儲存宮內膜幹細胞的方法
2023-12-03 08:49:16
專利名稱：儲存宮內膜幹細胞的方法
技術領域：
本發明屬於細胞分離培養與保存相關技術，尤其是從經血中分離宮內膜間充質幹細胞，宮內膜幹細胞株的建立，以及相應的培養和保存技術。
背景技術：
幹細胞技術是當今生命科學中最熱門的技術之一，其研究內容幾乎涉及所有生命科學的生物醫學領域，除了在細胞治療、組織/器官移植和基因治療中發揮重要作用外，還在發現新基因、基因功能分析、發育生物學模型及新藥開發等方面產生重要影響。近幾年來，幹細胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最權威的美國《kience》雜誌連續2年將幹細胞和人類基因組計劃列為當年的10大科學突破，尤其是在1999年甚至將幹細胞研究列為第一位。幹細胞很可能在醫學領域引發革命性進步，因而具有不可估量的醫學價值，引起了全世界的廣泛關注和研究，美國《時代》周刊認為幹細胞和人類基因組計劃將同時成為新世紀最具有發展和應用前景的領域。間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，簡稱MSCs)是來源於成熟組織中的多能幹細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞， 具有廣闊的應用前景。其中，研究最為廣泛的MSCs是來源於骨髓的間充質幹細胞，儘管其倫理問題與胚胎幹細胞相比大為減少，但骨髓細胞必須通過侵入的途徑獲得，而且隨著年齡的增長，幹細胞數量顯著減少。眾所周知，子宮內膜細胞系具有很強的自我更新能力。在每個月經周期都會有組織和血管的大量增長，這一增長過程會隨著月經周期的結束而停止。美日中等多國科學家的最新研究顯示在隨女性經血脫落的子宮內膜組織中，具有相當數量的間充質幹細胞(基質幹細胞)——宮內膜幹細胞，數量為骨髓來源的30倍；這些幹細胞活力更強，更強的自我更新和增殖能力(如心肌細胞的培育效率為傳統利用骨髓細胞培育的100倍)，分化潛能更接近胚胎幹細胞。有研究發現子宮內膜的再生細胞(ERC)不僅具有幾乎每M小時複製一次的驚人速率，而且它們產生獨特生長因子的速率，比來自於臍帶血的幹細胞要大上10 萬倍。如果把這些幹細胞通過科學的方法儲存起來，在女性未來的一生中，一旦發生腫瘤等重大疾病或意外嚴重傷害時，就可立即做自體幹細胞的移植，恢復健康，減輕自己及家人的經濟負擔，減輕社會負擔，還有可能實現女性夢寐以求的「青春常在」、「紅顏永駐」的美好願望，擁有高品質的人生。女性的宮內膜幹細胞不但可用於本人，還可為她的子女、相關親屬 (如堂表弟妹，甚至父母)等人的臨床應用。由於國內所實行的獨生子女政策，一旦患血液系統惡性疾病和遺傳性疾病，就只能採用異基因幹細胞移植，宮內膜幹細胞是異基因幹細胞移植最豐富最好的資源。一旦儲存了宮內膜幹細胞，就相當於為其整個家族建立了一個預防和治療腫瘤及其它相關需幹細胞治療疾病的生命銀行。儲存的宮內膜幹細胞還可供全國和全世界患者選擇作幹細胞移植用，並逐步替代價格昂貴、難以找到配型相合的骨髓幹細胞。全世界等待幹細胞移植的患者數以億計，僅白血病在我國的發病率就達十萬分之三、四，即每年新增四萬名左右的患者，而累計的白血病患者約有四百萬，其中大部分是兒童，他們都急需通過幹細胞移植來救治。目前有經血標本的儲存方法是獲得經血標本後，經過初步分離，去除大部分的紅細胞，然後直接添加凍存液凍存。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種儲存宮內膜幹細胞的方法。本發明針對現有幹細胞來源困難或受倫理限制等問題，尋找一種更為高效的來源廣泛且不受倫理限制的宮內膜幹細胞分離和培養方法。在此基礎上，擴增和純化幹細胞，並對所培養的幹細胞進行形態和功能鑑定，從而建立具有幹細胞特性的新型幹細胞株，然後再將優質的幹細胞資源儲存。本發明的優越之處在於女性廢棄的月經血來源廣泛，幹細胞含量豐富，先通過高效的分離方法能夠保證被儲存的幹細胞的質量。