新的神經毒性的分子靶的製作方法

2023-12-01 20:31:36

專利名稱：新的神經毒性的分子靶的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物學，遺傳學和醫學領域。本發明具體涉及檢測，鑑定和/或治療(或者控制)神經退行性疾病，尤其是肌萎縮側索硬化症的新方法。本發明同時涉及鑑定或者篩選對這些疾病有活性的化合物的方法。本發明進一步涉及用於實施上述方法的化合物，基因，細胞，質粒或者組合物。本發明主要來自於鑑定磷酸二酯酶4B在這些疾病中的作用並且描述了磷酸二酯酶4B作為這些病症中的靶或者治療、診斷或者試驗標記的應用。
很多神經退行性疾病被描述為具有與興奮毒性現象相關的組分或者階段。這種情形諸如阿默氏症，帕金森症，多發性硬化和亨汀頓舞蹈症。
肌萎縮側索硬化症(或者稱作ALS)是伴隨著不同類型的諸如路易士小體的包含體，並且特徵在於脊髓和皮層運動神經元的細胞程序性死亡的神經退行性疾病，所述皮層運動神經元的死亡有時相關於額葉性痴呆症。沒有突變記述的散發形式和與編碼超氧化物歧化酶的SOD1基因的突變相關的家族性形式(FALS)共存。大多數病例是散發的，家族性形式(FALS)非常少見。很可能是長時間的無症狀時期存在於臨床症狀出現之前，這些臨床症狀多變並難以分類。未來在治療上的發展將使得用基於疾病分子原因的治療策略代替症狀性治療成為可能。在細胞水平，這些症狀相關於皮層運動神經元和脊髓運動神經元的死亡。這種神經元的死亡已經與不同的現象聯繫起來，這些現象是多種神經退行性疾病的基礎。諸如與穀氨酸，氧化應激，針對神經元標記(在ALS情況下的鈣通道)的自身免疫，以及細胞骨架異常聯繫起來的興奮毒性的情況。雖然這些現象是已知的，但是包括ALS的這些疾病的一個或者多個病因仍然不清楚。即使FALS相關於編碼超氧化物歧化酶的SOD1基因的突變，但是神經元開始進行細胞死亡的機制還是未知的，所述細胞死亡中至少一種是細胞程序性死亡。
闡述參與涉及細胞死亡的不同現象的分子事件將許可開發新的治療策略。利用人活體組織檢查樣本很難進行這些事件的研究。這些活體組織檢查樣本顯然來自於死後樣品，這些樣本的質量很難控制並且僅僅反應疾病的最後階段出現的病理狀態。
動物模型提供的生物樣品使得不同發病階段的分析和與健康對照的比較成為可能。就這一點來講，如果使用許可獲自西北大學(Northwestern University)，表達攜帶在FALS中普遍流行的一種突變(突變G93A)的人SOD1基因的轉基因小鼠可獲自Jackson實驗室。這個模型在120天內重現具有類似於人類疾病的那些症狀的疾病的致死結果。相關於SOD1基因的突變G93A的ALS症狀的出現並非產生於超氧化物歧化酶活性的降低而是由於酶產生自由基能力的增強引起的。儘管擁有了這方面的認識，控制ALS不同階段的分子事件依然知之甚少。這些分子事件的複雜性反應了疾病的進展在所研究的轉基因模型中，在30天沒有觀察到神經元的異常或者臨床表現。60天是症狀出現不久之前的一個階段，但是大腦已經具有細胞生理改變的特徵，諸如線粒體代謝的改變，與興奮毒性現象相關的應激和神經元死亡。在90天，50％的皮層和脊髓運動神經元死亡並且伴隨著星形膠質細胞的激活開始了神經元細胞程序性死亡的活動過程。在這個階段不再觀察到興奮毒性的現象。神經元死亡與半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活相關，所述半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活似乎沒有參與疾病的早期階段。
闡明特異於疾病不同階段的不同分子事件應允許鑑定新的治療靶以及新的治療標記。進行這種鑑定的一種最有效的方法在於鑑定基因和蛋白，所述蛋白的表達表徵了病理生理狀態。
本發明描述了鑑定參與興奮毒性現象和神經元死亡的遺傳事件。因此，本發明給相關於這些現象的疾病提供了新的治療和診斷方法以及鑑定活性化合物的新的靶子。
更具體而言，對於提取自大腦和脊髓樣品的RNA已經進行了定性差異分析，沒有預先提取神經元目的是考慮與疾病發展相關的最大程度的選擇性剪接事件。根據DATAS的方法(描述於申請WO99/46403中)通過定性差異篩選進行分析，所述方法具有無與倫比的優點。
本專利申請特別來自於申請人在60天齡ALS模型動物的大腦中選擇性剪接的所有組成成分的構建物。這種含有多於200個不同序列的所有組成成分包括興奮毒性現象中的主要參與成分，諸如鉀通道和NMDA受體。來自編碼參與應激反應的蛋白，包括熱激蛋白的RNA的序列也是所有組成成分的組成部分，強調了後面的應激在ALS早期階段的作用。改變的能量代謝明顯表現出影響發生該種疾病的動物的皮層運動神經元。例如，線粒體肌酸激酶的內含子6特異性分離自60天齡的動物在病理狀態下表達的信使RNA。通過保持這個內含子中斷編碼序列產生編碼失活形式的酶的信使RNA。這個觀察結果與下列生化發現一致線粒體肌酸激酶活性的減少與這種酶的量在相同轉基因模型動物的神經元中的減少相關。
構成所有組成成分的序列特異性通過下列事實得以證實在90天齡的動物中，對基因表達進行相同定性差異分析導致不同的所有組成成分，在所有組成成分中，尤其是缺乏興奮毒性的不同標記。剪接修飾的分析證實疾病的階段不同，分子事件相異。
以特別有趣和意想不到的方式，對來自60天齡的轉基因動物和對照動物的RNA進行DATAS分析引起從來自磷酸二酯酶4B的mRNA分離cDNA片段。這種片段相應於特異性存在於對照動物中的外顯子片段，並因此在60天階段的SOD1G93A轉基因動物體內特異性缺失。這種片段跨越從小鼠PDE48終止子編號的核苷酸377到486(SEQ IDNO1)(序列也可獲自GenBank，登錄號AF208023)。這個序列包括2912個鹼基，缺失的片段相應於鹼基2760到2869。這是一個非編碼區並且在對照動物和轉基因動物中差異表達，原因在於選擇性使用非編碼3』外顯子或者是使用兩種選擇性聚腺苷酸化位點。這種差異表達已經通過示於圖1A和1B中的RT-PCR試驗加以闡明。
因此，本申請闡述了磷酸二酯酶4B參與了興奮毒性過程的發展以及神經元的死亡。獲得的結果表明PDE4B在病理性神經組織中高水平表達，所述表達與相應的RNA的結構修飾有關，尤其是與在3』非編碼部分區域的缺失有關。這個結果與通過DATAS在序列中鑑定到的mRNA不穩定序列完全一致。通過剪接或者通過使用選擇性聚腺苷酸化序列，它們在PDE4B mRNA中的缺失能夠引起穩定化，從而提高這個RNA編碼部分的表達。這個事件特異性發生在病理受試者而非對照受試者的大腦中。
因此本發明描述了引起PDE4B mRNA在病理受試者大腦中表達提高的最初分子事件，並且所述原始分子事件隨著時間的推移相關於興奮毒性現象和/或神經元的死亡。此外，本發明首次表明PDE4B表達的提高相關於ALS的早期階段。因此PDE4B是這些疾病的治療發展中的一個新的和重要的治療靶，尤其是用於這些疾病發展的早期階段，並且提出了疾病的真正分子基礎而非併發症或者炎性組分。本發明也提供了診斷，篩選，檢測，確定這些疾病的趨勢或者監控這些疾病的進展或者治療效果的新方法。
檢測，診斷和篩選因此，本發明的一個目的就是提供檢測受試者興奮毒性狀態或者神經元應激的方法，所述方法包括測定來自受試者的樣品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的體外表達。本方法優選包括測定PDE4B基因的3』非編碼區和基因的其它區，尤其是編碼區的差異表達。
