生物標誌物組合物和方法

2023-11-05 17:52:17

生物標誌物組合物和方法
【專利摘要】可以評估生物標誌物用於診斷、治療相關或預後方法以鑑定表型，如病症或疾病，或者疾病的階段或進程，選擇用於疾病、病症、疾病階段和病症階段的候選治療方案，並且用於確定治療效果。來自體液的循環生物標誌物可以用於生理狀態的分型或確定表型。這些包括核酸、蛋白質和循環結構，如囊泡，以及核酸-蛋白質複合物。
【專利說明】生物標誌物組合物和方法
[0001]交叉參考
[0002]本申請要求2011年6月16日提交的美國臨時專利申請N0.61/497，895 ;2011年6 月 20 日提交的 N0.61/499，138 ；2011 年 6 月 27 日提交的 N0.61/501,680 ；2011 年 7 月8 日提交的 N0.61/506,019 ；2011 年 7 月 11 日提交的 N0.61/506,606 ；2011 年 7 月 11 日提交的N0.61/506，598 ；2011年7月14日提交的N0.61/507,989 ；2011年7月25日提交的N0.61/511,455 ;2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年8月23日提交的N0.61/526，623的權益；將該申請全部按引用併入本文中作為參考。 [0003]本申請是2012年6月7日提交的國際專利申請PCT/US2012/041387的部分繼續，該國際專利申請要求2011年6月7日提交的美國臨時專利申請N0.61/494，196;2011年6月7日提交的N0.61/494,355 ;和2011年7月14日提交的N0.61/507，989的權益；將該申請全部按引用併入本文中作為參考。
[0004]本申請還是2012年2月17日提交的國際專利申請PCT/US2012/025741的部分繼續，該國際專利申請要求美國臨時專利申請2011年2月24日提交的N0.61/446,313 ；2011年6月27日提交的N0.61/501,680 ；2011年4月4日提交的N0.61/471,417 ；2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年2月22日提交的N0.61/445，273的權益；將該申請全部按引用併入本文中作為參考。
[0005]本申請還是2011年8月18日提交的國際專利申請PCT/US2011/048327的部分繼續，該國際專利申請要求美國臨時專利申請2010年8月18日提交的N0.61/374,951 ；2010年9月2日提交的N0.61/379，670 ;2010年9月9日提交的N0.61/381，305 ;2010年9月15 日提交的 N0.61/383,305 ；2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ；2010 年 10 月 15日提交的 N0.61/393，823 ；2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 ；2010 年 11 月 17 日提交的 N0.61/414,870 ;2010 年 11 月 23 日提交的 N0.61/416，560 ;2010 年 12 月 10 日提交的 N0.61/421，851 ;2010 年 12 月 15 日提交的 N0.61/423，557 ;2010 年 12 月 29 日提交的N0.61/428，196的權益；將該申請全部按引用併入本文中作為參考。
[0006]本申請還是2011年3月I日提交的國際專利申請PCT/US2011/026750的部分繼續，該申請聲稱是2009年11月12日提交的美國專利申請系列N0.12/591,226的部分繼續申請，其要求美國臨時申請2008年11月12日提交的N0.61/114,045 ;2008年11月12 日提交的 N0.61/114，058 ；2008 年 11 月 13 日提交的 N0.61/114，065 ；2009 年 2 月 9 日提交的 N0.61/151,183 ；2009 年 10 月 2 日提交的 N0.61/278,049 ；2009 年 10 月 9 日提交的N0.61/250, 454 ;和2009年10月19日提交的N0.61/253，027的權益；並且該申請還要求美國臨時申請2010年3月I日提交的N0.61/274，124 ;2010年6月22日提交的N0.61/357,517 ;2010年7月15日提交的N0.61/364，785的權益；將所有申請全部按引用併入本文中作為參考。
[0007]本申請還是2011年4月6日提交的國際專利申請PCT/US2011/031479的部分繼續，該國際專利申請要求美國臨時專利申請2010年4月6日提交的N0.61/321,392 ；2010 年 4 月 6 日提交的 N0.61/321，407 ;2010 年 5 月 6 日提交的 N0.61/332，174 ；2010年 5 月 25 日提交的 N0.61/348，214 ;2010 年 5 月 26 日提交的 N0.61/348，685 ;2010 年6 月 11 日提交的 N0.61/354，125 ；2010 年 6 月 16 日提交的 N0.61/355，387 ；2010 年 6月 21 日提交的 N0.61/356，974 ;2010 年 6 月 22 日提交的 N0.61/357，517 ;2010 年 7 月8 日提交的 N0.61/362，674 ；2010 年 11 月 12 日提交的 N0.61/413，377 ；2010 年 4 月 9日提交的 N0.61/322，690 ;2010 年 5 月 13 日提交的 N0.61/334，547 ;2010 年 7 月 15 日提交的 N0.61/364，785 ；2010 年 8 月 2 日提交的 N0.61/370, 088 ；2010 年 9 月 2 日提交的 N0.61/379，670 ；2010 年 9 月 9 日提交的 N0.61/381，305 ；2010 年 9 月 15 日提交的 N0.61/383，305 ;2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ;2010 年 10 月 15 日提交的N0.61/393, 823 ;2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 和 2010 年 11 月 23 日提交的N0.61/416，560的權益；將所有申請全部按引用併入本文中作為參考。
[0008]發明背景
[0009]用於諸如癌症的狀況和疾病的生物標誌物包括生物分子，如蛋白質、肽、脂質、RNA、DNA和它們的變體及修飾。
[0010]特定生物標誌物(例如DNA、RNA和蛋白質)的鑑定可以提供用於診斷、預後或治療診斷(theranosis)狀況或疾病的生物印記。生物標誌物可在體液中檢測，包括循環DNA、RNA、蛋白質和囊泡。循環生物標誌物包括蛋白質(諸如PSA和CA125)以及核酸(諸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA (mRNA))。循環生物標誌物可以與循環囊泡相關。囊泡是從細胞上脫落的膜包封的結構，並且可見於多種體液中，包括血液、血漿、血清、乳汁、腹水、支氣管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作為蛋白質、RNA、DNA、病毒和朊病毒的運送載體而參與細胞之間的通訊。微RNA是調控信使RNA轉錄和降解的短RNA。微RNA已經在體液中發現並且已經觀察到其作為從腫瘤細胞上脫落的囊泡內的組分。對與疾病相關的循環生物標誌物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助於檢測疾病或其嚴重程度、確定疾病的易感性以及進行治療決策。·
[0011]生物樣品中存在的囊泡提供了生物標誌物的來源，例如，所述標誌物存在於囊泡內(囊泡有效負載)或存在於囊泡的表面上。囊泡的特徵(例如尺寸、表面抗原、細胞源的確定、有效負載)還可提供診斷、預後或治療診斷的結果輸出。仍然存在對可用於檢測和治療疾病的生物標誌物進行鑑定的需求。與囊泡相關的微RNA、蛋白質和其它生物標誌物以及囊泡的特徵可提供診斷、預後或治療診斷。
[0012]本發明提供了用於通過檢測作為疾病或疾病進展的指徵的生物標誌物而表徵表型的方法和系統。所述生物標誌物可以是循環生物標誌物，包括但不限於囊泡標誌物、蛋白質、核酸、mRNA或/和微RNA。生物標誌物可以是核酸-蛋白質複合物。
[0013]發明概述
[0014]本文公開了用於通過分析循環生物標誌物(諸如生物樣品中存在的囊泡、微RNA或蛋白質)來表徵表型的方法和組合物。表徵受試者或個體的表型可以包括但不限於疾病或狀況的診斷、疾病或狀況的預後、疾病階段或狀況階段的確定、藥物效力、生理狀況、器官危困或器官排斥、疾病或狀況進展、與疾病或狀況的治療相關關聯性或者特定的生理或生物狀態。
[0015]在一個方面中，本發明提供了鑑定生物印記的方法，其包括:(a)測定生物樣品中一種或多種生物標誌物的存在或水平，其中所述一種或多種生物標誌物包含選自表5的一種或多種生物標誌物；和(b)鑑定包括所述一種或多種生物標誌物的存在或水平的生物印記。該方法可以進一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中將該比較用於表徵癌症。所述參照生物印記可以來自未患癌症的受試者。參照生物印記可以來自該受試者。例如，參照生物印記可以來自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時間過程中取自受試者的不同樣品。表徵可以包括鑑定受試者中癌症的存在或風險，或鑑定受試者中的癌症是轉移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記是否相對於參照生物印記有所改變，由此提供癌症的預後、診斷或治療診斷確定。
[0016]在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517木、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542-5p、miR_30b*、miR-1179及其組合。例如，所述一種或多種生物標誌物可以選自miR-22、let7a、miR_141、miR-920、miR-450a及其組合。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌。
