一種l－色氨酸的新合成方法
2023-11-09 17:55:22 4
專利名稱：一種l－色氨酸的新合成方法
技術領域：
本發明涉及一種胺基酸的合成方法，尤其涉及一種L-色氨酸的新合成方法；屬於生物醫藥領域。
背景技術：
L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族胺基酸，為白色或略帶黃色葉片狀結晶或粉末，水中溶解度1.14g(25℃)，溶於稀酸或稀鹼，在鹼液中較穩定，強酸中分解。微溶於乙醇，不溶於氯仿、乙醚。它是人體和動物生命活動中必需的胺基酸之一，對人和動物的生長發育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需胺基酸，廣泛應用於醫藥、食品和飼料等方面。在生物體內，從-色氨酸出發可合成5-羥基色胺等激素以及色素、生物鹼、輔酶、植物激素等生理活性物質，可預防和治療糙皮病，同時具有消除精神緊張、改善睡眠效果等功效。色氨酸代謝失凋會引起糖尿病和神經錯亂，因此在醫學上被用作胺基酸注射液和複合胺基酸製劑。
現有合成L-色氨酸主要有一化學合成法，其主要的合成過程為採用苯肼和乙醯氨基丙二酸二乙酯合成乙醯基色氨酸然後通過光拆分、水解得L-色氨酸；採用化學合成工藝比較繁瑣，成本高，汙染較重；二發酵法，其主要的合成過程為以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價原料為碳源，利用優良的色氨酸生產菌種來生產L-色氨酸粗成品，再通過；離心和樹脂分離，重結晶得到L-色氨酸，採用微生物直接發酵周期太長，達不到工業化生產的要求；三酶法，以吲哚和L-絲氨酸為底物，利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生產色氨酸，酶法能夠利用化工合成的前體物為原料，既充分發揮了有機合成技術的優勢，又具有產物濃度高、收率高、純度高、副產物少、精製操作容易的優點，但是底物L-絲氨酸成本太高，難以實現工業化生產。
中國藥科大學韋平和、吳梧桐等(《以L-半胱氨酸和吲哚酶法合成L-色氨酸》，文章編號1005-8915(2000)04-0197-03)介紹了用色氨酸酶基因工程菌WW-4催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸，雖然在80ml反應液(L-半胱氨酸0.75g，吲哚0.75g)37℃反應48h，可積累L-色氨酸1.18g。L-半胱氨酸轉化率為93.2％，吲哚轉化率為90.1％。產品總回收率達70％，所得晶體在熔點、旋光性和紅外吸收光譜等方面與標準品完全一致；但是採用該方法在反應過程中L-半胱氨酸易被氧化成L-胱氨酸；而且不易分離純化反應後的吲哚、L-半胱氨酸和L-色氨酸，因此該文獻所涉及的製備方法只處於實驗室製備階段，無法實現L-色氨酸的工業化生產。
發明內容
本發明針對現有的化學合成L-色氨酸工藝繁瑣，成本高，汙染較重的缺陷，提供一種工藝簡單、成本低，易工業化，基本無汙染的L-色氨酸的新合成方法；本發明還針對現有的微生物發酵合成L-色氨酸周期太長，達不到工業化生產的要求的缺陷，提供一種生產周期短，能夠達到工業化生產要求的L-色氨酸的新合成方法；本發明還針對現有的酶法生產L-色氨酸成本太高、底物易被氧化，不易分離純化，難以實現工業化生產的缺陷，提供一種成本低、能夠進行大規模工業化生產的L-色氨酸的新合成方法。
本發明的上述技術問題是通過以下技術方案得以實施的一種L-色氨酸的新合成方法，該方法包括以下步驟A、底物轉化在反應釜加入底物吲哚和L-半胱氨酸鹽，加入色氨酸酶，在溫度25～35℃，PH值7.0～8.5，負壓或控制氧分壓為0.01～0.03Mpa的條件下轉化為L-色氨酸轉化液；B、超濾膜純化將上述轉化後的L-色氨酸轉化液在溫度25～35℃，進口壓力為0.4～0.8Mpa，出口壓力為0.1～0.3Mpa的條件下通過超濾膜純化；C、離子交換樹脂吸附、洗脫將上述經過超濾膜純化的滲透液調至PH值為4.5～5.5，然後通過離子交換樹脂將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用0.8～1.5mol/L的鹽酸溶液洗脫2～5遍；D、納濾膜濃縮將上述經過鹽酸洗脫後的L-色氨酸粗成品在溫度25～35℃，進口壓力為0.4～0.8Mpa，出口壓力為0.1～0.3Mpa的條件下通過納濾膜濃縮；濃縮後得到L-色氨酸成品。
