重組質粒pSEB-Wnt5a及其製備方法
2023-11-05 09:37:52 3
專利名稱：重組質粒pSEB-Wnt5a及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種重組載體的構建，尤其涉及一種重組質粒pSEB-Wnt5a及其製備方法。
背景技術：
Wnt5a蛋白是一種分泌型的糖蛋白，屬於Wnt家族，它不但與胚胎發育有關， 它的異常表達與腫瘤發生有關，但在不同腫瘤中，Wnt5a發揮著不同的作用，如在它能 促使乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤生長甚至可促使腫瘤的侵襲，而在甲狀腺腫瘤、 結腸直腸癌等腫瘤中Wnt5a可能發揮著抑制腫瘤的作用。Wnt5a在腫瘤發生中的作用和 機理仍不清楚。目前有研究發現Wnt5a主要激活非經典Wnt信號通路發揮作用，在發 育的組織、骨髓基質細胞和造血細胞中有表達，可促進造血幹/祖細胞分化發育。
發明內容
本發明的目的在於提供一種重組質粒pSEB-Wnt5a，其包含載體片段pSEB和基 因片段Wnt5a。根據本發明的優選實施例，上述載體片段pSEB來自質粒pSEB-flag。
根據本發明的優選實施例，上述基因片段Wnt5a來自質粒pAdTrack-Wnt5a。
本發明還提供上述的重組質粒pSEB-Wnt5a的製備方法，其主要包含步驟
l)PCR擴增獲得Wnt5a基因； 2)將含有pSEB片段的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產物酶切後連 接； 3)將步驟2)獲得的連接產物轉化受體菌；
4)鑑定陽性克隆，獲得pSEB-Wnt5a連接產物。 根據本發明的優選實施例，上述步驟1)包含通過PCR從質粒pAdTrack-Wnt5a中 擴增獲得Wnt5a基因。 根據本發明的優選實施例，上述步驟1)中的PCR擴增中使用PCR引物5' -GGA AGA TCT GCC ACC ATG GCC ATG AAG AAG CCC ATT G-3'禾P 5' -A CGC GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'。 根據本發明的優選實施例，上述步驟2)中所述含有pSEB片段的載體為質粒 pSEB-flag。 根據本發明的優選實施例，上述步驟2)中採用Bg111、 Sal I酶對含有pSEB片段 的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產物進行酶切。 根據本發明的優選實施例，上述步驟4)中所述鑑定陽性克隆的方法為Wnt5a重 組質粒酶切鑑定和/或pSEB-Wnt5a重組質粒插入片斷測序鑑定。 重組表達質粒pSEB-Wnt5a的成功構建，有利於進一步的研究表達Wnt5a的逆轉 錄病毒載體的構建和研究Wnt5a基因對於腫瘤細胞的作用。
3
為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施 例，並配合附圖，作詳細說明如下。
圖1為pSEB-flag質粒圖譜；
圖2為質粒pAdTrack-T04圖譜； 圖3為重組表達質粒pSEB-Wnt5a包裝病毒後感染k562細胞後Western blot鑑定 結果，其中1.K562-Wnt5a細胞；2.K562-空載體細胞。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解的是，這些實施例僅用於 說明本發明而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明重組表達質粒 pSEB-Wnt5a及製備方法的簡單改進，都屬於本發明要求保護的範圍。
本發明從質粒pAdTrack-Wnt5a中得到Wnt5a核酸序列，構建重組表達載體 pSEB-Wnt5a質粒。本發明利用PCR法從質粒pAdTrack-Wnt5a中擴增得到Wnt5a核酸序列，並構建 了表達載體pSEB-Wnt5a，測序證實其中Wnt5a序列與pAdTrack-Wnt5a中Wnt5a序列完 全一致，並與Genebank所報導Wnt5a序列相似度為99.9X。並利用其包裝得到的逆轉錄 病毒感染K562細胞，證實可以使細胞Wnt5a蛋白表達量增高。