為了解決上述技術問題，本發明提供一種儲存宮內膜幹細胞的方法，依次包括以下步驟1)、準備採集套裝和配製培養基採集管1 裝有20ml Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，並添加以下成分至以下濃度萬古黴素(Vancomycin) 60 100 μ g/mL、頭孢氨苄(Claforan) 150 350 μ g/mL、卡那黴素(Amikacin) 50 150 μ g/mL、慶大黴素(Gentamycin) 80 160 μ g/mL、兩性黴素 B (Amphotericin B) 2 ~ 3 μ g/mL R 300 500 月幹i ；採集管2 裝有IOml Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，並添加150 250單位肝素；配製Chang完全培養基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha培養基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、16 20mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、1 3mL Chang C基液(Irvine kientific公司)、1 3mL青黴素或者鏈黴素 (Penicillin/Streptomycin, Invitrogen公司，或者為青黴素硫酸鹽或者鏈黴素硫酸鹽)、 1 :3mL 濃度為 200mM 的 L-穀氨醯胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、10 20mL 的胎牛血清(ES-FBS，hvitrogen公司)，充分混勻，置4°C冰箱待用；2)、經血收集收集月經開始的第二或第三天的經血；在採集管1內加入15 20ml的經血，在採集管2內加入5 IOml的經血；並於0 4°C的低溫下保存，所述保存期彡48h ；3)、無菌檢查將採集管2將離心處理後，得上清液；將上清液按照血培養法進行厭氧菌和需氧菌檢查，並鑑定；若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜幹細胞的程序；4)、宮內膜幹細胞分離培養將步驟幻所得的採集管1內的混合液先進行過濾，然後採用密度梯度離心法，收集單個核細胞；將上述所得的單個核細胞接種於Chang完全培養基中，單個核細胞的接種密度為 1*105 l*106/ml，置於37°C、飽和溼度、體積分數為5%的C02培養箱中進行培養；5)、細胞擴增和純化待步驟4)的單個核細胞接種於Chang完全培養基中開始細胞培養的4 5天後， 更換Chang完全培養基，並棄除未貼壁細胞；以後每3 4天全量換液一次(可根據細胞生長狀況而定，全量換液即指換掉全部的Chang完全培養基)；待細胞生長達到80% 90% 融合時，用質量濃度為0. 25%的胰蛋白酶(一般每1 20ml的細胞中使用Iml的所述胰蛋白酶)消化收集細胞，然後按5000-6000個/cm2密度傳代接種培養，並記為Pl代；6)、細胞凍存待步驟幻的Pl代細胞鋪滿容器底部後，用質量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞；用預冷的凍存液重懸細胞；從而使細胞的密度為1 2*106/ml ；凍存液為在 9體積份的Chang完全培養基中加入1體積份的DMSO(calbiochem公司)製備而得(即為含有10% DMSO的Chang完全培養基)；將上述被凍存液重懸的細胞進行凍存，凍存步驟如下第一步4°C，等待(即溫度降至4°C後，進入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體，即為箱體溫度)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1 · 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束； 取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存。作為本發明的儲存宮內膜幹細胞的方法的改進步驟4)中的密度梯度離心法為 將過濾後所得的混合液離心(例如1600g離心10分鐘)，去除上清後，得血液；用PBS稀釋血液，PBS與血液的體積比為1. 5 2. 5 1 ；將稀釋後的血液加至人淋巴細胞分離液上，稀釋後的血液與人淋巴細胞分離液的體積比為1.5 2. 