[0017]在其他實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包括選自由表20-24任一中的基因組成的組的信使RNA(mRNA)及其組合。例如，所述一種或多種生物標誌物可以包括選自A2ML1、BAX、C10orf47、Clortl62、CSDA, EIFC3、ETFB, GABARAPL2、GUKU GZMH、HIST1H3B、HLA-A、HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA、RABACl、RABAGAP1L、RPL22、SAP 18、SEPWl、SOXl 及其組合的mRNA。所述一種或多種生物標誌物還可以選自A2ML1、GABARAPL2、PTMA、RABAC1、S0X1、EFTB及其組合。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌。
[0018]所述一種或多種生物標誌物可以選自04-125、0麼19-9、(3-反應蛋白、^95、？4?-1、EGFR、EGFRvII1、阿樸脂蛋白Al、阿樸脂蛋白CII1、肌紅蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封閉蛋白(claudin)-3、封閉蛋白 _4、小窩蛋白-1、凝血因子 II1、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rabl3、橋粒芯膠蛋白(Desmocollin)-1、EMP-2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG-E8、HLA_DR、miR200 微 RNA、miR_200c 及其組合。例如，所述一種或多種生物標誌物選自CA-125、CA19-9、c-反應蛋白、⑶95、FAP-1及其組合。所述生物印記可以用於表徵卵巢癌。
[0019]在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自hsa-miR-574_3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa_miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625*及其組合。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於檢測前列腺癌的存在。所述一種或多種生物標誌物還可以選自hsa-miR-582_3p、hsa_miR-20a*、hsa-miR-375、hsa_miR-200b、hsa-miR-379、hsa-miR-572、hsa-miR-513a_5p、 hsa-miR-577、 hsa_miR-23a*、 hsa-miR-1236、 hsa-miR-609、hsa-miR-l7*、hsa_miR-l30b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198 及其組合。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分轉移性和非轉移性前列腺癌。
[0020]在另一個實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包括miR-497及其組合。所述生物印記可以用於表徵肺癌。
[0021]所述一種或多種生物標誌物可以是選自由AQP2、BMP5、C16orf86、CXCT13、DST、ERCC1、GNAO1、KIHL5、MA P4K1、NELL2、PENK、PGF、P0U3F1、PRSS21、SCML1、SEMGG1、SMAKCD3、SNAI2, TAF1C、TNNT3及其組合組成的組的信使RNA (mRNA)。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分前列腺癌與非癌樣品。
[0022]在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包括選自由ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf 14, EIFlAY, FEV, KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2,SLC30A4、SLC45A3、STX19、TRIM36, TRPM8及其組合組成的組的信使RNA(mRNA)。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分前列腺癌與非前列腺癌樣品，如乳腺癌樣品。
[0023]在其他實施方案中，一種或多種生物標誌物包括選自由ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAMl 10B、F0XA2、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MIPOLl、SLC45A3、SPDEF、TRM31、TRM36、ZNF613 及其組合組成的組的信使 RNA (mRNA)。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分前列腺癌與非前列腺癌樣品，如結腸直腸癌樣品。
[0024]在再其他的實施方案中，一種或多種生物標誌物包括選自由ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAMlIOB、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、S頂2、SLC45A3、SPDEF, TRIM36, TRPV6, ZNF613及其組合組成的組的信使RNA (mRNA)。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分前列腺癌與非前列腺癌樣品，如肺癌樣品。
[0025]所述一種或多種生物標誌物還可以是識別以上mRNA之一的微RNA。例如，微RNA可以選自 miRs-26a + b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342-5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR_216b、miR-519 家族、miR-203 及其組合。
[0026]在另一個方面中，本發明提供了一種方法，其包括:(a)從生物樣品分離一種或多種核酸-蛋白質複合物；(b)用所述一種或多種核酸-蛋白質複合物測定一種或多種核酸生物標誌物的存在或水平；和(C)鑑定包括所述一種或多種核酸生物標誌物的存在或水平的生物印記。所述方法可以進一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中所述比較用於表徵癌症。參照生物印記可以來自未患癌症的受試者。參照生物印記可以來自該受試者。例如，所述參照生物印記可以來自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時間過程中取自受試者的不同樣品。所述表徵可以包括鑑定受試者中癌症的存在或風險，或鑑定受試者中的癌症是 轉移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記相對於參照生物印記是否有所改變，由此提供用於癌症的預後、診斷或治療診斷確定。
[0027]所述核酸-蛋白質複合物可以包含選自一種或多種Argonaute家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB, ILF2、NCL (核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPLlOA、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG, TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白 A、apo A-1> apo A-1I> apo A-1V、apo A-V、阿樸脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白C、apo C-1> apo C-11、apoC-1I1、apo C-1V、阿樸脂蛋白D(ApoD)、阿樸脂蛋白E(ApoE)、阿樸脂蛋白 H(ApoH)、阿樸脂蛋白 L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6、AP0LD1及其組合的一種或多種蛋白質。例如，所述一種或多種蛋白質可以選自一種或多種Argonaute 家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)及其組合。一種或多種蛋白質還可以選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合。
[0028]所述核酸-蛋白質複合物可以包含一種或多種微RNA。在一個實施方案中，一種或多種微RNA可以是表5中的一種或多種微RNA。例如，所述一種或多種微RNA可以選自miR-22、miR-16、miR_148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合。在一個實施方案中，所述核酸-蛋白質複合物包含一種或多種選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合的蛋白質；並且所述一種或多種微RNA包括選自miR-16和miR_92a及其組合的一種或多種微RNA。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分前列腺癌與非癌樣品。
[0029]在再另一個方面，本發明提供了一種方法，其包括:(a)檢測來自生物樣品的微囊泡群體中的一種或多種蛋白質生物標誌物；(b)確定與所檢測的微囊泡群體相關的一種或多種核酸生物標誌物的存在或水平；和(C)鑑定包括所述一種或多種核酸的存在或水平的生物印記。例如，所述一種或多種核酸生物標誌物的水平可以相對於所述一種或多種蛋白質生物標誌物的水平標準化。所述方法可以進一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中所述比較用於表徵癌症。所述參照生物印記可以來自未患癌症的受試者。所述參照生物印記可以來自該受試者。例如，所述參照生物印記可以來自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時間過程中取自受試者的不同樣品。所述表徵可以包括鑑定受試者中癌症的存在或風險，或鑑定受試者中癌症是轉移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記是否相對於參照生物印記有改變，由此提供用於癌症的預後、診斷或治療診斷確定。
