海洋芽孢桿菌可溼性粉劑、及其製備和應用的製作方法

2023-12-03 14:03:06 1

專利名稱：：海洋芽孢桿菌可溼性粉劑、及其製備和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物農藥可溼性粉劑及其製備和應用。更具體地說，本發明涉及一種海洋芽孢桿菌可溼性粉劑及其製備方法，以及該海洋芽孢桿菌可溼性粉劑在防治植物病害方面的應用。背景近年來，隨著環境的惡化、作物連作以及單一種植，植物病害的發生越來越嚴重，這已經嚴重影響了整個農業的發展。並且為了經濟利益，農民通常採用縮短用藥間隔時間，加大用藥量和用藥種類的方法來控制植物病害，同時又用超常規的激素用量來降低化學農藥對植物本身的傷害。超量的農藥和激素對蔬菜和瓜果造成嚴重的汙染，其急性毒性和潛在的致癌作用對人體的健康構成很大的威脅。因此，農業部決定在全國範圍內實施"無公害食品行動計劃"，而使用無公害農藥是實施這一目標的關鍵措施。在無公害農藥的開發過程中，微生物活菌製劑的開發受到越來越多的重視，其製劑中的有效成分一一活菌不僅可以直接對病原菌產生拮抗或抑制作用，而且在植物體內定植的活菌可以持續不斷地分泌活性物質，從而達到殺菌或抑菌的目的，從而使產品的防病持續期延長。並且來自自然界的活菌對環境友好，滿足綠色環保的要求。而到目前為止，雖然以海洋中的活性物質為有效成分的產品較多，但大部分是以提取海產品中的殼聚糖作為肥料，而將海洋中的微生物開發成農藥卻未見報導。更無關於海洋芽孢桿菌開發成農藥的報導。
發明內容本發明的目的是為了提供一種可防治植物病害的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑。本發明對來源於海洋的細菌B-9987進行了分離和鑑定，然後將該海洋芽孢桿菌B-9987進行培養，獲得高活菌含量、高芽孢率的發酵液，再將其與載體和助劑混合，經過乾燥、粉碎得到一種可溼性粉劑，該可溼性粉劑可有效防治植物病害，從而完成了本發明。本發明第一方面提供了海洋芽孢桿菌B-9987的分離和鑑定。本發明的第二方面提供了海洋芽孢桿菌B-9987培養工藝的優化，以期獲得較為合適的可以進行可溼性粉劑生產的海洋芽孢桿菌B-9987發酵液。本發明第三方面提供了一種製備上述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的方法，該方法包括將海洋芽孢桿菌發酵液、載體、助劑混合，得到的混合物，乾燥後粉碎，得到所述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑。所述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑中的B-9987活菌含量為lxl06cfu/glxl012CfWg;所述載體選自白碳黑、硅藻土、澱粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土和高嶺土中的一種或多種；所述助劑選自十二烷基苯磺酸鈉、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉的一種或多種。所述的可溼性粉劑的乾燥方法包括通過靜態(如減壓蒸發等)或動態(如噴霧乾燥、氣流乾燥等)的方式來乾燥，後續的粉碎包括機械或氣流粉碎。本發明第四方面涉及本發明的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑在防治植物病害中的應用。本發明首次將海洋芽孢桿菌B-9987開發成微生物農藥可溼性粉劑，其對病害的防治範圍廣、防效高。該可溼性粉劑不僅可以單獨使用，而且也可以和其它微生物農藥和助劑復配來使用。具體實施方式本發明提供了一種海洋芽孢桿菌可溼性粉劑，它由海洋芽孢桿菌B-9987、載體和助劑組成，所述海洋芽孢桿菌B-9987在可溼性粉劑中的活菌含量為lxl06cfu/glxl012cfb/g。在一個較佳的實施方案中，所述載體選自白碳黑、硅藻土、澱粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土和高嶺土中的一種或多種；所述助劑選自十二垸基苯磺酸鈉、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉的一種或多種。本發明中所用的海洋芽孢桿菌為海洋芽孢桿菌B-9987，其保藏號為CGMCCNo.2095。上述助劑在可溼性粉劑中的重量百分比通常為0.01%10%，較佳為0.1%5%，更佳為1%3%。