絲樣材料前體、絲樣材料及它們的製備方法
2023-11-06 02:04:52 2
專利名稱：絲樣材料前體、絲樣材料及它們的製備方法
技術領域：
本發明涉及絲樣材料前體、由該前體製造的絲樣材料，以及它們的製備方法。
舉例來說，周等人已經報導了家蠶絲的一級結構(周等，NucleicAcids Research，28，2413-2419(2000))。根據這篇報導，在家蠶絲結構的重複結構域中，(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)n區域和Gly和Ala的連鎖中，Tyr和/或Val出現的區域交替出現。進而，這種有序的重複區域和約30個殘基的無序區域重複。
另外，通過風乾液態絲得到的絲膜的結構，即Silk I型結構由X射線衍射在原子水平研究，還進行了各種模型共聚物的合成和結構解析，但是，還不能正確地將其表徵。Silk I型結構的代表性模型包括已為人們熟知的Lotz等提出的「Crankshaft模型」和Fossey等提出的「Out-of-Register模型」。前者基於X射線數據分析、電子束分析和構象能計算的結果；後者基於詳細的構象能計算的結果。
但是，這兩種結構模型不能解釋所有的X射線數據。此外，在這兩種模型中，因為形成的全部是分子間氫鍵，所以從Silk I型結構到Silk II型結構轉變中，需要分子間氫鍵斷裂，以及進一步形成氫鍵。這意味著這兩種模型不能確切說明蠶從液態絲生成絲線的機理。
如上述，以往，由於沒有明確正確的Silk I型結構，沒有搞清蠶從液態絲生成絲線的正確的機理，因此不能合成絲線。本發明的發明人通過使用基於固體核磁共振的新的分析方法對Silk I型結構進行集中研究，結果成功地正確確定了Silk I型結構，並且基於該發現完成了本發明。
因此，本發明的第一個目的是提供含有液態絲的絲樣材料前體。
本發明的第二個目的是提供上述絲樣材料前體的製備方法。
本發明的第三個目的是提供能從上述絲樣材料前體合成的絲樣材料。
本發明的第四個目的是提供含有絲的絲樣材料的製備方法。
圖2(a)～(c)說明
圖1所示的Silk I型固體結構的絲樣材料前體形成的分子間結構。另外，圖2(b)中的虛線代表分子內氫鍵，而圖2(a)和圖2(c)中的虛線代表分子間氫鍵。
儘管式-[(GA1)j-((GA2)k-G-Y-(GA3)l)m]n-以嵌段共聚的形式表示，但本發明的前體並不限制於嵌段共聚。j是大於等於6的整數，k和l是0～5的整數，m是1～7的整數，n是大於等於10的整數。
另外，上式中的Y可以包括兩種或兩種以上的胺基酸，但優選是L-酪氨酸一種。前體的水溶性的程度取決於Y的含量而變化，其含量優選為小於等於20％(摩爾)。另外，n是大於等於10的數，從可能紡絲的角度而言，優選共聚物的分子量大於等於30000。
本發明的「β-轉角II型結構」是如圖1所示的結構，其中胺基酸殘基以螺旋狀捲曲轉角的形式重複，整體成為線狀的高分子。與Silk II型結構和以前的模型不同，上述β-轉角II型結構使本發明的上述通式代表的前體具有分子內氫鍵(圖1和圖2(b)的虛線部分)，而且該分子內氫鍵沿分子軸順序形成。
以下詳述本發明的絲樣材料前體的製備方法。在本發明的前體的製備期間，首先確定與甘氨酸一起使用的其他胺基酸的種類和使用量。較好地只用一種，也可以使用多種。另外，根據所期望的水溶性的程度確定Y的用量。Y的使用量優選小於等於全部胺基酸的20％(摩爾)。當Y的量太多時，得到的前體的穩定性變差，從而使纖維化變得困難。此外，在主鏈中引入Y是必要的。而且，通過在由A1表示的丙氨酸序列的每個第三A1中引入絲氨酸，可以調節共聚物的硬度。
本發明的前體可以通過固相肽合成方法，或者通過用大腸桿菌(Escherichia coli)的基因工程方法來合成。特別地，通過後一方法合成高分子量的共聚物時，首先確定合成的通式，然後，化學合成編碼目的序列的寡核苷酸後，用它們製備該通式的重複單元，如果需要，通過將其引入克隆載體適宜地聚合，然後轉移入大腸桿菌，通過大腸桿菌表達，優選是基因工程製備方法。類似的製備方法由Prince J，T等，Biochemistry34，10879(1995)公開。
圖1顯示用甘氨酸和L-丙氨酸合成的共聚物的，沿分子軸形成氫鍵的Silk I型結構。另外，圖2顯示圖1所示的共聚物以固體狀態形成的規則的分子間結構。圖2(a)～(c)分別是其分子間結構的c軸投影圖、a軸投影圖和b軸投影圖。但是，本發明的前體中，除了具有上述Silk I型的有序結構外，還包括無定形的前體。
在Silk I型結構的分子中，如圖1和圖2(b)所示，三個胺基酸殘基位於一端的氨基(例如Ala(i+3))和位於另一端的羧基(例如Gly(i))的氧原子形成氫鍵，從而形成稱為「β-轉角II型結構」的環狀結構。如圖1所示，兩個與此β-轉角II型結構的分子內氫鍵有關的肽基分別被其它β-轉角II型結構共用。Silk I型結構的分子中，分子全部形成該β-轉角II型結構。在本說明書中，將該結構定義為「重複β-轉角II型結構」。