因此本發明的進一步的目的就是提供檢測受試者興奮毒性狀態或者神經元應激的方法，包括檢測來自受試者樣品中的磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的突變RNA的存在，尤其是全部或者部分3』非編碼區缺失的形式。
本發明的另一個目的是將包括所有或者部分來自PDE4B基因或者信使RNA的序列的核酸用於實施診斷或者檢測神經元應激的狀態以及更具體是興奮毒性狀態的方法。
本發明總體上基於使用互補於所有或者部分PDE4B基因或者信使的核酸用於檢測相關於興奮毒性，應激，神經元死亡等的病理事件。更一般而言，本發明提供了診斷，篩選，鑑定或者監控退行性疾病的方法，包括闡明在PDE4基因中或者在相應的RNA中，典型的在PDE4B中的改變。
PDE4的表達，或者差異表達，或者改變形式的存在可以通過傳統分子生物學的方法，諸如，例如測序，雜交，擴增，RT-PCR，凝膠遷移等進行確定。本發明可以應用於診斷或者檢測不同的病理現象，包括興奮毒性現象，諸如，阿默氏症，帕金森氏症，多發性硬化，ALS，亨汀頓舞蹈症或者腦局部缺血。可以用於早期檢測，以闡明傾向性，指導治療的選擇和適應性，監控疾病的進展等等。尤其適於檢測早期階段的多發性硬化或者ALS。
為了實施根據本發明的診斷或者檢測的遺傳方法，更優選使用能夠闡明PDE4B mRNA的缺失形式，尤其是所有或者部分3』非編碼區缺失形式的核酸。特定的例子為使用互補於位於序列SEQ ID NO1的殘基2760到2869之間的所有或者部分區域的核酸，或者相應的人PDE4B基因或者mRNA序列的殘基。編碼人PDE4B的cDNA序列和相應的蛋白顯示在序列SEQ ID NO3和4(也可參見Genbank，登錄號NM 002600)中。人PDE4B基因或者RNA的3』非編碼區對應於SEQID NO3的殘基2461到4068。
以有利的方式，使用的核酸(作為探針)包括所有或者部分編碼位於序列SEQ ID NO1的核苷酸2384到2869之間或者序列SEQ IDNO3的核苷酸2461和4068之間的PDE4B基因或者RNA的3』非編碼區的序列或者其互補序列。
根據具體的實施方案，本發明使用互補於位於下列的一種序列中的區域的核酸-SEQ ID NO1的殘基2384到2869-SEQ ID NO1的殘基2500到2869-SEQ ID NO1的殘基2760到2869-SEQ ID NO1的殘基2780到2850-SEQ ID NO1的殘基2790到2810-SEQ ID NO3的殘基2600到4040-SEQ ID NO3的殘基3000到4040-SEQ ID NO3的殘基3500到4040-SEQ ID NO3的殘基3900到4040在另一個具體的實施方案中，使用互補於缺失了所有或者部分3』非編碼部分產生的PDE4 RNA區域序列的核酸。區域的缺失實際上在序列中建立了新的連接，所述序列特異於缺失形式並且可被用於闡明這種形式在樣品中的存在。
優選的，探針和靶序列之間的互補程度是完全的從而確保更加特異性的雜交。但是，應該明白也可以允許一些錯配。用於實施上述方法的核酸可以是DNA或者RNA，優選為合成的DNA。優選包括10到500個鹼基，通常10到100個鹼基。應該理解如果需要，可以使用更長的核酸，雖然這不是優選的。核酸優選為單鏈DNA，從10到500個鹼基，至少互補於PDE4B的3』非編碼序列的區域。核酸可通過，例如放射性，酶，發光，螢光，化學方法等進行標記。
用於檢測PDE4基因中存在改變的另一方法使用可以選擇性擴增部分PDE4 RNA的引物或者核酸引物對，優選含有3』非編碼區的部分。通常使用允許選擇性擴增PDE4 RNA改變形式的引物，尤其是通過缺失部分RNA 3』區建立的特異性連接的引物。
在這個方面，本發明的一個目的就是基於互補於PDE4B 3』非編碼區部分的引物，並且允許擴增這個區的一部分。引物優選包括8到20個鹼基。引物優選由位於SEQ ID NO1的核苷酸2384到2869之間或者序列SEQ ID NO3的核苷酸2461和4068之間序列的8到20個連續殘基的片段或者其互補序列組成。本發明的另一個目的就是提供允許對至少部分PDE4 3』非編碼區進行特異性擴增的引物對，所述引物對包括至少一個如上所述的引物。
為了實施本發明的方法，將來自受試者的含有核酸的生物樣品與諸如上述的核酸(探針，引物等等)體外接觸，並且檢測雜交體或者擴增產物的形成。生物樣品可以是血液，體液，細胞，組織等樣品。核酸可以固定在玻璃，二氧化矽，尼龍等載體上。
檢測，篩選或者診斷的過程可以通過使用來自受試者的不同類型的樣品，諸如，例如活體檢查組織，尤其是神經組織進行。以尤其令人驚訝和有利的方式，本發明進一步顯示與興奮毒性現象相關的PDE4表達的去調節可直接在肌肉組織中加以闡明。這種情況在神經退行性疾病諸如ALS的病例中尤其顯著。
在ALS的發展期間，退行性現象通過缺陷性神經支配不僅發生在大腦中也發生在脊髓中並且隨之發生在肌肉中。圖2描述了來自對照小鼠和轉基因小鼠的肌肉中PDE4B mRNA表達的修飾，通過利用與來自同樣這些動物大腦的RNA進行試驗的相同的PCR引物進行檢測。以類似的但是稍遜的方式，在症狀出現之前階段的末期，即90天齡時，動物的肌肉中特異性觀察到PDE4B的3』非編碼區而非這種mRNA的其它區域(尤其是編碼區)表達的降低。
研究和治療ALS過程中遇到的一個困難就是建立早期診斷。觀察到PDE4B mRNA在ALS肌肉中去調節使得有可能從病人的活體檢查組織肌肉中建立早期診斷。這種診斷基於檢測PDE4B的3』非編碼區和其它的序列，尤其是編碼部分之間的差異表達。
用於檢測受試者神經元應激，顯著的興奮毒性，尤其是相關於神經退行性疾病的狀態的特異性方法包括測定來自所述受試者肌肉細胞樣品中PDE4B基因的表達，或者PDE4B信使缺失形式的存在。
為了測定差異表達，人們使用例如相應於(換言之，特異於)部分3』非編碼區的探針以及相應於部分PDE4B編碼區的探針。用這些探針分別檢測的信號可以評估差異表達。另一方法使用允許一方面擴增部分3』非編碼區而另一方面擴增部分編碼區的兩對引物。
另一個目的是提供分析PDE4表達的試劑盒，尤其是3』非編碼區和編碼區之間差異表達的試劑盒，所述試劑盒包括特異於3』非編碼區部分序列的核苷酸探針和特異於編碼區部分序列的核苷酸探針。
本發明的另一個目的是提供用於分析PDE4表達的試劑盒，尤其是3』非編碼區和編碼區之間差異表達的試劑盒，所述試劑盒包括一對允許特異性擴增至少部分的PDE4的3』非編碼區的核苷酸引物以及一對允許特異性擴增至少部分的PDE4編碼區的核苷酸引物。
治療磷酸二酯酶水解諸如cAMP和cGMP的環核酸，調節不同信號級聯。PDE4B水解cAMP，從而調節細胞內這種第二信使的濃度。cAMP在細胞存活和細胞程序性死亡平衡中的作用已被廣泛描述於文獻中。具體而言，cAMP級聯在包括例如Akt和P13K激酶的細胞存活級聯中以及在調節轉錄因子CREB的活性中具有綜合作用。值得提及的是這種轉錄因子參與神經元存活和神經突出的生長。但是，PDE以及，優選PDE4抑制劑的使用從未被設想用於提高神經元的存活並且尤其是用於保護神經元抗興奮毒性。已經有人提出用於抑制炎性現象的PDE4抑制劑，可能在諸如阿默氏症的神經退行性疾病中是有用的。這種認識是基於減少在神經退行性活動期間大腦中觀察到的炎症的目的，並且完全不是基於直接抑制神經元死亡的基本目的。
本發明闡述了相關於神經元興奮毒性的進展的剪接事件和影響PDE4B基因的選擇性聚腺苷酸化位點的存在，並且提供了證實使用PDE4抑制劑治療ALS更通常用於提高興奮毒性現象期間神經元存活性，尤其是從這些疾病的早期階段開始的分子基礎。
因此本發明的另一個目的就是基於使用能夠抑制或者降低PDE4B表達或者活性的化合物，目的在於製備設計用來治療神經退行性疾病，尤其是早期階段的神經退行性疾病，更優選用來降低與神經退行性疾病，諸如ALS，阿默氏症或者帕金森症相關的早期神經元興奮毒性的組合物。
