聚烯亞胺凝膠的光化學合成方法
2023-12-03 16:48:16 3
專利名稱：聚烯亞胺凝膠的光化學合成方法
技術領域：
本發明涉及一種聚胺類化合物，特別是聚烯亞胺凝膠的光化學合成方法。
背景技術：
聚胺類高分子化合物，如包括聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)、聚丙烯亞胺(polypropyleneimine，PPI)等的聚烯亞胺(Polyalkylene imine)，以及聚異丙烯醯胺(poly N-isopropylacrylamide)等被廣泛地用於基因轉染載體及高分子凝聚劑、分散劑等領域。自1995年Boussif等(O.Boussif，F.Lezoualc』h，M.A.Zanta，M.D.Merbny，D.Scherman，B.Demeneix，J.P.Behr，Aversatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and invivopolyethyleneimine，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7297-7301)首先報導了聚乙烯亞胺可作為非病毒載體後，PEI等陽離子聚烯亞胺類聚合物成為重要的真核細胞的基因轉染載體，並成為研究最為廣泛的非病毒型基因轉染載體之一。大量的體內和體外的轉染實驗證實PEI具有顯著的基因轉染效率，在轉導過程中能夠更好地保護DNA不受其它酶類如DNase1和DNase2的攻擊而降解。
目前國內外已有商品化的聚烯亞胺(PEI及PPI等)，其大多為凝膠水溶液，也可冷凍真空乾燥成粉末，部分可用於基因轉染。它們的光化學合成方法通常為傳統的化學方法，如微乳液聚合(Xin Chen et al.，The synthesis andcharacterizations of monodisperse cross-linked polymer microspheres withcarboxyl on the surface，Polymer 43(15)(2003)4147-4152)、多步化學合成等。而這些合成方法有些步驟較多並繁雜、反應時間長；有些副反應多且不可控制，產率低；有些危險性較大(如國外常採用氮丙啶單體合成聚乙烯亞胺時)。如果利用PEI、PPI等聚烯亞胺預聚體合成更高分子量的聚烯亞胺凝膠，則由於其結構[結構式如下，R為(CH2)m，m為≥2的整數，常見的是2～5]中不含有雙鍵或不穩定環，所以用常規的化學法很難引發其聚合。另外，在 這些常規的化學合成工藝中，通常需要一些具有生物毒性的有機溶劑作為反應溶劑，或添加一些化學引發劑和催化劑，如常用溶劑之一二氯甲烷(YoungHeui Kim，Jeong Hyun Park，et al.，Polyethylenimine with acid-labile linkages asa biodegradable gene carrier，Journal of Controlled Release(2004)(In press))；又如有些是從2-氨基乙醇為起始原料合成，產品中有毒的反應物難以除盡，且反應物產率很低(Anke von Harpe，et al.，Characterization of commerciallyavailable and synthesized polyethylenimines for gene delivery，Journal ofControlled Release(2000))。這不僅使產品的純化工藝複雜，嚴重地汙染環境，而且影響其作為載體在生物醫藥領域應用的安全性。
另一方面，由於同一類型載體的基因轉染效果及安全性等方面可因其理化性質不同而有差異，如載體的分子量，分子量的分布，顆粒粒徑大小及其分布等。載體納米粒子在體內及體外的吸收對粒徑大小具有依賴性，控制載體納米凝膠的產品在一定的尺度具有窄粒徑分布，有助於提高轉染效率，提高產品的利用率、減少用量、減小細胞毒性。現有聚烯亞胺合成技術還不太完善，且所得聚烯亞胺的分子量及粒徑大小不易控制，分布範圍較寬，粒徑大小十分不均勻，分散性差，如PEl分子量有0.6～25kDa不等，但分布範圍較寬，其PCS(photon correlation spectroscopy，中文譯名為光子相關光譜)結果提示為多峰分布，粒徑分布較寬(如圖1所示)。