本發明的底物轉化步驟中採用L-半胱氨酸鹽代替了L-半胱氨酸，由於L-半胱氨酸鹽原料成本低，而且難以被氧化，易於保存，從而易實現工業化生產，現有技術為了保持反應過程中的離子、PH等工藝條件，常常加入添加輔酶因子磷酸吡哆醛並在磷酸鉀緩衝液中反應，但是不僅增加了成本，而且由磷酸鉀緩衝液帶來的鹽分提取比較困難，而本發明無需添加輔酶因子磷酸吡哆醛而且不需要磷酸鉀緩衝液，這樣不僅大大可以減少成本，而且減少磷酸鉀緩衝液帶來的鹽分，降低產品提取難度，更易工業化生產。
本發明的色氨酸酶可以由市售的微生物(如，大腸桿菌、溼菌體、色氨酸基因工程菌ww-4等)產生的色氨酸酶或色氨酸合成酶；現有技術一般在PH值8.8和37℃的條件下反應，這樣在生產上較難控制，而本發明在溫度25～35℃，PH值7.0～8.5的條件下反應，這樣的工藝條件比較容易控制，更易工業化生產，此外本發明的底物在負壓或或控制氧分壓為0.01～0.03Mpa的條件下進行轉化，這樣可以防止L-半胱氨酸被氧化成L-胱氨酸，提高底物轉化化率，降低產品提取難度，提高產品質量。
本發明採用了在生產上可行性較強的先進的超濾膜技術代替離心機純化轉化液中的物質，並用納濾膜代替升溫減壓濃縮，這樣降低了L-色氨酸產品在高溫下分解率，並且能夠同時除鹽，提高了L-色氨酸產品收率，降低了能耗，另外，經過本發明的超濾膜純化、離子交換樹脂吸附、洗脫，納濾膜濃縮可以一次性獲得合格的產品，無需重結晶等繁瑣工藝。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，步驟A中所述的吲哚和L-半胱氨酸鹽的重量比為1∶1.1～1.4，所述的色氨酸酶的用量為底物重量百分比的3％～8％。現有技術中底物轉化反應中是以L-半胱氨酸過量反應，過量的L-半胱氨酸易被氧化生成L-胱氨酸，由於L-胱氨酸和L-色氨酸混合在一起不僅增大了最終產品L-色氨酸的提取難度，而且還會導致L-色氨酸質量下降，而本工藝發明採用吲哚過量反應，可以有效的防止L-半胱氨酸被氧化生成L-胱氨酸，降低最終產品L-色氨酸提取難度，提高產品質量。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，步驟A中所述的L-半胱氨酸鹽為L-半胱氨酸鹽酸鹽。本發明採用L-半胱氨酸鹽酸鹽不僅降低了原料成本，並且比L-半胱氨酸比L-半胱氨酸較難被氧化，更易保存，更易工業化。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，步驟A中採用惰性氣體或氮氣保護條件下保持氧分壓為0.01-0.03MPa，採用惰性氣體或氮氣保護，優選氮氣，可以防止L-半胱氨酸被氧化，提高底物轉化化率，降低產品提取難度。
本發明步驟B中超濾膜的進口壓力為0.4～0.8Mpa，出口壓力為0.1～0.3Mpa；作為優選，進口壓力為0.6Mpa，出口壓力為0.2Mpa。採用該壓力可以提高膜通量，壓力太高對膜的損害較大，壓力太低膜的通量又會降低。
作為優選，步驟B中所述的超濾膜的膜孔徑為20000-30000道爾頓。本發明採用超濾膜純化，並將超濾膜的膜孔徑控制在20000-30000道爾頓，能夠去除絕大多數大分子量的蛋白質，而且不存在任何物理、化學反應，所以能夠提高產品的收率；孔徑太大，蛋白的去除率會下降，而孔徑太小，又會降低膜通量，增大膜面積和運行時間，提高了設備成本和運行成本。