5 1，離心 (例如600g離心15分鐘)，離心完畢後，離心管內出現明顯的分層，吸出中間白膜層即單個核細胞。在本發明中，步驟幻的無菌檢查和步驟4)的內膜幹細胞分離培養可同步進行，原因是無菌檢查需要較長周期，因此，不能等到無菌培養出結果後再進行細胞的分離培養。 如步驟3)的監測結果為陽性，則結束整個儲存宮內膜幹細胞的程序。現在世界上大部分幹細胞庫的做法是從人體取得幹細胞(或混有幹細胞的其他組織，人臍帶、羊水、外周血等)後，稍加分離即進行凍存，等到需要時再將凍存的細胞復甦、培養增殖。本發明的優越之處在於從人體取得經血標本後，經過密度梯度分離後，去除大部分紅細胞，再進行純化擴增培養，獲得純度較高、數量較大的目標細胞即宮內膜幹細胞，再進行凍存，這樣就保證了凍存細胞的質量，且以後需要用到該份細胞，復甦後的培養時間也較其他方法短得多。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是實施例1中培養不同時間的宮內膜幹細胞放大100倍的顯微照片；A 為 PO 代換液 4 天，100X ；B 為 Pl 代 3 天，100X ；C 為 P2 代 3 天，100X ；D 為 P7 代 3 天，100X ；E 為 P22 代 3 天，100X ；圖2是實施例1中流式細胞分析結果圖。
具體實施例方式實施例1 儲存宮內膜幹細胞的方法，即人宮內膜幹細胞的分離、培養、擴增及凍存、復甦；依次進行以下步驟1)、準備採集套裝和配製培養基採集管1 裝有20ml Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，並添加以下成分至以下濃度萬古黴素(Vancomycin) 70 μ g/mL、頭孢氨苄(Claforan) 200 μ g/mL、卡那黴素 (Amikacin) 100 μ g/mL、 X U M (Gentamycin) 140 μ g/mL、胃個生 # ■ B (Amphotericin B) 2. 5 μ g/mL及添加400單位肝素。採集管2 裝有IOml HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)，並添加180單位肝素。在開始步驟2、的收集經血以前，要將上述採集管1和採集管2在4°C環境下存放。配製Chang完全培養基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha培養基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、16mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、2· 5mL Chang C基液(Irvine kientif ic公司)、ImL青黴素(內含0. 25g作為有效成分的青黴素鉀鹽)、ImL濃度為 200mM 的 L-穀氨醯胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、15mL ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen公司)，充分混勻，置4°C冰箱待用。2)、經血收集在志願者(42歲，已籤訂知情同意書)月經開始的第二天，採取半蹲或全蹲的姿勢，將月事杯對摺兩次後，放入陰道內。兩小時後小心取出，將月事杯中的經血20ml倒入採集管1(事先含有步驟1)所述的特定採集液)中；再按照以上步驟重複操作，在採集管2(事先含有步驟1)所述的特定採集液)內加入IOml的經血。將所得的採集管1和採集管2放入搖床孵育，溫度設置為4°C。3)、無菌檢查將搖床孵育M小時後的採集管2進行離心處理(1600g離心10分鐘)後，得上清液；將所述上清液按照常規的血培養法進行厭氧菌和需氧菌檢查，並按照常規方法進行鑑定。若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜幹細胞的程序。4)、宮內膜幹細胞分離培養將搖床孵育對小時後的採集管1中的樣品用電動移液器吹打混勻，再過濾樣品中的血塊及粘液，接著轉移至50ml離心管中；配平離心管，1600g離心10分鐘，離心機降速調至最低檔；然後密度梯度離心分離單個核細胞，具體如下首先去除離心管中的上清；注意小心吸液，不要擾亂細胞層，造成額外的細胞丟失；用PBS按一定比例(體積比約為2 1)稀釋已轉移上清的血細胞，電動移液器吹打混勻；在超淨工作檯中取乾淨離心管，轉移15mL人淋巴細胞分離液至每根50ml離心管中；鋪層加樣將稀釋後的血液小心的加至已倒好的人淋巴細胞分離液上(加樣時動作要輕柔，避免衝散分層液面或與分層液面混合而影響分離效果)，稀釋後的血液和人淋巴細胞分離液的體積比為2 1 ；
