提取物(如肝細胞提取物)與編碼本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質或RNA產物的核酸序列以及測試化合物接觸；(b)確定(a)中存在的蛋白質或RNA產物的量；和(c)將(a)中的量和未與測試化合物接觸的相應對照中存在的量進行比較，使得如果蛋白質或RNA產物的量相對於對照中的量發生變化，則鑑定到待測化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。在一個具體實施方案中，用本文所述測試(如微陣列或RT-PCR)或本領域技術人員公知的測試確定表達水平相對於對照中的表達水平改變了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在替代性實施方案中，這種方法包括確定提取物中存在的本發明生物標誌物中至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少45種、至少50種、1-5種、1-10種、5-10種、5-25種或10-25種、全部或任意組合的蛋白質或RNA產物的量，以及比較對照中存在的那些的量。
在某些實施方案中，確定本發明生物標誌物的RNA產物的量，在另一些實施方案中，確定本發明生物標誌物的蛋白質產物的量，而在又一些實施方案中，確定本發明生物標誌物的RNA和蛋白質產物的量。可以使用確定本發明生物標誌物的RNA或蛋白質產物的量的標準方法和組合物。這樣的方法和組合物在以上已詳細描述。
在具體實施方案中，在本文所述篩選測試中，用試劑盒確定本發明生物標誌物的RNA或蛋白質產物的量。這樣的試劑盒包含測定至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個或更多個蛋白質或RNA產物表達需要的材料和試劑。在具體實施方案中，試劑盒還可以包含用於所述多種方法的一或多種附加的試劑，如(1)從血、肝癌細胞純化RNA的試劑；(2)產生測試核酸的引物；(3)dNTP和/或rNTP(預混的或分離的)，任選具有一或多種獨特標記的dNTP和/或rNTP(如生物素化或Cy3或Cy5標記的dNTP)；(4)合成後標記實際，如螢光染料的化學活性衍生物；(5)酶，如逆轉錄酶、DNA聚合酶等；(6)多種緩衝介質，如雜交和洗滌緩衝液；(7)標記探針純化試劑和成分，如離心柱等；和(8)蛋白質純化試劑；(9)信號產生和檢測試劑，如鏈親合素-鹼性磷酸酶偶聯物、化學螢光或化學發光底物等。在具體實施方案中，試劑盒包含預標記的質量控制的蛋白質和/或RNA轉錄本(優選mRNA)用作對照。
在一些實施方案中，試劑盒是RT-PCR試劑盒。在另一些實施方案中，試劑盒是核酸陣列和蛋白質陣列。根據本發明的這些試劑盒將至少包含具有本發明的相關蛋白質或核酸成員的陣列及其包裝物。作為替代方案，本發明的蛋白質或核酸成員可以預包裝到陣列上。
在具體實施方案中，測定本發明生物標誌物的RNA產物的試劑盒包含測定RNA產物表達必需的材料和試劑。例如可以使用微陣列或RT-PCR試劑盒，其僅含有測定至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物水平所必需的試劑和材料。或者，在一些實施方案中，試劑盒可以包含不限於測定1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物水平所必需的材料和試劑。例如，除了測定至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個本發明生物標誌物以外的基因的RNA產物水平所必需的材料和試劑以外，微陣列試劑盒可以含有測定1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物水平所必需的材料和試劑。在一個具體實施方案中，微陣列或RT-PCR試劑盒含有測定至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物、和1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450個或更多個不是本發明生物標誌物的基因、或1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000或500-1000個不是本發明生物標誌物的基因的RNA產物水平所必需的材料和試劑，對於核酸微陣列試劑盒，試劑盒一般包含附著到固相支持物表面的探針。可用可檢測標記物標記探針。在一個具體實施方案中，探針特異性針對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的5』區、3』區、內部編碼區、外顯子、內含子、外顯子連接處或外顯子-內含子連接處。微陣列試劑盒可以包含實施測試和方法的說明書，以解釋和分析實施測試所得的數據。試劑盒還可以包含雜交試劑和/或檢測探針與靶核酸序列雜交時產生的信號所必需的試劑。一般來說，微陣列試劑盒的材料和試劑在一個或多個容器中。試劑盒的每種組分一般在各自的合適容器中。
對於RT-PCR試劑盒，試劑盒一般包含預選的引物，它們特異性針對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的特定RNA產物(如外顯子、內含子、外顯子連接處、或外顯子-內含子連接處)。RT-PCR試劑盒還可以包含適於逆轉錄和/或擴增核酸的酶(如聚合酶，諸如Taq)，和進行逆轉錄反應與擴增的反應混合物所需要的脫氧核苷酸和緩衝液。RT-PCR試劑盒還可以包含特異性針對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的探針。所述探針可以標記或不標記可檢測標記物(如螢光標記物)。RT-PCR試劑盒的每種組分一般在各自的合適容器中。因此，這些試劑盒一般包含適於每種試劑、酶、引物和探針的不同容器。而且，RT-PCR試劑盒可以包含實施測試和方法的說明書，用於解釋和分析實施測試所得的數據。
對於基於抗體的試劑盒，試劑盒例如可以包含(1)第一抗體(可以與固相支持物連接或不連接)，它結合感興趣蛋白質(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個、全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質產物)；和任選地，(2)不同的第二種抗體，它結合所述蛋白質或第一抗體，並與可檢測標記物(如螢光標記物、放射性同位素或酶)偶聯。基於抗體的試劑盒還可以包含進行免疫沉澱的珠子。基於抗體的試劑盒的每種組分一般在各自的合適容器中。因此，這些試劑盒一般包含適於每種抗體的不同容器。而且，基於抗體的試劑盒可以包含實施測試和方法的說明書，用於解釋和分析實施測試所得的數據。
還可以進行基於報告基因的測試以鑑定待測試化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。在一個具體實施方案中，本發明提供鑑定待測試化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，所述方法包括(a)使化合物與表達報告基因構建體的細胞接觸，所述報告基因構建體包含與本發明生物標誌物的調節元件(如啟動子/增強子元件)可操作連接的報告基因；(b)測定所述報告基因的表達；和(c)將(a)中的量和未與測試化合物接觸的對應對照細胞中的存在量比較，使得如果報告基因表達量相對於對照中的量發生變化，則鑑定到待測化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。根據這種實施方案，所述細胞可以天然表達所述生物標誌物或被工程化表達所述生物標誌物。在另一個實施方案中，本發明提供鑑定待測試化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，所述方法包括(a)使化合物與無細胞提取物和報告基因構建體接觸，所述報告基因構建體包含與本發明生物標誌物的調節元件(如啟動子/增強子元件)可操作連接的報告基因；(b)測定所述報告基因的表達；和(c)將(a)中的量和未與測試化合物接觸的對應對照中的存在量比較，使得如果報告基因表達量相對於對照中的量發生變化，則鑑定到待測化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。
本領域技術人員公知的任何報告基因可以用於根據本發明方法使用的報告基因構建體中。報告基因表示編碼通過其存在(如通過RT-PCR、Northern印跡、Western印跡、ELISA等)或活性而容易檢測的RNA轉錄本或蛋白質的核苷酸序列。報告基因的非限制性實例列於下表6。通過本領域技術人員公知的任何方法可以獲得報告基因並確定所述元件的核苷酸序列。報告基因的核苷酸序列例如可以從文獻或資料庫如GenBank中獲得。作為替代方案，編碼報告基因的多核苷酸可以從合適來源的核酸產生。如果含編碼特定報告基因的核酸的克隆不可獲得，但所述報告基因的序列已知，編碼所述報告基因的核酸可以化學合成或經PCR從合適來源(如cDNA文庫、或從中產生的cDNA文庫、或核酸，優選優選polyA+RNA，分離自表達所述報告基因的任何組織或細胞)獲得。一旦確定報告基因的核苷酸序列，可以用操作核苷酸序列的本領域公知方法，如重組DNA技術、定點突變、PCR等(例如見以下描述的技術Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel et al.，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，NY，二者的全部內容經引用併入本文)操作所述報告基因的核苷酸序列，以產生具有不同胺基酸序列的報告基因，例如創建胺基酸替換、缺失和/或插入。
表6報告基因和報告基因產物的性質
根據本發明，天然或正常表達一或多種、全部或任意組合的本發明生物標誌物的細胞可用於本文所述的方法。作為替代方案，可以用本領域公知的技術和用於本文所述方法的技術將細胞工程化以表達一或多種、全部或任意組合的本發明生物標誌物或報告基因。這些技術的實例包括但不限於磷酸鈣沉澱(例如見Graham Van derEb，1978，Virol.52546)、葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣介導的轉染、polybrene介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、核酸包裹於脂質體中和直接將核酸微注射到核中。
在一個具體實施方案中，用於本文所述方法的細胞是肝癌細胞或細胞系、淋巴細胞(T或B細胞)、單核細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、紅細胞或血小板。在一個優選實施方案中，用於本文所述方法的細胞是肝癌細胞。在一個優選實施方案中，用於本文所述方法的細胞是淋巴細胞。在另一個優選實施方案中，用於本文所述方法的細胞是永生化細胞系，例如來源於組織。
根據本發明所述方法可以使用允許核酸的翻譯和任選但優選轉錄的任何無細胞提取物。所述無細胞提取物可以從任何物種來源的細胞分離。例如，無細胞提取物可以分離自人細胞、培養小鼠細胞、培養大鼠細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、爪蟾卵母細胞、兔網織紅細胞、小麥胚或黑麥胚(例如見Krieg Melton，1984，Nature308203和Dignam et al.，1990 Methods Enzymol.182194-203)。作為替代方案，無細胞提取物，例如兔網織紅細胞和小麥胚提取物，可以購自例如Promega(Madison，WI)。在一個優選實施方案中，無細胞提取物是分離自人細胞的提取物。在一個具體實施方案中，所述人細胞是HeLa細胞、淋巴細胞或肝癌細胞或細胞系。
除了調節本發明生物標誌物的RNA和/或蛋白質產物表達水平的能力以外，至少在某些情況下，可以期望化合物調節本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性。因此，本發明提供鑑定待測試化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，其包括鑑定調節本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質產物活性的化合物的方法。這樣的方法包括(a)使表達本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質產物的細胞與測試化合物接觸；(b)確定所述蛋白質產物的活性水平；和(c)將活性水平和未與測試化合物接觸的對應對照細胞中的相比較，使得如果(a)中的活性水平相對於對照中的活性水平發生變化，則鑑定到待測化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。在一個具體實施方案中，用本文所述測試(如微陣列或RT-PCR)或本領域技術人員公知的測試確定活性水平相對於對照中的活性水平改變了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在替代性實施方案中，這種方法包括確定細胞中存在的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、1-5種、1-10種、5-10種、5-25種或10-40種、全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性水平，以及與對照中存在的活性水平進行比較。
本發明提供鑑定待測試化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力的方法，其中包括鑑定調節本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質產物活性的化合物的方法。這樣的方法包括(a)使無細胞提取物與編碼本發明一種或多種生物標誌物的蛋白質產物的核酸以及測試化合物接觸；(b)確定所述蛋白質產物的活性水平；和(c)將活性水平和未與測試化合物接觸的對應對照中的相比較，使得如果(a)中的活性水平相對於對照中的活性水平發生變化，則鑑定到待測化合物具有預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力。在一個具體實施方案中，用本文所述測試(如微陣列或RT-PCR)或本領域技術人員公知的測試確定活性水平相對於對照中的活性水平改變了5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、5-25％、10-30％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、4倍、5倍、10倍、25倍、1-10倍或5-25倍。在替代性實施方案中，這種方法包括確定樣品中存在的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少45種、至少50種、1-5種、1-10種、5-10種、5-25種或10-40種、全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性水平，以及與對照中存在的活性水平進行比較。
可用標準技術確定本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性水平。本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性可以用本領域公知技術確定。
5.13.2利用化合物的生物活性的方法為了鑑定待測試化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的能力(為方便起見，本文中稱為「先導」化合物)，可以進一步研究所述化合物。例如，經本發明方法鑑定的化合物可以進一步在認可的肝癌動物模型中進行體內測試。而且，可以分析經所述方法鑑定的化合物的特異性。這些另外的化合物研究技術對本領域技術人員是公知的。
在一個實施方案中，可以通過測定靶細胞的細胞生長或活力來評價先導化合物的作用。可以用肝癌中涉及的細胞類型的代表性細胞(如肝癌細胞)進行這樣的測試。作為替代方案，可以用細胞系的細胞代替培養的患者細胞來篩選先導化合物。
可以用本領域公知的很多測試來評價暴露於先導化合物以後患者細胞或細胞系的存活和/或生長；例如，細胞增殖的測定可以通過測定溴脫氧尿嘧啶(BrdU)摻入(例如見Hoshino et al.，1986，Int.J.Cancer 38，369；Campana et al.，1988，J.Immunol.Meth.10779)或(3H)-胸腺嘧啶摻入(例如見Chen，J.，1996，Oncogene131395-403；Jeoung，J.，1995，J.Biol.Chem.27018367-73)，通過直接細胞計數，通過檢測已知基因如原癌基因(如fos、myc)或細胞周期標誌物(Rb、cdc2、細胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)轉錄、翻譯或活性改變。這種蛋白質和RNA(如mRNA)和活性的水平可以用本領域公知的任何方法確定。例如可以用已知的免疫診斷方法如Western印跡或免疫沉澱用商品抗體定量蛋白質。可以用本領域公知和常用的方法例如用Northern分析、RNase保護、逆轉錄結合聚合酶鏈式反應來定量mRNA。可以用臺盼藍染色或本領域已知的其它細胞死亡或活力標誌物評價細胞活力。在一個具體實施方案中，測定細胞ATP的水平以確定細胞活力。例如可以通過基於形態學改變的觀察評價分化。
5.13.3動物模型化合物在用於人之前可以在合適的動物模型系統中加以測試。這些動物模型系統包括但不限於大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔等。可以使用本領域公知的任何動物系統。在某些實施方案中，在小鼠模型中測試化合物。可以重複給予化合物。
可以用公認的動物模型確定經上述方法鑑定到的化合物預防、治療、控制和/或改善肝癌或其症狀的效果。
5.13.4毒性可以通過標準藥學方法在細胞培養物或試驗動物中確定根據本發明鑑定到的化合物的毒性和/或效果，例如確定LD50(群體中50％致死的劑量)和ED50(群體中50％有治療效果的劑量)。可以用於評價根據本發明鑑定到的化合物的細胞毒性的細胞和細胞系包括但不限於外周血單核細胞(PBMC)、Caco-2細胞和Huh7細胞。毒性和治療作用之間的劑量比是治療指數，它可以表示為LD50/ED50的比。優選根據本發明鑑定的表現大治療指數的化合物。雖然可以使用根據本發明鑑定的表現毒副作用的化合物，應該仔細設計遞送系統，使這些藥劑靶向受影響組織的部位，以最小化對未感染細胞的潛在破壞並因而降低副作用。
從細胞培養測試和動物研究中獲得的數據可以用於配製根據本發明鑑定的化合物用於人時的劑量範圍。這些藥劑的給藥劑量優選處於包括ED50而有很少或沒有毒性的循環濃度範圍內。根據所用劑量形式和給藥途徑可以在此範圍內改變給藥劑量。對於任何用於本發明方法的藥劑，可以從細胞培養測試初步估計治療有效劑量。劑量可以配製成在動物模型中達到循環血漿濃度範圍，包括細胞培養確定的IC50(即達到症狀最大抑制作用一半的化合物濃度)。這些信息可以用於更精確的確定用於人的劑量。例如通過高效液相層析可以測定血漿水平。
5.13.5同源物或類似物設計顯示期望生物活性的化合物可以用作先導化合物，以開發或設計具有有用藥理活性的同源物或類似物。例如，一旦鑑定到先導化合物，就可以用分子建模技術設計該化合物的可能更有效的變體。分子建模系統的實例是CHARM和QUANTA程序(Polygen Corporation，Waltham，MA)。CHARM執行能量最小化和分子動力學函數。QUANTA執行構建、圖形建模和分子結構分析。QUANTA允許構建、修飾、顯示和分析分子間的行為。
很多論文評論了與特異性蛋白質相互作用的藥物計算機建模，如Rotivinen et al.，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97159-166；Ripka，1998，New Scientist 54-57；McKinaly Rossmann，1989，Annu.Rev.Pharmaeol.Toxiciol.29111-122；Perry Davies，OSARQuantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis Dean，1989，Proc.R.Soc.Lond.236125-140 and 141-162；Askew et al.，1989，J.Am.Chem.Soc.1111082-1090。篩選和圖形描述化學物的其它電腦程式可以從一些公司獲得，如BioDesign公司(Pasadena，California)、Allelix公司(Mississauga，Ontario，Canada)和Hypercube公司(Cambridge，Ontario)。儘管這些主要設計用於特異性針對特定蛋白質的藥物，可以修改它們用於設計特異性針對任何鑑定區域的藥物。可以用上述生物活性的篩選測試類似物和同源物與感興趣蛋白質(即本發明生物標誌物的蛋白質產物)的結合。作為替代方案，篩選中確認的具有很少或沒有生物活性的先導化合物也可以用於設計化合物的具有生物活性的類似物和同源物。