[0030]在一個實施方案中，所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括選自PCSA、Ago2、⑶9及其組合的一種或多種蛋白質。所述一種或多種核酸生物標誌物可以是選自miR-22、miR-16、miR_148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合的一種或多種微 RNA。例如，所述一種或多種蛋白質生物標誌物可以包括PCSA和Ago2 ;並且所述一種或多種核酸生物標誌物可以包括miR-22。作為另一個實例，所述一種或多種蛋白質生物標誌物可以包括PCSA和/或⑶9 ;並且所述一種或多種核酸生物標誌物可以包括miR-22。在另一個實施方案中，所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括PCSA ;並且所述一種或多種核酸生物標誌物包括選自表22-24的信使RNA(mRNA)。所述生物印記可以用於表徵前列腺癌，如用於區分前列腺癌與非癌樣品。
[0031]所述生物印記可以包括從一種或多種蛋白質生物標誌物和一種或多種核酸生物標誌物的水平的比例計算的評分。在一個實施方案中，所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括PCSA和PSMA，並且一種或多種核酸生物標誌物包括miR-22和let7a。在這種情況中，計算評分可以包括取以下的總和:(a)微囊泡亞群中的miR-22有效負載的水平除以與微囊泡亞群相關的PCSA蛋白的水平的第一倍數；(b)微囊泡亞群中let7a有效負載的水平除以與微囊泡亞群相關的PCSA蛋白的水平的第二倍數；和(c)與微囊泡亞群相關的PSMA蛋白的水平的第三倍數。可以選擇所述第一、第二和第三倍數來優化確定生物印記。在一個實施方案中，第一倍數和第二倍數可以都是10。第三倍數可以是I。
[0032]在所述系統的方法的實施方案中，所述生物樣品包括體液。合適的體液不限於外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper』 s fluid)或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。例如，生物樣品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
[0033]在所述系統的方法的一些實施方案中，所述生物樣品包括組織樣品、來自組織樣品的細胞或從這些細胞釋放的循環生 物標誌物。例如，可以進行本發明的方法來鑑定針對組織樣品的生物印記。所述生物樣品可以包括細胞培養物樣品，例如，所述樣品可以包括培養的細胞和/或包含從這些培養的細胞釋放的循環生物標誌物的培養基。所述組織樣品或培養物樣品可以是癌樣品，或可以包括腫瘤樣品或腫瘤細胞。
[0034]在本發明的方法中，生物樣品可以含有一種或多種微囊泡。在一些實施方案中，一種或多種生物標誌物與一種或多種微囊泡相關。一種或多種微囊泡可以具有IOnm至2000nm 的直徑,例如，20nm 至 1500nm, 20nm 至 1000nm, 20nm 至 500nm,或 20nm 至 200nm。
[0035]可以使用本文中公開的或本領域已知的方法從樣品中分離一種或多種微囊泡。在實施方案中，一種或多種微囊泡經受尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、親和選擇、免疫分析、ELISA、微流體分離、流式細胞分析或其組合。
[0036]可以將一種或多種微囊泡接觸一種或多種結合劑。在一些實施方案中，所述一種或多種結合劑包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標記劑、化學化合物或其組合。例如，結合劑可以是抗體或適體。一種或多種結合劑可以用於捕獲和/或檢測一種或多種微囊泡。在一個實施方案中，一種或多種結合劑結合一種或多種微囊泡上的一種或多種表面抗原。一種或多種表面抗原可以包含一種或多種蛋白質。
[0037]該一種或多種蛋白質可以是目標囊泡上的任何有用的生物標誌物，如本文中公開的那些。在一個實施方案中，一種或多種蛋白質包括一種或多種細胞特異性或癌症特異性的囊泡標誌物，例如，CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam或者表4或5中的蛋白質。一種或多種蛋白質還可以包括一般囊泡標誌物，例如，四跨膜蛋白(tetraspanin)、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG_E8 或表 3 的蛋白質中的一種或多種。在一個實施方案中，一種或多種蛋白質包括表3-5任一中的一種或多種蛋白質。
[0038]一種或多種結合劑可以用於捕獲一種或多種微囊泡。捕獲的微囊泡可以用於進一步的評估。例如，可以評價微囊泡內的有效負載。微囊泡有效負載包括一種或多種核酸、肽、蛋白質、脂質、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所述核酸可包含一種或多種DNA、mRNA、微 RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA 或 shRNA。在一個實施方案中，一種或多種生物標誌物包括一種或多種捕獲的微囊泡內的有效負載。例如，一種或多種生物標誌物可以包括mRNA有效負載。一種或多種生物標誌物還可以包括微RNA有效負載。一種或多種生物標誌物還可以包括蛋白質有效負載，例如，內膜蛋白質或可溶性蛋白質。
[0039]本發明的方法可以在體外進行，例如，使用體外生物樣品或細胞培養物樣品。
[0040]在進一步的實施方案中，所分 析的癌症可以是肺癌，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌(包括小細胞癌(燕麥細胞癌)、混合小細胞/大細胞癌和複合性小細胞癌)、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰癌(pancreascancer)、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer)、皮膚癌、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、膠質瘤、成膠質細胞瘤、肝細胞癌、乳頭狀腎癌、頭頸鱗狀上皮細胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或實體腫瘤。
[0041]在實施方案中，通過本發明方法表徵的癌症包括急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎性瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明的癌症；類癌瘤；原發部位不明的癌瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；頡外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽因癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌?』胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstrom巨球蛋白血症；*Wilm’s腫瘤。例如，所述癌症可以是前列腺癌、肺癌、乳腺癌、結腸直腸癌或卵巢癌。
[0042]本發明的方法可以在體外進行，例如，使用體外生物樣品或細胞培養物樣品。
·[0043]在一個方面中，本發明提供了進行本發明任一方法的試劑。在一個相關方面中，本發明提供了試劑盒，其包含進行本發明任一方法的試劑。試劑可以是結合劑，包括但不限於一種或多種生物標誌物的抗體或適體。例如，試劑可以是能夠結合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一個中的至少一種生物標誌物的結合劑。在一些實施方案中，將結合劑直接標記或配置成進行間接標記。
[0044]在另一個方面中，本發明提供了分離的PCSA+囊泡。該囊泡可以含有有效負載，其包含一種或多種選自 miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a-5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517*、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542_5p、miR_30b*、miR-1179 及其組合的微RNA。該囊泡還可以含有有效負載，其包含選自表20-24任一個的一種或多種信使RNA(mRNA)。
[0045]在再另一個方面中，本發明提供了一種組合物，其包含:(a)寡核苷酸，其包含栓繫於基質上的第一部分、與目標微RNA序列至少75%互補的第二部分和包含標記的第三部分，其中第二部分位於第一部分和第三部分之間；和(b)微RNA。基質可以是本文中公開的基質，例如，平面基質、柱或珠。在一些實施方案中，寡核苷酸的第二部分與目標微RNA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補。寡核苷酸的第二部分可以與(b)中的微 RNA 至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%互補。
[0046]在一些實施方案中，寡核苷酸的第三部分是直接標記的。在其他實施方案中，寡核苷酸的第三部分是間接標記的。寡核苷酸的第三部分可以生物素化，例如，以促進包含抗生蛋白鏈菌素的標記(如抗生蛋白鏈菌素-phycoerytherin(PE) (SAPE))的結合。可以使用任何有用的標記。例如，寡核苷酸的第三部分可以包含螢光標記、放射性標記或酶標記。 [0047]在一個實施方案中，(b)中的微RNA是處於與蛋白質的複合物中。所述蛋白質可以選自 Argonaute 家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG、TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白 A、apo A-1、apoA_I1、apo A-1V,apo A-V、阿樸脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白 C、apo C-1>apo C-1I>apo C_II1、apo C-1V、阿樸脂蛋白D(ApoD)、阿樸脂蛋白E(ApoE)、阿樸脂蛋白H(ApoH)、阿樸脂蛋白L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6 和 AP0LD1。例如，微 RNA 可以被 Agol、Ago2、Ago3 和 Ago4 中的一個或多個結合。蛋白質可以呈現出核溶解活性(nucleolytic activity)。蛋白質可以包含重組蛋白質。作為非限制性實例，蛋白質可以包含重組Ago2(rAgo2)。
[0048]在一些實施方案中，組合物包含生物樣品。微RNA也可以從生物樣品分離。分離的微RNA可以處於與蛋白質(如以上那些，包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4)的核蛋白複合物中。生物樣品可以包括體液。有用的體液的非限制性實例包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。例如，生物樣品可以包括尿液、血液或血液衍生物。