材料和來源 菌株和質粒大腸桿菌克隆菌株DH5a(購自寶生物工程有限公司)和細胞 株K562、 HEK293購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，中國總代理北京中原公司， pSEB-flag(圖譜見圖1)、 pCL-Ampho(見文獻Naviaux RK， Costanzi E， Haas M， Verma IM， et al.The pCL vector system : rapid production of helper-free, high-titer， recombinant retrovirases.J Virol. 1996 Aug ; 70(8): 5701-5.)。 PCR引物Wnt5a引物由Invitrogen公司合成。上遊引物為5' -GGA AGA TCT GCCACCATGGCCATGAAGAAGCCCATTG-3，，下遊引物為5' -A CGC GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'。 其他主要試劑T4DNA連接酶、限制性內切酶BglII、限制性內切酶SalI、 pyrobest DNA多聚酶購買自TAKARA公司；TIANgel Midi Purification Kit購自天根生化科 技有限公司；脂質體2000(Lipofectamine 2000)、滅瘟素(Blasticidin S HCL)購自Invitrogen 公司；質粒普通純化試劑盒與去內毒素純化試劑盒購自Omega公司；RMPI-1640、 DMEM培養基購自Gibco公司；Wnt5a抗體購自Santa Cruz公司，GAPDH內參抗體購自 上海康成生物技術有限公司，HRP標記羊抗兔二抗、增強化學發光顯色試劑盒購自Pierce 公司；蛋白酶抑制劑Cocktail購自Roche公司。
重組質粒pSEB-Wnt5a的構建
1 .pAdTrack-Wnt5a載體的構建 1)委託生物公司合成下述序列(包括Kpnl和Xbal酶切位點以及Kozak序列)SEQ
ID NO : 1
4
cggggtacc atggccatga agaagcccat tggaatatta agcccgggag tggctttggg gaccgctgga
ggtgccatgt cttccaagtt cttcctaatg gctttggcca cgtttttctc cttcgcccag gttgttatag aagctaattc
ttggtggtct ctaggtacga ataaccctgt tcagatgtca gaagtatata tcataggtgc acagcctctc
tgcagccaac tggcaggact ttctcaagga cagaagaaac tctgccactt gtatcaggac cacatgcagt
acattggaga aggtgcgaag acaggcatca aggaatgcca gtaccagttc cggcatcgga gatggaactg
cagcacagtg gacaatactt ctgtctttgg cagggtgatg caaataggca gccgagagac ggccttcacg
tacgcggtga gcgcagctgg ggtggtgaac gccatgagcc gagcatgccg ggagggcgag ctgtctacct
gtggctgcag ccgcgctgcg cgccccaagg acctgcctcg ggactggttg tggggcggct gcggagacaa
catcgactat ggctaccgct tcgccaagga gttcgtggac gctagagaaa gggaacgaat ccacgctaag [O(HO]ggttcctatg agagcgcacg catcctcatg aacttacaca acaatgaagc aggccgtagg acagtataca
acctggcaga tgtagcctgt aagtgtcatg gagtgtctgg ctcctgtagc ctcaagacgt gctggctgca
gctggcggac ttccggaagg tgggcgatgc cctcaaggag aagtatgata gcgcggcggc catgaggctc
aacagccggg gcaagctggt gcaggtcaac agccgcttca actccccgac cacgcaggac ctggtctaca
tcgaccccag tccggactac tgtgtgcgca acgagagcac tggctcgctg ggcacgcagg gacgcctgtg
caacaagacc tcagagggga tggacggctg cgagctcatg tgctgtgggc gtggctatga ccagtttaag
acagtgcaga ccgaacgctg tcattgcaag tttcactggt gctgctatgt caaatgcaag aagtgcacgg