5.13.6化合物可以用本文所述方法測試和鑑定的化合物可以包括但不限於從任何商業來源獲得的化合物，包括Aldrich(1001 West St.Paul Ave.，Milwaukee，WI 53233)，SigmaChemical(P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)，Fluka Chemie AG(Industriestrasse25，CH-9471 Buchs，Switzerland(Fluka Chemical Corp.980 South 2nd Street，Ronkonkoma，NY 11779))，Eastman Chemical Company，Fine Chemicals(P.O.Box431，Kingsport，TN 37662)，Boehringer Mannheim GmbH(Sandhofer Strasse 116，D-68298 Mannheim)，Takasago(4 Volvo Drive，Rockleigh，NJ 07647)，SSTCorporation(635 Brighton Road，Clifton，NJ 07012)，Ferro(111 West Irene Road，Zachary，LA 70791)，Riedel-deHaen Aktiengesellschaft(P.O.Box D-30918，Seelze，Germany)，PPG Industries Inc.，Fine Chemicals(One PPG Place，34th Floor，Pittsburgh，PA 15272)。而且，用本發明方法可以篩選任何類型的天然產物，包括微生物、真菌、植物或動物提取物。
可以篩選來自大的合成或天然化合物庫的化合物。當前有很多手段可用於隨機和直接合成基於糖、肽和核酸的化合物。合成化合物庫可以從很多公司商業獲得，包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)和Microsource(New Milford，CT)。稀有化學物庫可以從Aldrich(Milwaukee，WI)獲得。可以獲得也可以製備組合化學庫。作為替代方案，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫例如可以從PanLaboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)獲得，或者容易用本領域公知的方法可重現地製備。此外，容易通過常規化學、物理和生化手段修飾天然和合成製備的庫和化合物。
另外，可以利用包括小分子測試化合物的測試化合物的多樣性庫。用本發明方法篩選的庫可以包含多種類型的化合物。可以根據本發明方法篩選的庫的實例包括但不限於類肽；隨機生物寡聚物；diversomers，如乙內醯脲、苯二氮和二肽；插烯(vinylogous)多肽；非肽的肽模擬物；寡聚氨基甲酸酯；肽膦酸酯；肽核酸庫；抗體庫；糖庫；和小分子庫(優選小有機分子庫)。在一些實施方案中，篩選庫中的化合物是核酸或肽分子。在非限制性的實例中，肽分子可以存在於噬菌體展示文庫中。在另一些實施方案中，化合物的類型包括但不限於肽類似物，包括含非天然胺基酸如D-胺基酸的肽，胺基酸的磷類似物如α-氨基磷酸和α-氨基磷酸，或具有非肽鍵的胺基酸，核酸類似物如硫代磷酸酯和PNA，激素，抗原，合成或天然藥物，阿片，多巴胺，血清素，兒茶酚胺，凝血酶，乙醯膽鹼，前列腺素，有機分子，信息素，腺苷，蔗糖，葡萄糖，乳糖和半乳糖。多肽或蛋白質的庫也可以用於本發明測試中。
在一個具體實施方案中，組合化學庫是小有機分子庫，包括但不限於苯二氮類、類異戊二烯、噻唑烷酮、metathiazanones、吡咯烷酮類、嗎啉代化合物和苯二氮類。在另一個實施方案中，組合化學庫包含類肽；隨機生物寡聚物；苯二氮類；diversomers如乙內醯脲、苯二氮類和二肽；插烯(vinylogous)多肽；非肽的肽模擬物；寡聚氨基甲酸酯；肽膦酸酯；肽核酸庫；抗體庫；或糖庫。組合化學庫自身是可以商業獲得的。例如庫可以從以下商業途徑獲得例如Specs and BioSpecs B.V.(Rijswijk，The Netherlands)，Chembridge Corporation(San Diego，CA)，ContractService Company(Dolgoprudny，Moscow Region，Russia)，Comgenex USA Inc.(Princeton，NJ)，Maybridge Chemicals Ltd.(Cornwall PL34 OHW，United Kingdom)，Asinex(Moscow，Russia)，ComGenex(Princeton，New Jersey)，Ru，Tripos，Inc.(St.Louis，Missouri)，ChemStar，Ltd(Moscow，Russia)，3D Pharmaceuticals(Exton，Pennsylvania)和Martek Biosciences(Columbia，Maryland)。
在一個優選實施方案中，預選擇所述庫，使得庫中的化合物更易於被細胞吸收。例如，基於特定參數選擇化合物，所述參數例如但不限於大小、親脂性、親水性和氫鍵，它們增強化合物進入細胞的可能性。在另一個實施方案中，用三維或四維計算機運算程序分析化合物。
根據本發明方法使用的組合化合物庫可以合成。對於創建小有機化合物的大集合或庫的合成方法有很多關注，它們可用於藥理、生物或其它活性的篩選。用於創建大組合化學庫的合成方法在溶液或在固相即固相支持物上進行。固相合成使得更容易進行多步反應並驅動反應以高產率完成，因為每個反應步驟以後可以容易地添加和洗去過量試劑。固相組合合成也傾向於改善分離、純化和篩選。然而，更傳統的液相化學支持比固相化學更寬範圍的有機反應。
本發明的組合化合物庫可以用Kilcoin等人的美國專利No.6,190,619所述的裝置合成，所述專利的全部內容經引用併入本文。美國專利No.6,190,619公開了能支持多個反應容器平行合成多種不相關的化合物或組合化合物庫的合成裝置。
在一個實施方案中，組合化合物庫可以在溶液中合成。Boger等人的美國專利No.6,194,612公開的方法表徵了用作液相合成組合庫的模板的化合物，該專利的全部內容經引用併入本文。設計模板，使得容易用液/液或固/液萃取使反應產物與未反應的反應物分離。用所述模板經組合合成產生的化合物優選是小有機分子。庫中的一些化合物可以模擬非肽或肽的作用。與固相合成組合化合物庫比較，液相合成不要求使用監測多步驟固相合成的各步驟的專門操作(Egner et al.，1995，J.Org.Chem.602652；Anderson et al.，1995，J.Org.Chem.602650；Fitch et al.，1994，J.Org.Chem.597955；Look et al.，1994，J.Org.Chem.497588；Metzger et al.，1993，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.32894；Youngquist et al.，1994，Rapid Commun.Mass Spect.877；Chu et al.，1995，J.Am.Chem.Soc.1175419；Brummel et al.，1994，Science264399；和Stevanovic et al.，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3431)。
用於本發明方法的組合化合物庫可以在固相支持物上合成。在一個實施方案中，使用裂分(split)合成法(在合成期間分離並混合固相支持物的操作方案)合成固相支持物上的化合物庫(例如見Lam et al.，1997，Chem.Rev.9741-448；Ohlmeyer etal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926及其中引用的參考文獻)。最終庫中的每種固相支持物具有連接在其表面的基本一種類型的化合物。在固相支持物上合成組合化合物庫的其它方法對本領域技術人員是公知的，其中一種產物連接到一種支持物上(例如見Nefzi et al.，1997，Chem.Rev.97449-472)。
在本發明的一些實施方案中，化合物可以經接頭附著到固相支持物上。接頭可以是整合在固相支持物上或是其部分，或者它們可以是非整合的，或者合成到固相支持物上或者在合成以後附著到其上。接頭不僅可用於提供化合物附著到固相支持物上的點，而且根據接頭的性質，允許在不同條件下從固相支持物上切除不同類型的分子。例如，接頭可以被親電切割、親核切割、光切割、酶切割、金屬切割、還原條件下切割或氧化條件下切割。在一個優選實施方案中，在高通量篩選化合物之前從固相支持物上切割化合物。
如果庫包含化合物的陣列或微陣列，其中每種化合物具有一個地址或標識符，所述化合物可以被去卷積(deconvoluted)，例如通過將陽性樣品交叉參考至應用於單個測試的原化合物列表上。
如果庫是肽或核酸庫，可以通過對肽或核酸直接測序來確定化合物的序列。這種方法對本領域技術人員是公知的。
很多物理化學技術可用於全新表徵化合物。這些技術的實例包括但不限於質譜、NMR光譜、X-射線晶體衍射和振動光譜。
5.14鑑定到的化合物預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的應用本發明提供預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的方法，所述方法包括向需要的對象給予一種或多種根據本發明方法鑑定的化合物。在某些實施方案中，所述對象患有輕度、中度、明顯或嚴重的肝癌。在一個優選實施方案中，所述對象是人。
在一個實施方案中，本發明提供預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的方法，所述方法包括向需要的對象給予預防或治療有效量的一種或多種根據本發明方法鑑定的化合物。在一個具體實施方案中，如果根據本發明方法鑑定的化合物之前已經用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀，則不給予這種化合物來預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一個實施方案中，如果根據本發明方法鑑定的化合物已經被建議用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀，則不給予這種化合物來預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一個實施方案中，根據本發明方法鑑定的化合物特異性結合到本發明的僅一種生物標誌物的蛋白質或RNA產物上和/或改變其表達和/或活性水平。在另一個實施方案中，如果根據本發明方法鑑定的化合物結合到表1的一種、兩種、三種、全部或任意組合的以下生物標誌物的蛋白質或RNA產物上和/或改變其表達和/或活性水平，則不給予這種化合物來預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一個實施方案中，根據本發明方法鑑定的化合物結合到本發明的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種或更多種生物標誌物的蛋白質或RNA產物上和/或改變其表達和/或活性水平。
本發明還提供預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的方法，所述方法包括向需要的對象給予一種或多種根據本文所述篩選方法鑑定的化合物，和一或多種其它治療(如預防或治療劑和手術)。在一個具體實施方案中，這些治療當前正在用於、已經用於或已知可用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀(包括但不限於本文所列舉的預防或治療劑)。本發明的組合治療的治療(如預防或治療劑)可以依次給予或同時給予。在一個具體實施方案中，本發明的組合治療包括根據本發明鑑定的化合物和具有與所述化合物相同機制的至少一種其它治療。在另一個具體實施方案中，本發明的組合治療包括根據本發明方法鑑定的化合物和具有與所述化合物不同機制的至少一種其它治療(如預防或治療劑)。通過與具有疊加或協同作用的化合物一起發揮功能，本發明的組合治療提高本發明化合物的預防或治療效果。本發明的組合治療降低與所述治療(如預防或治療劑)相關的副作用。
可以在相同藥物組合物中向對象給予所述組合治療的預防或治療劑。作為替代方案，可以在分離的藥物組合物中同時向對象給予所述組合治療的預防或治療劑。可以經相同或不同的給藥途徑向對象給予所述預防或治療劑。
在具體實施方案中，將包含本文所述測試中鑑定的一種或多種化合物的藥物組合物給予對象，優選人，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。根據本發明，所述藥物組合物還可以包含一種或多種預防或治療劑。這些藥劑優選當前正在用於、已經用於或已知可用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。
根據本發明方法鑑定的化合物可以用作肝癌的一線、二線、三線、四線或五線治療。本發明向不適合常規肝癌治療的對象提供治療、控制或改善肝癌或其症狀的方法，所述方法包括向所述對象給予預防或治療有效劑量的根據本發明方法鑑定的化合物。
本發明向不適合現有的單藥劑肝癌治療的對象提供治療、控制或改善肝癌或其症狀的方法，所述方法包括向所述對象給予預防或治療有效劑量的根據本發明方法鑑定的化合物和預防或治療有效劑量的一種或多種其它治療(如預防或治療劑)。本發明還提供通過向已證明抗其它治療且不再進行這些治療的患者給予根據本發明方法鑑定的化合物以及任何其它治療(如手術)的組合而治療或控制肝癌的方法。本發明還提供治療或控制患有肝癌以及因之前接受其它治療而受到免疫抑制的患者的方法。本發明還提供當激素治療和/或生物治療/免疫治療對於正在治療或控制的對象已經證明或可能證明毒性太大時，即導致不可接受或不能忍受的副作用時治療或控制肝癌的替代性方法。
5.15本發明的化合物根據本發明方法可用於預防、治療、控制和/或改善肝癌或其症狀的化合物的代表性、非限制性實例在下面詳細描述。
第一，這樣的化合物例如可以包括能下調本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物表達或活性的反義、核酶或三螺旋化合物。這些化合物將在下面的小節中詳細描述。
第二，這樣的化合物例如可以包括能調節本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物的表達、或者本發明生物標誌物的蛋白質產物活性的抗體組合物。在一個具體實施方案中，所述抗體組合物下調本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物的表達，或本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性。這些化合物將在下面的小節中詳細描述。
第三，這樣的化合物例如可以包括本發明生物標誌物的蛋白質產物。本發明涉及選用於模擬本發明生物標誌物的蛋白質產物的肽或肽模擬物用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的用途。而且，這樣的化合物例如可以包括能調節本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物的表達、或本發明生物標誌物的蛋白質產物的活性的顯性失活多肽。
所述方法還涉及本發明生物標誌物的蛋白質產物的衍生物、類似物和片段用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的用途。具體而言，本發明涉及本發明生物標誌物的蛋白質產物的片段用於預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀的用途，所述片段包含這種蛋白質的一個或多個結構域。在另一個具體實施方案中，本發明涉及本發明生物標誌物的蛋白質產物或這種蛋白質的衍生物、類似物和片段的用途，所述蛋白質及其衍生物、類似物和片段表達為融合體或嵌合蛋白質產物(包含經肽鍵與異源蛋白質序列連接的蛋白質、片段、類似物或衍生物)。
在具體實施方案中，給予至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種或更多本發明生物標誌物的反義寡核苷酸，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，給予一種或多種本發明生物標誌物的蛋白質產物或其片段、類似物或衍生物，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，給予特異性結合本發明的蛋白質產物的一種或多種抗體，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，給予一種或多種顯性失活多肽以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。
5.15.1反義、核酶、三螺旋組合物可用標準技術製備與表1-4中列出的一或多個基因反應的反義、三螺旋或核酶分子，以及表1-4中列出的基因的轉錄本，以用作本文所述方法的部分。首先，可用標準技術製備反義核酸分子，即與編碼感興趣多肽的正義核酸互補的分子，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補的分子。因此，反義核酸可與正義核酸形成氫鍵。反義核酸可與全部編碼鏈或僅一部分編碼鏈互補，例如蛋白質編碼區(或開放讀碼框)的全部或部分。反義核酸分子可以是對編碼感興趣多肽的核酸序列的編碼鏈的非編碼區的全部或部分反義的。所述非編碼區(「5』和3』非翻譯區」)是編碼區旁側的5』和3』序列，不翻譯成胺基酸。
反義寡核苷酸例如可以長約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸或更長。本發明的反義核酸可以用化學合成和酶促連接反應用本領域已知方法構建。例如，可以用天然存在的核苷酸或各種修飾核苷酸化學合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，所述修飾核苷酸設計用於增加分子的生物學穩定性或增加反義和正義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用於生成反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷(thiouridine)、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、beta-D-mannosylqueosine、5』-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。作為替代方案，可以用已經以反義方向(即從插入的核酸轉錄的RNA將和感興趣靶核酸是反義取向的)亞克隆有核酸的表達載體生物學製備反義核酸。
反義核酸分子被給予對象或原位產生，使得它們雜交或結合至編碼感興趣多肽的細胞mRNA上從而抑制表達，例如通過抑制轉錄和/或翻譯而抑制表達。雜交可以通過常規核苷酸互補性形成穩定的雙鏈體，或者，例如，對於結合DNA雙鏈體的反義核酸分子，通過在雙螺旋的大溝中特異性相互作用。給予本發明反義核酸分子的途徑的實例包括直接注射到組織部位，例如關節(如膝、髖、肘和指節)。作為替代方案，可以修飾反義核酸分子使之靶向選定的細胞然後系統性給藥。例如，為了系統性給藥，可以修飾反義分子，使得它們特異性結合至選定細胞如T細胞或肝細胞表面上表達的受體或抗原，例如，這種結合通過將反義核酸分子與結合到細胞表面受體或抗原的肽或抗體連接而實現。反義核酸分子還可以用載體如下述基因治療載體遞送到細胞。為達到足夠的細胞內反義分子濃度，優選在載體中將反義核酸分子置於強pol II或pol III啟動子控制之下。
感興趣的反義核酸分子可以是α-端基異構(anomeric)的核酸分子。α-端基異構的核酸分子與互補性RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中，與通常的α-單元相反，鏈互相平行(Gaultier et al.，1987，Nucleic Acids Res.156625-6641)。反義核酸分子還可以包含2』-o-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，1987，Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue et al.，1987，FEBS Lett.215327-330)。