本發明上述的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑可用以下方法獲得，該方法包括將含有海洋芽孢桿菌活菌的發酵液、載體和助劑混合，得到的混合物，通過合適的方式乾燥後粉碎(包括靜態(如減壓蒸發等)和動態(如噴霧乾燥、氣流乾燥等)乾燥，粉碎包括機械或氣流粉碎)，即可得到所述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑。本發明所用的術語"發酵液"、"活菌"、"載體"、"助劑"、"可溼性粉劑"等具有本領域技術人員通常熟知且承認的含義。在一個較佳的實施方案中，所述海洋芽孢桿菌活菌來自海洋芽孢桿菌發酵液，所述發酵液含有芽孢狀態的海洋芽孢桿菌活菌、非芽孢狀態的海洋芽孢桿菌活菌、和/或所述海洋芽孢桿菌的代謝產物。所述發酵液可通過在適合生長的條件下培養海洋芽孢桿菌(具體例如上述的海洋芽孢桿菌B-9987)，使其生長至一定的濃度來獲得。用於培養本發明中菌株的培養基中的營養源沒有特別的限制。本領域技術人員可以根據公知的技術來選擇合適的碳源、氮源和其它營養源。例如，碳源可以是澱粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米粉等。氮源可以是蠶蛹粉、大豆粉、花生餅粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麥皮、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其它有機或無機含氮化合物。另外，培養基中還可適當加入一些無機鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽如磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通常可採用各種已知的常規培養基，如LB瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養基和牛肉浸汁瓊脂培養基等。培養本發明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉速等條件沒有特別嚴格的限制，只要該條件適合該菌的生長即可。在培養時可採用豆油、泡敵等消泡劑進行消泡。在一些較佳的實施方案中，pH宜控制在5.58.0之間，培養溫度宜在2035"之間。培養時間通常在12h200h之間，最終的菌濃度通常可高達5xl0、fo/mllxl0"cfo/ml。在本發明的一個較佳的實施方案中，宜使所述發酵液中含有較高含量的芽孢，以賦予微生物耐高溫的特性，以便在後續的乾燥和粉碎過程中獲得更高的活菌含為了獲得含芽孢的海洋芽孢桿菌發酵液，通過調節培養過程中的氣液比、轉速來改變培養環境的溶氧水平(DO)，通過延長培養時間，可以使培養過程中的活菌芽孢率在0100%之間變化，較佳的是使活菌芽孢率在10%以上，更佳的是在30%以上，還要佳的是在50%以上。在本發明的一個較佳的實施方案中，所述海洋芽孢桿菌B-9987通過以下方法培養獲得在含有碳源、氮源、無機鹽的培養基中，在通氣量控制在氣液比為0.2:12:1、轉速在100r/min或以上，培養所述海洋芽孢桿菌24小時以上，其中所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、澱粉和大米粉中的一種或幾種，所述氮源選自蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和大豆粉中的一種或幾種，所述無機鹽包括常規的無機鹽(如MgS04、(NH4)2S04、MgCl2、KCl、KH2P04、NaCl、K2HPO^PCaC03)。在一個較佳的實施方案中，所述培養基具有以下組成葡萄糖0.01~1.5%、蔗糖0.01~1.0%、酵母粉0.05~1.0%、蛋白粉0.02~1.2%、MgCl20.001~0.15%、KCl0.001~0.5%、KH2P040.001~0.15%禾卩NaCl0.01~2%。上述列舉的這些參數只是實現本發明的較佳方案。因此，本領域技術人員在上述範圍以外選擇合適的培養條件也能獲得本發明的發酵液。所述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑中的載體和助劑對本發明的海洋芽孢桿菌活菌體、發酵液以及可溼性粉劑防治植物病害的生物效果無影響。所述載體可選自白碳黑、硅藻土、澱粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土和高嶺土中的一種或多種。