另外，在固體狀態，如圖2(a)和2(c)所示，Silk I型結構中，沿a軸方向相鄰的分子通過分子間氫鍵結合。如圖1所示，它們的分子間氫鍵在與分子內氫鍵無關的肽基間形成。也就是說，在Silk I型固體結構中，通過碳原子，與分子內氫鍵有關的肽基和對分子間氫鍵有貢獻的肽基，沿分子的分子鏈交替結合。
通過用穩定的同位素標記，使用REDOR法確定與分子內氫鍵有關的碳原子和氮原子之間的距離，確認Silk I型結構中實際的分子內氫鍵的形成。
上述「重複的β-轉角II型結構」合理地解釋了家蠶在室溫下的短時間內從液態絲生成絲線的機理。
Silk I型結構的本發明的前體具有高的熱穩定性，但是，如紡絲時那樣在纖維軸方向上施加張力時，其快速向Silk II型結構轉變。這從以下內容能夠容易地理解，如圖1和圖2(b)所示，在Silk I型結構中，分子內氫鍵的鍵軸幾乎與分子軸平行，與分子內氫鍵有關的肽基在相鄰的分子間接近。
也就是說，Silk I型結構中，分子內氫鍵的鍵軸與分子軸幾乎平行，通過將分子向其分子軸方向拉伸，該分子內氫鍵容易被切斷，由於與該分子內氫鍵有關的肽基在相鄰的分子間接近，在前述分子內氫鍵切斷的同時，在垂直於分子軸的方向上形成新的分子間氫鍵。因此，由於上述分子內氫鍵的切斷和新的分子間氫鍵的形成同時發生，在本說明書中將其記載為「分子內氫鍵的轉變」。
在本發明中，將為了得到本發明的前體而通過大腸桿菌合成的共聚物溶解在含有LiBr的水溶液中，並通過透析將LiBr從所得溶液除去，從該水溶液中除去水，得到本發明的前體。在上述水分去除的過程中，通常從水溶液形成膜。另外，通過降低上述水溶液的濃度，可以使得到的膜狀的本發明的前體是無定形的；在升高水溶液的濃度的情況下，可以得到Silk I型的。
通過拉伸上述得到的膜，或者用甲酸處理，可以得到具有Silk II型結構的膜。但是，在生產絲線的情況下，需要從前述膜形成前的水溶液中紡絲，或者通過將獲得的膜狀的上述前體溶解在六氟異丙醇等溶劑中進行紡絲。
紡絲條件根據前體的物理性質適當地確定。另外，通過選擇紡絲頭開口孔徑的大小，可以從纖維狀的前體生產線狀的粗的絲樣材料。為了生產強度大的絲樣材料，需要將紡絲得到的材料拉伸。從生產成本和生產環境的角度而言，優選不用六氟異丙醇那樣的溶劑。因此，優選設計能在水溶液中紡絲的前體，但是通過使用在溴化鋰(LiBr)水溶液中混合醇和/或醚那樣的有機溶劑的混合溶劑，採用通過透析除去LiBr的方法，也可以擴大前體的設計的容許範圍。
通過構成絲樣材料的共聚物成分的變化，所得的線狀和膜狀的本發明的絲樣材料可以具有各種功能。另外，除了因為是蛋白質，可以被微生物分解之外，它還具有類似於天然絲的性質，而且是優質的具有環境適合性的纖維。
以下通過實施例說明本發明，但它們並不意圖限制本發明。
通過相同的操作，在樣品VI的情況中得到同樣的凝膠狀物，證明其結構中Silk I型和Silk II共存。
另外，在樣品VII的情況中，進行同樣的操作，其在透析膜中沉澱。還發現得到的沉澱的結構為Silk I型。實施例4使用固相肽合成儀合成下述化合物。(AG)3YG(AG)3YG(AG)3YG(AG)3VIII(AG)3YG(AG)2VGYG(AG)3YG(AG)3IX(AGAGYG)5X將300mg化合物VIII、IX和X溶解在7ml 9M的溴化鋰水溶液中，通過透析3天而除去溴化鋰。在透析操作中，這些肽在透析膜內呈凝膠狀形態，得到含有較多水分的目的物。它們具有與化合物VII(AG)15的處理過程明顯不同的形態，該結果證實向共聚物中引入的L-酪氨酸殘基有效地賦予其以親水性質。而且，A是L-丙氨酸，G是甘氨酸，Y是L-酪氨酸。實施例5向1g精煉的去除了絲膠蛋白的絲心蛋白纖維中加入50ml 9MLiBr，並在40℃下溶解1.5小時。接著，將得到的溶液抽濾以除去不溶物，得到絲濃度為0.5％的9M LiBr水溶液。將這樣得到的水溶液移入透析膜中，並用蒸餾水透析4天，得到濃度小於等於0.5％的絲的水溶液。接著，將得到的水溶液在2號方形培養皿上展開，並在室溫下溫和乾燥，每個得到0.15g的無定形膜。這樣得到的無定形膜在室溫下(15℃～30℃)易溶於HFIP，約3.5小時即完全溶解。另外，拉伸從HFIP溶液中紡絲的纖維，得到Silk II型結構的絲。實施例6使用固相肽合成儀合成下下述化合物。(AG)6A[1-13C]G[1-13C]AG(AG)7XI(AG)7[1-13C]A[1-13C]G(AG)7XII(AG)6A[1-13C]GA[1-13C]G(AG)7XIII(AG)6A[1-13C]GA[15N]G(AG)7XIV(AG)7[1-13C]AG[15N]AG(AG)7XV將300mg每種化合物溶解在7ml 9M溴化鋰水溶液中後，通過透析3天以除去溴化鋰，各樣品均在透析膜內沉澱。此時，通過IR光譜確認沉澱採取Silk I型結構。對化合物XI、XII和XIII的各樣品進行二維固體13C NMR自旋擴散，對化合物XIV和XV的樣品進行REDOR NMR測定。另外，[1-13C]G和[1-13C]A分別表示用13C標記一個碳原子的甘氨酸和丙氨酸，[15N]G和[15N]A分別表示用15N標記氮原子的甘氨酸和丙氨酸。