一個特別的目的在於使用PDE4抑制劑用於製備設計用來治療ALS，尤其是用來降低患有ALS的受試者興奮毒性或者增加患有ALS的受試者的神經元存活率的組合物。
本發明的另一個目的是使用能夠抑制(優選以選擇的方式)序列SEQ ID NO2或者4的PDE4B的表達或者活性的化合物，目的在於製備設計用於降低神經元興奮毒性的組合物。
本發明的另一個目的是提供治療與神經元應激相關的疾病，尤其是興奮毒性的方法，所述方法包括給受試者施用抑制PDE4B活性或者表達的化合物，優選是選擇性抑制PDE4的化合物。
本發明的另一個目的是基於治療ALS的方法，尤其是用於提高患有ALS的受試者神經元存活率的方法，所述方法包括給受試者施用PDE4抑制劑，優選是一種選擇性抑制PDE4的化合物。
在本發明的上下文，術語「治療」是指預防，治癒，緩解治療，以及病人處理(減輕痛苦，提高生命期望值，減緩疾病的惡化)等等。治療可以連同其它藥物或者治療一起進行，尤其是疾病的晚期階段，諸如半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶抑制劑或者其它的活性化合物。
使用的化合物可以是能夠抑制PDE4表達，尤其是PDE4B表達的任一化合物，也就是說，特別是抑制基因轉錄，RNA成熟加工，mRNA翻譯，翻譯後蛋白修飾等的任何化合物。所述化合物可以是抑制RNA修飾，尤其是3』非編碼區的部分缺失的化合物。
在一個具體的實施方案中，化合物為能夠抑制PDE4B基因轉錄或者相應的mRNA翻譯的反義核酸。反義核酸可以包括PDE4B基因的所有或者部分序列，其片段，PDE4B信使或者其互補序列。反義核酸可以主要包括互補於位於SEQ ID NO1的殘基218到2383之間或者SEQ ID NO3的殘基766到2460之間序列的區域，並且抑制(或者減少)其翻譯成蛋白。反義核酸可以為DNA，RNA，核酶等。它可以為單鏈或者雙鏈。它也可以是由反義基因編碼的RNA。如果它為反義寡核苷酸，通常含有少於100個鹼基，例如從10到50個鹼基。這種寡核苷酸可被修飾以提高其穩定性，其對核酸酶的抗性，其進入細胞的穿透性等。
根據其它的實施方案，化合物為肽，例如包括PDE4蛋白(尤其是PDE4B)的區域並且能夠拮抗其活性。
根據本發明的另一實施方案，化合物為天然或者合成來源的化合物，尤其是植物，細菌，病毒，動物，真核生物，合成或者半合成來源，能夠調節PDE4B的表達或者活性的有機或者無機分子。
在一個優選的變體中，化合物為抑制PDE4的合成化合物。可以使用不同類型的抑制劑。優選為來自吡唑並吡啶家族的化合物，其中一個具體的例子為etazolate，或者來自黃嘌呤(或者2，6-二氧嘌呤)衍生物家族，尤其是包括己酮可可鹼(pentoxifylline)的化合物。
來自吡唑並吡啶家族的化合物尤其選自下列化合物具有下式的etazolate 4-丁基氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(tracazolate)，4-丁基氨基-1-乙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(4-氨基-吡唑並[3，4-b]吡啶-1-基)-β-D-1-脫氧-呋喃核糖，1-乙基-4-(N』-異亞丙基-聯氨基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(SQ 20009)，4-氨基-6-甲基-1-正戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶，4-氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(去丁基tracazolate)，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-甲醯胺(carboxamide)，
1-乙基-6-甲基-4-甲基氨基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-丙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-乙基-4-乙基氨基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-丁基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，5-(4-氨基-吡唑並[3，4-b]吡啶-1-基)-2-羥甲基-四氫呋喃-3-醇，1-烯丙基-4-氨基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸，4-氨基-1-乙基-3，6-二甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-二甲基氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-乙基-6-甲基-4-丙基氨基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-丁-3-烯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-烯丙醯胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-異丙醯胺，4-氨基-1-戊基-N-正丙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-甲醯胺，4-氨基-1-丁基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-丙-2-炔基醯胺，4-氨基-1-(3-甲基-丁基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並3，4-b吡啶-5-N-(2-丙烯基)甲醯胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-丁醯胺，4-氨基-1-丁-3-炔基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-丁-3-烯基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-烯丙醯胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-(3-甲基-丁基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，