[0049]在相關方面中，本發明提供了一種方法，其包括:(i)提供如以上教導的組合物；
(ii)在允許微RNA結合寡核苷酸的條件下孵育所述組合物；和(iii)檢測標記從基質切割的量。在一個實施方案中，檢測標記從基質切割的量包括檢測在步驟(ii)之前和之後與基質接觸的標記的量。在另一個實施方案中，標記從基質切割表示與微RNA複合的蛋白質的存在。蛋白質可以是如以上所述的那些的蛋白質，包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4。可以在切割反應發生之前和之後觀察標記從基質切割的量。或者，可以實時觀察標記從基質切割的量。
[0050]通過引用併入
[0051]本說明書中提及的所有公開、專利和專利申請均以引用方式併入本文，其引用的程度如同各單個公開、專利或專利申請均特定地且單獨地表明以引用的方式併入一般。
[0052]附圖簡述
[0053]圖1A描述了鑑定包含核酸的生物印記以表徵表型的方法。圖1B描述了鑑定囊泡或囊泡群體的生物印記以表徵表型的方法。[0054]圖2詳細描述了通過評估囊泡生物印記而表徵表型的方法。圖2A為塗敷有捕獲抗體的平面基底的簡圖，所述的捕獲抗體捕獲表達該蛋白質的囊泡。所述捕獲抗體是針對囊泡蛋白質(其對源自病變細胞的囊泡(「疾病囊泡」)具有或不具有特異性)的。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結合併提供螢光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關的抗原，或檢測與細胞源或疾病(如癌症)相關的抗原。圖2B為塗敷有捕獲抗體的珠的簡圖，所述捕獲抗體捕獲表達該蛋白質的囊泡。所述的捕獲抗體是針對囊泡蛋白質(其對於源自病變細胞的囊泡(「疾病囊泡」)具有或不具有特異性)的。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結合併提供螢光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關的抗原，或檢測與細胞源或疾病(如癌症)相關的抗原。圖2C為篩選方案的實例，其可以通過使用如圖2B中所示的珠以多重方式實施。圖2D示出了捕獲或檢測囊泡以表徵表型的說明性示意圖。圖2E示出了用於評估囊泡有效負載以表徵表型的說明性方案。
[0055]圖3詳細說明了可以在本發明的一些示例性實施方案中使用的計算機系統。
[0056]圖4詳細說明了使用檢測來自受試者的囊泡的基於珠的方法描述結果的方法。在給定強度下捕獲的珠的數量為囊泡以怎樣的頻率在所述強度下表達檢測蛋白質的指示。對於給定的珠而言，信號的強度越強，則檢測蛋白質的表達越多。該圖顯示了通過將正常的患者組合到一條曲線中而將癌症患者組合到另一條曲線中，並使用生物統計分析區分所述曲線而得到的歸一化的圖。對由各個個體得到的數據歸一化以考慮由檢測儀器所讀取的珠的數量的差異，將這些數據加和，然後再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數。
[0057]圖5說明了通過評估TMPRSS2-ERG表達使用EpCam對來自血漿的前列腺癌細胞源囊泡的捕獲。將VcaP純化的囊泡摻入到正常血漿中，然後與塗敷有EpCam或同種型對照抗體的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分離RNA。使用來自各樣品的等體積RNA來進行RT-PCR以及隨後的Taqman分析。
[0058]圖6描述了使用⑶9珠捕獲的miR-21或miR-141表達的柱狀圖。將得自前列腺癌患者的Iml血漿、250ng/ml的LNCaP或正常的純化囊泡與⑶9塗敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分離 RNA。此外，對一個樣品(#6)不進行捕獲以用於比較。使用qRT-PCR測量微RNA的表達，並比較各樣品的平均CT值。CD9捕獲改善了前列腺癌樣品中miR-21 和 miR-141 的檢測。
[0059]圖7詳細說明了使用MoFlo XDP進行的囊泡分離和鑑定。
[0060]圖8是檢測樣品中囊泡的示意圖，其中使用微球平臺評估所希望的囊泡的存在或水平。圖8A是使用基於柱的過濾方法從血漿中分離囊泡的示意圖，其中所述分離的囊泡隨後使用微球平臺進行評估。圖8B是由於諸如超離心這樣的高速離心而導致囊泡膜壓縮的示意圖。圖8C是使用雷射檢測對結合於微球的囊泡進行檢測的示意圖。
[0061]圖9A詳細說明了囊泡生物印記區分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌症標誌物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標誌物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標誌物包括PCSA。PSMA可以與PCSA—樣使用。據發現所述測試對於PCa對比正常樣品具有96%的靈敏度和95%的特異性。圖9B在Y軸上示出了正常和前列腺癌患者中圖9A的囊泡標誌物的平均螢光強度(MFI)。
[0062]圖10是用於囊泡前列腺癌分析的決策樹的示意圖，以用於確定樣品對於前列腺癌是否為陽性。[0063]圖11顯示了根據所述決策樹針對前列腺癌的囊泡檢測分析相對於使用提高的PSA水平進行檢測的結果。
[0064]圖12說明了從對照和PCa樣品分離的囊泡中的miR-145的水平。
[0065]圖13A-13B詳細說明了使用微RNA確認來自基於囊泡的前列腺癌診斷分析的假陰性。圖13A詳細說明了使用囊泡中的miR分析以將假陰性轉換成真陽性的示意圖，由此改善了靈敏度。圖13B詳細說明了使用囊泡中的miR分析以將假陽性轉換成為真陰性的示意圖，由此改善特異性。miR-107(圖13C)和miR-141 (圖13D)的歸一化水平在Y軸上針對所述囊泡診斷分析所得的真陽性(TP)、所述囊泡診斷分析所得的真陰性(TN)、所述囊泡診斷分析所得的假陽性(FP)和所述囊泡診斷分析所得的假陰性(FN)示出。miR-107和miR-141可以用於圖13A和圖13B中所示的方案中。
[0066]圖14說明了結腸直腸癌(CRC)細胞系和患者樣品中的KRAS測序。樣品包括從細胞系(圖14B)或從患者的組織樣品(圖14D)獲得的基因組DNA，或從細胞系(圖14A)或患者的血漿樣品(圖14C)脫落的囊泡內的RNA有效負載獲得的cDNA。
[0067]圖15說明了來自人血漿的微RNA的免疫沉澱。圖1SA顯示了人血漿的各種部分中檢測到的平均miR-16量。「(Beads) 」是使用針對Argonaute2 (Ago2)、阿樸脂蛋白Al (ApoAl)、GW182和IgG對照的抗體共同免疫沉澱的miR-16的含量。「Dyna」是指使用Dynabea d蛋白G的免疫沉澱，而「Magna」是指Magnabind蛋白G珠。「supernt」是免疫沉澱反應的上清液中檢測的miR-16的量。對於詳細內容，參見實施例。圖15B與圖15A相同，除了檢測了 miR-92a。
[0068]圖16說明了用PE標記的抗-PCSA抗體和FITC標記的抗_Ago2抗體染色的複合物的流式分選。
[0069]圖17說明了人血漿樣品中PCSA/Ago2陽性複合物中微RNA的檢測。血漿樣品來自患有前列腺癌(PrC)的受試者或正常對照(正常)。圖17A顯示了來自人血漿的總循環微囊泡群體中的miR-22拷貝數。圖17B顯示了使用針對PCSA和Argonaute2(Ago2)的抗體來分選血漿源的複合物。分離RNA且miR-22的拷貝數在PCSA/Ago2雙陽性事件的群體中測定。圖17C顯示了對於每個血漿樣品通過流式細胞術計數的PCSA/Ago2雙陽性事件的數目。圖17D對於每個血漿樣品顯示miR-22拷貝數除以PCSA/Ago2陽性事件總數的結果。這獲得了每個PCSA/Ago2雙陽性複合物的miR-22拷貝數。
[0070]圖18說明了用抗-⑶9和/或抗-PCSA染色的循環微囊泡(cMV)的流式細胞分析。圖18A說明了使用⑶9和PCSA的標記抗體分析血漿源的cMV。圖18B說明了使用抗-⑶9和抗-PCSA的雙重免疫沉澱後雙陽性⑶9/PCSA cMV的富集。比較圖18A和圖18B之間區域R7中的雙陽性群體。圖18C說明了使用針對PCSA的標記抗體分析血漿源的cMV。圖18D說明了使用抗PCSA的抗體的單一免疫沉澱後PCSA陽性事件的富集。比較圖18C和圖18D之間區域R4中的群體。
[0071]圖19說明了各種不同血漿部分中miR-22的水平。圖19A說明了如通過ABITaqman檢測試劑盒(Assay ID#000398)測定的未改變血漿中的miR-22拷貝數。圖19B說明了如通過ABI Taqman檢測試劑盒測定的從患者血眾濃縮的總循環微囊泡群體中的miR-22拷貝數。圖19C說明了使用從抗-CD9柱釋放的起始材料在抗-PCSA柱上保留的miR-22拷貝數。圖19D說明了如使用基於珠的分析測定的相對於樣品匹配PCSAMFI的miR-22拷貝數。用於雙重免疫沉澱的癌症和正常輸入血漿的平均PCSA MFI信號分別是161.67和729.17。圖19E說明了輸入血漿中的miR-22拷貝數。圖19F說明了來自圖19E的輸入血漿的保留在抗-PCSA柱上的cMV的miR-22拷貝數。圖19G說明了如使用基於珠的分析測定的相對於樣品匹配PCSA MFI的miR-22拷貝數。用於單一 IP的癌症和正常血漿的平均PCSA MFI信號分別是69.17和526.5。
[0072]圖20A-C說明了使用源自PCSA和PSMA蛋白的水平以及與分離自血漿的cMV相關的miR-22和let7a微RNA的評分來區分PCa和正常(非PCa)樣品。圖20A顯示了對於正常和癌症樣品計算的評分的曲線圖。圖20B顯示了圖20A的數據，其中將正常分成正常組(無前列腺病症)、非典型組、炎症組和高等級前列腺上皮內瘤組(高等級PIN，或HGPIN)，並且將癌症分成確定為觀察等待(WW)或癌症的組。圖20C顯示了用該數據產生的ROC曲線。AUC 為 0.77。
[0073]圖21顯示了用於不同樣品群體中miR-920 (圖21A)和miR_450a(圖21B)的差異表達的曲線圖。樣品包含從血漿分離的PCSA表達cMV中的微RNA。與前列腺癌(「癌症」)和正常(「正常」)相比，miR-920在混雜疾病(即，高等級PIN( 「hgpin」)和炎性疾病(「炎症」))中過表達。與其他相比，miR-450在癌症中下調。
[0074]圖22說明了來自囊泡mRNA有效負載水平的微陣列譜分析的選定mRNA的減去原始背景的螢光值的點圖。在每個圖中，Y軸顯示了減去原始背景的螢光值(原始BGsub螢光)。X軸顯示了四個正常對照血漿和四個來自前列腺癌患者的血漿的點圖。所示的mRNA為 A2ML1 (圖 22A)、GABARAPL2(圖 22B)、PTMA(圖 22C)、RABACl (圖 22D)、S0X1 (圖 22E)和ETFB (圖 22F)。