agattgtgga tcagttcgtg tgcaaatag tctagactag 2)使用限制性內切酶Kpnl和Xbal對合成產物進行酶切，同時對質粒 pAdTrack-T04(芝加哥大學醫學中心，THE UNIVERSITY OF CHICAGO MEDICAL CENTER MOLECULAR ONCOLOGY LABORATORY,圖譜見圖2)進行酶切(37。C消化 3小時，酶切反應體系為14iUDNA， ， 2iU限制性內切酶KpnI， 2iU限制性內切酶 Xbal， 2ii 1 10 X Buffer)。 3)回收酶切產物。取酶切產物做1%瓊脂糖凝膠電泳，證實得到大小為1100bp 左右和9000bp左右的特異性片段。使用TIANgel Midi Purification Kit回收向吸附柱中 (吸附柱放入收集管中)加入500iU平衡液BL， 12,000rpm離心l分鐘，倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱重新放回收集管中；紫外燈下切下含特異DNA條帶的膠條，放入EP管 中稱重，加入3倍體積溶膠液PN， 5(TC水浴10分鐘直至膠條完全融化，將l個吸附柱放 入收集管中，將全部樣品移入柱內，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回 同一收集管中，加700iU的漂洗液於吸附柱內，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將 吸附柱放回同一收集管中，重複洗滌，最後離心2分鐘，將吸附柱放入l個乾淨的1.5ml 離心管，加50iU三蒸水於吸附柱上的膜中心，柱子放置1分鐘後離心1分鐘，收集洗脫 的DNA。 4)使用T4DNA連接酶連接酶切片段(16。C過夜，連接反應體系為2 y 1T4DNA Ligase， 2 ii 110XT4 DNALigase Buffer,質粒酶切回收產物6 y 1， PCR酶切回收產物 10iU)。取一無菌離心管，加入已製備好的感受態DH5a細菌200iU，冰浴，吸取5 y 1 連接產物加入管中，轉化DH5a菌，輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42"C水浴90秒，取 出離心管再冰浴2分鐘，加入800iU室溫的LB培養基，混勻，37t:搖床220rpm振蕩培 養1小時，取50iU菌液塗於含卡那黴素(濃度為50mg/L)的LB培養板上，37。C恆溫培 養箱過夜培養，次日挑取單個菌落接種於含卡那黴素的LB培養基中擴大培養。
5)按照Omega E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I質粒抽提試劑盒說明書提取重組質 粒沉澱菌體，12000rpm，離心1分鐘，棄上清，儘量吸乾，用250 y 1預冷的溶液I將上 述細菌沉澱重懸，劇烈振蕩，加入溶液II 250iU輕輕顛倒混勻5次，使其澄清，加入溶液 III 350 ii 1，輕輕混勻後12000rpm離心10分鐘；小心吸取水相(約800 y 1)移於另一 1.5ml 離心管(含吸附柱)中，加入GB buffer 500 iU洗滌，棄去洗滌液，加入700 y 1 Wash buffer 洗滌DNA 2次，最後一次洗滌後12000rpm離心2分鐘，室溫乾燥2分鐘，加入Elution buffer 50 y 1溶解質粒DNA， -20 °C保存。6)取10 y l質粒用限制性內切酶Kpnl、 Xbal雙酶切後1 %瓊脂糖凝膠電泳鑑定， 酶切反應體系為質粒DNA 10 ii 1， Kpnl、 Xbal各1 y 1， 10 Xbuffer 2 y 1， ddH206 y 1， 37t:水浴3小時，取酶切產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩個大小分別約為1100bp、 9000bp的特異片段。經測序後比對，插入序列與預期插入序列一致。
2.PCR法獲得Wnt5a基因
(l)引物設計與合成
Wnt5a序列SEQ ID : 2 上遊引物為(包括Bgl II酶切位點和Kozak序列)為5' -GGA AGA TCTGCC ACC ATG GCC ATG AAG AAG CCC ATT G-3'，下遊引物(包括Sal I酶切位點)5' -A CGC GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'，下劃線部分為酶切位點， 將上述引物委託Invitrogen公司進行合成。