從樣品XI的光譜及其解析確定，丙氨酸殘基的扭轉角(φ，)為-60°±5°和130°±5°。另外，從樣品XII和XIII的光譜及其解析確定甘氨酸殘基的扭轉角(φ，)為70°±5°和30°±5°。
它們的扭轉角的值從樣品XIV和XV的REDOR測定的結果得到支持。丙氨酸和甘氨酸的交互共聚物在採取Silk I型結果的情況下，扭轉角被調整到上述值時，共聚物的結構如圖1所示。實施例7使用固相肽合成儀合成下述化合物。(AG)15VII(AG)6A[1-13C]GAG[15N]AG(AG)6XVI與實施例5相同地，製備Silk I型結構樣品。對樣品XVI進行REDOR測定的結果確定，第14位甘氨酸殘基的羰基碳和第17位丙氨酸殘基的氨基氮間的距離為4.0±0.1。在用等量的樣品VII稀釋樣品XVI得到的樣品的情況下，該值相同，因此，不存在分子間的影響。另外，上述4.0±0.1的值與從圖1的結構得到的相應原子間的距離一致，從而確認Silk I型結構形成了分子內氫鍵。實施例8向1g精煉的去除了絲膠蛋白的絲心蛋白纖維中加入50ml 9MLiBr，並在40℃下溶解上述絲心蛋白纖維1.5小時。接著，將得到的溶液抽濾以除去不溶物，得到濃度為0.5％的9M LiBr水溶液。將這樣得到的水溶液移入透析膜中，並用蒸餾水透析4天，得到濃度小於等於0.5％的絲的水溶液。另一方面，將胰凝乳蛋白酶溶解在數毫升水中後，加入用磷酸鈉將pH調節到7.8的絲水溶液(含4g絲)，在40℃下保溫24小時。將沉澱物在10000rpm下離心分離，並通過0.03N鹽酸終止酶反應。將得到的沉澱物洗淨，得到CP部分(約55％原始絲心蛋白)。
其序列以前已經知道，主要由重複的AGAGSG組成(Strydom等，Biochem.Biophy.Res.Commun.，3932(1977))。
將該樣品溶解在9M LiBr中後，透析、沉澱得到的樣品通過IR確認為Silk I型。測定該樣品和(AG)15的樣品的13C固體高分辨NMR，丙氨酸和甘氨酸區的峰非常一致，丙氨酸-甘氨酸共聚物是絲的結晶部(AGAGSG)n的模型。同樣地，用甲酸處理它們的樣品，在Silk II型的情況下，丙氨酸和甘氨酸區的峰也非常一致。工業實用性通過構成絲樣材料的共聚物的成分的變化，本發明的絲樣材料可以具有各種功能。另外，由於是蛋白質，可以通過微生物得以分解；就纖維而言，由於其能夠具有與天然絲類似的性質，因此是質感高級且有利環境的好的纖維。
序列表序列表110東京農工大學長代表的日本國120絲樣材料前體、絲樣材料及它們的製備方法16010210121111212PRT213人工序列4001Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly1 5 10210221111212PRT213人工序列4002Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly1 5 10210321111212PRT213人工序列4003Gly Ala Gly Val Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly1 5 10210421130212PRT213人工序列4004Thr Gly Phe Asp Ser Glu Ser Ser Trp Ala Tyr Glu Tyr Gly Ser1 5 10 15Tyr Gly Gly Asn Ala Val Tyr Pro Gly Phe Gly Ser Ser Gly Thr20 25 30210521124212PRT213人工序列4005Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20210621130212PRT213人工序列4006Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25 30210721130212PRT213人工序列4007Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25 30210821130212PRT213人工序列4008Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25 30210921130212PRT213人工序列4009Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Val Gly Tyr1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25 302101021130212PRT213人工序列40010Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly1 5 10Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly15 20 25Tyr Gly302101121130212PRT213人工序列222(14)223Xaa代表[1-13C].222(15)223Xaa代表[1-13C]A.40011Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Xaa Xaa1 5 1015Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25302101221130212PRT213人工序列222(15)223Xaa代表[1-13C]A.222(16)223Xaa代表[1-13C]G.40012Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Xaa1 5 1015Xaa Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25302101321130212PRT213人工序列222(14)223Xaa代表[1-13C]G.222(16)223Xaa代表[1-13C]G.40013Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Xaa Ala1 5 1015Xaa Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25302101421130212PRT213人工序列222(14)223Xaa代表[1-13C]G.222(16)223Xaa代表[15N]G.40014Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala1 5 1015Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25302101521130212PRT213人工序列222(15)223Xaa代表[1-13C]A.222(17)223Xaa代表[15N]A.40015Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Xaa1 5 1015Gly Xaa Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly20 25302101621130212PRT213人工序列222(14)223Xaa代表[1-13C]G.222(17)223Xaa代表[15N]A.40016Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Xaa Ala1 5 1015Gly Xaa Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
權利要求
1.一種絲樣材料前體，其是通式-[(GA1)j-((GA2)k-G-Y-(GA3)l)m]n-表示的共聚物，其中(GA1)j部分具有重複的β轉角II型結構，其沿分子軸連續形成分子內氫鍵；式中G是甘氨酸，A1是丙氨酸，每個第三A1也可以是絲氨酸；A2和A3是丙氨酸，它們的一部分可以用纈氨酸替代；Y是具有不對稱碳原子的胺基酸，其賦予該共聚物以水溶性；另外，j是大於等於6的整數，k和l為0～5的整數，m為1～7的整數，n是大於等於10的整數。
2.如權利要求1所述的絲樣材料前體，其中該通式中Y的含量為小於等於20％(摩爾)。
3.如權利要求1或2所述的絲樣材料前體，其中該通式中Y是L-酪氨酸。
4.一種絲樣材料前體的製備方法，其特徵在於，設計前述通式表示的共聚物，化學合成編碼目的序列的寡核苷酸後，用這些寡核苷酸製備通式中的重複單元，必要時將其引入克隆載體中以適宜地聚合，將得到的重複單元或其聚合物引入表達載體，再轉移入大腸桿菌，通過大腸桿菌進行表達。
5.一種絲樣材料，其特徵在於對權利要求1至3之任一項所述的絲樣材料前體進行紡絲，在前述前體內沿分子軸形成的分子內氫鍵轉變為分子間氫鍵。
6.如權利要求5所述的絲樣材料，其中所述紡絲在含水氣氛中進行。
7.一種具有Silk II型結構的絲樣材料的製備方法，其特徵在於，從溶解有權利要求1的絲樣材料前體的溶液中紡絲，使沿著所述絲樣材料前體中的該前體分子軸形成的分子內氫鍵轉變成分子間氫鍵，必要時進行拉伸。
8.權利要求7所述的絲樣材料的製備方法，其中在紡絲中提供的溶液如下製備從溶解有絲樣材料前體的水溶液製備無定形或Silk I型薄膜，乾燥後，在15℃～30℃下溶解在六氟異丙醇中。
全文摘要
本發明提供絲樣材料前體及其製備方法，以及由該前體製備的絲樣材料。絲樣材料前體是通式－[(GA
文檔編號C12N15/12GK1419602SQ01807015
公開日2003年5月21日 申請日期2001年3月6日 優先權日2000年3月24日
發明者朝倉哲郎 申請人:東京農工大學長代表的日本國