[0075]圖23A-23B說明了從非復發前列腺癌和轉移性前列腺癌樣品分離的囊泡中miR-141 (圖23A)和miR-375 (圖23B)的水平，如X軸上所示。使用Taqman分析檢測了從囊泡分離的miR。P值顯示於·曲線下方。Y軸顯示了檢測的miR的拷貝數。
[0076]圖24A和24B說明了使用患者血樣來區分肺癌和正常(非肺癌)的微RNAmiR-497 ο Y-軸顯示了 0.1ml樣品中的miR-497拷貝數。在圖24A中，水平線表示1154個拷貝的拷貝數。在圖24B中，水平線表示1356的拷貝數。圖24C是用於通過檢驗循環微囊泡(cMV)中的miR-497水平區分非-小細胞肺癌和正常血漿樣品的受試者工作特徵(ROC)曲線。數據對應於圖24B。
[0077]圖25A是結合於載玻片的Vcap-衍生微囊泡的電子顯微照片。圖25B是Vcap-衍生的微囊泡的掃描電子顯微照片，而圖25C是結合於用聚-L-賴氨酸塗覆的聚苯乙烯珠的Vcap微囊泡的掃描電子顯微照片。圖2?說明了按照樣品收集實驗方案中詳細說明的處理成血漿的血液。
[0078]圖26說明了微RNA功能分析。圖26A顯示了標記的合成RNA分子261-266和含有感興趣的目標微RNA267的核蛋白複合物。圖26B證明了在被核蛋白複合物267識別時，在目標識別位點263處的合成RNA分子的切割，由此釋放標記265-266。圖26C-E說明了來自各種來源的輸入核蛋白複合物。
[0079]發明詳述
[0080]本文公開了用於表徵生物樣品(如，來自細胞培養物、生物體或受試者的樣品)的表型的方法和系統。可通過評估一種或多種生物標誌物表徵所述表型。所述生物標誌物可與囊泡或囊泡群體關聯，其為存在的囊泡表面抗原或囊泡有效負載。如本文所使用的，囊泡有效負載包含封裝於囊泡內的實體。囊泡相關的生物標誌物可包含膜結合的和可溶的生物標誌物。所述生物標誌物還可以是循環生物標誌物，諸如在體液中評估的核酸(例如，微RNA)或蛋白質/多肽，或其功能性片段。除非另行說明，本文中提及囊泡或生物標誌物組分而使用的術語「純化的」或「分離的」指的是這些組分從細胞或生物體中部分或完全地純化和分離。此外，除非另行說明，所稱的使用結合劑進行的囊泡分離包括將囊泡與所述結合劑結合，無論該結合是否使得所述囊泡與起始材料中的其它生物實體完全分離。
[0081]通過分析循環生物標誌物(如核酸生物標誌物)而表徵表型的方法描述於圖1A的方案6100A中，其為非限制性說明實例。在第一步驟6101中獲得生物樣品，如體液、組織樣品或細胞培養物。從所述樣品中分離核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。對這些核酸的評估可提供該表型的生物印記。通過對與目標表型(如疾病對比健康、治療前和治療後)相關的核酸取樣，可測定作為表型的指示的一種或多種核酸標誌物。本發明的各個方面涉及通過評估在所述樣品中存在的一種或多種核酸分子(如微RNA)而確定生物印記6105，其中所述生物印記對應於預定的表型6107。圖1B詳細說明了使用囊泡分離所述核酸分子的方案6100B。在一個實施例中，獲得了生物樣品6102，並且從所述樣品中分離一種或多種囊泡6104，如來自特定細胞源的囊泡和/或與特定疾病狀態相關的囊泡。通過表徵與所述囊泡關聯的表面抗原和/或測定所述囊泡中存在的組分(「有效負載」)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行說明，本文所使用的術語「抗原」通常指的是可被結合劑結合的生物標誌物，無論所述結合劑是抗體、適體、凝集素或用於所述生物標誌物的其它結合劑，並且無論這些生物標誌物是否在宿主中引發免疫應答。囊泡有效負載可以是蛋白質(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效負載包括信使RNA (mRNA)和微RNA (本文中亦稱為miRNA或miR)。根據所述囊泡的生物印記表徵表型6108。在本發明的另一個說明性方法中，方案6100A和6100B —起實施以表徵表型。在這樣的方案中，評估了囊泡和核酸(如微RNA)，從而表徵所述表型。
[0082]在一個相關的方面，本文提供了用於發現生物標誌物的方法，其包括評估一個樣品中的囊泡表面標誌物或有效負載標誌物以及將所述標誌物與另一樣品進行比較。在所述樣品之間區分的標誌物可用作本發明的生物標誌物。這些樣品可以來自受試者或受試者組。例如，所述組可以是，例如，對於給定疾病或失調的給定治療的已知反應者和非反應者。發現區分所述已知反應者和非反應者的生物標誌物提供了關於患者是否可能對治療(諸如治療劑，如藥物或生物製品)有反應的生物印記。
[0083]表型
[0084]本文公開了通過分析囊泡(諸如膜囊泡)來表徵個體的表型的產品和方法。表型可以為患者的任何可觀察的特徵或性狀，例如疾病或狀況、疾病階段或狀況階段、疾病或狀況的易感性、疾病階段或狀況的預後、生理狀態或對治療的反應。表型可以由受試者的基因表達及環境因素的影響以及這二者之間的相互作用引起，以及由對核酸序列的外遺傳修飾引起。
[0085]受試者中的表型可以通過從受試者獲得生物樣品並分析所述樣品中的一種或多種囊泡來表徵。例如，表徵受試者或個體的表型可以包括檢測疾病或狀況(包括症狀前的早期階段檢測)，確定疾病或狀況的預後、診斷或治療診斷，或者確定疾病或狀況的階段或進程。表徵表型還可以包括鑑定針對特定疾病、狀況、疾病階段或狀況階段的適當治療或治療效力、疾病進展的預測和可能性分析，特別是疾病重新發生、轉移擴散或疾病復發。表型還可以為狀況或疾病(例如癌症或腫瘤)的臨床上獨特的類型或亞型。表型的確定還可以為生理狀況的確定、器官危境或器官排斥(例如移植後)的評估。本文所述的產品和方法允許在個體的基礎上評估受試者，其可以提供在治療中的更有效和更經濟的決策的益處。
[0086]在一個方面，本發明涉及生物樣品的分析以鑑定生物印記，從而預測受試者是否可能對疾病或失調的治療有反應。表徵表型包括預測所述受試者的響應者/無響應者狀態，其中響應者對疾病的治療有反應而無響應者對所述治療無反應。可在所述受試者中分析囊泡並與已知對治療有反應或沒有反應的先前受試者的囊泡分析進行比較。如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對所述治療有反應的先前受試者更為接近，則所述受試者可表徵或預測為所述治療的響應者。類似地，如果所述受試者中的囊泡生物印記與對所述治療無反應的此前受試者更為接近，則所述受試者可表徵或預測為所述治療的無響應者。所述治療可以針對任意適當的疾病、失調或其它狀況。在與響應者/無響應者狀態相關的囊泡生物印記已知的情況下，所述方法可用於任意疾病情況中。
[0087]本發明所使用的術語「表型」可以指貢獻於囊泡生物印記的任何性狀或特徵，該生物印記使用本發明的方法而鑑定。例如，表型可以是患者可能對治療有反應的標識，或更廣義地其可為基於針對獲自受試者的樣品鑑定的生物印記的診斷、預後或治療診斷確定。
[0088]在一些實施方案中，所述的表型包括疾病或狀況，如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括腫瘤、贅生物或癌症的存在或發生腫瘤、贅生物或癌症的可能性。通過本文所述的產品或方法檢測或評估的癌症包括但不限於乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、增生性息肉、腺瘤、結腸直腸癌、高度異型增生(high grade dysplasia)、低度異型增生(1Wgradedysplasia)、前列腺增生、前列腺 癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌(例如成膠質細胞瘤)、血液惡性腫瘤、肝細胞癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)或胃癌。所述的結腸直腸癌可以為CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。所述的血液惡性腫瘤可以為B細胞慢性淋巴細胞性白血病、B細胞淋巴瘤-DLBCL、B細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣以及伯基特氏淋巴瘤。
[0089]所述表型可以是惡變前狀況，諸如光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維症、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性幹皮病、巴雷特食管、結腸直腸息肉或有可能發展成為惡性腫瘤的其它異常組織生長或病灶。諸如HIV和HPV的轉化型病毒感染也提供了可根據本發明進行評估的表型。
[0090]通過本發明的方法表徵的癌症可包括但不限於，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖細胞瘤、胚細胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限於，上皮腫瘤、鱗狀細胞腫瘤鱗狀細胞癌、基底細胞腫瘤基底細胞癌、移行細胞乳頭狀瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺體)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰島瘤(linitisplastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性腸肽瘤、膽管癌、肝細胞癌、囊性腺樣癌、闌尾類癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒細胞瘤、許特萊氏細胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、腎細胞癌、格拉維茨瘤(grawitztumor)、多發性內分泌腺瘤、子宮內膜腺瘤、附件和皮膚附件腫瘤、粘液表皮樣腫瘤、囊性、粘液性和漿液性腫瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、導管、小葉和髓質腫瘤、腺泡細胞腫瘤、複合上皮腫瘤、沃辛腫瘤(warthin' s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺腫瘤、性索間質瘤、泡膜細胞瘤、粒膜細胞瘤、卵巢含睪丸母細胞瘤、支持細胞睪丸間質細胞瘤、血管球瘤、副神經節瘤、嗜鉻細胞瘤、血管神經肌瘤、痣與黑色素瘤、黑素細胞痣、惡性黑色素瘤、黑色素瘤、結節性黑色素瘤、發育不良痣、惡性痣性黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤以及惡性肢端著色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限於，Askin』 s腫瘤、葡萄狀肉瘤(botryodies)、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內皮細胞瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤，其包括:腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促結締組織增生性小圓形細胞瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限於，慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞性白血病、淋巴眾細胞性淋巴瘤(Iymphoplasmacyticlymphoma)(諸如