核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能切割與之有互補區的單鏈核酸如mRNA，也可以用標準技術製備。因此，核酶(如錘頭核酶(描述於Haselhoffand Gerlach，Nature 334585-591))可用於催化性切割mRNA轉錄本，從而抑制由該mRNA編碼的蛋白質的翻譯。可以基於本文公開的cDNA的核苷酸序列設計對編碼感興趣多肽的核酸分子有特異性的核酶。例如，可以構建四膜蟲L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與待切割核苷酸序列互補，見Cech et al.U.S.Patent No.4,987,071；和Cech et al.U.S.Patent No.5,116,742。作為替代方案，可用編碼感興趣多肽的mRNA從RNA分子庫中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如見Bartel and Szostak，1993，Science 2611411-1418。
三螺旋結構也可以用公知技術製備。例如，通過靶向與編碼感興趣多肽的基因的調節區互補的核苷酸序列，以形成阻止靶細胞中所述基因轉錄的三螺旋結構，從而可以抑制所述多肽的表達。一般可見Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，1992，Bioassays 14(12)807-15。
在多種實施方案中，可以在鹼基、糖基或磷酸骨架處修飾核酸組成，從而例如提高分子的穩定性、雜交或溶解性。例如，核酸的脫氧核糖磷酸骨架可以被修飾以製備肽核酸(見Hyrup et al.，1996，Bioorganic Medicinal Chemistry 45-23)。本文所用術語「肽核酸」或「PNA」表示核酸模擬物，如DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸骨架被假肽骨架替換而僅四種天然核酸鹼基被保留。PNA的中心骨架已經顯示允許在低離子強度下與DNA和RNA特異性雜交。PNA寡聚物的合成可以使用標準固相肽合成方法，如下文所述Hyrup et al.，1996，同上；Perry-O′Keefe et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314670-675。
例如，通過將親脂性或其它輔助基團連接到PNA、通過形成PNA-DNA嵌合體、或通過使用脂質體或本領域已知的其它藥物遞送技術，可以修飾PNA，從而例如增強其穩定性或細胞吸收。例如，可以製備PNA-DNA嵌合體，它可以組合PNA和DNA的有益特性。這些嵌合體允許DNA識別酶如RNase H和DNA聚合酶與其DNA部分相互作用，而PNA部分提供高結合親和力和特異性。PNA-DNA嵌合體可以用適當長度的接頭連接，根據鹼基堆積、核鹼基之間的鍵數和取向選擇合適的長度(Hyrup，1996，同上)。PNA-DNA嵌合體的合成如下述進行Hyrup，1996，同上，和Finn etal.，1996，Nucleic Acids Res.24(17)3357-63。例如，可以用標準的亞磷醯胺偶聯化學和修飾的核苷類似物在固相支持物上合成DNA鏈。化合物如5』-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5』-脫氧-胸腺嘧啶亞磷醯胺可以用作PNA和DNA的5』端之間的連接(Mag et al.，1989，Nucleic Acids Res.175973-88)。然後逐步偶聯PNA單體，以產生具有5』PNA節段和3』DNA節段的嵌合分子(Finn et al.，1996，Nucleic Acids Res.24(17)3357-63)。作為替代方案，可以合成具有5』DNA節段和3』PNA節段的嵌合分子(Peterser et al.，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.51119-11124)。
在另一些實施方案中，所述寡核苷酸可以包括其它附加基團如肽(例如為體內靶向宿主細胞受體)，或輔助跨細胞膜轉運(例如見Letsinger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；國際公開號WO 88/09810)或血腦屏障(例如見國際公開號WO 89/10134)的因子。此外，可以用雜交觸發的切割劑(例如見Krol et al.，1988，Bio/Techniques6958-976)或嵌入劑(例如見Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)修飾寡核苷酸。為此，寡核苷酸可以與另一個分子例如肽、雜交觸發的交聯劑、轉運劑、雜交觸發的切割劑等連接。
5.15.2抗體組成在一個實施方案中，將特異性結合一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的抗體給予對象，優選人，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一個實施方案中，將特異性結合一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的抗體的任意組合給予對象，優選人，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在一個具體實施方案中，將特異性結合本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物的一或多種抗體與其它類型治療(如NSAIDS)一起給予對象，優選人，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在某些實施方案中，將本領域已知的特異性結合一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的抗體單獨或與其它類型治療(如NSAIDS)一起給予對象，優選人，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，不將本領域已知的特異性結合一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的抗體單獨或與其它類型治療(如NSAIDS)一起給予對象，優選人，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。
可以用本領域技術人員已知的多種遞送系統將特異性結合一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的一或多種抗體給予對象，優選人。例如，可以通過脂質體包裹、微顆粒或微膠囊給予這些抗體。例如見美國專利No.5,762,904、美國專利No.6,004,534和國際公開No.WO99/52563。此外，可以用能表達抗體的重組細胞或能表達抗體的逆轉錄病毒、其他病毒載體或非病毒載體給予這些抗體。
可以從任何已知來源獲得特異性結合一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的抗體。例如，表5提供特異性針對一或多種本發明生物標誌物的一或多種蛋白質產物的商業抗體的列表。作為替代方案，特異性結合本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物的抗體可以用本領域已知的合成抗體的任何方法製備，尤其是用化學合成或優選重組表達技術製備。
抗體包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝化(camelised)抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)(例如見Bird et al.(1988)Science 242423-426；和Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)、單鏈抗體、單結構域抗體、Fab片段、F(ab』)片段、二硫鍵連接的Fv(sdFv)和抗獨特型(抗Id)抗體(例如，包括抗本發明抗體的抗Id抗體)，以及以上任一種的表位結合片段。本文所用術語「抗體」表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何類(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。免疫球蛋白分子的免疫活性片段的實例包括F(ab)片段(由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段)和F(ab』)2片段(包含在鉸鏈區經二硫橋連接的兩個F(ab)片段的雙價片段)，它們可以通過用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶處理相應抗體而產生。免疫活性片段還包括但不限於Fd片段(由VH和CH1結構域組成)、Fv片段(由抗體單臂的VL和VH結構域組成)、dAb片段(由VH結構域組成；Ward et al.，(1989)Nature 341544-546)和分離的互補性決定區(CDR)。特異性結合抗原的抗體可以用本領域已知的合成抗體的任何方法製備，尤其是用化學合成或優選重組表達技術製備。
特異性結合抗原的多克隆抗體可以用本領域公知的多種方法製備。例如，可以將人抗原給予多種宿主動物，包括但不限於兔、小鼠、大鼠等，以誘導產生含特異性針對所述人抗原的多克隆抗體的血清。根據宿主物種，可以使用多種佐劑以增加免疫應答，包括但不限於弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚和潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌。這些佐劑也是本領域公知的。
術語「單特異性抗體」表示對特定靶如表位表現單結合特異性和親和力的抗體。該術語包括單克隆抗體。單克隆抗體可以用本領域已知的各種技術製備，包括使用雜交瘤、重組和噬菌體展示技術、或這些技術的組合。例如見美國專利No.RE 32,011、4,902,614、4,543,439、4,411,993和4,196,265；Kennett et al(eds.)，MonoclonalAntibodies，HybridomasA New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press(1980)；和Harlow and Lane(eds.)，Antibodies.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press(1988)，它們經引用併入本文。例如，單克隆抗體可用雜交瘤技術製備，包括本領域已知的技術和下文教導的技術，例如Harlow et al.，AntibodiesALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，et al.，inMonoclonal and T-cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，(所述參考的全部內容經引用併入本文)。也可使用經重組技術而製備抗體的其它技術來構建單克隆抗體(例如下述的技術William D.Huse et al.，1989，Science，2461275-1281；L.Sastry et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865728-5732；和Michelle Alting-Mees et al.，Strategies in Molecular Biology，31-9(1990)，其中提到了可從Stratacyte，La Jolla，Calif.獲得的商業系統)。本文所用術語「單克隆抗體」不限於經雜交瘤技術產生的抗體。術語「單克隆抗體」表示來源於單個克隆的抗體，包括來源於任何真核、原核生物或噬菌體克隆，不涉及生產所述抗體的方法。
用雜交瘤技術生產和篩選特異性抗體的方法是常規的和本領域公知的。簡單的說，可以用本發明生物標誌物的蛋白質產物免疫小鼠，一旦檢測到免疫應答，例如，在小鼠血清中檢測到對所述蛋白質有特異性的抗體，則收穫小鼠脾並分離脾細胞。然後用公知技術將所述脾細胞與任何合適的骨髓瘤細胞融合，如可從ATCC獲得的細胞系SP20的細胞。用有限稀釋法選擇和克隆雜交瘤。此外，可以使用RIMMS(多點重複免疫)技術來免疫動物(Kilptrack et al.，1997，Hybridoma 16381-9，全部內容經引用併入本文)。然後用本領域已知方法測試雜交瘤克隆中分泌能結合本發明多肽的抗體的細胞。通常含高水平抗體的腹水中可以用陽性雜交瘤克隆免疫小鼠而製備。
因此，本發明提供通過培養分泌本發明抗體的雜交瘤細胞來製備抗體的方法，其中所述雜交瘤的製備優選通過將分離自用本發明生物標誌物的蛋白質產物免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，然後篩選融合所得雜交瘤中分泌能結合所述蛋白質或蛋白質片段的雜交瘤克隆。
識別本發明生物標誌物的蛋白質產物的特異性表位的抗體片段可以用本領域技術人員已知的任何技術來製備。例如，本發明的Fab和F(ab』)2片段可以通過用酶如木瓜蛋白酶(製備Fab片段)或胃蛋白酶(製備F(ab』)2片段)蛋白水解性切割免疫球蛋白分子來製備。F(ab』)2片段含有可變區、輕鏈恆定區和重鏈的CH1結構域。而且，本發明抗體還可以用本領域已知的多種噬菌體展示方法製備。
在噬菌體展示方法中，功能性抗體結構域被展示到攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面。具體來說，從動物cDNA文庫(如人或小鼠受感染組織的cDNA文庫)中擴增編碼VH和VL結構域的DNA序列。編碼VH和VL結構域的DNA經PCR與scFv接頭重組在一起並克隆到噬粒載體中。載體電穿孔到大腸桿菌中，並用輔助噬菌體感染大腸桿菌。用於這些方法的噬菌體典型地是絲狀噬菌體，包括fd和M13，並且VH和VL結構域通常被重組融合到噬菌體基因III或基因VIII上。可以用抗原選擇或鑑定表達結合到特定抗原的抗原結合結構域上的噬菌體，例如使用標記抗原或結合或捕獲到固相表面或珠子上的抗原。可用於製備本發明抗體的噬菌體展示方法的實例包括以下公開的那些Brinkman et al.，1995，J.Immunol.Methods 18241-50；Ames et al.，1995，J.Immunol.Methods 184177-186；Kettleborough et al.，1994，Eur.J.Immunol.24952-958；Persic et al.，1997，Gene 1879-18；Burton et al.，1994，Advances in Immunology 57191-280；PCT申請No.PCT/GB91/O1 134；國際公開No.WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；以及美國專利No.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；其中每篇的全部內容經引用併入本文。
如以上參考文獻所述，噬菌體選擇以後，可以從噬菌體分離抗體編碼區並用於製備完整抗體，包括人抗體，或者任何其它的期望的抗原結合片段，並在任何期望宿主中表達，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌，例如下述。也可以用本領域公知方法使用重組製備Fab、Fab』和F(ab』)2片段的技術，如以下公開國際公開No.WO 92/22324；Mullinax et al.，1992，BioTechniques 12(6)864-869；Sawai et al.，1995，AJRI 3426-34；和Better et al.，1988，Science 2401041-1043(所述參考的全部內容經引用併入本文)。
為製備完整抗體，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點和保護限制性位點的旁側序列的PCR引物來擴增scFv克隆中的VH或VL序列。可以使用本領域技術人員已知的克隆技術，將PCR擴增的VH結構域克隆至表達VH恆定區如人γ4恆定區的載體中，將PCR擴增的VL結構域克隆到表達VL恆定區如人κ或λ恆定區的載體中。表達VH或VL結構域的載體優選包含EF-1α啟動子、分泌信號、可變結構域、恆定結構域的克隆位點以及選擇標誌物如新黴素。VH和VL結構域還可以克隆入表達必要的恆定區的一種載體中。然後用本領域技術人員已知的技術將重鏈轉換載體和輕鏈轉換載體共轉染入細胞系，以產生表達全長抗體如IgG的穩定或瞬時細胞系。
對於一些應用，包括抗體體內使用於人和體外檢測測試，可以優選使用人或嵌合抗體。對於人對象的治療性處理，特別期望完全的人抗體。通過本領域已知的多種方法可以製備人抗體，包括使用來源於人免疫球蛋白序列的抗體庫的上述噬菌體展示方法。也見美國專利No.4,444,887和4,716,111；和國際公開No.WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其中每個的全部內容經引用併入本文。
還可以通過轉基因動物製備抗體。具體來說，可以用不能表達功能性內源免疫球蛋白但能表達人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠製備人抗體。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物可以隨機或經同源重組導入小鼠胚胎幹細胞。作為替代方案，除了人重鏈和輕鏈基因以外，也可以將人可變區、恆定區和多樣性區導入小鼠胚胎幹細胞。可以在經同源重組導入人免疫球蛋白座位的同時或不同時使小鼠輕鏈和重鏈免疫球蛋白基因無功能。具體而言，純合缺失JH區防止內源性抗體生成。可以擴增修飾的胚胎幹細胞並微注射入胚泡以產生嵌合小鼠。然後繁殖嵌合小鼠產生表達人抗體的純合後代。用選定的抗原如全部或部分的本發明多肽以常規方式免疫轉基因小鼠。抗所述抗原的單克隆抗體可以用常規雜交瘤技術從免疫的轉基因小鼠獲得。轉基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉基因在B細胞分化期間重排，隨後經歷類型轉換和體細胞突變。因此，使用這樣的技術，可以製備治療有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。這種製備人抗體的技術的全面評述見Lonberg and Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.1365-93)。對於製備人抗體和人單克隆抗體的這種技術和製備這些抗體的操作方案的詳細討論，例如見國際公開No.WO 98/24893，WO 96/34096和WO 96/33735；和美國專利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，其中全部內容經引用併入本文。此外，可以讓公司如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)用與上述相似的技術提供抗選定抗原的抗體。
例如，美國專利No.5,849,992描述了在轉基因哺乳動物乳腺中表達抗體的方法。構建轉基因使之包括乳汁特異性啟動子和編碼感興趣抗體和分泌信號序列的核酸。雌性的這種轉基因動物產生的乳汁包括分泌到其中的感興趣抗體。可以從乳汁中純化抗體，或在一些應用中直接使用。
嵌合抗體是抗體的不同部分來源於不同免疫球蛋白分子的一種分子。製備嵌合抗體的方法在本領域已知。例如見Morrison，1985，Science 2291202；Oi et al.，1986，BioTechniques 4214；Gillies et al.，1989，J.Immunol.Methods 125191-202；和美國專利No.5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415，其中全部內容經引用併入本文。