作為優選，步驟C中將上述經過超濾膜純化的滲透液調至PH值為5.0，然後通過離子交換樹脂將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用1mol/L的鹽酸溶液洗脫3遍。由於大多數雜質不會與樹脂進行交換，所以本發明採用離子交換樹脂將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，並在洗脫過程中採用分階段收集產品，從而提高了產品質量。
本發明步驟D中納濾膜的進口壓力為0.4～0.8Mpa，出口壓力為0.1～0.3Mpa；作為優選，所述的進口壓力為0.6Mpa，出口壓力為0.2Mpa。採用該壓力可以提高膜通量，壓力太高對膜的損害較大，壓力太低膜的通量又會降低。
作為優選，步驟D中所述的納濾膜的膜孔徑為100-150道爾頓。本發明採用納濾膜濃縮，並將納濾膜的膜孔徑控制在100-150道爾頓，這樣鹽和水能夠通過納濾膜，而L-色氨酸不能通過，除去大多數鹽，而且不存在任何物理、化學反應，所以能夠提高產品的收率。如果納濾膜的孔徑太大L-色氨酸會和鹽同時透過，導致產品收率降低，孔徑太小，鹽又很難透過，導致除鹽效率降低。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，該方法還包括步驟E、離心、烘乾將步驟D中經過納濾膜濃縮的L-色氨酸在轉速為800rpm～1500rpm的條件下離心1～5分鐘後，在溫度為60～90℃，壓力為-0.05～-0.15Mpa的條件下烘乾後得到L-色氨酸成品。
縱上所述，本發明的L-色氨酸的新合成方法具有以下優點本發明的L-色氨酸的新合成方法操作簡單、生產周期短、成本低、基本無汙染，適合大規模的工業化生產；利用本發明的方法製備的L-色氨酸收率高、產品呈白色、片狀並具有光澤，沒有異味。
具體實施例方式
下面通過實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明；但本發明並不限於這些實施例。
實施例1用電子天平(上海精密科學儀器有限公司製造)稱量底物吲哚6.3g、L-半胱氨酸鹽酸鹽8.6g，60mg溼菌體(浙江普洛醫藥科技有限公司製造)加入到裝有1000g去離子水的反應釜，然後通過恆溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠製造)不斷攪拌後，在溫度25℃，用酸度計(上海精密科學儀器有限公司製造)控制PH值為8.5，通過SHZ-DC(III)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠製造)控制負壓為-0.06MPa的水溶液條件下轉化為L-色氨酸轉化液；將上述轉化後的L-色氨酸轉化液轉移至超濾膜儲槽中，在溫度25℃，進口壓力為0.4Mpa，出口壓力為0.1Mpa的條件下通過膜孔徑為20000道爾頓的超濾膜(廈門三達膜技術有限公司製造)純化；純化後L-色氨酸粗成品的收率為98％，將上述經過超濾膜純化的滲透液用0.8mol/L的鹽酸調至PH值為5.5，然後通過離子交換樹脂(上海華震科技貿易公司製造)將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用0.8mol/L的鹽酸溶液分階段洗脫5遍；洗脫後L-色氨酸收率為90％，將上述經過鹽酸洗脫後的L-色氨酸溶液在溫度25℃，進口壓力為0.4Mpa，出口壓力為0.1Mpa的條件下通過膜孔徑為150道爾頓的納濾膜(廈門三達膜技術有限公司製造)濃縮；濃縮後L-色氨酸粗成品的收率為98％，經過納濾膜濃縮的L-色氨酸在轉速為800rpm的離心機中離心10分鐘後，通過控制選片真空泵(浙江黃巖求精真空泵廠製造)，在壓力為-0.1MPa，溫度為80℃的條件下在真空乾燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)烘乾，4小時後得到L-色氨酸成品8.1g)。經觀察實施例1製備的L-色氨酸呈白色、片狀並具有光澤，沒有異味，經HPLC分析，實施例1製備的L-色氨酸含量為98.5％。