4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸異丁酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-丁醯胺，4-氨基-6-甲基-1-(3-甲基-丁-2-烯基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-環丙醯胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-異羥肟酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸丙-2-炔基酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-烯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-丙醯胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-環丙基甲基-醯胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸2-甲基烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-烯丙醯胺(ICI190，622)，4-氨基-1-戊-4-炔基-N-2-丙烯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-甲醯胺，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-丙-2-炔基醯胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-丁-2-炔基醯胺，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-(2-環丙基-乙基)-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-己-5-炔基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-環丙基甲基-醯胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸丁-3-烯基酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸環丙基甲酯，4-丁基氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-烯丙醯胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸2-環丙基-乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸環丙基甲酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸環丙基甲酯，4-氨基-1-苄基-6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-苄基醯胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-苯基醯胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸苄酯，4-疊氮基-1-β-D-呋喃核糖基吡唑並[3，4-b]吡啶，1-戊-3-炔基-N-2-丙烯基-4-丙醯胺基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-甲醯胺，2-(4-氨基-吡唑並[3，4-b]吡啶-1-基)-5-羥甲基-四氫-呋喃-3，4-二醇，2-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-乙醇，3-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-丙-1-醇，3-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-乙酸丙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-丙酸乙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-戊酸乙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-苯甲酸乙酯，3-(6-甲基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-戊酸丙酯，N-苯亞甲基-N』-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-呋喃-2-基亞甲基-N』-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(4-氟-苯亞甲基)-N』-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，
N-(3-呋喃-2-基-亞丙烯基)-N』-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(4-甲氧基-苯亞甲基)-N』-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，4-[(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-亞肼甲基]-苄腈，N-苯並[1，3]間二氧雜環戊烯-5-基亞甲基-N』-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-N』-(4-硝基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-N』-(2-硝基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-N』-(4-三氟甲基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-N』-(5-硝基-呋喃-2-基亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-N』-(2-三氟甲基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-4-基)-N』-(6-硝基-苯並[1，3]間二氧雜環戊烯-5-基亞甲基)-肼，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-(吡啶-4-基甲基)-醯胺，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-(四氫-呋喃-2-基甲基)-醯胺，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-(5-羥基-戊基)-醯胺，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-[3-(2-氧-吡咯烷-1-基)-丙基]-醯胺，4-叔-丁基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-環丙基氨基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-丙基氨基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-苯基氨基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-丁基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-(2-乙氧基-乙基氨基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-苄基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-苯乙基氨基-1H-吡唑並[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，在黃嘌呤衍生物中，人們尤其使用(i)(ω-1)-羥烷基-二烷基黃嘌呤，其中(ω-1)-羥烷基含有5或者6個碳原子，並且在1或者7位，在其他7或者1位的烷基含有1到12個碳原子並且在3位的烷基含有1到4個碳原子，(ii)(ω-1)-氧烷基-二甲基黃嘌呤，其中(ω-1)-氧烷基含有5或者6個碳原子並且在1或者7位，或者(iii)具有含4到12個碳原子的烷基或者在1或者7位具有苄基的二甲基黃嘌呤的衍生物。