人源化抗體是能結合預定抗原的抗體或其變體或片段，其包含基本具有人免疫球蛋白胺基酸序列的框架區和基本具有非人免疫球蛋白胺基酸序列的CDR。人源化抗體基本包含全部的至少一個、通常兩個可變結構域(Fab、Fab』、F(ab』)2、Fabc、Fv)，其中全部或基本全部的CDR區對應非人免疫球蛋白(即供體抗體)的CDR區，全部或基本全部的框架區是人免疫球蛋白共有序列的框架區。優選地，人源化抗體還包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。一般地，所述抗體將含有輕鏈以及重鏈的至少可變結構域。抗體還可以包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區。人源化抗體可以從任何類型和任何同種型的免疫球蛋白中選擇，所述類型包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，所述同種型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。期望人源化抗體表現細胞毒活性時，通常恆定結構域是固定補體的恆定結構域，典型的類型是IgG1。如果不期望這種細胞毒活性時，恆定區可以是IgG2類型。人源化抗體可以包含來自一種以上類型或同種型的序列，並且選擇特定恆定區以優化期望的效應子功能是在本領域技術人員的能力範圍內。人源化抗體的框架和CDR區不必精確對應母體序列，如供體CDR或共有框架區可以通過替換、插入或缺失至少一個殘基而被突變，使得該位點的CDR或框架殘基不對應共有序列或來源抗體。然而這些突變將不是昂貴的。通常，人源化抗體殘基的至少75％將對應母體FR和CDR序列中的殘基，更經常90％，最優選大於95％。可以用多種本領域已知的技術製備人源化抗體，包括但不限於CDR移植(歐洲專利No.EP 239,400；國際公開No.WO 91/09967；和美國專利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089)，表面覆蓋(veneering)或表面再造(resurfacing)(歐洲專利No.EP 592,106和EP519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)489-498；Studnicka et al.，1994，Protein Engineering 7(6)805-814；和Roguska et al.，1994，PNAS 91969-973)，鏈重排(chain shuffling)(美國專利No.5,565,332)和例如下文中公開的技術美國專利No.6,407,213、美國專利No.5,766,886、WO 9317105、Tan et al.，2002，J.Immunol.1691119-25，Caldas et al.，2000，Protein Eng.13(5)353-60，Morea et al.，2000，Methods 20(3)267-79，Baca et al.，1997，J.Biol.Chem.272(16)10678-84，Roguska etal.，1996，Protein Eng.9(10)895-904，Couto et al.，1995，Cancer Res.55(23 Supp)5973s-5977s，Couto et al.，1995，Cancer Res.55(8)1717-22，Sandhu JS，1994，Gene150(2)409-10，和Pedersen et al.，1994，J.Mol.Biol.235(3)959-73。框架區的框架殘基經常被CDR供體抗體的相對應殘基替換，以改變、優選提高抗原結合。這些框架替換通過本領域公知的方法鑑定，例如，通過模擬CDR和框架殘基的相互作用鑑定對抗原結合重要的框架殘基，進行序列比較以鑑定在特定位置不常見的框架殘基。(例如見Queen et al.，美國專利No.5,585,089；和Riechmann et al.，1988，Nature332323，其全部內容經引用併入本文)。
可以通過本領域公知方法製備單結構域抗體，例如缺乏輕鏈的抗體。見Riechmann et al.，1999，J.Immune.23125-38；Nuttall et al.，2000，Curr.Pharm.1(3)253-263；Muylderman，2001，J.Biotechnol.74(4)277302；美國專利No.6,005,079；和國際公開No.WO 94/04678，WO 94/25591和WO 01/44301，其中每個的全部內容經引用併入本文。
而且，可以用本領域技術人員公知的技術將特異性結合抗原的抗體再用於產生「模擬」抗原的抗獨特型抗體。(例如見Greenspan Bona，1989，FASEB J.7(5)437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)2429-2438)。這些抗體可以單獨或與其它治療組合使用，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。
本發明涉及包含編碼特異性結合抗原的抗體或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發明還涉及在高嚴謹、中等或低嚴謹雜交條件下與編碼本發明抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。
可以通過本領域已知的任何方法獲得所述多核苷酸並確定所述多核苷酸的核苷酸序列。編碼已知抗體的核苷酸序列可以用本領域公知方法確定，即將已知編碼特定胺基酸的核苷酸密碼子裝配成產生編碼所述抗體的核酸。編碼所述抗體的這種多核苷酸可以從化學合成的寡核苷酸組裝(例如描述於Kutmeier et al.，1994，BioTechniques17242)，簡單的說，它包括合成含有部分的編碼所述抗體或其片段或變體的序列的重疊寡核苷酸，退火併連接這些寡核苷酸，然後經PCR擴增連接的寡核苷酸。
作為替代方案，編碼抗體的多核苷酸可以從合適來源的核酸製備。如果含編碼特定抗體的核酸的克隆不可獲得，但抗體分子的序列已知，則編碼所述免疫球蛋白的核酸可以化學合成而獲得，或用可與所述序列的3』和5』端雜交的合成引物經PCR擴增或用特異性針對特定基因的寡核苷酸探針經克隆鑑定例如來自編碼所述抗體的cDNA文庫的cDNA克隆從合適來源(例如，從表達所述抗體的任何組織或細胞中，如篩選表達本發明抗體的雜交瘤細胞中製備的抗體cDNA文庫或cDNA文庫，或從中分離的核酸，優選polyA+RNA)而獲得。經PCR製備的擴增核酸然後可以用本領域公知的任何方法克隆入複製型克隆載體。
確定抗體的核苷酸序列以後，可以用本領域公知的操作核苷酸序列的方法，例如用重組DNA技術、定點突變、PCR等(例如見以下描述的技術Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY and Ausubel et al.，eds.，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，NY，二者的全部內容經引用併入本文)操作所述抗體的核苷酸序列，以產生具有不同胺基酸序列的抗體，例如創建胺基酸替換、缺失和/或插入。
獲得編碼本發明的抗體分子、抗體分子的輕或重鏈或其片段(優選但不必須，含有重或輕鏈可變結構域)的多核苷酸以後，可以用本領域公知的技術經重組DNA技術製備產生所述抗體分子的載體。
在一個優選實施方案中，在哺乳動物細胞中製備單克隆抗體。表達所述克隆抗體或其抗原結合片段的優選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub and Chasin(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220)，與例如描述於Kaufman and Sharp(1982，Mol.Biol.159601-621的DHFR選擇標記一起使用；淋巴細胞系，例如NS0骨髓瘤細胞和SP2細胞、COS細胞，以及來自轉基因動物如轉基因哺乳動物的細胞。例如所述細胞是哺乳動物上皮細胞。
除了編碼多樣化免疫球蛋白結構域的核酸序列以外，重組表達載體可以攜帶另外的序列，如調節載體在宿主細胞中複製的序列(如複製起點)和選擇標記基因。選擇標記基因有利於選擇已經導入了載體的宿主細胞(例如見美國專利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，選擇標記基因通常賦予已經導入了載體的宿主細胞以藥物抗性，如G418、潮黴素或氨甲喋呤抗性。優選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(和氨甲喋呤選擇/擴增一起用於dhfr-宿主細胞)和neo基因(用於G418選擇)。
在重組表達本發明的抗體或其抗原結合部分的示例性系統中，編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達載體經磷酸鈣介導的轉染導入dhfr-CHO細胞。在重組表達載體內，抗體重鏈和輕鏈基因分別與增強子/啟動子調節元件(如來源於SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件和SV40增強子/AdMLP啟動子調節元件)可操作的連接，以驅動所述基因的高水平轉錄。重組表達載體還攜帶DHFR基因，它允許用氨甲喋呤選擇/擴增選擇已經轉染了載體的CHO細胞。培養篩選的轉化體宿主細胞，以使之表達抗體重鏈和輕鏈並從培養基中回收完整抗體。使用標準分子生物學技術製備重組表達載體、轉染宿主細胞、篩選轉化體、培養宿主細胞和從培養基回收抗體。例如，一些抗體可以通過蛋白A和蛋白G親合層析分離。
對於包括Fc結構域的抗體，抗體生產系統優選合成Fc區被糖基化的抗體。例如，IgG分子的Fc區在CH2結構域的297位天冬醯胺處被糖基化。該天冬醯胺是雙天線型寡糖修飾的位點。已經證明Fcγ受體和補體C1q介導的效應子功能需要這種糖基化(Burton and Woof，1992，Adv.Immunol.511-84；Jefferis et al.，1998，Immunol.Rev.16359-76)。在一個優選實施方案中，在適當糖基化對應297位天冬醯胺的殘基的哺乳動物表達系統中製備Fc結構域。Fc結構域還可以包括其它真核翻譯後修飾。
重組表達製備了抗體分子以後，可以用本領域已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法純化，例如經層析(如離子交換、親合、尤其是蛋白A以後再經特異性抗原親合，和體積排阻柱層析)、離心、差異溶解性，以及經任何其它的純化蛋白質的標準技術。而且，所述抗體或其片段可以與本領域已知的異源多肽融合以促進純化。
5.15.3基因治療技術基因治療表示經向對象給予表達的或可表達的核酸而進行的治療。本領域可用的任何基因治療的方法可以根據本發明使用。實例性方法見下述。
在具體實施方案中，可以通過基因治療的方式給予本發明一或多種生物標誌物的一或多種反義寡核苷酸，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，通過基因治療的方式給予包含編碼特異性結合本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物的一或多種抗體的核苷酸的一或多種核酸分子，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，通過基因治療的方式給予包含編碼本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物或其類似物、衍生物或片段的核苷酸的一或多種核酸分子，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。在另一些實施方案中，通過基因治療的方式給予包含編碼本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物的一或多種顯性失活多肽的核苷酸的一或多種核酸分子，以預防、治療、控制或改善肝癌或其症狀。
對於基因治療方法的一般性綜述見Goldspiel et al.，1993，Clinical Pharmacy 12488-505；Wu and Wu，1991，Biotherapy 387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science 260926-932；和Morganand Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH11(5)155-215)。可以使用的重組DNA技術領域的公知方法描述於Ausubel et al.(eds.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，NY；和Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。
在一個方面中，本發明組合物包含編碼特異性結合本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物的一或多種抗體的核酸序列，所述核酸序列是在合適宿主中表達一或多種抗體的表達載體的一部分。具體而言，這些核酸序列具有與所述抗體可操作連接的啟動子，所述啟動子是誘導型或組成型，並任選是組織特異性的。
在另一個方面中，本發明組合物包含編碼本發明一或多種生物標誌物的一或多種蛋白質產物的顯性失活多肽的核酸序列，所述核酸序列是在合適宿主中表達顯性失活多肽的表達載體的一部分。具體而言，這些核酸序列具有與所述顯性失活多肽可操作連接的啟動子，所述啟動子是誘導型或組成型，並任選是組織特異性的。在另一個具體實施方案中，使用這樣的核酸分子，其中所述顯性失活編碼序列和任何其它期望的序列的旁側是促進在基因組中期望位點發生同源重組的區域，從而提供顯性失活核酸的染色體內表達(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature 342435-438)。
可以直接或者間接向患者遞送所述核酸，在直接遞送情況下患者直接暴露於所述核酸或攜帶核酸的載體，在此間接遞送情況下首先用所述核酸體外轉化細胞，然後移植入患者。這兩種方法已知分別是體內或離體基因治療。
在一個具體實施方案中，直接體內給予所述核酸序列，這時它表達產生編碼產物。這可以通過本領域已知的很多方法的任何一種實施，例如通過將它構建為適當核酸表達載體的一部分並給予使它們成為細胞內的，如通過用缺陷型或減毒逆轉錄病毒或其它病毒載體感染(見美國專利No.4,980,286)，或直接注射裸DNA，或使用微粒轟擊(如基因槍；Biolisitic，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑包被，包裹於脂質體、微粒或微膠囊中，或將它們與已知進入核的肽連接進行給予，通過將其與參與受體介導的細胞內吞的配體連接進行給予(例如見Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)(可用於靶向特異性表達該受體的細胞類型)等。在另一個實施方案中，可以形成核酸-配體複合物，其中配體包含致溶性病毒肽以破壞內體，從而使所述核酸免於溶酶體降解。在另一個實施方案中，通過靶向特異性受體，所述核酸可以體內打靶用於細胞特異性吸收和表達(例如見國際公開No.WO 92/06180
公開日1992年4月16日(Wu et al.)；WO 92/2263
公開日1992年12月23日(Wilsonet al.)；WO 92/2031
公開日1992年11月26日(Findeis et al.)；WO 93/14188
公開日1993年7月22日(Clarke et al.)，WO 93/2022
公開日1993年10月14日(Young))。作為替代方案，通過同源重組，所述核酸可以細胞內導入並整合入宿主細胞DNA中進行表達(Koller and Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra et al.，1989，Nature 342435-438)。
例如，可以使用逆轉錄病毒載體。這些逆轉錄病毒載體已經被修飾，刪除了不是包裝病毒基因組和整合入宿主細胞DNA必需的逆轉錄病毒序列。用於基因治療的編碼感興趣抗體、或感興趣蛋白質或其片段的核酸序列被克隆入一或多種載體中，它有利於將所述基因遞送入患者。關於逆轉錄病毒的更詳細描述可見Boesen et al.，1994，Biotherapy 6291-302，其中描述了使用逆轉錄病毒遞送mdr1基因到造血幹細胞以使造血幹細胞更耐受化療。說明逆轉錄病毒載體在基因治療中應用的其它參考文獻是Clowes et al.，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Kiem et al.，1994，Blood 831467-1473；Salmons and Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4129-141；和Grossman andWilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3110-114。
腺病毒是能用於基因治療的其它病毒載體。腺病毒是向呼吸道上皮遞送基因特別有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮，引起輕度疾病。基於腺病毒的遞送系統的其它目標是肝、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉。腺病毒具有能感染非分裂細胞的優點。Kozarsky and Wilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development3499-503提供了基於腺病毒的基因治療的綜述。Bout et al.，1994，Human GeneTherapy 53-10證明了腺病毒載體將基因轉移到恆河猴的呼吸道上皮細胞中的用途。腺病毒在基因治療中應用的其它實例可以見Rosenfeld et al.，1991，Science 252431-434；Rosenfeld et al.，1992，Cell 68143-155；Mastrangeli et al.，1993，J.Clin.Invest.91225-234；PCT公開WO94/12649；和Wang，et al.，1995，Gene Therapy2775-783。在一個優選實施方案中，使用腺病毒載體。
也已經建議將腺相關病毒(AAV)用於基因治療(Walsh et al.，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美國專利No.5,436,146)。
另一種基因治療方法涉及通過諸如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣介導的轉染或病毒感染的方法將基因轉移到組織培養中的細胞中。轉移方法通常包括將選擇標記轉入細胞。然後將細胞置於選擇下以分離已經攝入並表達轉移基因的那些細胞。然後將那些細胞轉入患者。
在這種實施方案中，在體內給予所得重組細胞之前將核酸導入細胞。這種導入可以用本領域已知的任何方法實現，包括但不限於轉染、電穿孔、微注射、用含所述核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、原生質球融合等。本領域已知很多技術用於將外源基因導入細胞(例如，見Loeffler and Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618；Cohen et al.，1993，Meth.Enzymol.217618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.2969-92)，並且可以根據本發明使用，只要接受細胞的必要發育和生理功能不被破壞即可。所述技術應該提供核酸向細胞的穩定轉移，使得所述核酸可以被該細胞表達，並優選可被其後代細胞遺傳並表達。
可以用本領域已知的多種方法將所得重組細胞遞送給患者。重組血細胞(如造血幹細胞或祖細胞)和/或肝癌細胞優選靜脈內給予。預使用的細胞的量取決於期望的效果、患者狀態等，並可以由本領域技術人員確定。
可以導入核酸用於基因治療的細胞包括任何期望的可用的細胞類型，包括但不限於上皮細胞、內皮細胞、角化細胞、肝癌細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種幹細胞或祖細胞，尤其是造血幹細胞或祖細胞，如從骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等獲得的那些。
在一個優選實施方案中，用於基因治療的細胞是患者自體的。
在一個將重組細胞用於基因治療的實施方案中，將編碼感興趣抗體、感興趣蛋白質或其片段的核酸序列導入細胞，使得它們可以被該細胞或其後代表達，然後體內施用重組細胞以產生治療效果。在一個具體實施方案中，使用幹細胞或祖細胞。能體外分離和維持的任何幹細胞和/或祖細胞可以有利地根據本發明的這個實施方案使用。(例如見公開於1994年4月28日的國際公開No.WO 94/08598；Stemple andAnderson，1992，Cell 71973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A229；和Pittelkow and Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61771)。