發明內容
本發明的目的是解決上述問題，提供一種聚烯亞胺(凝膠)的光化學合成方法。
本發明的目的通過下列技術方案來實現一種聚烯亞胺凝膠的光化學合成方法，其將聚烯亞胺預聚物在鹼性條件下，採用抽氫劑進行紫外光照合成反應。
其中，本發明所說的聚烯亞胺預聚物是指結構式如上所示的鏈狀或樹枝分叉狀的不含有雙鍵或不穩定環的現有聚烯亞胺產品，其中結構式中R為(CH2)m，m為≥2的整數，較佳的是2～5，由此根據本發明方法合成的聚烯亞胺納米凝膠是指聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、聚丁烯亞胺或聚戊烯亞胺等，也可以根據需要選用上述兩種或兩種以上預聚物合成其共聚物。本發明重點研究可作為基因轉染載體的聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺凝膠的合成，故n優選2或3，即選用聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺預聚物。
該聚烯亞胺預聚物分子量相對較低，通常不超過50kDa，目前作為載體的聚乙烯亞胺預聚物的分子量一般＜25kDa；本發明中聚烯亞胺預聚物通常選用其凝膠水溶液；該聚烯亞胺預聚物在反應體系中的重量濃度為0.05-16％，較佳為1-7％。
本發明在聚烯亞胺預聚物溶液中還可以加有成核劑，所說的成核劑是指能與聚烯亞胺上的N發生絡合，具有可以控制粒度大小並提高聚烯亞胺分散性，從而得到大小更均勻且儲存穩定性高的納米凝膠的物質。已知化學領域中能與N絡合的物質，如過渡金屬鹽等均可作為本發明成核劑，例如鐵、銅、稀土元素等的金屬鹽；優選羧酸鐵、氯化亞鐵、氯化銅、氯化亞銅等。
加入的成核劑在反應體系中的濃度較佳地為0.07-20mg/ml，更佳為1.5-3.5mg/ml。
而所說的鹼性條件是指pH≥7，較佳的是7.6～11，更佳的是8～10。
本發明中所說的抽氫劑是指在紫外光光照下產生羥基等自由基可以從一些有機物分子上抽取C、N或S等原子上連接的H原子，從而得到新的自由基而引發一系列的交聯反應的一類分子。其可為現有紫外光合成反應中常用的各種光引發劑，如過氧化物等，本發明的抽氫劑優選過氧化氫，其在反應體系中的體積濃度為0.02-3％，較佳為0.05-1％，更佳的是0.1～0.5％。
基於如圖3所示的本發明合成體系的紫外分光光度吸收光譜圖，本發明選用的紫外光波長為200～260nm，本發明選擇能高效產生其中253.7nm短波長紫外光的低壓汞燈為輻照源，其較佳的光照強度為＞0、≤18mw/cm2，更佳的是3～18mw/cm2，光照時間一般不少於5分鐘，最長不超過3小時；本發明為便於觀察及控制反應條件，通常選用光照強度18mw/cm2，光照時間1小時左右。
同大多數高分子有機反應一樣，本發明合成過程中採用攪拌，優選採用140轉/分鐘左右的機械攪拌，由於本發明中需攪拌物質流動性較好，所以根據常規採用越高的攪拌速度越好，一般為140～500轉/分鐘，為便於觀察及控制反應條件，本發明採用140轉/分鐘左右的機械攪拌。
而本發明中所說的紫外光照合成反應，同現有紫外光合成反應一樣，在除氧條件下進行，本發明採用最簡易的氮氣鼓泡法。
更佳地，尤其為得到更好的基因轉染載體，本發明隨後還包括純化步驟即將上述光化學合成方法製得的聚烯亞胺納米凝膠先用0.45μm針式濾器純化，再用分子量為10000-12000的透析袋純化去除未經反應的成分及其它雜質。當然，也可以根據不同產品要求，採用其它的過濾、萃取等提純方法。
利用上述本發明光化學合成方法可製備粒徑≥20nm的聚烯亞胺凝膠、通常為20-600nm，更佳為30-200nm的聚烯亞胺納米凝膠。以聚乙烯亞胺為例，其PCS結果為單峰分布，粒徑分布窄，粒徑均勻並分散性較好，多分散係數(Poly.Index)通常為0.100-0.700；而且其核磁共振碳譜如圖4所示，說明合成的PEI納米凝膠中含有C＝N鍵(δ166.35，164.92)，紅外波譜中m＝1651.92處的弱中峰也證明了C＝N鍵的存在，和反應前預聚體所含有的官能團不一樣。