Waldenstrom巨球蛋白血症)、脾邊緣區淋巴瘤、眾細胞骨髓瘤、眾細胞瘤、單克隆免疫球蛋白沉積病、重鏈病、亦稱為malt淋巴瘤的結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤(nmzl)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T細胞幼淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤，鼻型、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、母細胞性NK細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病/塞澤裡症候群(sezary syndrome)、原發性皮膚⑶30陽性T細胞淋巴組織增生性疾病、原發性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、非指定、間變性大細胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(結節性硬化、混合細胞性、富淋巴細胞、淋巴細胞耗盡或非耗盡)以及結節性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤。生殖細胞腫瘤包括但不限於，生殖細胞瘤、無性細胞瘤、精原細胞瘤、非生殖細胞瘤性生殖細胞瘤、胚胎癌、內胚竇腫瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺細胞瘤。胚細胞瘤包括但不限於，腎母細胞瘤、成神經管細胞瘤和視網膜母細胞瘤。其它癌症包括但不限於，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺癌(延髓和乳頭狀甲狀腺癌)、腎癌、腎實質癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、睪丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、腦腫瘤(·如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、髓母細胞瘤和外周神經外胚層腫瘤)、膽囊癌、支氣管癌、多發性骨髓瘤、基底細胞癌、畸胎瘤、視網膜母細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、精原細胞瘤、橫紋肌肉瘤、盧頁咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文氏肉瘤和漿細胞瘤。
[0091]在進一步的實施方案中，進行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌(包括小細胞癌(燕麥細胞癌)、小細胞/大細胞混合癌以及複合性小細胞癌)、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質細胞瘤、膠質母細胞瘤、肝細胞癌、乳頭狀癌腎癌、頭頸部鱗狀細胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或實體腫瘤。
[0092]在實施方案中，所述癌症包括急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病?』腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明腫瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstrom巨球蛋白血症或腎母細胞瘤。本發明的方法可用於表徵這些及其它癌症。因此，對表型的表徵可提供本文公開的癌症之一的診斷、預後和治療診斷。
[0093]所述的表型還可以為炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以為炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(⑶)、潰瘍性結腸炎(UC)、盆腔炎症、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發性硬化症、重症肌無力、I型糖尿病、類風溼性關節炎、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST症候群、硬皮病、風溼病、器官排 斥反應、原發性硬化性膽管炎或膿毒症。
[0094]所述的表型還可以包括心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風或局部缺血。所述的心血管疾病或狀況可以為高血壓、狹窄症、血管阻塞或血栓形成事件。
[0095]所述的表型還可以包括神經疾病，例如多發性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂症、雙相型障礙、抑鬱症、孤獨症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷頓病(HD)、唐氏症候群、腦血管疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經精神性系統性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風)、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞症候群。所述的表型還可以為諸如纖維肌痛、慢性神經病理性疼痛或周圍神經病理性疼痛的狀況。
[0096]所述的表型還可以包括感染性疾病，例如細菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或狀況可以為惠普爾氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結核病或流行性感冒。可以評估囊泡中的病毒蛋白質(例如HIV或HCV樣顆粒)從而表徵病毒狀況。
[0097]所述的表型還可以包括圍產期或妊娠相關的狀況(例如先兆性子癇或早產)、代謝疾病或狀況(例如與鐵代謝有關的代謝疾病或狀況)。例如，可以測定在囊泡中的鐵調素(hepcidin)從而表徵鐵缺乏。所述的代謝疾病或狀況還可以為糖尿病、炎症或圍產期狀況。
[0098]本發明的方法可以用於表徵這些疾病和失調和表徵可通過包含一個或多個生物標誌物的候選生物印記評價的其他疾病和失調。因此，表徵表型可以提供本文中公開的疾病和失調之一的診斷、預後或治療診斷。
[0099]在本發明的各個實施方案中，用於本文中公開的任何病症或疾病的生物印記可以包含幾個不同的標誌物類別之一中的一種或多種生物標誌物，其中所述類別包括以下的一種或多種:1)疾病特異性標誌物；2)細胞-或組織-特異性生物標誌物；3)囊泡-特異性標誌物(例如，一般囊泡生物標誌物)；4.血管生成-特異性生物標誌物；和5)免疫調節生物標誌物。本文中公開了所有這些標誌物的實例，並且它們是本領域普通技術人員已知的。此外，鑑定為在特定疾病或病症中具有作用的本領域已知的生物標誌物適於用作本發明的組合物和方法中的靶標。在進一步的實施方案中，這樣的生物標誌物可以全部是所有囊泡表面標誌物，或囊泡表面標誌物和囊泡有效負載標誌物(即，囊泡包裹的分子)的組合。此外，如本文中所述，所評估的生物樣品可以是任何生物流體，或可以包含這樣的生物流體內存在的單個組分(例如，囊泡、核酸、蛋白質或其複合物)。
[0100]受試者
[0101]可通過分析從受試者獲得的生物樣品中的一種或多種囊泡(如多種囊泡)來確定受試者的一種或多種表型。`受試者或患者可以包括但不限於哺乳動物，例如牛、鳥、犬、馬、貓、綿羊、豬或靈長動物(包括人及非人靈長動物)。受試者還可以包括:由於瀕危而變得重要的哺乳動物，例如西伯利亞虎；或者具有經濟意義的動物(例如用於人消費的農場飼養動物)，或對人類而言具有社會意義的動物(例如作為寵物或在動物園中飼養的動物)。此類動物的實例包括但不限於:食肉動物，例如貓和狗；豬，包括畜養豬、食用豬和野豬；反芻動物或有蹄類動物，例如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛、駱駝或馬。此外，還包括瀕危的或在動物園中飼養的鳥；以及禽類，和更特別的是家養的禽類，即，家禽，例如火雞和雞、鴨、鵝、珍珠雞。還包括家養的豬和馬(包括賽馬)。此外，與商業活動有關的任何動物種類也都被包括在內，例如與農業、水產業和其它活動有關的動物，所述行業中為了經濟生產率和/或食物鏈的安全而常規實施疾病監測、診斷和療法的選擇。
[0102]所述的受試者可以患有先前存在的疾病或狀況，例如癌症。或者，所述的受試者可以並未患任何已知的先前存在的狀況。所述的受試者還可以對現有或過去的治療是非反應性的，例如對癌症的治療是非反應性的。
[0103]樣品
[0104]得自所述受試者的生物樣品可以為任何體液或生物流體。例如，所述的生物樣品可以為任何生物流體包括但不限於外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管肺抽吸液或其它灌洗液。生物樣品還可以包括囊胚腔、臍帶血或母體循環血(其可以為胎兒來源或母體來源的)。所述的生物樣品還可以為組織樣品或組織活檢樣品，從中可獲得囊泡和其它循環生物標誌物。例如，可以培養得自樣品的細胞，並且從所述培養物中分離囊泡(例如參見實施例1)。在各個實施方案中，可由這些生物樣品直接評估本發明公開的生物標誌物和/或生物印記(如，對核酸或者多肽生物標誌物或其功能性片段的存在或水平的鑑定)，其使用各種方法，諸如，從血液、血漿、血清或任意前述生物樣品中提取核酸分子，使用蛋白質或抗體陣列鑑定多肽(或功能性片段)生物標誌物，以及本領域中已知用於鑑定和評估核酸和多肽分子的其它陣列、測序、PCR和蛋白質組技術。此外，可以首先分離或富集這些樣品中存在的一種或多種成分，並且進一步處理以評估選定生物標誌物的存在或水平，例如，評估給定的生物印記。例如，可以在針對蛋白質和/或核酸生物標誌物對微囊泡進行分型之前，從樣品分離微囊泡。
[0105]表1列出了疾病、狀況或生物學狀態的說明性實例，以及可以對其中的囊泡進行分析的生物樣品的相應列表。
[0106]表1:針對各種疾病、狀況或生物學狀態，用於囊泡分析的生物樣品的實例
[0107]
[0108]
【權利要求】