可用於控制編碼感興趣抗體、感興趣蛋白質或其片段的核酸序列表達的啟動子可以是組成型、誘導型或組織特異性的。非限制性的實例包括SV40早期啟動子區(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290304-310)、勞斯肉瘤病毒的3』長末端重複中含有的啟動子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調控序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)；原核表達載體如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 753727-3731)或tac啟動子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8021-25)；也見″Useful proteins fromrecombinant bacteria″in Scientific American，1980，24274-94；植物表達載體，其中包含胭脂鹼合成酶啟動子區(Herrera-Estrella et al.，Nature 303209-213)或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(Gardner et al.，1981，Nucl.Acids Res.92871)和光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶(Herrera-Estrella et al.，1984，Nature 310115-120)；來自酵母或其它真菌的啟動子元件如Gal 4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(甘油磷酸激酶)啟動子、鹼性磷酸酶啟動子，以及表現組織特異性並已被用於轉基因動物的以下動物轉錄調控區在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因調控區(Swift etal.，1984，Cell 38639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因調控區(Hanahan，1985，Nature 315115-122)；在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因調控區(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-658；Adames et al.，1985，Nature 318533-538；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、在睪丸、乳房、淋巴樣和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒調控區(Leder et al.，1986，Cell45485-495)、在肝臟中有活性的白蛋白基因調控區(Pinkert et al.，1987，Genes andDevel.1268-276)、在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因調控區(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer et al.，1987，Science 23553-58；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因調控區(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-171)、在髓樣細胞中有活性的β-珠蛋白基因調控區(Mogram et al.，1985，Nature 315338-340；Kollias et al.，1986，Cell 4689-94；在腦的少突膠質細胞中有活性的髓鞘鹼性蛋白基因調控區(Readhead et al.，1987，Cell 48703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調控區(Sani，1985，Nature 314283-286)和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因調控區(Mason et al.，1986，Science 2341372-1378)。
在一個具體實施方案中，待導入用於基因治療的核酸包含與編碼區可操作連接的誘導型啟動子，使得通過控制適當轉錄誘導劑的存在或缺失而控制所述核酸的表達。
5.13.4抗炎治療已經表明抗炎藥成功的用於治療、控制和改善肝癌，並且現在是這種疾病的常用而標準的治療。可以將本領域技術人員公知的任何抗炎藥用於本發明的組合物和方法中。抗炎藥的非限制性實例包括非甾體類抗炎藥(NSAID)、甾體類抗炎藥、β-激動劑、抗膽鹼能劑和甲基黃嘌呤類。NSAID的實例包括但不限於阿司匹林、布洛芬、塞來昔布(CELEBREXTM)、雙氯芬酸(VOLTARENTM)、依託度酸(LODINETM)、非諾洛芬(NALFONTM)、吲哚美辛(INDOCINTM)、酮洛酸(ketoralac)(TORADOLTM)、丙嗪(DAYPROTM)、萘普酮(RELAFENTM)、舒林酸(CLINORILTM)、託美汀(TOLECTINTM)、羅非昔布(VIOXXTM)、萘普生(ALEVETM、NAPROSYNTM)、酮洛芬(ACTRONTM)和萘普酮(RELAFENTM)。這些NSAID通過抑制環氧合酶(如COX-1和/或COX-2)而發揮功能。甾體抗炎藥的實例包括但不限於糖皮質激素類、地塞米松(DECADRONTM)、可的松、氫化可的松、強的松(DELTASONETM)、強的松龍、去炎松、柳氮磺胺吡啶和二十酸類，如前列腺素、血栓烷和白三烯。
5.16藥物組合物用本發明方法鑑定的生物活性化合物或其藥學上可接受的鹽可以給予患肝癌的患者，優選哺乳動物，更優選人。在一個具體實施方案中，化合物或其藥學上可接受的鹽被給予患肝癌的患者，優選哺乳動物，更優選人。在另一個實施方案中，化合物或其藥學上可接受的鹽作為抗肝癌的預防措施被給予患肝癌的患者，優選哺乳動物，更優選人。根據這些實施方案，患者可以是兒童、成人或老年人，其中「兒童」是年齡在24個月和18歲之間的對象，「成人」是年齡在18歲或更老的對象，而「老年人」是年齡在65歲或更老的對象。
當施用於患者時，所述化合物或其藥學上可接受的鹽優選作為組合物的成分施用，所述組合物任選地包含藥學上可接受的載體。所述組合物可以經口施用或經任何其它方便的途徑施用，例如經輸注或快速濃注，經上皮或黏膜內層(如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並可以與另一種生物活性劑一起施用。可以系統性或局部施用。已知多種遞送系統，如脂質體包裹、微粒、微膠囊、膠囊等，並可以用於施用所述化合物及其藥學上可接受的鹽。
施用方法包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、經口、舌下、鼻內、腦內、陰道內、透皮、經直腸、吸入或外用，尤其是外用於耳、鼻、眼或皮膚。施用模式留給醫生判斷。多數情況下，施用將導致所述化合物或其藥學上可接受的鹽釋放到血流中。
在具體實施方案中，可能期望局部施用所述化合物或其藥學上可接受的鹽。這可以通過以下方式實現，例如但不限於手術期間局部輸注，表面塗敷如手術後與創傷敷料一起表面塗敷，注射，經導管，以栓劑方式，或以植入物方式，所述植入物是多孔的、無孔的或凝膠材料，包括膜如sialastic膜，或纖維。在一個具體實施方案中，化合物局部施用於受肝癌影響的肝的一或多個部位。
在某些實施方案中，可能期望將所述化合物或其藥學上可接受的鹽以任何合適的途徑導入中樞神經系統，所述方式包括心室內、胸內和硬膜外注射。心室內注射可以用心室內導管輔助，例如與儲藥器如Ommaya儲藥器連接的導管。
也可以經肺施用，例如使用吸入器或噴霧器，和帶氣溶膠化劑的製劑，或經在氟碳或合成肺表面活性劑中灌輸。在某些實施方案中，所述化合物及其藥學上可接受的鹽可以與傳統粘合劑和賦形劑如甘油三酯一起配製成栓劑。
在另一個實施方案中，所述化合物及其藥學上可接受的鹽可以在小泡中尤其是脂質體中遞送(見Langer，1990，Science 2491527-1533；Treat et al.，in Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；一般的見前)。
在另一個實施方案中，所述化合物及其藥學上可接受的鹽可以在控釋系統中遞送(例如見Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，同上，vol.2，pp.115-138(1984))。也可以使用以下綜述中討論的其它控釋系統Langer，1990，Science2491527-1533。在一個實施方案中，可以使用泵(見Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald et al.，1980，Surgery 88507；Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個實施方案中，可以使用聚合物材料(見Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，BocaRaton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York；Ranger and Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；也見Levy et al.，1985，Science 228190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71105)。在另一個實施方案中，控釋系統可以放置在所述化合物或其藥學上可接受的鹽的靶RNA附近，從而只需要系統性劑量的若干分之一。
本文所述化合物可以引入適於施用的藥物組合物中。這些組合物通常包含活性化合物和藥學上可接受的載體。本文所用表述「藥學上可接受的載體」包括任何和所有的與藥物施用相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。對於藥物活性物質使用的這些介質和試劑在本領域公知。考慮在組合物中使用不與所述活性化合物相容的任何常規介質或試劑以外的介質和試劑。也可以向組合物中引入輔助性活性化合物。
本發明包括製備用於調節感興趣多肽或核酸的表達或活性的藥物組合物的方法。這樣的方法包括將藥學上可接受的載體與調節感興趣多肽或核酸的表達或活性的藥劑一起配製。這種組合物還可以包括其他的活性劑。因此，本發明還包括通過將藥學上可接受的載體與調節感興趣多肽或核酸的表達或活性的藥劑以及一或多種另外的活性化合物一起配製來製備藥物組合物的方法。
本發明的藥物組合物配製成與其期望的給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括胃腸道外給藥，如靜脈內、皮內、皮下、經口(如吸入)、透皮(外用)、透黏膜和直腸給藥。優選靜脈內給藥。用於胃腸道外、皮內或皮下應用的溶液或懸劑可以包括以下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯(methyl parabens)；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；鰲合劑如乙二胺四乙酸；緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和滲透壓調節劑如氯化鈉或右旋糖。pH可以用酸或鹼如鹽酸或氫氧化鈉調節。胃腸道外製劑可以密封於安瓿、可棄型注射器或玻璃或塑料製造的多劑量小管中。
適於注射用途的藥物組合物包括無菌水溶液(當可以水溶時)或分散液和用於即時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝液(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，並且應該是一定程度上存在易注射性的流體。它必須在製造和保存條件下是穩定的，並且必須抗微生物如細菌和真菌的汙染作用。載體可以是溶劑或分散介質，其中例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，及其合適的混合物。例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，對於分散體系通過維持需要的顆粒大小並通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性。多種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等可以實現阻止微生物的作用。在很多情況下，組合物中將優選包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的成分例如單硬脂酸鋁和明膠可以實現注射組合物的吸收時間延長。
通過將需要量的活性化合物(如多肽或抗體)引入適當溶劑中，如果需要其中還引入一種成分或成分的組合，然後過濾除菌，從而可以製備無菌注射溶液。一般來說，可以通過將活性化合物引入無菌賦形劑中來製備分散體系，所述賦形劑中含有基礎分散介質和需要的上述其它成分。對於用於製備無菌注射溶液的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥預先無菌過濾的溶液，從而獲得活性成分和另外的期望成分的粉末。
經口組合物一般包括惰性稀釋劑或可食性載體。它們可以密封在明膠膠囊中或壓成片劑。對於經口治療性施用的目的，活性化合物可以與賦形劑摻在一起並以片劑、錠劑或膠囊形式使用。經口組合物還可以用流動載體製備，用作漱口劑，其中流動載體中的化合物經口使用和漱口並吐出或吞咽下。
藥學上相容性粘合劑和/或輔助材料可以作為組合物的一部分被包括在內。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有以下任何一種的成分或相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑如澱粉或乳糖，崩解劑如海藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化矽；甜味劑如蔗糖或糖精；或調味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙味香精。
對於吸入給藥，化合物以氣溶膠噴霧的形式從含有合適推進劑的壓力容器或分配器中或噴霧器中出來，所述推進劑例如氣體如二氧化碳。
也可以通過透黏膜或透皮方式系統性給藥。對於透黏膜或透皮給藥，可以在製劑中使用對於待透過屏障適當的通透劑。這些通透劑是本領域公知的，對於透黏膜給藥例如包括去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。透黏膜給藥可通過使用噴鼻劑或栓劑實現。對於透皮給藥，活性化合物配製成本領域公知的軟膏、油膏、凝膠或乳霜。
化合物還可以製備成栓劑形式(如用常規栓劑基質如可可脂和其它甘油三酯)或用於直腸遞送的保留灌腸劑。
在一個實施方案中，活性化合物與保護化合物免於從身體快速清除的載體一起製備，如控釋配方，包括植入物和微膠囊化遞送系統。可以使用生物降解性、生物相容性聚合物，如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。製備這些製劑的方法對於本領域技術人員將是顯而易見的。所述材料還可以從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商業獲得。脂質體懸液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細胞的脂質體)也可以用作藥學上可接受的載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法製備，如美國專利No.4,522,811所述。
特別有利的是將經口或胃腸道外組合物配製成劑量單位形式，以便於給藥和劑量均一性。本文所用的劑量單位形式表示適用作單位劑量給予待治療對象的物理分離的單位；每個單位含有經計算產生期望治療效果的預定量的活性化合物以及需要的藥學上可接受的載體。本發明劑量單位形式的規格遵從並直接依賴於活性化合物的獨特性質和要獲得的具體治療效果，以及混合這樣的活性化合物用於個體治療領域中固有的限制。
對於抗體，優選的劑量是0.1mg/kg-100mg/kg體重(更優選0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg或0.1-1.0mg/kg)。如果抗體在腦內起作用，通常50mg/kg-100mg/kg的劑量是適當的。一般來說，部分人抗體和完全人抗體比其它抗體在人體內具有更長半衰期。因此，更低劑量和更少頻次的給藥經常是可能的。修飾如脂化可用於穩定抗體並增強攝入和組織通透性(如腦中)。脂化抗體的方法由Cruikshank等人描述(1997，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14193)。
在一個具體實施方案中，蛋白質或多肽的有效量(即有效劑量)範圍是約0.001mg/kg-30mg/kg體重，優選約0.01-25mg/kg體重，更優選0.1-20mg/kg體重，甚至更優選0.1-1.0mg/kg、1-10mg/kg、2-9mg/kg、3-8mg/kg、4-7mg/kg或5-6mg/kg體重。
技術人員將知道某些因素可以影響有效治療對象需要的劑量，包括但不限於疾病或病症的嚴重程度、之前的治療、一般健康狀況和/或對象的年齡以及是否存在其它疾病。而且，用治療有效量的蛋白質、多肽或抗體治療對象可以包括單個治療，或優選的是可以包括一系列治療。
除了上述化合物以外，本發明包括調節感興趣核酸或多肽的表達或活性的小分子的用途。小分子的非限制性實例包括肽、肽模擬物、胺基酸、胺基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、分子量小於約10,000g/mol的有機或無機化合物(即包括異源有機化合物和有機金屬化合物)、分子量小於約5,000g/mol的有機或無機化合物、分子量小於約1,000g/mol的有機或無機化合物、分子量小於約500g/mol的有機或無機化合物，和鹽、酯及這些化合物的其它藥學上可接受的形式。
可以理解，小分子藥劑的適當劑量依賴於具有普通技術的醫生、獸醫或研究人員知識範圍內的很多因素。小分子的劑量的變化例如將依賴於被處理的對象或樣品的身份、大小和狀況而變化，還取決於待給藥的組合物的途徑(如果適用的話)，以及醫生期望小分子對本發明核酸或多肽的作用。示例性劑量包括毫克或微克量的小分子每千克對象或樣品重量(如約1微克/千克到約500毫克/千克、約100微克/千克到約5毫克/千克，或約1微克/千克到約50微克/千克)。而且可以理解，小分子的適當劑量依賴於所述小分子對待調節的表達或活性的功效。這些適當劑量可以用本文所述測試確定。當一或多種這些小分子給予對象(如人)以調節本發明多肽或核酸的表達或活性時，醫生、獸醫或研究人員例如可以首先開相對低劑量的處方，隨後增加劑量直至獲得適當反應。此外，可以理解對於任何特定動物對象的具體劑量水平將依賴於多種因素，包括所使用具體化合物的活性、對象的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、給藥時間、給藥途徑、排洩速率、任意藥物組合和待調節的表達或活性的程度。
所述藥物組合物可以與給藥說明一起包括在容器、包裝或分配器中。
5.17試劑盒本發明提供試劑盒，以測定至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質和RNA產物的表達。這些試劑盒包含測定這些蛋白質和RNA產物的表達所需要的材料和試劑。在具體實施方案中，所述試劑盒還可以包含所述多種方法中使用的一或多種其它試劑，如(1)從血中純化RNA的試劑；(2)產生受試核酸的引物；(3)dNTP和/或rNTP(預混或分離的)，任選地具有一或多種獨特標記的dNTP和/或rNTP(如生物素化或帶Cy3或Cy5標籤的dNTP)；(4)合成後標記試劑，如螢光染料的化學活性衍生物；(5)酶，如逆轉錄酶、DNA聚合酶等；(6)多種緩衝介質，如雜交和洗滌緩衝劑；(7)標記探針純化試劑和成分，如離心柱等；和(8)蛋白質純化試劑；(9)信號產生和檢測試劑，如鏈親合素-鹼性磷酸酶偶聯物、化學螢光或化學發光底物等。在具體實施方案中，所述試劑盒包含從樣品(如血)中分離以用作對照的預標記的質量控制蛋白質和/或RNA。
在一些實施方案中，試劑盒是RT-PCR試劑盒。在另一些實施方案中，試劑盒是核酸陣列和蛋白質陣列。根據本發明的這些試劑盒將至少包含具有本發明的相關蛋白質或核酸成員的陣列及其包裝物。作為替代方案，本發明的蛋白質或核酸成員可以預包裝到陣列上。