本發明採用短波長的紫外光引發較低分子量的聚烯亞胺預聚體產生自由基，進一步聚合得到高分子量的聚烯亞胺納米凝膠。在聚烯亞胺預聚體中不含有雙鍵或不穩定環，用常規的化學法很難引發其聚合，而本發明光化學合成法是利用抽氫劑在253.7nm波長下產生的羥基自由基抽取預聚體上的H原子從而使其發生交聯反應，生成高分子量的分叉狀PEI目標產物，另外還可使用成核劑與聚烯亞胺上的N發生絡合得到大小更均勻的納米凝膠。以PEI為例，其反應過程如圖2所示。
本發明的積極進步效果在於第一、本發明光化學合成方法通過紫外光輻照引發不含雙鍵和不穩定環的物質的聚合，不需要添加引發劑及表面活性劑；具體而言，其使抽氫劑在紫外光照射下分解產生羥基自由基，抽取PEI預聚體上的氫原子使預聚體發生交聯，最終得到更高分子量的PEI納米凝膠，而PEI預聚體本身在該波長下是很難發生光降解的。另外，反應在水溶液中進行，可以提高其體內試驗的安全性；而紫外光可以使大腸菌、紅痢菌、傷寒菌、葡萄球菌、結核菌、枯草菌、穀物黴菌等細菌和病毒死亡，保證了樣品的醫用質量。第二、本發明光化學合成方法工藝簡單，反應時間快，一般僅需5分鐘～1小時，所用試劑生物毒性小，有利於環保。第三、本發明光化學合成方法得到了接近球狀的高分子納米凝膠，並能重複製備要求粒徑大小的納米凝膠，控制光照的時間即可控制反應的時間；由此製得的PEI納米凝膠基因載體粒徑可控，粒徑分布窄，表面呈分叉狀，分散性好，穩定性好，從而降低了細胞毒性和免疫原性，提高了其作為載體在生物醫藥領域應用的安全性及轉染效率。
圖1為現有PEI預聚體的PCS檢測結果。
圖2為本發明採用PEI預聚體光化學合成反應過程示意圖。
圖3為本發明各種合成體系的紫外分光光度吸收光譜圖；其中，A圖為現有PEI預聚體凝膠水溶液；B圖為PEI預聚體凝膠水溶液加入成核劑後的反應體系；C圖為抽氫劑雙氧水的反應體系。
圖4為本發明聚乙烯亞胺納米凝膠的核磁共振碳(C13)譜圖。
圖5為本發明實施例1中3個重複樣品的PCS檢測結果(A圖為1號樣品，B圖為2號樣品，C圖為3號樣品)。
圖6為小劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響圖表；圖7為小劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟丙二醛(MDA)含量的影響圖表；在圖6～7中，生理鹽水(NS)作為陰性(空白)對照，PEI預聚體作為陽性對照，其中▲P＜0.05(vs NS)，*P＜0.05(vs PEI預聚體)，n＝6。
具體實施例方式
下面以聚乙烯亞胺的合成為例，用實施例來進一步說明本發明光化學合成方法的操作步驟及其效果，但本發明並不僅限於此。
其中，PEI預聚體(Polyethyleneimine)購自日本東京化成工業株式會社，原液是30％(w/w，重量百分比)水凝膠溶液；水為二蒸水；其餘試劑為常規市售AR試劑。
用英國MARLVEN公司Zetasizer 3000HS型雷射粒度散射儀，對本發明PEI納米凝膠粒子的粒徑進行PCS表徵，測試時的溫度為25℃，入射雷射的波長為633nm，其偏振方向與散射檢測光平面垂直。並使用Nanoscope IIIaAFM原子力顯微鏡(Digital Instruments，Santa Barbara，CA)和LEO1530VP型掃描電子顯微鏡(SEM)對純化後的納米粒子的形貌進行表徵。
實施例1在50ml石英燒瓶中，加入下列各種組分組成反應體系，每種組分的濃度依次為PEI預聚物的濃度為1.15％(w/w)、羧酸鐵作為成核劑的濃度為1.54mg/ml，加入極少量稀鹽酸溶液(0.5M)調節pH值至9.5。控制攪拌速度為140轉/分鐘左右，通氮氣除氧30分鐘後，加入3％的雙氧水(過氧化氫)，使其在反應液中的濃度為0.057％(v/v)。在連續通氮氣(氮氣流量80ml/min)的情況下，用紫外低壓汞燈，以光照強度為18mw/cm2光照1h(小時)引發反應。控制如上所述的反應條件進行三次重複試驗得到1號、2號、3號三個樣品，對所得三次重複樣品用0.45μm針式濾器(ANPEL產品)和分子量10000-12000道爾頓的透析袋(華美生物工程公司)純化樣品。
用上述雷射粒度散射儀PCS法測量三個納米凝膠樣品的粒徑各三次，結果示單峰分布，粒徑分布窄(如圖5所示)，所得平均值分別為1號，91.9nm；2號，79.4nm；3號，89.9nm，它們的多分散係數依次為0.303、0.6、0.439，平均粒徑大小約為87nm。