配平離心管，600g離心15分鐘，離心機升降速要調至最低速擋，確保離心穩定，分層清晰；提取單個核細胞離心完畢後，離心管內出現明顯的分層，由下到上依次為紅細胞層、粒細胞層、分離液層、單核細胞(MNC)層和血漿層；吸出單個核細胞層把吸管或移液管直接伸入單個核細胞層，先吸該層中央部分細胞，再吸取四周細胞，動作要輕柔，保證不把該層細胞吹散。如果分離液層和MNC層呈乳白色，界面不清楚，提示含有較多單個核細胞，酌情吸取分離液層，速度要緩慢，確保不吸取到紅細胞層；洗滌細胞吸出的單個核細胞混有部分細胞分離液，需用PBS加以洗滌；用電動移液器加PBS將細胞稀釋兩倍以上，混勻，200g離心10分鐘；離心完畢後，小心取出離心管，
去除上清；重複此步驟一次；細胞計數將以上所得細胞充分混勻，用臺盤藍染色，計數活細胞；接種細胞根據細胞計數結果，調整細胞密度至2*105/ml接種於75cm2培養瓶內 (內裝IOml的Chang完全培養基)。當然，接種時的細胞密度可採用l*105-l*106/ml。5)、細胞擴增和純化細胞培養於75cm2培養瓶中(內設含有密度為2*105/ml細胞的Chang完全培養基10ml)，置於培養箱內，瓶蓋擰松半圈，確保瓶內空氣與培養箱內空氣相通，保持培養箱 37 °C、飽和溼度、CO2體積濃度5%的狀態開始培養。4天後，從(X)2培養箱中取出細胞培養瓶，在無菌條件下去除瓶中的培養基，棄除未貼壁細胞，添加IOmL Chang完全培養基到培養瓶中，再次放入CO2培養箱培養，根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次(即全量更換Chang完全培養基一次)。待細胞達到 80%-90%融合時，在每個培養瓶中加入ImL 0. 25% (質量濃度)的胰蛋白酶消化，水平方向輕輕搖晃，使胰酶鋪滿平底，作用1分鐘後，倒置顯微鏡下觀察消化效果，待大部分細胞縮至圓形後，再加入IOmL Chang完全培養基終止消化；然後按按5000-6000個/cm2密度傳代接種培養，並記為Pl代。傳代培養過程中，根據細胞生長情況，每3-4天進行全量或半量換液，直至細胞再次融合，鋪滿平底，重複以上操作進行傳代，記為P2代，依此操作進行傳代。細胞原代培養3-4天全量換液後，去除未貼壁細胞，鏡下觀察，可見較多幾個細胞聚集在一起的克隆，細胞增殖迅速，其倍增時間大約為M-36小時，2天後細胞形態呈均勻長梭形，培養4-5天後細胞可達到80% -90%融合，細胞呈漩渦狀分布。傳代後細胞M小時內完全貼壁，3-4天可鋪滿瓶底，繼續傳代。體外培養細胞培養至20代後，細胞的增殖速度明顯減慢，細胞出現老化現象。圖1顯示了培養傳代過程中的細胞形態圖A原代培養4天，換液後2天的細胞形態圖，可見細胞形態較多，有圓形、多角形、梭形等，此時細胞較雜；B是Pl代細胞傳代後3 天的圖，細胞形態趨於一致；C是P2代細胞傳代後3天的圖，D是P7代細胞傳代後3天的圖， 細胞呈漩渦狀排列，此時細胞純度較高；E是P22代細胞傳代後3天的圖，細胞密度較低，增殖速度慢，並呈現老化現象。以上結果說明，從細胞形態來看，本發明分離培養的細胞符合幹細胞的特點，細胞的增殖能力較強，本發明中細胞可傳代至20代左右。
6)、細胞凍存選擇Pl代細胞進行凍存，既保證了凍存時細胞的原始狀態，也能夠使細胞擴增到