(2)PCRPCR按pyrobest DNA多聚酶試劑盒說明進行pAdTrack-Wnt5a模板0.5ul， 10 XPyrobest Buffer II 5ul， dNTP Mixture 4 ii 1， Pyrobest DNA Polymerase 0.25ul， ddH20
40 ii 1，上下遊引物各1 y l(終濃度為50pmol)。
94t:預變性5分鐘，然後94°C 30秒， 58.8t:30秒，72t:75秒，35個循環，最後72。C延伸10分鐘，反應結束後取PCR產物做 1%瓊脂糖凝膠電泳，證實得到大小為1100bp左右的特異性片段。
(3)Wnt5a目的基因的回收 使用TIANgel Midi Purification Kit回收進行柱平衡向吸附柱中(吸附柱放入 收集管中)加入500iU平衡液BL， 12,000rpm離心l分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。紫外燈下切下含DNA條帶的膠條，放入EP管中稱重，加入3倍 體積溶膠液PN， 5(TC水浴10分鐘直至膠條完全融化，將l個吸附柱放入收集管中，將全 部樣品移入柱內，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回同一收集管中，加 700iU的漂洗液於吸附柱內，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回同一收集 管中，重複洗滌，最後離心2分鐘，將吸附柱放入l個乾淨的1.5ml離心管，加50iU三 蒸水於吸附柱上的膜中心，柱子放置1分鐘後離心1分鐘，收集洗脫的DNA。
3.Wnt5a重組質粒構建將pSEB-flag載體、回收的PCR產物用BglII、 Sal I雙酶切37°C消化3小時 (酶切反應體系為14iUDNA， ， 2iU限制性內切酶Bgl II， 2 y 1限制性內切酶Sal I， 2 ii 110XBuffer),電泳，回收(步驟參照PCR法獲得Wnt5a基因中DNA回收步驟)，用 T4DNA連接酶16t:過夜連接(連接反應體系為2iU T4 DNALigase， 2iU10XT4DNA Ligase Buffer,質粒酶切回收產物6 y 1， PCR酶切回收產物10 y 1)，取一無菌離心管，加入已製備好的感受態DH5a細菌200iU，冰浴，吸取5 y 1連接產物加入管中，轉化 DH5a細菌，輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42。C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘， 加入800 ii 1室溫的SOC培養液(成分2 % (W/V)胰化(蛋白)腖，0.5 % (W/V)酵母提取 物，0.05%(W/V)NaCl， 2.5mM KC1 10mM MgCl2， 20mM葡萄糖)混勻，37。C搖床220rpm 振蕩培養1小時，取50 iU菌液塗於含氨苄西林(濃度為50 ii g/mL)的LB培養板上，37°C 恆溫培養箱過夜培養，次日挑取單個菌落接種於含氨苄西林的LB培養基擴大培養。
4.Wnt5a重組質粒酶切鑑定 按照Omega E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I質粒抽提試劑盒說明書提取重組質粒 質粒抽提試劑盒說明書提取重組質粒沉澱菌體，12000rpm，離心1分鐘，棄上清，盡 量吸乾，用250iU預冷的溶液I將上述細菌沉澱重懸，劇烈振蕩，加入溶液II 250iU輕輕 顛倒混勻5次，使其澄清，加入溶液III 350 ii 1，輕輕混勻後12000rpm離心10分鐘；小 心吸取水相(約800 ii 1)移於另一 1.5ml離心管(含吸附柱)中，加入GB buffer 500 y 1洗 滌，棄去洗滌液，加入700 ii 1 Wash buffer洗滌DNA 2次，最後一次洗滌後12000rpm離 心2分鐘，室溫乾燥2分鐘，加入Elution buffer 50 ii 1溶解質粒DNA， -20"保存。
取lOiU質粒用BglII、 Sall雙酶切後1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定，酶切反應體系 為pSEB-Wnt5a質粒DNA 10 y 1， Bgl II與Sal I各1 y 1， 10Xbuffer H 2 y 1， ddH206 y 1， 離心數秒，37t:水浴2小時，取酶切產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩個大小分別約為 1100bp、 6000bp的特異片段，表明pSEB-flag質粒中已插入大小約為1100bp的片段。