實施例2用電子天平(上海精密科學儀器有限公司製造)稱量底物吲哚6.3g、L-半胱氨酸鹽酸鹽8.6g、60mg溼菌體(浙江普洛醫藥科技有限公司製造)加入到裝有1000g去離子水的反應釜，然後通過恆溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠製造)不斷攪拌後，在溫度30℃，用酸度計(上海精密科學儀器有限公司製造)控制PH值為8.0通過採用氮氣保護條件下保持氧分壓為0.02MPa的水溶液條件下轉化為L-色氨酸轉化液；將上述轉化後的L-色氨酸轉化液轉移至超濾膜儲槽中，在溫度30℃，進口壓力為0.6Mpa，出口壓力為0.2Mpa的條件下通過膜孔徑為25000道爾頓的超濾膜(廈門三達膜技術有限公司製造)純化；純化後L-色氨酸粗成品的收率為97.8％，將上述經過超濾膜純化的滲透液用1.0mol/L的鹽酸調至pH值為5.0，然後通過離子交換樹脂(上海華震科技貿易公司製造)將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用1.0mol/L的鹽酸溶液分階段洗脫3遍；洗脫後L-色氨酸收率為91％，將上述經過鹽酸洗脫後的L-色氨酸粗成品在溫度30℃，進口壓力為0.6Mpa，出口壓力為0.2Mpa的條件下通過膜孔徑為150道爾頓的納濾膜(廈門三達膜技術有限公司製造)濃縮；濃縮後L-色氨酸粗成品的收率為98.1％，經過納濾膜濃縮的L-色氨酸在轉速為1000rpm的離心機中離心7分鐘後，通過控制選片真空泵(浙江黃巖求精真空泵廠製造)，在壓力為-0.1MPa，溫度為80℃的條件下在真空乾燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)烘乾，4小時後得到L-色氨酸成品8.2g)。經觀察實施例1製備的L-色氨酸呈白色、片狀並具有光澤，沒有異味，經HPLC分析，實施例2製備的L-色氨酸含量為98.2％。
實施例3用電子天平(上海精密科學儀器有限公司製造)稱量底物吲哚6.3g、L-半胱氨酸鹽酸鹽8.6g、60mg溼菌體(浙江普洛醫藥科技有限公司製造)加入到裝有1000g去離子水的反應釜，然後通過恆溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠製造)不斷攪拌後，在溫度35℃，用酸度計(上海精密科學儀器有限公司製造)控制PH值為8.5通過採用氬氣保護條件下保持氧分壓為0.02MPa的水溶液條件下轉化為L-色氨酸轉化液；將上述轉化後的L-色氨酸轉化液轉移至超濾膜儲槽中，在溫度35℃，進口壓力為0.8Mpa，出口壓力為0.3Mpa的條件下通過膜孔徑為20000道爾頓的超濾膜(廈門三達膜技術有限公司製造)純化；純化後L-色氨酸粗成品的收率為98％，將上述經過超濾膜純化的滲透液用1.5mol/L的鹽酸調至PH值為4.5，然後通過離子交換樹脂(上海華震科技貿易公司製造)將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用1.5mol/L的鹽酸溶液分階段洗脫2遍；洗脫後L-色氨酸收率為90％，將上述經過鹽酸洗脫後的L-色氨酸粗成品在溫度35℃，進口壓力為0.8Mpa，出口壓力為0.3Mpa的條件下通過膜孔徑為150道爾頓的納濾膜(廈門三達膜技術有限公司製造)濃縮；濃縮後L-色氨酸粗成品的收率為98％，經過納濾膜濃縮的L-色氨酸在轉速為1500rpm的離心機中離心4分鐘後，通過控制選片真空泵(浙江黃巖求精真空泵廠製造)，在壓力為-0.1MPa，溫度為80℃的條件下在真空乾燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)烘乾，4小時後得到L-色氨酸成品8.2g。經觀察實施例1製備的L-色氨酸呈白色、片狀並具有光澤，沒有異味，經HPLC分析，實施例3製備的L-色氨酸含量為99.1％。