在一些實施方案中，試劑盒是定量RT-PCR試劑盒。在一個實施方案中，定量RT-PCR試劑盒包括以下(a)用於擴增本發明生物標誌物的各種組合的引物；(b)緩衝劑和酶，包括逆轉錄酶；(c)一或多種熱穩定聚合酶；和(d)SybrGreen。在一個優選實施方案中，本發明的試劑盒還包括(a)參考對照RNA和(b)帶標記的(spiked)對照RNA。
本發明提供可用於診斷肝癌的試劑盒。例如，在本發明一個具體實施方案中試劑盒包含正向和反向引物，其中正向和反向引物的設計使得可以定量與表2中鑑定的各種生物標誌物對應的所有種類mRNA的表達。在某些實施方案中，至少一種引物設計為跨外顯子連接處。
本發明提供的用於檢測、診斷、監測和預測肝癌的試劑盒基於樣品中至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質和RNA產物的表達。在某些實施方案中，這些試劑盒不包括測定已經被現有技術暗示與肝癌有關的本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物表達的材料和試劑。在另一些實施方案中，這些試劑盒包括測定已經被現有技術暗示與肝癌有關的本發明生物標誌物和本發明生物標誌物以外的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或更多基因的蛋白質或RNA產物表達的材料和試劑。
本發明提供的用於監測對象所接受的一或多種治療的效果的試劑盒基於樣品中至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質和RNA產物的表達。在某些實施方案中，這些試劑盒不包括測定已經被現有技術暗示與肝癌有關的本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物表達的材料和試劑。在另一些實施方案中，這些試劑盒包括測定已經被現有技術暗示與肝癌有關的本發明生物標誌物和本發明生物標誌物以外的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、或更多基因的蛋白質或RNA產物表達的材料和試劑。
本發明提供的用於確定對象是否對治療有反應的試劑盒基於樣品中至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質和RNA產物的表達。在某些實施方案中，這些試劑盒不包括測定已經被現有技術暗示與肝癌有關的本發明生物標誌物的蛋白質或RNA產物表達的材料和試劑。在另一些實施方案中，這些試劑盒包括測定已經被現有技術暗示與肝癌有關的本發明生物標誌物和本發明生物標誌物以外的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種或更多基因的蛋白質或RNA產物表達的材料和試劑。
本發明提供測定樣品中至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物的表達的試劑盒。在一個具體實施方案中，這些試劑盒包含測定本發明生物標誌物的RNA產物表達必需的材料和試劑。例如，可以製備用於肝癌的微陣列或RT-PCR試劑盒，並且其僅含有測定至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物的水平必需的試劑和材料。作為替代方案，在一些實施方案中，所述試劑盒可以包含不限於測定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25個或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物的水平需要的那些材料和試劑。例如，除了測定至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物的水平必需的試劑和材料以外，微陣列試劑盒還可以含有測定未必與肝癌相關或未必是肝癌指標的RNA產物的水平所需的材料和試劑。在一個具體實施方案中，微陣列或RT-PCR試劑盒含有測定以下的RNA產物的水平所需的試劑和材料至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少12種、至少15種、至少20種、至少25種或全部或任意組合的本發明生物標誌物，以及本發明生物標誌物以外的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450個或更多基因，或本發明生物標誌物以外的1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000、500-1000個基因。
對於核酸微陣列試劑盒，所述試劑盒通常包含附著到固相支持物表面的探針。所述探針可以用可檢測的標記物標記。在一個具體實施方案中，探針特異性針對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25個或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物的外顯子、內含子、外顯子連接處或外顯子-內含子連接處。所述微陣列試劑盒可以包含實施測試的說明和解釋與分析實施測試所得數據的方法。在一個具體實施方案中，所述試劑盒包含診斷肝癌的說明。所述試劑盒還可以包含雜交試劑和/或檢測當探針與靶核酸序列雜交時所產生信號必需的試劑。一般來說，微陣列試劑盒的材料和試劑處於一或多個容器中。試劑盒的每種組分一般在各自的合適容器中。
對於RT-PCR試劑盒，試劑盒通常包含預選的引物，它們特異性針對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25個或全部或任意組合的本發明生物標誌物的特定RNA產物(如外顯子、內含子、外顯子連接處或外顯子-內含子連接處)。RT-PCR試劑盒還可以包含適於逆轉錄和/或擴增核酸的酶(例如聚合酶，如Taq)，和逆轉錄和擴增的反應混合物需要的脫氧核苷酸和緩衝液。RT-PCR試劑盒還可以包含特異性針對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25個或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物的探針。所述探針可以標記或不標記可檢測標記物(如螢光標記物)。RT-PCR試劑盒的每種組分一般在各自的合適容器中。因此，這些試劑盒通常包含適於每種相應試劑、酶、引物和探針的不同容器。而且，RT-PCR試劑盒可以包含實施測試的說明和解釋與分析實施測試所得數據的方法。在一個具體實施方案中，所述試劑盒含有診斷肝癌的說明。
在一個具體實施方案中，所述試劑盒是實時RT-PCR試劑盒。這種試劑盒可以包含96孔板和SYBR Green檢測所需的材料和試劑。所述試劑盒可以包含可以使用β-肌動蛋白校正結果的試劑和材料。所述試劑盒還可以包含對照，如水、磷酸鹽緩衝液和噬菌體MS2 RNA。而且，所述試劑盒可以包含實施測試的說明和解釋與分析實施測試所得數據的方法。在一個具體實施方案中，說明中指出應該在差別如5倍到10倍的兩個濃度檢查1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個或全部或任意組合的本發明生物標誌物的RNA產物水平。
對於基於抗體的試劑盒，試劑盒例如可以包含(1)第一抗體(可以與固相支持物附著或不附著)，它結合感興趣蛋白質(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25個或全部或任意組合的本發明生物標誌物的蛋白質產物)；和任選地(2)不同的第二抗體，它結合所述蛋白質或第一抗體，並與可檢測標記物(如螢光標記物、放射性同位素或酶)偶聯。基於抗體的試劑盒還可以包含進行免疫沉澱的珠子。基於抗體的試劑盒的每種組分一般在各自的合適容器中。因此，這些試劑盒通常包含適於每種抗體的不同容器。而且，基於抗體的試劑盒可以包含實施測試的說明和解釋與分析實施測試所得數據的方法。在一個具體實施方案中，試劑盒含有診斷肝癌的說明。
5.19SNP單核苷酸多態性(SNP)是不同個體的基因組中特定位置處的單個核苷酸變異。在基因組DNA的編碼區和非編碼區中都發現有SNP。儘管可以評價的表型極少，但在人基因組中發現大量的SNP(Cooper et al.，Hum Genet 69210-205，1985)。SNP是在基因中經常發現的穩定遺傳性變異，並且對生物中發現的各種表型變異有貢獻。單核苷酸多態性(SNP)在鑑定很多遺傳病以及表型特徵中可以具有預測價值。例如已知某些SNP導致引起疾病的突變，如與遺傳性乳癌相關的SNP(Cannon-Albrightand Skolnick，Semin Oncol 231-5，1996)。
可以用本領域公知的多種方法鑑定生物體DNA中的SNP，包括但不限於通過DNA測序、通過擴增PCR產物並測序PCR產物、通過寡核苷酸連接測定(OLA)、通過雙碼OLA(Doublecode OLA)、通過單鹼基延伸測定、通過等位基因特異性引物延伸或通過錯配雜交來鑑定SNP。
通過鑑定到在患有肝癌的個體血中差異表達的基因集合，本發明提供更集中而有效的篩選SNP以鑑定與肝癌特異性相關的那些SNP的方法。在本發明的一個方面中，選擇的待篩選的SNP是表1和3中所列基因中發現的那些SNP。在本發明的另一個方面中，待篩選的SNP是圖3中列出的那些SNP。在本發明的又一個方面中，可以用上述方法在疾病相關的生物標誌物中鑑定新SNP。
具體地說，本發明關注通過僅篩選本文鑑定的生物標誌物中的那些SNP而鑑定與肝癌相關的SNP的方法。用本文公開的方法鑑定的那些SNP將是方便的診斷標誌物。鑑定與肝癌相關的SNP的一個優選方面涉及從樣品如成群個體的血中分離DNA，篩選圖3中鑑定的SNP基因以鑑定一或多種SNP作為肝癌的診斷標誌物，所述個體中的一些已被診斷患有肝癌，那些個體中的一些不患有肝癌。更具體地說，如果患有肝癌的個體在SNP基因座處相對於不患有肝癌的個體具有不同的多態性，則SNP被認為是肝癌相關的SNP。而且，如果發現SNP的特定多態性以比不患有肝癌的個體統計學顯著更高的頻率存在於患有肝癌的個體中，則特定的SNP被認為對肝癌具有診斷性。統計學顯著性指標包括p＜0.05，p＜0.001，p＜0.01和p＜0.10。然而，本發明不限於從圖3中鑑定肝癌診斷性SNP，包括在表1和2中所列肝癌生物標誌物基因中鑑定新SNP的方法，和確定它們對肝癌的診斷價值的方法。
將會理解，優選的樣品是血，但這些方法包括可以從中獲得DNA的任何樣品，包括上皮細胞、口腔細胞、毛髮、唾液、組織細胞等。有很多可用於獲得並保存組織和/或血液樣品的方法。這些替代性方法允許以適於從樣品中回收基因組DNA以進行基因型分析的形式保存並運輸組織和血液樣品。可以將DNA樣品收集並保存於多種固體介質上，包括Whatmann紙、Guthrie卡、管、藥籤、濾紙、載片或其它容器。當將全血收集在濾紙上時，例如，它可以在室溫乾燥並保存。
在本發明的另一個方面中，肝癌相關的SNP可以從表1和2中所列肝癌生物標誌物基因的RNA轉錄本中鑑定，而不是從基因組DNA中鑑定。在一個實施方案中，從患有和不患有給定疾病或病症的個體的樣品如血中分離RNA，並將這些肝癌生物標誌物基因編碼的轉錄本逆轉錄成cDNA。擴增並分析cDNA以確定肝癌生物標誌物基因中是否存在SNP。然後可以通過比較患有肝癌的個體與不患有肝癌的個體中差異表達的肝癌相關的生物標誌物基因中鑑定的各種SNP的分布，鑑定肝癌相關的SNP。在這種實施方案的進一步變換方案中，不分析cDNA中是否存在SNP，而是分析疾病特異性生物標誌物基因的RNA轉錄本或其擴增產物中是否存在SNP。
分析包含肝癌生物標誌物基因的基因組DNA具有在編碼區以及調節區中鑑定SNP的潛力，所述調節區可能對所述基因表達水平的變化有貢獻。分析cDNA編碼的SNP具有僅鑑定肝癌生物標誌物基因的編碼區中SNP的能力，這可能有助於解析肝癌的基於蛋白質的機制。分析cDNA編碼的SNP的方法可以通過分析本文所述RT-PCR反應中產生的cDNA進行，所述RT-PCR反應用於鑑定患者和非患者的樣品中生物標誌物的水平。
肝癌相關的SNP可以通過本領域技術人員公知的很多方法在肝癌生物標誌物基因的DNA中鑑定(例如見美國專利No.6,221,592和5,679,524)，包括但不限於經以下方法鑑定SNPPCR或DNA擴增、寡核苷酸連接測定(OLA)(Landegren et al.，Science 2411077，1988)、雙碼OLA、錯配雜交、質譜、單鹼基延伸測試、(US6638722)、基於等位基因特異性限制性內切酶切割的RFLP檢測(Kan and Dozy，Lancetii910-912，1978)、用等位基因特異性寡核苷酸探針雜交(Wallace et al.，Nucl AcidsRes 63543-3557，1978)、包括固定化寡核苷酸(Saiki et al.，Proc Natl Acad Sci USA866230-6234，1989)或寡核苷酸陣列(Maskos and Southern，Nucl Acids Res212269-2270，1993)、等位基因特異性PCR(Newton et al.，Nucl Acids Res 172503-16，1989)、錯配修復檢測(MRD)(Faham and Cox，Genome Res 5474-482，1995)、MutS蛋白的結合(Wagner et al.，Nucl Acids Res 233944-3948，1995)、單鏈構象多態性檢測(Orita et al.，Genomics 5874-879，1983)、錯配鹼基對處的RNA酶切割(Myers et al.，Science 2301242，1985)、化學品(Cotton et al.，Proc Natl Acad SciUSA 854397-4401，1988)或酶促(Youil et al.，Proc Natl Acad Sci USA 9287-91，1995)切割異源雙鏈DNA、基於等位基因特異性引物延伸的方法(Syvanen et al.，Genomics8684-692，1990)、遺傳位分析(GBA)(Nikiforov et al.，Nuci Acids Res 224167-4175，1994)和用本領域公知的標準方法進行放射性和/或螢光DNA測序。
篩選SNP的亞組以鑑定肝癌生物標誌物基因中肝癌相關SNP的本發明方法還包括DNA的非PCR方法。這些方法包括連接酶鏈式反應(「LCR」)，公開於歐洲專利申請No.320,308；Qβ複製酶，描述於PCT專利申請No.PCT/US87/00880；等溫擴增方法，Walker et al.(Nucleic Acids Res 20(7)1691-6，1992)；鏈置換擴增(SDA)，描述於美國專利No.5,712,124、5,648,211和5,455,166；循環探針反應；基於轉錄的擴增，包括基於核酸序列的擴增(NASBA)和3SR，Kwoh et al.，Proc Natl Acad SciUSA，861173-77，1989；PCT專利申請WO 88/10315 et al.，1989；其它擴增方法，如描述於英國專利申請No.GB 2,202,328，和PCT專利申請No.PCT/US89/01025，Davey et al.，歐洲專利申請No.329,822，Miller et al.，PCT專利申請WO 89/06700；「race」和「one-sided PCR.TM.」，描述於Frohman，InPCR ProtocolsA Guide ToMethods And Applications，Academic Press，N.Y.，1990；基於在具有所得「雙寡核苷酸」序列的核酸存在下連接兩種(或更多種)寡核苷酸的方法，描述於Wu et al.，Genomics 4560-569，1989。
儘管一般認為所用聚合酶將是熱穩定的，但非熱穩定的聚合酶也可以用於本發明公開的內容中。聚合酶和可用於此處公開內容的核酸修飾酶的實例包括熱穩定聚合酶OmniBase測序酶、Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(測序級)、TaqBead熱啟動聚合酶、AmpliTaq Gold、Vent DNA聚合酶、Tub DNA聚合酶、TaqPlus DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶；DNA聚合酶DNA聚合酶I、Klenow片段、外切核酸酶Minus、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I大(Klenow)片段、末端脫氧核苷醯轉移酶、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶；逆轉錄酶AMV逆轉錄酶和M-MLV逆轉錄酶；T4 DNA連接酶和T4多核苷酸激酶。
摻入引物、擴增期間摻入擴增產物或與探針連接的識別基團可用於鑑定擴增分子。很多不同的標記物可用於這種目的，例如螢光物質、發色物質、放射性同位素、酶標籤、抗體、化學發光、電發光、親合標記物等。本領域技術人員將認識到這些和本文未提及的其它螢光物質也可以成功用於本公開內容。親合標記物的實例包括但不限於以下抗體、抗體片段、受體蛋白、激素、生物素、DNP或與親合標記物結合併可用於分離擴增基因的任何多肽/蛋白質。酶標記物的實例包括酶標籤，如脲酶、鹼性磷酸酶或過氧化物酶。另外，比色指示底物可用於提供人眼或分光光度計可觀察的檢測手段，以鑑定與含互補性核酸的樣品的特異性雜交。所有這些實例都是本領域公知的，並且技術人員將認識到本公開不限於上述實例。具體考慮將以下螢光物質用於本公開中Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、螢光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、Rhodamine Green、Rhodamine Red、ROX、TAMRA、TET、四甲基羅丹明和德克薩斯紅。
在本公開中，具體考慮用DNA晶片或微陣列分析所公開方法的DNA擴增產物以檢測SNP。然後可以將擴增的DNA產物通過含寡核苷酸或多核苷酸探針的DNA晶片或微陣列。擴增的DNA能或不能與微陣列或DNA晶片雜交將有助於表徵編碼樣品中存在的轉錄本的生物標誌物基因中是否存在SNP。
以下實施例不是限制性的，而僅僅是本發明多個方面和特性的代表。
5.18實施例實施例1從裂解血中分離RNA將10ml全血收集於Vacutainer中並在4℃以2,000rpm離心5分鐘，除去血漿層。以3份裂解緩衝液比1份血的比例加入裂解緩衝液(裂解緩衝液(1L)0.6g EDTA；1.0g KHCO2，8.2g NH4Cl，用NaOH調節到pH7.4)。混合樣品放置於冰上5-10分鐘直至透明。在4℃以1000rpm離心裂解的樣品10分鐘，並吸棄上清液。將沉澱重懸於5ml裂解緩衝液，在4℃以1000rpm再次離心裂解的樣品10分鐘。以每10ml原始血樣大致6ml TRIzol的比例用TRIzol(GIBCO/BRL)勻漿沉澱細胞並充分振蕩。樣品在室溫靜置5分鐘。用1.2ml氯仿/1ml TRIzol提取RNA。在4℃以12,000×g離心樣品5分鐘並收集上層。按0.5ml/1ml TRIzol的比例向上層中加入異丙醇。樣品於-20℃靜置過夜或在-20℃放置1小時。根據已知方法沉澱RNA，空氣乾燥RNA沉澱，並將沉澱重懸於DEPC處理的ddH2O中。RNA樣品也可以保存於75％乙醇中，在此條件下樣品在室溫下穩定，以便運輸。
實施例2從全血中分離RNA100μl全血收集於微離心管中，在4℃以2,000rpm(800g)離心5分鐘，去除上清液。以每10μl原始血樣大致6μl TRIzol的比例用TRIzol(GIBCO/BRL)勻漿沉澱細胞並充分振蕩。樣品在室溫靜置5分鐘。用12μml氯仿/10μl TRIzol提取RNA。在4℃以12,000×g離心樣品5分鐘並收集上層。按5μl/10μl TRIzol的比例向上層中加入異丙醇。樣品於-20℃靜置過夜或在-20℃放置1小時。根據已知方法沉澱RNA，空氣乾燥RNA沉澱，並將沉澱重懸於DEPC處理的ddH2O中。RNA樣品也可以保存於75％乙醇中，在此條件下樣品在室溫下穩定，以便運輸。
從離心裂解血中分離RNA將10ml全血收集於Vacutainer中並在4℃以2,000rpm(800g)離心5分鐘，除去血漿層。以3份裂解緩衝液比1份血的比例加入裂解緩衝液(裂解緩衝液(1L)0.6g EDTA；1.0g KHCO2，8.2g NH4Cl，用NaOH調節到pH7.4)。混合樣品放置於冰上5-10分鐘直至透明。在4℃以1000rpm離心裂解後樣品10分鐘，並吸棄上清液。沉澱重懸於5ml裂解緩衝液，在4℃以1000rpm再次離心裂解後樣品10分鐘。以每10ml原始血樣大致6ml TRIzol的比例用TRIzol(GIBCO/BRL)勻漿沉澱細胞並充分振蕩。樣品在室溫靜置5分鐘。用1.2ml氯仿/1ml TRIzol提取RNA。在4℃以12,000×g離心樣品5分鐘，並收集上層。按0.5ml/1ml TRIzol的比例向上層中加入異丙醇。樣品於-20℃靜置過夜或在-20℃放置1小時。根據已知方法沉澱RNA，空氣乾燥RNA沉澱，並將沉澱重懸於DEPC處理的ddH2O中。RNA樣品也可以保存於75％乙醇中，在此條件下樣品在室溫下穩定，以便運輸。