1.一種方法，其包括: (a)測定生物樣品中一種或多種生物標誌物的存在或水平，其中所述一種或多種生物標誌物包括一種或多種選自表5的生物標誌物；和 (b)鑑定包括所述一種或多種生物標誌物的存在或水平的生物印記。
2.權利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標誌物選自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517木、miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179 及其組合。
3.權利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標誌物選自miR-22、let7a、miR-141、miR-920、miR-450a 及其組合。
4.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自表20-24任一個中的基因組成的組的信使RNA (mRNA)及其組合。
5.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自A2ML1、ΒΑΧ、C10orf47、Clorfl62, CSDA, EIFC3、ETFB, GABARAPL2、GUKU GZMH、HIST1H3B、HLA-A,HSP90AA1、NRGN、PRDX5、PTMA, RABACl、RABAGAP1L、RPL22、SAP18、SEPffU SOXl 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
6.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自A2ML1、GABARAPL2、PTMA, RABACl、SOXl、EFTB 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
7.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自CA-125、CA19-9、c-反應蛋白、CD95、FAP-1、EGFR、EGFRvII1、阿樸脂蛋白Al、阿樸脂蛋白CII1、肌紅蛋白、腱生蛋白C、MSH6、封閉蛋白-3、封閉蛋白-4、小窩蛋白-1、凝血因子II1、CD9、CD36、CD37、CD53、CD63、CD81、CD136、CD147、Hsp70、Hsp90、Rabl3、橋粒芯膠蛋白-1、EMP_2、CK7、CK20、GCDF15、CD82、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG-E8、HLA-DR、miR200 微 RNA、miR_200c 及其組合。
8.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自CA-125、CA19-9, c_反應蛋白、CD95、FAP-1及其組合。
9.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-107、hsa_miR-301a、hsa-miR-484、hsa-miR-625* 及其組合。
10.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自hsa-miR-582-3p、hsa-miR_20a*、 hsa-miR-375、 hsa_miR-200b、 hsa-miR-379、 hsa-miR-572、hsa-miR-513a_5p、 hsa-miR-577、 hsa_miR-23a*、 hsa-miR-1236、 hsa-miR-609、hsa-miR-17*、hsa_miR-130b、hsa-miR-619、hsa-miR-624*、hsa-miR-198 及其組合。
11.權利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標誌物包括miR-497。
12.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自AQP2、BMP5、C16orf86、CXCLl3、DST、ERCC1、GNA01、KLHL5、MAP4KU NELL2、PENK、PGF、P0U3F1、PRSS21、SCMLl、SEMGl、SMARCD3、SNAI2, TAF1C、TNNT3 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
13.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自ADRB2、ARG2、C22orf32、CYorf 14, EIFlAY, FEV, KLK2、KLK4、LRRC26、MAOA、NLGN4Y、PNPLA7、PVRL3、SIM2,SLC30A4、SLC45A3、STX19 、TR頂36、TRPM8 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
14.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自ADRB2、BAIAP2L2、C19orf33、CDX1、CEACAM6、EEF1A2、ERN2、FAMl 10B、F0XA2、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MIPOLl、SLC45A3、SPDEF, TRIM3U TRIM36, ZNF613 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
15.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自ASTN2、CAB39L、CRIP1、FAMlIOB、FEV、GSTP1、KLK2、KLK4、L0C389816、LRRC26、MUC1、PNPLA7、S頂2、SLC45A3、SPDEF, TRIM36, TRPV6、ZNF613 及其組合的信使 RNA (mRNA)。
16.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括選自miRs-26a+b、miR-15、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424、miR-206、miR-342_5p、miR-186、miR-1271、miR-600、miR-216b、miR-519 家族、miR-203 及其組合的微 RNA。
17.—種方法,其包括: (a)從生物樣品分離一種或多種核酸-蛋白質複合物； (b)用所述一種或多種核酸-蛋白質複合物確定一種或多種核酸生物標誌物的存在或水平；和 (C)鑑定包括所述一種或多種核酸生物標誌物的存在或水平的生物印記。
18.權利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白質複合物包含括選自一種或多種Argonaute 家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB、ILF2、NCL(核仁素)、NPM1 (核磷蛋白)、RPL10A、RPL5、RPLP1、RPS12、RPS19、SNRPG、TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白A、apo A_1、apo A_I1、apo A_IV、apo A_V、阿樸脂蛋白B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白 C、apo C-1、 apo C_I1、apo C-III、 apo C_IV、阿樸脂蛋白D (ApoD)、阿樸脂蛋白E (ApoE)、阿樸脂蛋白H(ApoH)、阿樸脂蛋白L、APOLl、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6、APOLDl及其組合的一種或多種蛋白質。
19.權利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白質複合物包含選自一種或多種Argonaute家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)及其組合的一種或多種蛋白質。
20.權利要求17的方法，其中所述核酸-蛋白質複合物包含一種或多種選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合的蛋白質。
21.權利要求17的方法,其中所述一種或多種核酸包括一種或多種微RNA。
22.權利要求21的方法，其中所述一種或多種微RNA包括表5中的微RNA。
23.權利要求21的方法,其中所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自miR-22、miR-16、miR-148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合的微 RNA。
24.權利要求21的方法，其中所述核酸-蛋白質複合物包含一種或多種選自Ago2、阿樸脂蛋白1、GW182(TNRC6A)及其組合的蛋白質；並且所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自miR-16和miR-92a及其組合的微RNA。
25.—種方法,其包括: (a)檢測來自生物樣品的微囊泡群體中的一種或多種蛋白質生物標誌物； (b)確定與所檢測的微囊泡群體相關的一種或多種核酸生物標誌物的存在或水平；和 (C)鑑定包括所述一種或多種核酸的存在或水平的生物印記。
26.權利要求25的方法，其中將所述一種或多種核酸生物標誌物的水平相對於所述一種或多種蛋白質生物標誌物的水平標準化。
27.權利要求25的方法,其中所述一種或多種生物標誌物包括一種或多種選自PCSA、Ago2、⑶9及其組合的蛋白質。
28.權利要求25的方法,其中所述一種或多種核酸生物標誌物包括一種或多種選自miR-22、miR-16、miR-148a、miR_92a、miR-451、let7a 及其組合的微 RNA。
29.權利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括PCSA和Ago2;並且所述一種或多種核酸生物標誌物包括miR-22。
30.權利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括PCSA和/或⑶9；並且所述一種或多種核酸生物標誌物包括miR-22。
31.權利要求25的方法，其中所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括PCSA;並且所述一種或多種核酸生物標誌物包括選自表22-24任一個中的信使RNA (mRNA)。