對樣品進行冷凍真空乾燥後用掃描電子顯微鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)表徵其形狀為球形結構，整體分散性較好，局部有團聚現象。作為對照，將現有的上述PEI預聚體同樣條件下進行PCS檢測，結果如圖1所示，多峰分布，粒徑分布寬，大小十分不均勻，分散性差。
實施例2PEI預聚物濃度為4.8％(w/w)、氯化亞鐵濃度為3.21mg/ml、加入極少量稀鹽酸溶液調節溶液的pH值至10.0。加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.12％(v/v)，餘同實施例1。
將純化後的聚乙烯亞胺納米凝膠樣品用雷射粒度散射儀PCS法測量，為單峰分布(圖未示)，該聚乙烯亞胺納米凝膠的粒徑平均值為172.9nm，多分散係數為0.355。在4℃條件下放置21天後再檢測，其粒徑的平均值為171.7nm，多分散係數為0.415。結果表明聚乙烯亞胺納米凝膠樣品在放置過程中基本保持穩定，粒徑沒有發生明顯變化，具有一定的貯存穩定性。經真空乾燥的聚乙烯亞胺納米凝膠樣品以掃描電子顯微鏡測試該樣品的形狀也同實施例1近於球形，分散性好。
實施例3PEI濃度為1.15％(w/w)、羧酸鐵濃度為1.54mg/ml、加入稀鹽酸溶液調節pH值至8.0。控制攪拌速度為140轉/min左右，通氮氣除氧30min後，加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.11％(v/v)。在連續通入氮氣(氮氣流量80ml/min)的條件下，紫外光光照強度為18mw/cm2光照1h引發反應。控制如上所述的反應條件每隔一個月進行一次重複試驗，得到4號、5號、6號三個樣品，樣品經0.45um針式濾器過濾和三次透析純化後，經PCS測量三個納米凝膠樣品的粒徑各三次，結果示單峰分布，粒徑分布窄(圖未示)，所得平均值分別為4號，136.5nm；5號，146.4nm；6號，150.4nm，它們的多分散係數依次為0.300、0.437和0.408。
實施例4每種組分的濃度依次為PEI濃度為6.3％(w/w)，不添加成核劑，加入極少量稀鹽酸溶液(0.5M)調節pH值＝10.6，在通氮除氧30min後加入過氧化氫使其在反應液中的濃度為1.36％(v/v)，控制紫外光光照強度為18mw/cm2，光照反應時間為3小時，餘同實施例1。純化後用PCS測得結果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為38nm。
實施例5PEI預聚物濃度為6％(w/w)、成核劑羧酸鐵的濃度為0.1mg/ml、調節溶液的pH值至10.0，餘同實施例1，用PCS測得結果示單峰分布，所得納米凝膠的粒徑為341nm。
實施例6PEI濃度為16％(w/w)，成核劑濃度為20mg/ml，調節pH值＝9.5，雙氧水在反應液中的濃度為2.8％(v/v)，餘同實施例1。純化後，用PCS測得結果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為106nm。
實施例7PEI濃度為3.7％(w/w)，成核劑氯化銅濃度為0.7mg/ml，調節pH值＝10.6，雙氧水在反應液中的濃度為0.05％(v/v)，餘同實施例1。純化後用PCS測得結果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為590nm。
實施例8PEI濃度為4.8％(w/w)，成核劑濃度為3.2mg/ml，調節pH值＝10.6，加入過氧化鈉，使其在反應液中的濃度為0.13％(v/v)，控制紫外光光照強度為3mw/cm2，光照0.5小時，餘同實施例1。純化後，用PCS測得結果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為200nm。