從無血清全血中分離RNA將10ml全血收集於Vacutainer中並在4℃以2,000rpm(800g)離心5分鐘，除去血漿層。以每10ml原始血樣大致6ml TRIzol的比例用TRIzol(GIBCO/BRL)勻漿沉澱細胞並充分振蕩。樣品在室溫靜置5分鐘。用1.2ml氯仿/1ml TRIzol提取RNA。在4℃以12,000×g離心樣品5分鐘，並收集上層。按0.5ml/1ml TRIzol的比例向上層中加入異丙醇。樣品於-20℃靜置過夜或在-20℃放置1小時。根據已知方法沉澱RNA，空氣乾燥RNA沉澱，並將沉澱重懸於DEPC處理的ddH2O中。RNA樣品也可以保存於75％乙醇中，在此條件下樣品在室溫下穩定，以便運輸。
實施例3靶核酸製備和雜交從mRNA製備螢光DNA探針製備RNA的螢光標記的靶核酸樣品，以用本發明的陣列進行分析。
通過在70℃加熱10分鐘，並在冰上冷卻，將1μg Oligo-dT引物退火到總體積10μl的10μg總RNA上，所述總RNA從診斷患有肝癌或懷疑患有肝癌的患者的血中分離。在25μl體積中將樣品在42℃孵育40分鐘以逆轉錄mRNA，所述25μl體積中含有終濃度50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、25mM DTT、25mM未標記dNTP、400單位Superscript II(200U/μl，BRL)和15mM Cy3或Cy5(Amersham)。通過加入2.5μl 55500mM EDTA和5μl 1M NaOH並在65℃孵育10分鐘，從而終止反應。加入12.5μl 1M TrisHCl(pH7.6)中和反應混合物。
在Centricon-30微濃縮器(Amicon)中離心來純化標記的靶核酸樣品。如果兩種不同的靶核酸樣品(如來源於不同患者的兩個樣品)通過與同一陣列雜交進行分析和比較，每種靶核酸樣品用不同的螢光標記物(如Cy3和Cy5)標記並分別濃縮。分別濃縮的靶核酸樣品(Cy3和Cy5標記的)合併到新Centricon中，用500μl TE洗滌，並再次濃縮到少於7μl的體積。加入1μL 10μg/μl polyA RNA(Sigma，#P9403)和1μL 10μg/μl tRNA(GIBCO-BRL，#15401-011)並用蒸餾水調節體積到9.5μl。對於最終的靶核酸製備物，加入2.1μl 20×SSC(1.5M NaCl，150mM檸檬酸鈉(pH8.0))和0.35μl 10％SDS。
雜交100℃加熱2分鐘變性標記的核酸，在37℃孵育20-30分鐘，然後放置於核酸陣列上，用22mm×22mm蓋玻片蓋上。在用3×SSC的小儲器維持溼潤的定製玻片室中在65℃下雜交14-18小時。依次浸入含0.1％SDS的2×SSC、1×SSC和0.1×SSC中並攪拌2-5分鐘洗滌陣列。最後，在Beckman GS-6臺式離心機中在650 RPM 2分鐘的Microlus載體中在玻片架中離心2分鐘以乾燥陣列。
實施例4實時RT PCR使用Qiagen的SYBRGreen試劑盒(產品號204143)對表1公開的基因進行實時RT PCR。表1中選擇的基因的實驗結果表示於以下實施例6。
可以使用一步(逆轉錄和PCR組合)或兩步(首先逆轉錄，然後再進行PCR)法。在兩步操作方案中，首先用Applied Biosystems的High-Capacity cDNA Archive試劑盒(產品號4322171)並根據其中使用的操作方案進行逆轉錄。
更具體地，將本文前面所述的純化RNA與逆轉錄緩衝液、dNTP、隨機引物和逆轉錄酶一起孵育，在25℃孵育10分鐘，隨後在37℃孵育2小時，所得混合物用作定量PCR的起始產物。
將逆轉錄獲得的cDNA與按提供形式而不調節鎂濃度的QuantiTect SYBRGreen PCR Master Mix一起孵育。不加入尿嘧啶-N-糖基化酶。加入5μM的對本發明基因特異性的正向引物和反向引物，孵育反應，並根據標準操作用ABI PRISM7700/ABI GeneAmp 5700/iCycler/DNA Engine Opticon監測。
表7用於實時RT PCR的引物
實施例5TAQMAN還可以用Qiagen的QuantiTectTM探針RT-PCR系統(產品號204343)組合對應感興趣基因的TaqMan雙標記探針和引物進行定量實時RT-PCR。可以從AppliedBiosystems Assays-On-DemandTM定購TaqMan探針和引物。
雙標記探針同時含有螢光和淬滅分子。淬滅分子鄰近螢光報告分子阻止報告分子發螢光，但在PCR延伸步驟期間，Taq DNA聚合酶的5』-3』核酸外切酶活性釋放螢光分子使得它可以發螢光。因此，螢光的量與生成的PCR產物量相關。
實施例6統計分析實時PCR結果用已知方法統計分析對從分類為正常或患有肝癌的個體分離的血樣進行的實時PCR分析，以確認公開為生物標誌物的基因的有用性。
優選選擇具有相似年齡和性別的個體進行進一步分析。可在年齡和性別基礎上進行比較的樣品選擇用本領域技術人員已知的t-檢驗確定。
對年齡和性別匹配的約4-20個樣品的組進行t-檢驗。對樣品組中的每一個進行分析以確定所述組之間的變化倍數區別(見下表8)。圖2示出對從離心裂解血分離的總RNA分析所述三種已鑑定生物標誌物。
表8
實施例7特異性分析為了驗證血中鑑定基因的特異性，我們驗證了在肝癌和對照患者之間顯示顯著差異的四種基因的表達水平，並測試結腸癌和胃癌患者中的所述相同基因。CD14抗原(CD14)、α-synuclein(SNCA)和Clusterin(CLU)在HCC中顯著高於對照中(分別是1.5、2.4和1.8倍)。CDC樣激酶(CLK1)的基因表達水平在HCC中比對照中低30％(p＝0.006)。
也檢測了胃癌和結腸癌患者的血中這些基因的表達。除了CLU在結腸癌中被下調(p＜0.05)(數據未示出)以外，沒有顯著變化。
實施例8用邏輯回歸鑑定生物標誌物組合用ABI High Capacity cDNA Archive試劑盒(Cat#4322171)在Perkin-ElmerDNA熱循環儀上進行第一鏈cDNA合成。用Qiagen Quantitect SYBRGreen PCR試劑盒(Cat#204143)進行特定cDNA的定量，並用瓊脂糖凝膠確認期望產物。在每個樣品中，用其Ct值定量靶基因的表達水平，Ct值是擴增子可以與背景區分的濃度依賴的PCR循環數。通過減去管家基因β-肌動蛋白的Ct值，每個Ct值與內標相關。為了獲得更大區分能力，用邏輯回歸生成ΔCt的線性組合。用MedCalc(MedCalc；Mariakerke，Belgium)、XLSTAT(AddinSoft；Paris，France)和我們自己的軟體經ROC(接受器工作特徵)曲線分析定量評價所述組合的診斷準確性(即真與假陽性和真與假陰性報告的可能性)。分析用邏輯回歸生成的分類符的ROC分析。ROC＞0.9的分類符的實例表示於圖6和圖7。
實施例9本發明的分類符可以如上實施例8所述或用本文所述其它數學模型生成。例如圖6所示的分類符寫作以下
X＝45.721-12.133*APLP2+13.946*CLK1-3.76*SNCA-2.88*TFEC為使用分類符進行診斷，測定測試個體的APLP2、CLK1、SNCA和TFEC的ΔCt(如實施例8概述)並代入以上等式。當x＜0時測試個體被考慮診斷為對照(不患有肝癌)。與之相似，當x＞0時測試個體被考慮診斷為患有肝癌。本領域技術人員將會理解，在等式X＝-45.721+12.133*APLP2-13.946*CLK1+3.76*SNCA-2.88*TFEC中，當x＞0時測試個體被考慮診斷為對照，當x＜0時診斷為患有肝癌。
實施例10用圖1所述的分離生物標誌物分析與正常個體的基因表達譜相比肝癌個體血樣的基因表達譜本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用TRIzol試劑(GIBCO)從每個患者的一滴血中分離總mRNA，然後製備每種血樣的螢光標記探針，使探針變性並雜交到含有表1、表2或圖1所述的每個基因的全長cDNA序列的微陣列上。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性雜交。通過用t-檢驗進行統計分析來確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述三種基因的差異表達(GlantzSA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical PublishingDivision，2002)。
實施例11用圖1所述3種基因的5』區分析與健康個體的基因表達譜相比肝癌個體血樣的基因表達譜本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用TRIzol試劑(GIBCO)從每個患者的一滴血中分離總mRNA，然後製備每種血樣的螢光標記探針，使探針變性並雜交到含有與表3、表4或圖1所述3種基因的每個的5』區對應的長25個核苷酸的DNA序列的微陣列上。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性雜交。通過用t-檢驗進行統計分析來確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述三種基因的差異表達(Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical Publishing Division，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
實施例12用圖1所述基因的3』區分析與健康個體的基因表達譜相比肝癌個體血樣的基因表達譜本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用TRIzol試劑(GIBCO)從每個患者的一滴血中分離總mRNA，然後製備每種血樣的螢光標記探針，使探針變性並雜交到含有與表3、表4或圖1所述3種基因的每個的3』區對應的長50個核苷酸的DNA序列的微陣列上。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性雜交。通過用t-檢驗驚醒統計分析來確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述三種基因的差異表達(Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical Publishing Division，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
實施例13用圖1所述基因的內部編碼區分析與健康個體的基因表達譜相比肝癌個體血樣的基因表達譜本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用TRIzol試劑(GIBCO)從每個患者的一滴血中分離總mRNA，然後製備每種血樣的螢光標記探針，使探針變性並雜交到含有與表3、表4或圖1所述3種基因的每個的內部編碼區對應的長70個核苷酸的DNA序列的微陣列上。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性雜交。通過用t-檢驗進行統計分析確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述三種基因的差異表達(Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical Publishing Division，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
實施例14用抗由表3、表4或圖1所述基因編碼多肽的單克隆抗體分析與健康個體血樣相比的肝癌個體血樣本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用BD Clontech蛋白質提取和標記試劑盒(目錄號#K1848-1或#631786)從每個患者獲取的血中分離並標記總細胞蛋白質。簡單的說，提取操作主要由三步組成機械破碎細胞、溶解細胞和離心提取物。操作可以從細胞沉澱或冷凍組織開始，並可以使用任何機械破碎方法-French press、超聲、切碎或研磨。破碎以後，加入提取/標記緩衝液(1∶20w/v)溶解樣品。因為該緩衝液為使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)-酯染料(如Cy3和Cy5染料)標記而配製，它不含與染料反應競爭的任何蛋白酶抑制劑或還原劑。提取以後，離心樣品以沉澱不溶物質如染色體DNA。然後用Cy3和Cy5螢光染料(單功能NHS-酯)標記可溶性提取物。然後將標記的蛋白質與單克隆抗體陣列一起孵育，所述單克隆抗體針對由表3、表4或圖1所述三種基因編碼的全長多肽。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性結合。通過用Wilcox Mann Whitney秩和檢驗進行統計分析確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述三種基因的差異表達(GlantzSA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical PublishingDivision，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
實施例15用抗由表3、表4或圖1所述基因的5』區編碼的多肽氨基末端區的單克隆抗體，分析與健康個體的血樣相比肝癌個體的血樣本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用BD Clontech蛋白質提取和標記試劑盒(目錄號#K1848-1或#631786)從每個患者獲取的血中分離並標記總細胞蛋白質。簡單的說，提取操作主要由三步組成機械破碎細胞、溶解細胞和離心提取物。操作可以從細胞沉澱或冷凍組織開始，並可以使用任何機械破碎方法-French press、超聲、切碎或研磨。破碎以後，加入提取/標記緩衝液(1∶20w/v)溶解樣品。因為該緩衝液為使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)-酯染料(如Cy3和Cy5染料)標記而配製，它不含與染料反應競爭的任何蛋白酶抑制劑或還原劑。提取以後，離心樣品以沉澱不溶物質如染色體DNA。然後用Cy3和Cy5螢光染料(單功能NHS-酯)標記可溶性提取物。然後將標記的蛋白質與單克隆抗體陣列一起孵育，所述單克隆抗體針對由表3、表4或圖1所述基因的5』區編碼的多肽的氨基末端區。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性結合。通過用WilcoxMann Whitney秩和檢驗進行統計分析確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述三種基因的差異表達(Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical Publishing Division，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
實施例16用抗由表3、表4或圖1所述基因的3』區編碼的多肽羧基末端區的單克隆抗體，分析與健康個體的血樣相比肝癌個體的血樣本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用BD Clontech蛋白質提取和標記試劑盒(目錄號#K1848-1或#631786)從每個患者獲取的血中分離並標記總細胞蛋白質。簡單的說，提取操作主要由三步組成機械破碎細胞、溶解細胞和離心提取物。操作可以從細胞沉澱或冷凍組織開始，並可以使用任何機械破碎方法-French press、超聲、切碎或研磨。破碎以後，加入提取/標記緩衝液(1∶20w/v)溶解樣品。因為該緩衝液為使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)-酯染料(如Cy3和Cy5染料)標記而配製，它不含與染料反應競爭的任何蛋白酶抑制劑或還原劑。提取以後，離心樣品以沉澱不溶物質如染色體DNA。然後用Cy3和Cy5螢光染料(單功能NHS-酯)標記可溶性提取物。然後將標記的蛋白質與單克隆抗體陣列一起孵育，所述單克隆抗體針對由表3、表4或圖1所述基因的3』區編碼的多肽的羧基末端區。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性結合。通過用WilcoxMann Whitney秩和檢驗進行統計分析確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述基因的差異表達(Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical Publishing Division，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
實施例17用抗由表3、表4或圖1所述基因的內部編碼區編碼的多肽的內部多肽區的單克隆抗體，分析與健康個體的血樣相比肝癌個體的血樣本實施例證明了要求保護的本發明通過檢測與健康患者血樣相比肝癌患者血樣中的差異基因表達而診斷肝癌的用途。
血樣取自如本文所述臨床診斷患有肝癌的患者。然後分析基因表達譜，並與不受肝癌影響的患者的表達譜比較。在每種情況下，由熟練的執業醫生確認肝癌診斷。
首先用BD Clontech蛋白質提取和標記試劑盒(目錄號#K1848-1或#631786)從每個患者獲取的血中分離並標記總細胞蛋白質。簡單的說，提取操作主要由三步組成機械破碎細胞、溶解細胞和離心提取物。操作可以從細胞沉澱或冷凍組織開始，並可以使用任何機械破碎方法-French press、超聲、切碎或研磨。破碎以後，加入提取/標記緩衝液(1∶20w/v)溶解樣品。因為該緩衝液為使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)-酯染料(如Cy3和Cy5染料)標記而配製，它不含與染料反應競爭的任何蛋白酶抑制劑或還原劑。提取以後，離心樣品以沉澱不溶物質如染色體DNA。然後用Cy3和Cy5螢光染料(單功能NHS-酯)標記可溶性提取物。然後將標記的蛋白質與單克隆抗體陣列一起孵育，所述單克隆抗體針對由表3、表4或圖1所述基因的內部編碼區編碼的多肽的內部多肽區。通過用GMS掃描儀418掃描並用Scananalyzer軟體(Michael Eisen，Stanford University)處理試驗數據，隨後用GeneSpring軟體(Silicon Genetics，CA)分析，從而測定檢測與陣列的特異性結合。通過用WilcoxMann Whitney秩和檢驗進行統計分析確定與健康患者相比肝癌患者血樣中所述基因的差異表達(Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed.New York，USAMcGraw-Hill Medical Publishing Division，2002)。表3、表4或圖1所述每種基因的差異表達可用於診斷肝癌。
序列表110基因信息公司120肝癌生物標誌物1304231/2078150US 60/516,8531512003-11-0316046170PatentIn version 3.1210121120212DNA213人工的220
223GOS2基因的正向引物4001gagaggagga gaacgctgag 20210221119212DNA213人工的220
223GOS2基因的反向引物4002gaggcgggag tgaccttag 19210321119212DNA213人工的220
223BCL2A1基因的正向引物4003ccccggatgt ggataccta 19210421119212DNA213人工的220
223BCL2A1基因的反向引物4004attttcccag cctccgttt 19210521122212DNA213人工的220
223C8FW的正向引物
4005cgctgcaagg tgtttcccat ta 22210621122212DNA213人工的220
223C8FW的反向引物4006ggatcacttc cacaatgcca gt 22210721122212DNA213人工的220
223APLP2的正向引物4007tggaggttga tccaatgctc ac 22210821122212DNA213人工的220
223APLP2的反向引物4008tccctgccac ctaaatctgc at 22210921122212DNA213人工的220
223CD14的正向引物4009tcacaagtgt gaagcctgaa gc 222101021122212DNA213人工的220
223CD14的反向引物40010gcgctccatg gtcgataagt ct 222101121120212DNA213人工的220
223CD5的正向引物
40011tgtactaacg ctgagctggt 202101221123212DNA213人工的220