足夠數量級。每個試管內裝含有密度為l_2*106/ml的Pl代細胞1ml。待Pl代細胞生長至融合80 % -90 %後，用Iml質量濃度為0. 25 %的胰蛋白酶消化收集細胞。用少量Chang完全培養基重懸細胞，臺盤藍染色，計算細胞數量和細胞活率，確定細胞活率在80%以上，用Chang完全培養基調整細胞密度為2_4*106/ml，加入等體積預冷)的凍存液(10% DMS0)；然後分裝於2ml的凍存管中。採用的凍存液是含有10% DMSO(calbiochem公司)的Chang完全培養基(即，凍存前細胞的終濃度為l-2*106/ml)。將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序。凍存程序設置如下第一步4°C，等待(即溫度降至4°C後，進入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1. 0°C /分鐘降至-40. O0C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束； 取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存。實施例2、細胞復甦培養將上述實施例1所得的凍存的樣本從液氮儲存罐中取出，立即放入37°C水浴中解凍。當觀察到凍存管內的冰核只有黃豆大小的時候，將凍存管取出，立刻放入冰水混合物中。在無菌條件下，將凍存管中樣本輕柔吸出，加入一支50mL無菌離心管中，再立即加入 IOmL的Chang完全培養基，充分混勻洗滌，在4°C、IOOOrpm的條件下離心10分鐘，去除管中上清。重複操作一次。用臺盤藍進行細胞計數及活率分析。按照10000個/cm2的密度(利用Chang完全培養基)將細胞接種到75cm2培養瓶中，放入37°C、飽和溼度、體積分數為5 % 的(X)2培養箱培養。根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次，待細胞達到80% -90%融合時，用濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化，以5000-6000個/cm2密度傳代，復甦後細胞形態正常，增殖速度沒有改變，傳代至20代左右，細胞出現老化現象。實施例3.流式細胞檢測選擇實施例1中所得培養P5代的宮內膜間充質幹細胞按如下步驟進行流式檢測。每個試管內裝有濃度為5*106/ml的P5代細胞^il。1)細胞懸液製備用Iml的0. 25% (質量濃度)的胰酶將細胞消化下來，500rpm，5min離心，棄上清。 加PBS洗2遍，然後aiil PBS重懸細胞，從而使細胞濃度為5*106/ml。2) 4%多聚甲醛(PBS配製)固定15min，然後PBS洗2遍(1500rpm，離心5min)。3)5%的85六固定40111士11。4)根據流式抗體(直標)稀釋度要求每IO6個細胞/200ul分別加入20ul抗體 (CD39、CD44、CD90、CD34、HLA (ABC)、HLA (DR-DP-DQ))，避光，37°C 孵育 30min。5)用PBS洗一遍，1500rpm,離心5min，棄上清，再加入500ul PBS重懸，準備上機檢測。
6)流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司，型號FC-500。所用抗體來自於貝克頓迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富蘭克林湖，NJ)。根據檢測的幹細胞大小特點利用前向散射光(FS)、側向散射光(SS)找到目標細胞群。根據所選擇的抗體的螢光素標記選擇流式檢測通道，對目標細胞的螢光強弱進行分析，計算出細胞表面標記分子的陽性百分比。具體如圖2所示。從以上實施例可見本發明方法可以成功從女性經血樣品中分離獲得人宮內膜幹細胞，細胞經過擴增和純化培養可培養至20代；細胞經過凍存後能夠復甦繼續傳代培養，保持幹細胞形態。經過流式細胞檢測，復甦細胞表達⑶39、⑶44、⑶90，不表達⑶34、 HLA(ABC)、HLA(DR-DP-DQ)。表明本發明能夠建立人宮內膜幹細胞株，本發明的人宮內膜幹細胞儲存方法實際可行，並具有其他細胞庫儲存方法不具備的優點。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.