32.權利要求25的方法，其中所述生物印記包括從所述一種或多種蛋白質生物標誌物和一種或多種核酸生物標誌物的水平的比率計算的評分。
33.權利 要求32的方法，其中所述一種或多種蛋白質生物標誌物包括PCSA和PSMA，並且所述一種或多種核酸生物標誌物包括miR-22和let7a。
34.權利要求32的方法，其中計算評分包括取以下的總和: (a)微囊泡亞群體中miR-22有效負載的水平除以與微囊泡亞群體相關的PCSA蛋白質的水平的第一倍數； (b)微囊泡亞群體中let7a有效負載的水平除以與微囊泡亞群體相關的PCSA蛋白質的水平的第二倍數；和 (c)與微囊泡亞群體相關的PSMA蛋白的水平的第三倍數。
35.權利要求34的方法，其中計算評分包括所述總和的單調變換。
36.權利要求34的方法，其中第一倍數是10。
37.權利要求34的方法，其中第二倍數是10。
38.權利要求34的方法，其中第三倍數是I。
39.前述任一項權利要求的方法，進一步包括將所述生物印記與參照生物印記進行比較，其中所述比較用於表徵癌症。
40.權利要求39的方法，其中所述參照生物印記來自未患癌症的受試者。
41.權利要求39的方法，其中所述表徵包括鑑定受試者中癌症的存在或風險，或鑑定受試者中癌症是轉移性的或侵襲性的。
42.權利要求39的方法，其中所述比較步驟包括確定生物印記是否相對於參照生物印記有改變，由此提供癌症的預後、診斷或治療診斷確定。
43.前述任一項權利要求的方法，其中所述生物樣品包括體液。
44.權利要求43的方法，其中體液包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。
45.前述任一項權利要求的方法，其中所述生物樣品包括尿液、血液或血液衍生物。
46.權利要求1-43任一項的方法，其中所述生物樣品包括細胞培養物。
47.權利要求1-43任一項的方法，其中所述生物樣品包括組織樣品。
48.前述任一項權利要求的方法，其中所述生物樣品含有一種或多種微囊泡。
49.權利要求48的方法，其中所述一種或多種生物標誌物與所述一種或多種微囊泡相關。
50.權利要求48的方法，其中所述一種或多種微囊泡具有20nm至2000nm的直徑。
51.權利要求48的方法，其中所述一種或多種微囊泡具有20nm至200nm的直徑。
52.權利要求48的方法，其中所述一種或多種微囊泡經受尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、免疫分析、微流體分離、流式細胞分析或其組合。
53.權利要求48的方法，其中將所述一種或多種微囊泡接觸一種或多種結合劑。
54.權利要求53的方法，其中所述一種或多種結合劑包括核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PM)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標記劑、化學化合物或其組合。
55.權利要求53的方法,其中所述一種或多種結合劑用於捕獲和/或檢測一種或多種微囊泡。
56.權利要求53的方法，其中所述一種或多種結合劑結合一種或多種微囊泡上的一種或多種表面抗原。
57.權利要求56的方法,`其中所述一種或多種表面抗原包括一種或多種蛋白質。
58.權利要求57的方法，其中所述一種或多種蛋白質包括⑶9、⑶63、⑶81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam中的一種或多種。
59.權利要求57的方法，其中所述一種或多種蛋白質包括四跨膜蛋白、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG_E8 或表 3 中的蛋白質中的一種或多種。
60.權利要求57的方法,其中所述一種或多種蛋白質包括表3-5任一個中的一種或多種蛋白質。
61.權利要求53的方法,其中所述一種或多種結合劑用於捕獲所述一種或多種微囊泡。
62.權利要求61的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括所述一種或多種捕獲的微囊泡內的有效負載。
63.權利要求62的方法，其中所述有效負載包含一種或多種核酸、肽、蛋白質、脂質、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
64.權利要求63的方法，其中所述核酸包括一種或多種DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
65.權利要求62的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包括mRNA。
66.權利要求39的方法，其中所述癌症包括急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎性瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明的癌症；類癌瘤；原發部位不明的癌瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症jwilm』 s腫瘤。
67.從屬於權利要求1-6、9-10或12-38任一項的權利要求39的方法，其中所述癌症包括前列腺癌。
68.從屬於權利要求1、11、15、17-22、25或26任一項的權利要求39的方法，其中所述癌症包括肺癌。`
69.從屬於權利要求1、13、17-22、25或26任一項的權利要求39的方法，其中所述癌症包括乳腺癌。
70.從屬於權利要求1、14、17-22,25或26任一項的權利要求39的方法，其中所述癌症包括結腸直腸癌。
71.從屬於權利要求1、7-8、17-22、25或26任一項的權利要求39的方法，其中所述癌症包括卵巢癌。
72.前述任一項權利要求的方法，其中所述方法在體外進行。
73.用於實施前述任一項權利要求的方法的試劑的用途。
74.—種包含配置為實施權利要求1-72任一項的方法的試劑的試劑盒。
75.權利要求74的試劑盒，其中所述試劑是能夠結合表3-5、9-11、16-27、29或31-32任一個中的至少一種生物標誌物的結合劑。
76.分離的PCSA+囊泡。
77.權利要求76的囊泡，包含一種或多種選自miR-22、let7a、miR-141、miR-182、miR-663、miR-155、mirR-125a_5p、miR-548a_5p、miR-628_5p、miR-517*、miR_450a、miR-920、hsa_miR-619、miR_1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR-376a、miR-542_5p、miR-30b*、miR-1179 及其組合的微 RNA。
78.權利要求76的囊泡，包含一種或多種選自表20-24任一個中的信使RNA(mRNA)。
79.一種組合物，其包含: (a)寡核苷酸，其包含栓繫於基底的第一部分，與目標微RNA序列至少75%互補的第二部分，和包含標記的第三部分，其中第二部分位於第一和第三部分之間；和
(b)微RNA。
80.權利要求79的方法，其中所述基底包括平面基底、柱或珠。
81.權利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分與(b)中的微RNA至少75%、80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 互補。
82.權利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第二部分與目標微RNA序列至少80%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 互補。
83.權利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是間接標記的。
84.權利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是生物素化的。
85.權利要求83的方法，其中所述標記包括抗生蛋白鏈菌素。
86.權利要求79的方法,其中所述寡核苷酸的第三部分的標記包括突光標記、放射性標記或酶標記。
87.權利要求79的方法，其中所述標記包括藻紅蛋白(PE)。
88.權利要求79的方法，其中所述寡核苷酸的第三部分是間接標記的。
89.權利要求79的方法，其中(b)中的所述微RNA處於與蛋白質的複合物中。
90.權利要求89的方法,其中所述蛋白質選自Argonaute家族成員、Agol、Ago2、Ago3、Ago4、GW182 (TNRC6A)、TNRC6B、TNRC6C、HNRNPA2B1、HNRPAB, ILF2、NCL (核仁素)、NPMl (核磷蛋白)、RPLlOA、RPL5、RPLPl、RPS12、RPS19、SNRPG, TR0VE2、阿樸脂蛋白、阿樸脂蛋白 A、apo A-1> apo A-1I> apo A-1V、apo A-V、阿樸脂蛋白 B、apo B48、apo B100、阿樸脂蛋白 C、apo C-1、apo C-11、apoC-1I1、apo C-1V、阿樸脂蛋白 D(ApoD)、阿樸脂蛋白 E(ApoE)、阿樸脂蛋白 H(ApoH)、阿樸脂蛋白 L、AP0L1、AP0L2、AP0L3、AP0L4、AP0L5、AP0L6 和 AP0LD1。
91.權利要求89的方法,其中所述蛋白質選自Agol、Ago2、Ago3和Ago4。
92.權利要求89的方法，其中所述蛋白質包括重組蛋白質。
93.權利要求92的方法，其中所述蛋白質包括Ago2。
94.權利要求79的方法，其中所述組合物包括生物樣品。
95.權利要求79的方法，其中所述微RNA從生物樣品分離。
96.權利要求94或95的方法，其中所述生物樣品包括體液。
97.權利要求96的方法，其中所述體液包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。
98.權利要求96的方法，其中所述體液包括尿液、血液或血液衍生物。
99.權利要求95的方法，其中所述微RNA在與蛋白質的複合物中分離。
100.—種方法，其包括: (i)提供權利要求79-99任一項的組合物； (?)在允許所述微RNA結合所述寡核苷酸的條件下孵育所述組合物；和 (iii)檢測標記從基底切割的量。
101.權利要求100的方法，其中檢測標記從基底切割的量包括檢測在步驟(ii)之前和之後接觸基底的標記的量。
102.權利要求100的方法，其中標記從基底切割指示與微RNA複合的蛋白質的存在。
103.權利要求102的方法,其中所述蛋白質選自Agol、Ago2、Ago3和Ago4。
104.權 利要求100的方法，其中實時觀察標記從基底切割的量。
【文檔編號】G01N33/53GK103797131SQ201280039945
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年6月14日 優先權日:2011年6月16日
【發明者】K·布朗, T·保羅斯基, D·斯佩特茨勒 申請人:卡裡斯生命科學盧森堡控股有限責任公司