5.pSEB-Wnt5a重組質粒插入片斷測序 將重組質粒pSEB-Wnt5a送往上海生工公司測序。測序的結果顯示，插入片段 長度為1149bp(包含Kozak序列)，與pAdTrack-Wnta5a中插入序列完全一致。重組質粒 命名為pSEB-Wnt5a。
發明效果 1.質粒pSEB-Wnt5a、 pSEB-flag和pCL-Ampho去內毒素大量提取
按照Omega質粒DNA提取試劑盒操作(E.Z.N.A.Fastfilter Endo-free Plasmid maxi Kit):從抗性平板上挑取質粒轉化菌落，接種於4ml含氨苄西林的LB培養基中37t:恆溫 培養，8小時後接種到含有氨苄西林的lOOmlLB培養基中37t:恆溫擴大培養12-16小時。 沉澱菌體，4500g，離心10分鐘，棄上清，儘量吸乾，用lOml預冷的溶液I將上述細菌 沉澱重懸，劇烈振蕩，加入溶液II lOml輕輕顛倒混勻5次，使其澄清，加入Buffer N3， 溫和上下顛倒混勻後倒入針筒過濾器中，收集裂解液上清，加入0.1倍體積ETR溶液，靜 置，4000g離心5分鐘，將上清移置另一試管中，加入1/2體積的無水乙醇，顛倒5次放 置5分鐘，將HiBind大量結合柱套入50ml試管中，把過濾液倒入結合柱中，4000g離心 5分鐘，棄去收集管中的濾液，在結合柱中加入10ml HB Buffer, 4000g離心5分鐘，棄 去收集管中的濾液，在結合柱中加入15ml DNA Wash Buffer, 4000g離心5分鐘，棄去收 集管中的濾液，重複使用15ml DNA Wash Buffer洗滌柱子，待柱子乾燥後加入2ml預熱的 ddH20，室溫放置2分鐘，5000g離心5分鐘，收集洗脫下的DNA溶液，-20"保存。
2.pSEB-Wnt5a、 pCL-Ampho與脂質體2000共轉染HEK293細胞
HEK293細胞使用含10X小牛血清的完全DMEM培養液，置37t:、5XC02 細胞培養箱中(50ml細胞培養瓶)，飽和溼度下培養，當細胞處於對數生長期且細胞
7濃度為30-40 %時準備轉染；準備轉染的試劑，包括250iUDMEM(無血清)、5 y 1 pCL-Ampho(約0.5-1.0 y g DNA)、 10 y 1 pSEB-Wnt5a或pSEB-flag(約1.0-2.0 y g DNA)、 15iULipofectamine 2000(Invitrogen)，混勻，放置15-20分鐘；仔細使用無血清的DMEM 衝洗細胞三次，加入2.5ml無血清的DMEM，小心加入轉染混合物；加入後3-5小時後， 把培養基吸出，加入4ml完整DMEM培養液；在36小時、60小時、84小時和108小時 收集含有逆轉錄病毒的上清。-S(TC保存病毒。
3.感染K562細胞 使用以上所得上清液置換培養處於對數生長期的K562細胞的培養液(添加海美 溴銨最終濃度為12 y g/ml)，反覆感染4次後，換為含有10%小牛血清的RMPI-1640完全 培養基，培養24小時後加入滅瘟素(最終濃度為40iig/ml)，培養6天後更換為含有10% 小牛血清的RMPI-1640完全培養基，未感染逆轉錄病毒的細胞已全部死亡，得到陽性的 抗性細胞克隆。 4.提取K562細胞蛋白以及Western blot鑑定Wnt5a蛋白的表達
離心收集10ml培養瓶中細胞，0.1MPBS漂洗一次，取5X 106細胞收集於1.5ml 離心管中，加入100iU總蛋白提取液和10iUCocktail(0.1MPBS溶解)，混勻，冰浴30 分鐘，10000rpm、 4t:離心15分鐘，收集上清，測定總蛋白濃度。配製10^Tricine SDS-PAGE分離膠和濃縮膠。電泳80V 30分鐘，120V 1小時。電泳結束後，取下凝膠 置於轉印緩衝液中平衡20-60分鐘，剪下凝膠大小的PVDF膜和厚濾紙，將PVDF膜在 100%的甲醇中浸泡1分鐘後與濾紙一起置於轉印緩衝液中浸泡5分鐘，12V恆壓電轉印 l小時，取下PVDF膜，蒸餾水洗膜5分鐘3次，TBST洗滌10分鐘3次，室溫下5%脫 脂奶粉封閉膜l小時，TBST洗滌10分鐘3次，加入用3XBSA/TBS稀釋至1 : 1000的 兔抗人Wnt5a多克隆抗體，4t:孵育過夜，TBST洗滌10分鐘3次，加入3^BSA/TBS稀 釋至l : 5000的羊抗兔二抗，37t:孵育2小時，TBST洗滌10分鐘3次，將發光液A和 B等體積混勻製成工作液，滴於膜上，作用5分鐘，化學發光檢測並採集圖像。
結果顯示，通過與感染空載體K562細胞比較，所得到K562細胞株穩定過表達 Wnt5a基因，請見圖3，其中1.K562-Wnt5a細胞；2.K562-載體細胞，GAPDH為甘油 醛-3-磷酸脫氫酶。