助劑包括十二垸基苯磺酸鈉、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉的一種或多種。上述助劑在可溼性粉劑中的重量百分比皆為0.01%10%。上述這些載體和助劑均可市售購得。載體細度要求通過44pm篩的比例大於95%，更佳為大於98%。為了便於長期貯存，將發酵液與載體、助劑按照一定的比例混合後得到的混合物，乾燥後粉碎來試製可溼性粉劑。其乾燥和粉碎步驟採用本領域中的常規技術。為了能使海洋芽孢桿菌可溼性粉劑中的有效成分儘可能保持較高的含量和較長的貯存期，含有海洋芽孢桿菌的可溼性粉劑含水量的重量百分比宜控制在小於20%，更佳為小於15%。在一個較佳的實施方案中，本發明涉及的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑其活菌含量為lxl06cfo/glxl0i2cfWg，細度(通過44pm篩)大於95%，懸浮率大於34%，潤溼時間小於180s，滿足國家對農藥可溼性粉劑的要求。本發明中涉及的防治植物病害的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑使用方法就是農業中常用的灌根和噴霧的方法。上述用藥方法，如將可溼性粉劑稀釋一定倍數後對植物進行灌根的方法和稀釋後利用噴霧設備進行噴霧的方法是本領域中的常規技術。本發明者還發現，本發明的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑可防治植物菌核病、灰黴病、白粉病、紋枯病、赤黴病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜黴病、斑枯病、葉黴病、早疫病、黑斑病。本發明的內容、優點和目的可從下文進一步詳細描述中清楚地得知。實施例1海洋芽孢桿菌B-9987的篩選和鑑定本實施例描述了海洋芽孢桿菌B-9987的分離篩選和鑑定。從海洋環境中分離得到402株海洋真菌，1032株海洋細菌，利用稻瘟黴96孔板篩選模型對其無細胞濾液進行生物活性篩選，經過初篩和復篩得到活性強的菌株45株，其中海洋真菌13株、海洋細菌32株。選擇了3株活性最強的海洋細菌測試了其菌株產生的活性物質的遺傳和熱穩定性。選擇能產生活性高、穩定性好的代謝物質的一株菌株，命名為B-9987。對分離得到的菌株B-9987進行了鑑定。染色按本領域常規方法進行革蘭氏染色。形態特徵於改良的2216E培養基、加海水的LB瓊脂培養基上28'C培養2天，取菌體塗片，染色後用光學顯微鏡觀察菌體形態。培養特徵在上述培養基培養2天後觀察菌落形成及顏色。生理生化特徵參照《Bergey，sManualofSystematicBacteriology》方法和《常見細菌系統鑑定手冊》進行。實驗結果(1)革蘭氏染色結果表明，B-9987菌株為革蘭氏陽性。(2)菌落特徵菌落白色至淺黃色，不透明，有皺褶，邊緣鋸齒狀。(3)形態和培養特徵B-9987菌株菌體直杆狀或近直杆狀，周生鞭毛，有芽孢，芽孢圓形，0.53.0^nxl.411.5pm，能運動；好氧生長，兼性厭氧，在上述培養基無可溶性色素。(4)生理生化特徵B-9987菌株的生理生化特徵見表1。tableseeoriginaldocumentpage7(5)根據上述分析和鑑定結果，將其與細菌鑑定手冊相比較，將B-9987菌株鑑定為海洋芽孢桿菌(5flc/〃wsmaWm^)。該菌株已經於2007年6月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京市海澱區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCCNo.2095。實施例2海洋芽孢桿菌發酵液中芽孢培養工藝本實施例通過改變如下發酵參數來控制海洋芽孢桿菌發酵液中的活菌芽孢率通氣量、轉速、培養時間。結果與分析本部分發明考察了通氣量和轉速的改變以及培養時間的延長對海洋芽孢桿菌產芽孢的影響。發酵結果表明，當海洋芽孢桿菌在上述優化後的培養基(葡萄糖0.011.5%、蔗糖0.01~1.0%、酵母粉0.05~1.0%、蛋白粉0.02~1.2%、MgCl20.001~0.15%、KC10.0010.5%、KH2PO40.0010.15。/o和NaC10.012。/o組成)中發酵時，氣液比(每小時通氣量(m3)與發酵液體積(m3)的比)由0.2:1調整為2:1時，發酵不同時間後的芽孢率如下表2。表2:不同通氣量對芽孢形成的影響tableseeoriginaldocumentpage8由表2可知，通氣量加大時，芽孢形成時間提前。