儲存宮內膜幹細胞的方法，其特徵是依次包括以下步驟 1)、準備採集套裝和配製培養基採集管1 裝有20ml Hank's平衡鹽溶液，並添加以下成分至以下濃度萬古黴素 60^100 Pg/mL、頭孢氨苄 150 ；350 Pg/mL、卡那黴素 5(Tl50 Pg/mL、慶大黴素8(Tl60 Pg/mL、 兩性黴素B 2 3Pg/mL及300 500單位肝素；採集管2 裝有IOml Hank's平衡鹽溶液，並添加15(Γ250單位肝素； 配製Chang完全培養基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha培養基、 16^20mL Chang B基液、廣3mL Chang C基液、廣3mL青黴素或者鏈黴素、廣3mL濃度為200 mM的L-穀氨醯胺、l(T20mL的胎牛血清，充分混勻，置4°C冰箱待用； 2)、經血收集收集月經開始的第二或第三天的經血；在採集管1內加入15 20ml的經血，在採集管2 內加入5 10ml的經血；並於0、°C的低溫下保存，所述保存期彡48h ；3)、無菌檢查將採集管2將離心處理後，得上清液；將所述上清液按照血培養法進行厭氧菌和需氧菌檢查，並鑑定；若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜幹細胞的程序；4)、宮內膜幹細胞分離培養將步驟2)所得的採集管1內的混合液先進行過濾，然後採用密度梯度離心法，收集單個核細胞；將上述所得的單個核細胞接種於Chang完全培養基中，單個核細胞的接種密度為 l*105 l*106/ml，置於37°C、飽和溼度、體積分數為5%的(X)2培養箱中進行培養；5)、細胞擴增和純化待步驟4)的單個核細胞接種於Chang完全培養基中開始細胞培養的4飛天后，更換Chang完全培養基，並棄除未貼壁細胞；以後每3、天全量換液一次；待細胞生長達到 809Γ90%融合時，用質量濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，然後按5000-6000個/cm2 密度傳代接種培養，並記為Pl代；6)、細胞凍存待步驟5)的Pl代細胞鋪滿容器底部後，用質量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞；用預冷的凍存液重懸細胞；從而使細胞的密度為廣2*106/ml ；所述凍存液為在9 體積份的Chang完全培養基中加入1體積份的DMSO製備而得； 將上述被凍存液重懸的細胞進行凍存，凍存步驟如下 第一步4°C，等待； 第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C ； 第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C ； 第四步1. O0C /分鐘降至-40. O0C ； 第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C ； 第六步結束；取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存。
2.根據權利要求1所述的儲存宮內膜幹細胞的方法，其特徵是所述步驟4)中的密度梯度離心法為將過濾後所得的混合液離心，去除上清後，得血液；用PBS稀釋血液，所述PBS與血液的體積比為1. 5^2. 5 1 ；將稀釋後的血液加至人淋巴細胞分離液上,稀釋後的血液與人淋巴細胞分離液的體積比為1.5 2. 5:1，離心，離心完畢後，離心管內出現明顯的分層，吸出中間白膜層即單個核細胞。
全文摘要
本發明公開了一種儲存宮內膜幹細胞的方法，依次包括以下步驟1)準備採集套裝和配製培養基；2)經血收集；3)無菌檢查；4)宮內膜幹細胞分離培養將步驟2)所得的採集管1內的混合液先進行過濾，然後採用密度梯度離心法，收集單個核細胞；將上述所得的單個核細胞接種於Chang完全培養基中，單個核細胞的接種密度為1*105~1*106/ml，置於37℃、飽和溼度、體積分數為5%的CO2培養箱中進行培養；5)細胞擴增和純化；6)細胞凍存。採用本發明的方法能獲得純度較高、數量較大的目標細胞即宮內膜幹細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102154202SQ201110085328
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月6日 優先權日2010年4月6日
發明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術有限公司