通常，氧烷基-二烷基黃嘌呤包括，例如1-(5-氧己基)-3，7-和7-(5-氧己基)-1，3-二甲基黃嘌呤。也可使用其他黃嘌呤，諸如尤其是在1或者7位用丁基，異戊基，己基，月桂基或者苄基取代的3，7-二甲基黃嘌呤和1，3-二甲基黃嘌呤，以及在(ω-1)-位用羥基或者氧基取代的這些化合物的類似物，例如1-(4-羥戊基)-和1-(5-羥己基)-3，7-二甲基黃嘌呤，7-(4-羥戊基)-和7-(5-羥己基)-1，3-二甲基黃嘌呤，1-(4-氧戊基)-和1-(5-氧己基)-，1-(2-甲基-3-氧丁基)-和1-(2-乙基-3-氧丁基)-3，7-二甲基黃嘌呤和相應的在7位具有(ω-1)-羥烷基或者(ω-1)-氧烷基的1，3-二甲基化合物。上述羥烷基-二甲基黃嘌呤的類似物是那些在1或者7位沒有被羥烷基佔據，具有除了甲基以外的2到12個碳原子的烷基，諸如，1-乙基-，1-丙基-，1-丁基-和1-異丁基-3-甲基-7-(5-羥己基)-黃嘌呤和7-乙基-，7-丙基-，7-丁基-和7-異丁基-1-(5-羥己基)-3-甲基黃嘌呤，和相應的在位點上具有除了甲基以外的含有2到4個碳原子的烷基，諸如尤其是，乙基，正丙基，異丙基，異丁基或者正丁基的化合物。
在這些黃嘌呤衍生物中，人們尤其使用具有下式的己酮可可鹼(Pentoxifylline) 因此，本發明首次提議PDE4B作為治療靶用於治療與興奮毒性相關的分子事件。根據具體的實施方案，本發明可被用於抑制或者降低神經退行性疾病早期階段的神經元的興奮毒性。尤其是應用於治療阿默氏症，帕金森氏症，多發性硬化，ALS，亨汀頓舞蹈症和腦局部缺血。
本發明的其它目的基於使用上述化合物，尤其是etazolate或者己酮可可鹼用於治療ALS，以顯著降低ALS早期階段的神經元興奮毒性，或者使用上述化合物，尤其是己酮可可鹼或者etazolate用於製備設計用來抑制患有ALS的病人PDE4B活性的組合物。
本發明同時涉及治療ALS的方法，所述方法包括施用選擇性抑制序列SEQ ID NO2或者4的PDE4B的表達或者活性的化合物。優選的，本發明的方法用於治療神經退行性疾病的早期階段。
可以根據本領域技術人員公知的任一方法進行給藥，優選通過口服途徑或者通過注射，通常通過腹膜內，腦內，靜脈內，動脈內或者肌內的途徑給藥。優選使用口服途徑給藥。給藥劑量可以是本領域技術人員所接受的劑量。通常，對於天然是化合物的抑制劑化合物而言，注射大約0.01mg到100mg/kg。對於核酸化合物而言，給藥劑量例如從大約0.01mg到100mg每劑量。應該理解，可以進行反覆注射，有可能與其它活性製劑或者任一藥學上可接受的介質(例如，在穩定劑等存在下，緩衝液，等滲鹽溶液等)聯合使用。
本發明可用於哺乳動物，尤其用於人類。實施例中列舉的結果顯示了PDE4B抑制劑對提高處於興奮毒性狀態的神經元的存活率的效果。
可選擇的方法和手段本發明的其它目的涉及選擇，鑑定或者鑑別對與興奮毒性，或者神經元應激相關疾病有活性的化合物的方法，所述方法包括將化合物與表達PDE4B(尤其是缺乏3』非編碼區的變體)的細胞接觸，並且鑑定抑制這個蛋白表達或者活性的化合物。
所述方法可用於不同的細胞群，諸如哺乳動物來源(人，鼠等等)的初級細胞或者細胞系。優選的，使用不天然表達PDE4B，用編碼需要的變體的核酸轉化的細胞。用這種方式，方法的可選擇性提高了。也可使用低等真核生物(酵母等)或者原核生物的細胞。
篩選方法也可通過測定試驗化合物結合PDE4B或者其變體或者其片段的能力在無細胞系統中實施。
本發明的另一個目的涉及如上所述的編碼多肽的任一核酸，含有核酸的載體，重組細胞，及其應用。載體可以為質粒，噬菌體，粘粒，病毒，人工染色體等等。優選的載體的例子為質粒載體，諸如來自市售的質粒(pUC，pcDNA，pBR等等)。這種載體優選含有選擇的基因和/或複製起點和/或轉錄啟動子。其它的具體載體為例如，病毒或者噬菌體，尤其是複製缺陷型重組病毒，諸如來自逆轉錄病毒，腺病毒，AAV，皰疹病毒，杆狀病毒等的病毒。載體可用於任一感受態宿主，諸如，例如原核或者真核細胞。它們可以為細菌(例如大腸桿菌)，酵母(例如，糖酵母或者克魯維氏酵母)，植物細胞，昆蟲細胞，哺乳動物細胞，尤其是人等等。它們可以是細胞系，初級細胞，混合培養物等。
本發明的其它方面和優點根據下列用於說明而非限制目的的實施例將更加明顯。


圖1大腦(1A)和肌肉(1B)樣本中PDE4B的半定量PCR。
圖2己酮可可鹼(Pentoxifylline)保護初級神經元防止形成與由紅藻氨酸誘導的興奮毒性相關的小腦顆粒體。
圖3己酮可可鹼(Pentoxifylline)保護初級神經元防止形成與由NMDA/絲氨酸誘導的興奮毒性相關的小腦顆粒體。
圖4etazolate的神經元保護效果防止由大腦顆粒細胞上的NMDA/絲氨酸誘導的毒性。
圖5etazolate的神經元保護效果防止由大腦顆粒細胞上的紅藻氨酸誘導的毒性。
圖6己酮可可鹼(Pentoxifylline)的神經元保護效果防止由皮層神經元上的NMDA/絲氨酸誘導的毒性。
圖7己酮可可鹼(Pentoxifylline)的神經元保護效果防止由皮層神經元上的紅藻氨酸誘導的毒性。
圖8etazolate的神經元保護效果防止由皮層神經元上的NMDA/絲氨酸誘導的毒性。
圖9etazolate的神經元保護效果防止由皮層神經元上的紅藻氨酸誘導的毒性。
圖108-溴-cAMP的神經元保護效果防止由大腦顆粒細胞上的NMDA/絲氨酸誘導的毒性。
圖118-溴-cAMP的神經元保護效果防止由大腦顆粒細胞上的紅藻氨酸誘導的毒性。
實施例實施例1鑑定作為興奮毒性分子靶的PDE4對從不同階段的動物樣本的大腦中提取的聚腺苷醯化(poly A+)的RNA進行定性差異分析，不用預先分離神經元從而考慮與疾病的發展相關的可選擇剪接事件的最大值。
poly A+RNA通過本領域技術人員公知的方法進行製備。尤其是，可以通過諸如，硫氰酸胍的離液劑處理，然後利用溶劑(例如，酚，氯仿)的方法提取總RNA。這種方法對於本領域技術人員是公知的[參見Maniatis等人，Chomczynsli等人，Anal.Biochem.162(1987)156]，而且通過使用市售的試劑盒可以很容易的進行操作。poly A+RNA根據本領域技術人員公知的常規方法從總RNA中製備，並且以市售試劑盒的形式提供。這些poly A+RNA作為利用逆轉錄酶進行逆轉錄反應的模板。以優選的方式，使用缺失RNase H活性的逆轉錄酶，從而獲得在大小上大於用傳統逆轉錄酶獲得的第一個互補DNA鏈。這種不含RNase H的逆轉錄酶製備物可以市售獲得。
在疾病發生的每個時間點(30天，60天和90天)，poly A+RNA以及單鏈cDNA從轉基因動物(T)和同系基因的對照動物(C)製備而來。
根據DATAS方法，在每個時間點進行mRNA(C)與cDNA(T)的雜交，以及mRNA(T)與cDNA(C)的交互雜交。