實施例9PEI預聚物濃度為0.05％(w/w)、成核劑濃度為0.56mg/ml、調節溶液的pH值至8，加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.02％(v/v)，紫外光光照強度為18mw/cm2，光照5分鐘引發反應，餘同實施例1。純化後的聚乙烯亞胺納米凝膠用PCS測得結果為單峰分布，其粒徑平均值為256nm。
實施例10PEI預聚物濃度為3.7％(w/w)、成核劑氯化亞鐵濃度為0.07mg/ml、調節溶液的pH值至7.6，加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.037％(v/v)，紫外光光照強度為18mw/cm2，光照0.5小時引發反應，餘同實施例1。純化後的聚乙烯亞胺納米凝膠用PCS測得結果示單峰分布，其粒徑平均值為325nm。
應用實施例1 PEI納米凝膠作為腫瘤治療基因轉導載體的安全性在徐州醫學院的協作下，我們對本發明製備得到的高分子量PEI納米凝膠作為腫瘤治療基因轉導載體的安全性進行了驗證。
給小鼠按5mg/kg體重的劑量，1次/天，連續3天注射實施例1～4製備得到的各種粒徑的PEI納米凝膠，同劑量的生理鹽水(NS)作為陰性(空白)對照，PEI預聚體作為陽性對照，採用SPSS12.0統計軟體LSD方法對各組數據進行方差分析及差異作統計學比較，結果如圖6、7所示，提示本發明各種粒徑的PEI納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量無顯著影響，但PEI預聚體降低了小鼠肝臟、腎臟和心臟SOD活力，並顯著提高MDA含量，這說明預聚體對小鼠重要臟器有氧化性損傷。以上實驗結果證實本發明的光化學合成方法製得的PEI納米凝膠比現有PEI產品的細胞毒性更低，作為載體在生物醫藥領域應用的安全性更高。
權利要求
1.一種聚烯亞胺的光化學合成方法，其將聚烯亞胺預聚物在鹼性條件下，採用抽氫劑進行紫外光照合成反應。
2.根據權利要求1所述的光化學合成方法，其特徵在於該聚烯亞胺預聚物是指聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺。
3.根據權利要求1所述的光化學合成方法，其特徵在於該聚烯亞胺預聚物在反應體系中的重量百分比為0.05-16％。
4.根據權利要求1所述的光化學合成方法，其特徵在於該聚烯亞胺預聚物中還加入成核劑，其在反應體系中的濃度為0.07-20mg/ml。
5.根據權利要求4所述的光化學合成方法，其特徵在於該成核劑為過渡金屬鹽。
6.根據權利要求5所述的光化學合成方法，其特徵在於該過渡金屬鹽選自氯化亞鐵、羧酸鐵和氯化銅中的一種或幾種，其在反應體系中的濃度為1.5-3.5mg/ml。
7.根據權利要求1所述的光化學合成方法，其特徵在於該鹼性環境是指pH7.6～11，該抽氫劑為過氧化物，該紫外光波長為200～260nm。
8.根據權利要求7所述的光化學合成方法，其特徵在於該過氧化物為過氧化氫，其在反應體系中的體積濃度為0.02-3％。
9.根據權利要求7所述的光化學合成方法，其特徵在於該紫外光波長為253.7nm，其光照強度為＞0、≤18mw/cm2，光照時間為5分鐘至3小時。
10.根據權利要求1～9任一項所述的光化學合成方法，其特徵在於其隨後還包括純化步驟將權利要求1～9製得的聚烯亞胺先用0.45μm針式濾器純化，再用截留分子量10000-12000道爾頓的透析袋純化。
全文摘要
本發明公開了一種聚胺類化合物，特別是聚烯亞胺，包括聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺等凝膠的光化學合成方法，其將聚烯亞胺預聚物在鹼性條件下，採用抽氫劑進行紫外光照合成反應。本發明光化學合成方法工藝簡單，反應時間快，所用試劑生物毒性小，有利於環保，而且可按需控制反應起始及結束；從而本發明光化學合成方法可製得聚烯亞胺的納米凝膠，其顆粒粒徑可控，粒徑分布窄，比較均勻，由此降低了細胞毒性和免疫原性，提高了其可作為載體在生物醫藥領域應用的安全性及轉染效率。
文檔編號C08J3/28GK1743359SQ20051002647
公開日2006年3月8日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者姚思德, 徐冬梅, 劉永彪, 喬向利, 餘家會, 孫漢文, 盛康龍 申請人:中國科學院上海應用物理研究所