序列表 中國人民解放軍第三軍醫大學
重組質粒pSEB-Wnt5a及其製備方法
2PatentIn version 3.3
1
1168
DNA人工設計合成的用於pAdTrack-Wnt5a載體構建的序列
1cggggtacca tggccatgaa gaagcccatt ggaatattaa gcccgggagt ggctttgggg 60
8
accgctggag gtgccatgtc ttccaagttc ttcctaatgg ctttggccac gtttttctcc 120 ttcgcccagg ttgttataga agctaattct tggtggtctc taggtacgaa taaccctgtt 180 cagatgtcag aagtatatat cataggtgca cagcctctct gcagccaact ggcaggactt 240 tctc鄉g3c鄉鄉^ct ctgccacttg latc昭gacc aratgc敏3 cattgg昭^ 300 ggtgcgaaga caggcatcaa ggaatgccag taccagttcc ggcatcggag atggaactgc 360 agcacagtgg acaatacttc tgtctttggc agggtgatgc aaataggcag ccgagagacg 420 gccttcacgt acgcggtgag cgcagctggg gtggtgaacg ccatgagccg agcatgccgg 480 gagggcgagc tgtctacctg tggctgcagc cgcgctgcgc gccccaagga cctgcctcgg 540 gactggttgt ggggcggctg cggagacaac atcgactatg gctaccgctt cgccaaggag 600 ttcgtggacg ctog昭^昭gg^cg礎c cacgctogg gttcct啤a g昭cgracgc 660 atcctc啤3 3ctocac^ ra噸^gra ggccgt昭ga c敏她c^ cctggc昭at 720 gtagcctgta agtgtcatgg agtgtctggc tcctgtagcc tcaagacgtg ctggctgcag 780 ctggcggact tccggaaggt gggcgatgcc ctcaaggaga agtatgatag cgcggcggcc 840 atgaggctca acagccgggg caagctggtg caggtcaaca gccgcttcaa ctccccgacc 900 acgc昭gacc tggtclarat cgacccc敏ccggaclact gtgtgcgc^ cg昭昭ract 960 ggctcgctgg gcacgcaggg acgcctgtgc aacaagacct cagaggggat ggacggctgc 1020 gagctcatgt gctgtgggcg tggctatgac cagtttaaga cagtgcagac cgaacgctgt 1080 cattgcaagt ttcactggtg ctgctatgtc aaatgcaaga agtgcacgga gattgtggat 1140 cagttcgtgt gcaaatagtc tagactag 1168 2 1149 DNA 〈213〉Wnt5a序列 2 啤gcc啤a昭^gccrat tgga她to昭cccggg昭tggctttggg gaccgctgga 60 ggtgcc噸t cttcra敏t cttccto噸gctttggcra cgtttttctc cttcgccc昭 120 gttgttatag aagctaattc ttggtggtct ctaggtacga ataaccctgt tcagatgtca 180 gaagtatata tcataggtgc acagcctctc tgcagccaac tggcaggact ttctcaagga 240 c昭鄉3^c tctgcractt g1atc昭gac rac噸c敏3C3ttgg昭a昭gtgcg^g 300 acaggcatca aggaatgcca gtaccagttc cggcatcgga gatggaactg cagcacagtg 360 gacaatactt ctgtctttgg cagggtgatg caaataggca gccgagagac ggccttcacg 420 tacgcggtga gcgcagctgg ggtggtgaac gccatgagcc gagcatgccg ggagggcgag ■ ctgtctacct gtggctgcag ccgcgctgcg cgccccaagg