然後根據DATA方法的操作流程純化mRNA/cDNA異雙鏈體。
不與互補DNA配對的RNA序列通過RNAse H的作用從這些異雙鏈體釋放，因為這種酶降解成對的RNA序列。這種未配對的序列代表在相互同源的RNA之間存在的定性差異。這種定性差異可以位於RNA序列上的任一位點，在序列的5』或者3』區或者在序列中間，尤其在編碼序列中。根據他們的位點，這些序列可能不只是選擇性剪接，還可能是易位或者缺失的結果。
然後根據本領域技術人員公知的方法，更具體的是描述於DATAS方法專利中的那些方法，克隆代表定性差異的RNA序列。
這些序列進入組成定性差異文庫的cDNA文庫。一種這樣的文庫含有健康狀態特異的外顯子和內含子；另一種文庫就含有病理狀況下的剪接事件的特徵。
通過與探針雜交檢測克隆的差異表達，所述探針由研究中的差異狀態下提取的信使RNA的反轉錄獲得。保留顯示差異雜交的克隆用於後面的分析。通過DATAS鑑定的序列對應於通過在病理狀態和正常狀態中的剪接而差異表達的內含子和/或外顯子。這些剪接事件可以特異於疾病發展的特定階段或者為正常狀態的特徵。
將這些序列與資料庫比較可以將獲得的信息進行分類，並且提議根據診斷和治療目的對序列加以合理選擇。
對來自60天齡轉基因動物和對照動物的RNA實施DATAS已經分離了來自磷酸二酯酶4B mRNA的cDNA片段。這個片段相應於特異性存在於對照動物中的外顯子片段，並且因此在60天齡階段的SOD1G93A轉基因動物體內特異性缺失。這個片段包括從鼠PDE4B的終止密碼子開始編號的核苷酸377到486(SEQ ID NO1)。這個序列包括2912個鹼基，缺失的片段相應於鹼基2760到2869。由於選擇性使用3』非編碼外顯子或者由於使用兩種可選擇的聚腺苷醯化位點，這個區是非編碼的並且在對照動物和轉基因動物之間差異表達。
實施例2RT-PCR試驗證實差異表達PDE4B在神經元應激狀態下的差異表達和參考狀態相比通過描述於圖1的RT-PCR試驗進行證實。
這些實驗根據本領域技術人員公知的方法進行並且使隨後表達PDE4B mRNA兩個不同區域成為可能。這樣的一個區域跨越了這個mRNA的起始密碼子(PDE4B 5』)，其它區域部分跨越了通過DATAS(PDE4B DATAS)方法鑑定的片段。所使用的PCR引物的位置顯示在圖1中。
PO RNA是核糖體RNA，作為內部對照以檢測相同量的RNA用於每個試驗點。用從30天齡，60和90天齡，即，在病理症狀出現之前的對照動物(C)和轉基因(T)動物提取的RNA進行分析。
來自對照或者30，60，或者90天齡的SOD1 G93A小鼠大腦的總RNA利用標準SuperscriptTM操作流程(Invitrogen)轉錄為cDNA。為了進行半定量PCR，逆轉錄反應產物稀釋10倍。DATAS片段的特異性引物對應於有義鏈的核苷酸2526到2545(5』GCC AGG CCG TGAAGC AAA TA3』；SEQ ID NO5)，和反義鏈核苷酸2790到2807(5』TCAAAG ACG CGA AAA CAT 3』；SEQ ID NO6)並且對於5′引物片段而言，引物對應於有義鏈的核苷酸145到165(5』CCG CGT CAG TGC CTTTGC TAT 3』；SEQ ID NO7)，和反義鏈的核苷酸426到404(5』CGC TGTCGG ATG CTT TTA TTC AC 3』；SEQ ID NO8)。P0基因作為參考並且利用下列引物進行擴增，有義鏈5』TCG CTT TCT GGA GGG TGT C3』(SEQ ID NO9)和反義鏈CCG CAG GGG CAG CAG TGG 3』(SEQ IDNO10)。
如下所述進行30個PCR循環的擴增-在94℃ 30秒-在57℃ 1分鐘-在72℃ 30秒，然後在72℃ 2分鐘一個循環不同的PCR產物加樣到1.5％的瓊脂糖凝膠上。用兩種不同的逆轉錄反應重複試驗三次。
圖1顯示了從動物的大腦或者肌肉提取的RNA獲得的結果。
如果從所有樣品的PO RNA擴增相同量的cDNA，用PDE4BmRNA觀察到變化。在90天齡的動物體內檢測到最顯著的改變在轉基因動物的大腦中觀察到PDE4 5』片段表達增加的同時，在轉基因動物的大腦中出現PDE4B(DATAS)表達非常顯著的降低。
這種發現建立了PDE4B的3』非編碼區mRNA片段表達的降低和這個相同的信使的5』編碼區表達的提高之間的關聯。這個結果和在由DATAS鑑定的序列中存在mRNA去穩定序列完全一致，並且表明PDE4B表達和興奮毒性現象之間的關聯。
實施例3通過PDE4的抑制劑抑制興奮毒性對於這個實施例，大鼠大腦顆粒以及皮層神經元根據本領域技術人員公知的技術進行培養。
初級大鼠大腦顆粒細胞的培養7天齡Wistar大鼠去頭並且解剖大腦。除去腦膜後，將組織切割成小塊並在37℃胰酶消化15分鐘。細胞在研磨機上進行研磨分離並以300,000細胞/cm2接種在添加了10％胎牛血清和2mM穀氨醯胺的基礎Eagle培養基上。第二天，添加10μM的ARA-C(一種抗有絲分裂劑)以抑制神經膠質細胞的生長。培養9天以後，用磷酸二酯酶抑制劑己酮可可鹼和etazolate處理細胞，3小時後在10μg的D-絲氨酸的存在下加入毒素50μM的紅藻氨酸或者100μM的N-甲基-D-天冬氨酸。在毒素之前立即加入8-溴-cAMP。所有處理至少重複兩次並在至少兩種不同的培養物中進行。溫育6小時以後，通過MTT試驗評估毒性。結果歸一化到未處理對照的平均數，用Wilcoxon試驗進行統計分析。顯著性水平設定為p＜0.05。
初級皮層細胞的培養取出來自Wistar大鼠的16天齡胚胎並且解剖皮層。在37℃用胰蛋白酶處理25分鐘後，細胞在研磨機中研磨分離，然後以300,000細胞/cm2接種在添加了10％馬血清，10％胎牛血清和2mM穀氨醯胺的極限必需培養基上。培養4天以後，一半的培養基用添加了5％馬血清和2mM穀氨醯胺的極限必需培養基替換。同一天，添加10μM的5-氟-2-脫氧尿苷(一種抗有絲分裂劑)。培養7和11天以後，用由添加了5％馬血清和2mM穀氨醯胺的MEM組成的條件培養基替換一半的培養基；這種培養物在使用前在一層皮層星形膠質細胞上傳代。在第14天，在10μg的D-絲氨酸的存在下加入毒素50μM的紅藻氨酸或者20μM的N-甲基-D-天冬氨酸之前1小時用磷酸二酯酶抑制劑己酮可可鹼和etazolate處理細胞。所有的處理至少重複兩次並在至少兩種不同的培養物中進行。溫育6小時以後，通過MTT試驗評估毒性。結果歸一化到未處理對照的平均數，用Wilcoxon試驗進行統計分析。顯著性水平設定為p＜0.05。
MTT利用MTT試驗測定毒性。與化合物溫育後，加入MTT使得每孔的終濃度為0.5mg/ml。然後，將微孔板在37℃黑暗條件下培養30分鐘。對培養基抽氣，並將晶體重新懸浮在500μl的DMSO(二甲基亞碸)中。讀取550nm處的吸光度並且計算百分比存活率。
結果結果示於圖2到10中。這些結果顯示了本發明的化合物對於神經元存活的保護效果。當神經元用PDE4抑制劑共處理時，觀察到對兩種興奮毒性誘導劑(NMDA/絲氨酸和紅藻氨酸)的劑量依賴性保護效果。用己酮可可鹼和etazolate觀察到這樣的保護效果。
圖2和3顯示利用己酮可可鹼對大腦顆粒細胞獲得的結果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下己酮可可鹼對這些細胞提供43％的保護，以及在紅藻氨酸誘導的毒性的情況下對這些細胞提供33％的保護。