權利要求
1.一種L-色氨酸的新合成方法，該方法包括以下步驟A、底物轉化在反應釜加入底物吲哚和L-半胱氨酸鹽，加入色氨酸酶，在溫度25～35℃，PH值7.0～8.5，負壓或控制氧分壓為0.01～0.03Mpa的條件下轉化為L-色氨酸轉化液；B、超濾膜純化將上述轉化後的L-色氨酸轉化液在溫度25～35℃，進口壓力為0.4～0.8Mpa，出口壓力為0.1～0.3Mpa的條件下通過超濾膜純化；C、離子交換樹脂吸附、洗脫將上述經過超濾膜純化的滲透液調至PH值為4.5～5.5，然後通過離子交換樹脂將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用0.8～1.5mol/L的鹽酸溶液洗脫2～5遍；D、納濾膜濃縮將上述經過鹽酸洗脫後的L-色氨酸粗成品在溫度25～35℃，進口壓力為0.4～0.8Mpa，出口壓力為0.1～0.3Mpa的條件下通過納濾膜濃縮；濃縮後得到L-色氨酸成品。
2.根據權利要求1所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟A中所述的吲哚和L-半胱氨酸鹽的重量比為1∶1.1～1.4，所述的色氨酸酶的用量為底物重量百分比的3％～8％。
3.根據權利要求1所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟A中所述的L-半胱氨酸鹽為L-半胱氨酸鹽酸鹽。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟A中採用惰性氣體或氮氣保護條件下保持氧分壓為0.01-0.03MPa。
5.根據權利要求1所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟B中所述的進口壓力為0.6Mpa，出口壓力為0.2Mpa。
6.根據權利要求1或5所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟B中所述的超濾膜的膜孔徑為20000-30000道爾頓。
7.根據權利要求1所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟C中將上述經過超濾膜純化的滲透液調至PH值為5.0，然後通過離子交換樹脂將L-色氨酸粗成品交換至樹脂上，然後用1mol/L的鹽酸溶液洗脫3遍。
8.根據權利要求1所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟D中所述的進口壓力為0.6Mpa，出口壓力為0.2Mpa。
9.根據權利要求1或8所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於步驟D中所述的納濾膜的膜孔徑為100-150道爾頓。
10.根據權利要求1所述的一種L-色氨酸的新合成方法，其特徵在於該方法還包括步驟E、離心、烘乾將步驟D中經過納濾膜濃縮的L-色氨酸在轉速為800rpm～1500rpm的條件下離心1～5分鐘後，在溫度為60～90℃，壓力為-0.05～-0.15Mpa的條件下烘乾後得到L-色氨酸成品。
全文摘要
本發明涉及一種L－色氨酸的新合成方法，該方法包括以下步驟A.底物轉化；B.超濾膜純化；C.離子交換樹脂吸附、洗脫；D.納濾膜濃縮，本發明L－色氨酸的新合成方法操作簡單、生產周期短、成本低、基本無汙染，適合大規模的工業化生產；製備的L－色氨酸收率高、產品呈白色、片狀並具有光澤，沒有異味。
文檔編號C12P13/00GK101033479SQ200710068130
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月19日 優先權日2007年4月19日
發明者杜堅全, 劉益榮, 何俊勇, 朱黎君, 金子波, 楊勝君 申請人:橫店集團家園化工有限公司