在2:1的氣液比下，48h就可觀察到有芽孢形成，在144h時，其芽孢率可達100%;而0.2:1的氣液比在72h才觀察到有芽孢形成，在144h時，其芽孢率才為80%。由此可知，加大通氣量，可以縮短芽孢形成的時間，提高芽孢率。由表2數據也可知，發酵時間的延長有利於芽孢率的提高。發酵罐攪拌速度對海洋芽孢桿菌發酵液中活菌芽孢率(以培養96h為參考)的影響見表3。由該表可見，在其它發酵條件不變的情況下，當攪拌轉速逐漸升高時，發酵液中的活菌芽孢率逐漸提高。由此可見，提高攪拌速度可以提高芽孢率。表3:不同攪拌轉速對芽孢形成的影響tableseeoriginaldocumentpage8綜合該部分的結果，海洋芽孢桿菌芽孢培養工藝為在優化後的培養基中，接種B-9987後，在2035'C之間培養，通氣量控制在氣液比0.2:12:1，轉速控制在100r/min或以上，培養時間大於96h，即可得到合適的B-9987發酵液。實施例3海洋芽孢桿菌可溼性粉劑載體的選擇本實施例從白碳黑、硅藻土、澱粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土及其混合物中篩選適合海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的載體，以產品中的活菌含量高低作為篩選標準。海洋芽孢桿菌B-9987按照實施例2所述的培養工藝進行培養，得到海洋芽孢桿菌發酵液。然後將上述載體逐步加入所述海洋芽孢桿菌發酵液中，混合至載體完全潤溼但無明顯游離水後，將混合物放在烘箱中乾燥後碾磨，得到細粉。由於不同載體吸附能力不同，因此單位重量的載體吸附的發酵液重量不盡相同。測定乾燥前後樣品的活菌量。活菌含量的測定採用本領域技術人員通常熟知且承認的稀釋塗平板法。結果與分析本發明利用同一批海洋芽孢桿菌的發酵液和不同載體混合後製備成製劑，乾燥後測定其活菌含量，白碳黑、硅藻土、澱粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土和高嶺土作為載體製備的製劑中的活菌含量都高達lX108cfU/g以上。因此從製劑的活菌含量來看，上述載體(白碳黑、硅藻土、澱粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土和高嶺土)均適合於作為製備可溼性粉劑的載體。實施例4海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的製備下面對海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的製備進行說明，並對製備出的可溼性粉劑參照國家標準進行了各項指標的測定。製備工藝流程海洋芽孢桿菌發酵液和載體(實施例3中的載體)、助劑(十二烷基苯磺酸鈉、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉中的1種或多種)混合後(助劑在可溼性粉劑中的總重量百分比為0.01%10%)，通過合適的途徑進行乾燥，如減壓乾燥、噴霧乾燥、氣流乾燥等動態乾燥方法以及室溫晾乾、烘房乾燥等靜態乾燥方法，得到的固體再通過機械或氣流粉碎，即可得到海洋芽孢桿菌可溼性粉劑。對得到的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑按照國家要求測定各項指標，結果如表4。表4:海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的各項指標測定tableseeoriginaldocumentpage9潤溼時間(s)98g80細度(通過44nm篩)(％)99.0^95由表4的結果可知，得到的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑各項指標都符合農藥可溼性粉劑的國家標準。實施例5海洋芽孢桿菌可溼性粉劑對植物病害的防治利用實施例4中製備的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑，分別在山東、上海、河北、新疆、浙江等地進行了防治植物病害的初步藥效試驗。海洋芽孢桿菌可溼性粉劑稀釋500倍後對根部病害(如立枯病)灌根，對葉部病害(如霜黴病、白葉枯病等)噴霧。不同病害使用的對照藥劑(如菌核淨、多菌靈、井岡黴素等)根據其使用說明進行使用。各種病害的病指根據不同病害的分級標準來計算。防效=(空白病指一用藥病指)/空白病指xl00。丄其結果如下表5。