圖4和5顯示了利用etazolate對大腦顆粒細胞獲得的結果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下etazolate對這些細胞提供60％的保護，以及在紅藻氨酸誘導的毒性的情況下對這些細胞提供57％的保護。
圖6和7顯示了利用己酮可可鹼對皮層神經元獲得的結果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下己酮可可鹼對這些細胞提供50％的保護，以及在紅藻氨酸誘導的毒性的情況下對這些細胞提供66％的保護。
圖8和9顯示了利用etazolate對皮層神經元獲得的結果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下etazolate對這些細胞提供33％的保護，以及在紅藻氨酸誘導的毒性的情況下對這些細胞提供25％的保護。
這種保護的相關性通過利用提高cAMP(一種PDE底物)的濃度獲得的保護的百分比進行證實，作為大腦顆粒細胞的例子顯示在圖10和11中。NMDA/絲氨酸處理觀察到40％的保護，而紅藻氨酸處理觀察到40％的保護。
因此本發明不僅顯示PDE4B參與興奮毒性的機制，尤其是在ALS模型中，而且還顯示PDE4抑制劑在與興奮毒性相關的應激中保持神經元存活率的能力。
實施例4人類的臨床應用這個實施例描述了PDE4抑制劑臨床應用在處理人ALS的條件。這個實施例顯示了本發明的治療潛能和其在人類中的實施條件。
在這個臨床試驗中，處理是基於己酮可可鹼和2-氨基-6-三糖甲氧苯噻唑(riluzole)的聯合使用，前者每天三次400mg的劑量，每天總共1200mg的劑量。己酮可可鹼以片劑的形式給藥。這是一個多中心、雙盲、安慰劑對照的試驗，試驗對象是400名包括18到80年齡段的男性和女性的病人，代表散發或者家族性ALS，並且用2-氨基-6-三糖甲氧苯噻唑(50mg b.i.d)至少治療3個月。用己酮可可鹼治療的計劃時間為18個月。
最終的主要效果為存活率，生命質量和肌肉試驗。
本發明的其它方面和應用涉及- 使用所有或者部分來自PDE4B信使RNA的序列用於診斷或者篩選或者鑑定具有與興奮毒性現象相關的組分或者階段的神經退行性疾病，諸如阿默氏症，帕金森氏症，多發性硬化，亨汀頓舞蹈症，ALS或者腦局部缺血，- 使用包括反義RNA的任一核酸用於在患有這種疾病的病人體內抑制PDE4B的表達，- 利用任一化合物，尤其是己酮可可鹼，etazolate，或者含有它們的任一組合物用於在患有這種疾病的病人體內抑制PDE4B的活性，
- 利用所有或者部分來自PDE4B信使RNA的序列用於鑑定組織以及局部缺血的狀態。
序列表110埃克森海特治療股份有限公司(Exonhit Therapeutics SA)120新的神經毒性的分子靶(New Molecular Target of Neurotoxicity)130SCT040204-47140
141
16010170PatentIn Ver.2.121012112912212DNA213Mus musculus220
221CDS222(218)..(2383)4001aaaggcagcc tgataaagct ccttgtgaca ggctgtcttg ccagtctccc agtatgctcc 60tcttgctctg aagtgctcca ggattgaaac cacagcttcc caaattagcc tgggaagagt 120gtgcggaccc agcagccttt taacccgcgt cagtgccttt gctatgttca agactgctgt 180tttggatggt gaatgctagc tagcactcca tcgagac atg aca gca aaa aat tct 235Met Thr Ala Lys Asn Ser1 5cca aaa gaa ttt act gct tcg gaa tct gag gtt tgc ata aag act ttc 283Pro Lys Glu Phe Thr Ala Ser Glu Ser Glu Val Cys Ile Lys Thr Phe10 15 20aag gag cag atg cgc ttg gaa ctt gag ctt cca aag cta cca gga aac 331Lys Glu Gln Met Arg Leu Glu Leu Glu Leu Pro Lys Leu Pro Gly Asn25 30 35aga cct aca tct ccc aaa att tct cca cgc agt tca cca agg aat tca 379
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212PRT213智人(Homo sapiens)4004Met Lys Glu His Gly Gly Thr Phe Ser Ser Thr Gly Ile Ser Gly Gly1 5 10 15Ser Gly Asp Ser Ala Met Asp Ser Leu Gln Pro Leu Gln Pro Asn Tyr20 25 30Met Pro Val Cys Leu Phe Ala Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met35 40 45Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile50 55 60Gln Thr Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg65 70 75 80Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly85 90 95Asn Gln Val Ser Glu Tyr Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn100 105 110Asp Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Asp Arg Glu Lys Lys Lys115 120 125Lys Gln Gln Leu Met Thr Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His130 135 140Ser Ser Ser Leu Asn Asn Thr Ser Ile Ser Arg Phe Gly Val Asn Thr145 150 155 160Glu Asn Glu Asp His Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Trp165 170 175Gly Leu Asn Ile Phe Asn Val Ala Gly Tyr Ser His Asn Arg Pro Leu180 185 190Thr Cys Ile Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr195 200 205Phe Arg Ile Ser Ser Asp Thr Phe Ile Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu210 215 220Asp His Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala225 230 235 240Asp Val Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp245 250 255Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala260 265 270Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn275 280 285Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu290 295 300Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys305 310 315 320
Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys325 330 335Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser340 345 350Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser355 360 365Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu370 375 380Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu385 390 395 400Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln405 410 415Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys420 425 430Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp435 440 445Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro450 455 460Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr465 470 475 480Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln Asn485 490 495Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu500 505 510Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His Ser515 520 525Tyr Phe Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg530 535 540Asp Ser Leu Gly Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser545 550 555 560Pro Val Asp Thr210521120212DNA213人工序列220
223引物4005gccaggccgt gaagcaaata20
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223引物4006tcaaagacgc gaaaacat 18210721121212DNA213人工序列220
223引物4007ccgcgtcagt gcctttgcta t 21210821123212DNA213人工序列220
223引物4008cgctgtcgga tgcttttatt cac 23210921119212DNA213人工序列220
223引物4009tcgctttctg gagggtgtc 192101021118212DNA213人工序列220
223引物40010ccgcaggggc agcagtgg 18
權利要求
1.檢測受試者興奮毒性狀態或者神經元應激狀態的方法，所述方法包括體外測定來自受試者的樣品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的表達。
2.根據權利要求1的方法，所述方法包括檢測來自受試者的樣品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的突變RNA的存在，具體是全部或者部分3』非編碼區缺失的形式。
3.根據權利要求1或者2的方法，所述方法包括將來自受試者的含有核酸的生物樣品體外與包括全部或者部分來自PDE4B信使RNA或者基因的序列的核酸接觸，並且檢測雜交體的形成。
4.根據權利要求3的方法，其中樣品包括神經或者肌肉細胞。
5.根據上述任一權利要求的方法，用於診斷或者檢測阿默氏症，帕金森氏症，多發性硬化，亨汀頓舞蹈症，ALS或者腦局部缺血。
6.至少一種抑制或者降低PDE4B表達或者活性的化合物在製備設計用於治療神經退行性疾病的組合物中的應用。
7.根據權利要求6的應用，其中化合物為能夠抑制PDE4B基因轉錄或者相應的信使翻譯的反義核酸。
8.根據權利要求6的應用，其中化合物為天然或者合成來源的化合物。
9.根據權利要求8的應用，其中化合物選自吡唑並吡啶家族，尤其是etazolate，以及黃嘌呤衍生物家族，尤其是己酮可可鹼。
10.根據權利要求6到9中之一的應用，用於抑制或者降低神經退行性疾病早期階段的神經元的興奮毒性。
11.根據權利要求6到10中之一的應用，用於提高患有ALS的病人神經元的存活率。
12.根據權利要求6到11中之一的應用，用於治療阿默氏症，帕金森氏症，多發性硬化，亨汀頓舞蹈症，或者腦局部缺血。
13.根據權利要求6到11中之一的應用，用於治療ALS，尤其是用於降低ALS早期階段的神經元的興奮毒性。
14.己酮可可鹼在製備設計用於提高患有ALS病人的神經元存活率的組合物中的應用。
15.etazolate在製備設計用於提高患有ALS病人的神經元存活率的組合物中的應用。
16.至少一種屬於吡唑並吡啶家族的PDE4抑制劑化合物在製備設計用於提高患有ALS病人的神經元存活率的藥物組合物中的應用。
17.核苷酸引物，其組成為位於序列SEQ ID NO1的核苷酸2384和2869之間或者序列SEQ ID NO3的核苷酸2461和4068之間的序列或者其互補序列的8到20個連續殘基的片段。
18.分析PDE4表達，尤其是3』非編碼區和編碼區之間的差異表達的試劑盒，所述試劑盒包括特異於部分3』非編碼區序列的核苷酸探針以及特異於部分編碼區序列的核苷酸探針。
19.分析PDE4表達，尤其是3』非編碼區和編碼區之間的差異表達的試劑盒，所述試劑盒包括一對允許特異性擴增至少部分PDE4的3』非編碼區的核苷酸引物以及一對允許特異性擴增至少部分PDE4編碼區的核苷酸引物。
全文摘要
本發明涉及生物學，遺傳學和醫學領域。具體而言，本發明涉及檢測，鑑定和/或治療(或者控制)神經退行性疾病，尤其是肌萎縮側索硬化症的新方法。本發明同時涉及鑑定或者篩選對這些疾病有活性的化合物的方法。本發明進一步涉及用於實施上述方法的化合物，基因，細胞，質粒或者組合物。特別地，本發明描述了PDE4B在這些疾病中的作用及其作為治療、診斷或者試驗靶的應用。
文檔編號A61K48/00GK1541278SQ02815840
公開日2004年10月27日 申請日期2002年8月13日 優先權日2001年8月14日
發明者阿里·艾特·伊赫列夫, 安內利斯·熱欣卡, 法比安·施魏格霍費爾, 施魏格霍費爾, 斯 熱欣卡, 阿里 艾特 伊赫列夫 申請人:埃克森海特治療股份有限公司