acctgcctcg ggactggttg 540 tggggcggct gcggagacaa catcgactat ggctaccgct tcgccaagga gttcgtggac 600 gctagagaaa gggaacgaat ccacgctaag ggttcctatg agagcgcacg catcctcatg 660 aacttacaca acaatgaagc aggccgtagg acagtataca acctggcaga tgtagcctgt 720 aagtgtcatg gagtgtctgg ctcctgtagc ctcaagacgt gctggctgca gctggcggac 780 ttccggaagg tgggcgatgc cctcaaggag aagtatgata gcgcggcggc catgaggctc 840 ^c昭ccggg gc鄉ctggt gc昭gtc^c昭ccgcttra actccccgac racgc昭gac 900
ctggtctaca tcgaccccag tccggactac tgtgtgcgca acgagagcac tggctcgctg 960 ggcacgcagg gacgcctgtg caacaagacc tcagagggga tggacggctg cgagctcatg 1020 tgctgtgggc gtggctatga cc敏ttaag acagtgcaga ccgaacgctg tcattgcaag 1080 tttcactggt gctgctatgt caaatgcaag aagtgcacgg agattgtgga tcagttcgtg 1140 tgcaaatag 1149
10
權利要求
一種重組質粒pSEB-Wnt5a，包含載體片段pSEB和基因片段Wnt5a。
2. 根據權利要求1所述的重組質粒pSEB-Wnt5a，其特徵在於所述載體片段pSEB來 自質粒pSEB-flag。
3. 根據權利要求1所述的重組質粒pSEB-Wnt5a，其特徵在於所述基因片段Wnt5a來 自質粒pAdTrack-Wnt5a。
4. 權利要求1所述的重組質粒pSEB-Wnt5a的製備方法，其特徵在於包含步驟1) PCR擴增獲得Wnt5a基因；2) 將含有pSEB片段的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產物酶切後連接；3) 將步驟2)獲得的連接產物轉化受體菌；4) 鑑定陽性克隆，獲得pSEB-Wnt5a連接產物。
5. 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於步驟l)包含通過PCR從質粒 pAdTrack-Wnt5a中擴增獲得Wnt5a基因。
6. 根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟1)中的PCR擴增中使用PCR引GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'。
7. 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於步驟2)中所述含有pSEB片段的載體 為質粒pSEB-flag。
8. 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於步驟2)中採用Bgin、 Sall酶對含有 pSEB片段的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產物進行酶切。
9. 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於步驟4)中所述鑑定陽性克隆的方法 為Wnt5a重組質粒酶切鑑定和/或pSEB-Wnt5a重組質粒插入片斷測序鑑定。
全文摘要
本發明涉及一種重組質粒pSEB-Wnt5a及其製備方法，其中該重組質粒包含載體片段pSEB和基因片段Wnt5a。上述載體片段pSEB來自質粒pSEB-flag，基因片段Wnt5a來自質粒pAdTrack-Wnt5a。重組表達質粒pSEB-Wnt5a的成功構建，有利於進一步的研究表達Wnt5a的逆轉錄病毒載體的構建和研究Wnt5a基因在腫瘤發生中的作用和機理研究。
文檔編號C12N15/85GK101691585SQ20091010471
公開日2010年4月7日 申請日期2009年8月27日 優先權日2009年8月27日
發明者司維柯, 李軍, 李招權, 潘靜, 牛長春, 趙宸 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學