表5海洋芽孢桿菌可溼性粉劑防治植物病害匯總tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11由上述防治數據可知海洋芽孢桿菌可溼性粉劑可有效防治菌核病、灰黴病、白粉病、紋枯病、赤黴病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜黴病、斑枯病、葉黴病、早疫病、黑斑病。儘管上面已經描述了本發明的具體例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。權利要求1.一株來源於中國渤海潮間帶植物鹽地鹼蓬(Suaedasalsa)根內的海洋芽孢桿菌(Bacillusmarinus)B-9987，其保藏號為CGMCCNo.2095。2.—種海洋芽孢桿菌可溼性粉劑，它含有保藏號為CGMCCNo.2095的海洋芽孢桿菌B-9987、載體和助劑，其特徵在於，所述海洋芽孢桿菌B-9987在所述可溼性粉劑中的活菌含量為lxl06cfu/glxl012cfb/g。3.如權利要求2所述的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑，其特徵在於，所述載體選自白碳黑、硅藻土、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土和澱粉中的一種或多種；所述助劑選自十二垸基苯磺酸鈉、茶皂素、Tween-20、辛基酚聚氧乙烯醚、二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉中的一種或多種。4.如權利要求2或3所述的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑，其特徵在於，所述助劑在可溼性粉劑中的重量百分比為0.01%10%。5.如權利要求2所述的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑，其特徵在於，所述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的含水量小於15%重量，通過44^篩的比例大於95%，懸浮率大於34%，潤溼時間小於180s。6.—種製備如權利要求2所述的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟將含保藏號為CGMCCNo.2095的海洋芽孢桿菌B-9987活菌的發酵液與載體、助劑混合，得到的混合物通過靜態或動態乾燥後再通過機械或氣流粉碎，得到所述海洋芽孢桿菌可溼性粉劑。7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述發酵液含有芽孢狀態的海洋芽孢桿菌B-9987活菌、非芽孢狀態的海洋芽孢桿菌B-9987活菌、和/或所述海洋芽孢桿菌B-9987的代謝產物。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述海洋芽孢桿菌B-9987的發酵液是通過以下方法培養獲得的在含有碳源、氮源、無機鹽的培養基中，在通氣量控制在氣液比為0.2:12:1、轉速在100r/min或以上，培養所述海洋芽孢桿菌24小時至168小時，其中所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、澱粉或/和大米粉，所述氮源選自蛋白粉、酵母粉、花生餅粉或/和大豆粉。9.權利要求2所述的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑在防治植物病害中的應用。10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述植物病害選自菌核病、灰黴病、白粉病、紋枯病、赤黴病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜黴病、斑枯病、葉黴病、早疫病、黑斑病。全文摘要本發明涉及一種海洋芽孢桿菌可溼性粉劑及其應用，該可溼性粉劑由載體、助劑和海洋芽孢桿菌B-9987發酵液混合後經乾燥、粉碎而得到。本發明的海洋芽孢桿菌可溼性粉劑通過灌根或噴霧可用來防治植物病害。文檔編號A01N25/14GK101331881SQ200710042798公開日2008年12月31日申請日期2007年6月27日優先權日2007年6月27日發明者張久明,李元廣,李淑蘭,黎田,羅遠嬋,立鄭,魏鴻剛申請人:國家海洋局第一海洋研究所;華東理工大學;上海澤元海洋生物技術有限公司