223CD5的反向引物40012agggtagatg tacctgaaac tga 232101321120212DNA213人工的220
223CLEC2的正向引物40013caaccggaac attgtggagt 202101421122212DNA213人工的220
223CLEC2的反向引物40014tctgagataa ccgagccatc ct 222101521122212DNA213人工的220
223CLK1的正向引物40015actgggatga acacagttct gc 222101621122212DNA213人工的220
223CLK1的反向引物40016gaggtcaaag agacgctcat gt 222101721120212DNA213人工的220
223CLU的正向引物40017aacttccacg ccatgttcca 202101821120212DNA213人工的220
223CLU的反向引物40018tcatcgtcgc cttctcgtat 202101921120212DNA213人工的220
223CTSB的正向引物40019ccatgtaggg tgcagaccgt 202102021122212DNA213人工的220
223CTSB的反向引物40020aggctcacag atcttgctac ac 222102121121212DNA213人工的220
223CTTN(EMS1)的正向引物40021actatcccgc agaggacagc a212102221119212DNA213人工的220
223CTTN(EMS1)的反向引物40022atctcatcat cgcccgcag 192102321122212DNA213人工的
220
223FCN1的正向引物40023ggcagtgcgg gtaattctct aa 222102421122212DNA213人工的220
223FCN1的反向引物40024ttgaagcatg acagtcggcg ta 222102521122212DNA213人工的220
223IL23a的正向引物40025cagtcagttc tgcttgcaaa gg 222102621120212DNA213人工的220
223IL23A的反向引物40026agtagggagg catgaagctg 202102721122212DNA213人工的220
223IMP3的正向引物40027tcagttcaag gctcagggaa ga 222102821122212DNA213人工的220
223IMP3的反向引物40028aactctgcca gcagcaaagg at 222102921124212DNA213人工的
220
223ITGB3的正向引物40029agctcattgt tgatgcttat ggga 242103021122212DNA213人工的220
223ITGB3的反向引物40030atacaagact tgaggccagg ga 222103121126212DNA213人工的220
223KLRB1的正向引物40031ggatgaattg atacacacac agaacc 262103221122212DNA213人工的220
223KLRB1的反向引物40032gagccgttta tccacttcca gt 222103321120212DNA213人工的220
223OAS1的正向引物40033tgtggactgt tccaccaaca 202103421122212DNA213人工的220
223OAS1的反向引物40034tggtaggact ttagcagctc gt 222103521122212DNA
213人工的220
223OAS3的正向引物40035atgtgatgcc agccctcctt ta 222103621120212DNA213人工的220
223OAS3的反向引物40036atcaacggcc ttgttcacct 202103721126212DNA213人工的220
223RORA的正向引物40037ccttaggttg tgaagacttt attagc 262103821119212DNA213人工的220
223RORA的反向引物40038ttgcagccat gagcgatct 192103921120212DNA213人工的220
223RRAS2的正向引物40039aacgaccggc agagtttcaa 202104021122212DNA213人工的220
223RRAS2的反向引物40040tgtgactcca gatctgcctt gt 222104121122
212DNA213人工的220
223SNCA的正向引物40041tgggcaagaa tgaagaagga gc 222104221122212DNA213人工的220
223SNCA的反向引物40042tgataccctt cctcagaagg ca 222104321120212DNA213人工的220
223STK17B的正向引物40043acaggattgt cgggcagaaa 202104421122212DNA213人工的220
223STK17B的反向引物40044tctccacctg cagcatattc ca 222104521121212DNA213人工的220
223TFEC的正向引物40045aggacaacca caacctcatt g212104621120212DNA213人工的220
223TFEC的反向引物40046tgttccagcg catatcagga 20
權利要求
1.包含兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與至少兩種本發明生物標誌物選擇性雜交，其中所述生物標誌物選自表1所列出的以下基因β-澱粉樣蛋白(A4)前體樣蛋白2(APLP2)；BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；補體成分5(C5)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；組織蛋白酶B(CTSB)；cortactin(CTTN)；ficolin(含有膠原/纖維蛋白原結構域)1(FCN1)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；IGF-II mRNA結合蛋白3(IMP-3)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；2』，5』-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)；2』-5』-寡腺苷酸合成酶3(OAS3)；RAR相關孤兒受體A(RORA)；相關的RAS病毒(r-ras)癌基因同源物2(RRAS2)；α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))；人絲氨酸蘇氨酸激酶17b(凋亡誘導型)(STK17B)；轉錄因子EC(TFEC)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，其中所述組合物用於測定所述生物標誌物的表達水平。
2.包含兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與至少兩種生物標誌物的RNA產物選擇性結合，其中所述生物標誌物選自表1所列出的以下基因β-澱粉樣蛋白(A4)前體樣蛋白2(APLP2)；BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；補體成分5(C5)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；組織蛋白酶B(CTSB)；cortactin(CTTN)；ficolin(含有膠原/纖維蛋白原結構域)1(FCN1)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；IGF-II mRNA結合蛋白3(IMP-3)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；2』，5』-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)；2』-5』-寡腺苷酸合成酶3(OAS3)；RAR相關孤兒受體A(RORA)；相關的RAS病毒(r-ras)癌基因同源物2(RRAS2)；α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))；人絲氨酸蘇氨酸激酶17b(凋亡誘導型)(STK17B)；轉錄因子EC(TFEC)。
3.權利要求2的組合物，其中所述多核苷酸用於定量RT-PCR(QRT-PCR)。
4.包含兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述蛋白質與至少兩種生物標誌物的蛋白質產物選擇性結合，其中所述生物標誌物選自表1所列出的以下基因β-澱粉樣蛋白(A4)前體樣蛋白2(APLP2)；BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；補體成分5(C5)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；組織蛋白酶B(CTSB)；cortactin(CTTN)；ficolin(含有膠原/纖維蛋白原結構域)1(FCN1)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；IGF-II mRNA結合蛋白3(IMP-3)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；2』，5』-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)；2』-5』-寡腺苷酸合成酶3(OAS3)；RAR相關孤兒受體A(RORA)；相關的RAS病毒(r-ras)癌基因同源物2(RRAS2)；α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))；人絲氨酸蘇氨酸激酶17b(凋亡誘導型)(STK17B)；轉錄因子EC(TFEC)。
5.包含兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與至少兩種生物標誌物選擇性結合，其中所述生物標誌物選自表2所列出的以下基因BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；或α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))。
6.包含分離蛋白質的集合的組合物，所述分離蛋白質與生物標誌物的蛋白質產物選擇性結合，其中所述生物標誌物選自表2所列出的以下基因BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；或α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))。
7.包含分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與生物標誌物的RNA產物選擇性結合，其中所述生物標誌物選自表2所列出的以下基因BCL2相關蛋白A1(BCL2A1)；受致有絲分裂途徑調節的磷酸化蛋白(C8FW)；CD14抗原(CD14)；C型凝集素樣受體2(CLEC2)；CDC樣激酶1(CLK1)；Clusterin(CLU)；假想的淋巴細胞G0/G1開關基因(G0S2)；白細胞介素23A(IL23A)；殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B，成員1(KLRB1)；或α-synuclein(澱粉樣蛋白前體的非A4組分(SNCA))。
8.包含兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與至少兩種生物標誌物的RNA產物選擇性結合，其中所述RNA產物選自表3所列出的RNA轉錄本。
9.包含兩種或更多種分離多核苷酸的集合的組合物，所述多核苷酸與至少兩種生物標誌物的RNA產物選擇性結合，其中所述RNA產物選自表4所列出的RNA轉錄本。
10.包含兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述分離蛋白質與至少兩種生物標誌物的蛋白質產物選擇性結合，其中所述蛋白質產物選自表3所列出的RNA轉錄本。
11.包含兩種或更多種分離蛋白質的集合的組合物，所述分離蛋白質與至少兩種生物標誌物的蛋白質產物選擇性結合，其中所述蛋白質產物選自表4所列出的RNA轉錄本。
12.權利要求3、5、9或10中任一項的組合物，其中所述分離蛋白質是配體。
13.權利要求3、5、9或10中任一項的組合物，其中所述配體是抗體。
14.權利要求12的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
15.權利要求1、2、4、6、7或8中任一項的組合物，其中所述分離多核苷酸是單鏈或雙鏈RNA。
16.權利要求1、2、4、6、7或8中任一項的組合物，其中所述分離多核苷酸是單鏈或雙鏈DNA。
17.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，其中在步驟b)的比較中檢測到所述一種或多種RNA轉錄本的每種的差異表達是步驟a)的個體中肝癌的指標。
18.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表2的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，其中在步驟b)的比較中檢測到所述一種或多種RNA轉錄本的每種的相同水平是步驟a)的個體中癌症的指標。
19.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，c)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，d)確定步驟a)的所述一種或多種RNA轉錄本的水平相對於步驟c)的所述轉錄本的水平而言歸類於步驟b)中所述轉錄本的水平，其中所述確定是步驟a)的所述個體患有肝癌的指標。
20.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，c)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平進行比較，d)確定步驟a)的所述一種或多種RNA轉錄本的水平相對於步驟b)的所述轉錄本的水平而言歸類於步驟c)中所述轉錄本的水平，其中所述確定是步驟a)的所述個體不患有肝癌的指標。
21.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體獲得的血中表達的一種或多種RNA轉錄本的水平，其中所述一種或多種RNA轉錄本對應於表1的所述一種或多種生物標誌物，和b)用步驟a)的結果與分類符組合以確定對於肝癌的診斷。
22.權利要求17-21中任一項的方法，其中所述血樣由全血組成。
23.權利要求17-21中任一項的方法，其中所述血樣由血滴組成。
24.權利要求17-21中任一項的方法，其中所述血樣由已裂解的血組成。
25.權利要求17-21中任一項的方法，還包括從所述血樣分離RNA的步驟。
26.權利要求17-21中任一項的方法，其中確定所述一種或多種RNA轉錄本的每種的水平的步驟包括定量RT-PCR(QRT-PCR)，其中所述一種或多種轉錄本來自權利要求17-21中的步驟a)和/或步驟b)。
27.權利要求26的方法，其中所述QRT-PCR使用與所述一種或多種轉錄本或其互補物雜交的引物，其中所述一種或多種轉錄本來自權利要求17-21中的步驟a)和/或步驟b)。
28.權利要求27的方法，其中所述引物長15-25個核苷酸。
29.權利要求17-21中任一項的方法，其中確定所述一種或多種轉錄本的每種的水平的步驟包括使對應於所述一種或多種轉錄本的第一組分離核酸分子與包含第二組分離核酸分子的陣列雜交。
30.權利要求29的方法，其中所述第一組分離核酸分子包括RNA、DNA、cDNA、PCR產物或EST。
31.權利要求29的方法，其中所述陣列包含多種分離核酸分子，所述分離核酸分子包括RNA、DNA、cDNA、PCR產物或EST。
32.權利要求29的方法，其中所述陣列上的所述第二組分離核酸分子包括對應於表1的一種或多種生物標誌物的多核苷酸。
33.權利要求29的方法，其中所述陣列上的所述第二組分離核酸分子包括對應於表2的一種或多種生物標誌物的多核苷酸。
34.權利要求29的方法，其中所述陣列上的所述第二組分離核酸分子包括對應於表3的一種或多種RNA產物的多核苷酸。
35.權利要求29的方法，其中所述陣列上的所述第二組分離核酸分子包括對應於表4的一種或多種RNA產物的多核苷酸。
36.診斷或預測肝癌的試劑盒，包含a)兩種生物標誌物特異性引發物，設計用於產生與選自表1的生物標誌物互補的雙鏈DNA；其中所述第一種引發物含有可以選擇性雜交到與所述生物標誌物互補的RNA、cDNA或EST上的序列，以產生延伸產物，所述第二種引發物能與所述延伸產物選擇性雜交；b)具有逆轉錄酶活性的酶，c)具有熱穩定的DNA聚合酶活性的酶，和d)標記物質；其中所述引物用於檢測受試對象中所述生物標誌物的定量表達水平。
37.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質由表1列出的一種或多種生物標誌物編碼，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，其中在步驟b)的比較中檢測到所述一種或多種蛋白質的每種的水平的差異是步驟a)的個體中肝癌的指標。
38.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質由表1列出的所述一種或多種生物標誌物編碼，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，其中在步驟b)的比較中檢測到所述一種或多種蛋白質的每種的相同水平是步驟a)的個體中肝癌的指標。
39.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質的水平，其中所述一種或多種蛋白質由表1列出的所述一種或多種生物標誌物編碼，和b)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，c)將根據步驟a)的所述血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平與不患有肝癌的一個或多個個體的血中所述一種或多種蛋白質的每種的水平進行比較，d)確定步驟a)的所述一種或多種蛋白質的水平相對於步驟c)中所述蛋白質的水平而言歸類於步驟b)中所述蛋白質的水平，其中所述確定是步驟a)中所述個體患有肝癌的指標。
40.診斷或預測個體中肝癌的方法，包括以下步驟a)確定從所述個體所得血中表達的一種或多種蛋白質產物的水平，其中所述一種或多種蛋白質產物對應於表1列出的一種或多種生物標誌物，和b)使用步驟a)的結果與分類符組合以確定關於肝癌的診斷。
41.權利要求37-40中任一項的方法，其中確定所述一種或多種蛋白質的每種的水平的步驟包括使用一種或多種抗體，其中所述一種或多種抗體的每種特異性針對表1列出的生物標誌物的蛋白質產物。
42.權利要求41的方法，其中所述一種或多種抗體選自單克隆抗體、fv.scfv、dab、fd、fab和fab』2。
43.產生用於診斷肝癌的分類符的方法，所述方法包括(a)測定訓練群體中表1鑑定的生物標誌物的產物的表達水平，其中所述訓練群體包括兩個亞組，第一亞組診斷為患有肝癌，而所述第二亞組診斷為不患有肝癌。(b)將一種或多種數學模型應用於步驟(a)的表達水平，以產生區分所述第一亞組和所述第二亞組的一種或多種分類符。
44.權利要求43的方法，還包括評價步驟(b)的一種或多種所述分類符正確表徵訓練群體中每個個體的分類能力。
45.權利要求43的方法，還包括評價步驟(b)的一種或多種所述分類符正確表徵不是訓練群體的群體中一個或多個個體的分類能力。
全文摘要
本發明涉及在識別患有肝癌的個體方面表現出獨特優勢的生物標誌物的鑑定和選擇。本發明進一步涉及用於診斷肝癌的生物標誌物的有用組合。本發明還提供用作診斷疾病和監測治療方案效果的工具的多核苷酸和多肽及其試劑盒。本發明還提供選擇生物標誌物組合的方法和用於診斷肝癌的由此鑑定的組合。本發明還涉及鑑定用於治療肝癌的治療靶點和鑑定與肝癌相關的單核苷酸點突變的篩選方法。
文檔編號A61K39/395GK101039951SQ200480036460
公開日2007年9月19日 申請日期2004年11月3日 優先權日2003年11月3日
發明者劉宗正, 湯姆·亞格, 亞當·登普西, 塞繆爾·尚 申請人:基因信息公司, 凱思琳·M·威廉士