Tnf－樣分泌性蛋白質的製作方法

2023-12-01 11:24:06 3

專利名稱：Tnf－樣分泌性蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新穎的蛋白質INSP058，經本發明鑑定為一種TNF-樣分泌性蛋白質，本發明還涉及該蛋白質和編碼基因的核酸序列在診斷、預防和治療疾病中的應用。
本文所引用的出版物、專利和專利申請，均納入其全文作為參考。
背景技術：
目前，藥物發現方法正蘊釀著一場根本革命，因為功能基因組學年代已經來臨。術語「功能基因組學」應用於使用生物信息學工具將功能歸因於感興趣的蛋白質序列的方法。這些工具正日益顯示其必要性，因為序列數據產生的速度遠遠高於研究實驗室將功能劃分給這些蛋白質序列的能力。
隨著生物信息學工具的功效和準確性提高，這些工具正快速取代生物化學特性鑑定的常規技術。事實上，鑑定本發明所用的先進生物信息學工具現在能夠輸出可獲得較高置信度的結果。
各所研究院和商業機構正在檢查已有的序列數據，並且逐漸獲得重大發現。例如，Incyte Genomics，Inc.提交了一個專利申請，公開號為WO 00/68380，該專利申請涉及人胞外基質與粘著相關蛋白質(EXMAD)有關的序列以及鑑定和編碼EXMAD的聚核苷酸。然而，仍然有必要鑑定和特性分析其它基因和它們編碼的多肽，作為研究和藥物發現的目標。
分泌性蛋白質細胞製造和分泌胞外蛋白質的能力是許多生物過程的中心。酶、生長因子、胞外基質蛋白和信號傳導分子全部由細胞分泌出來。這是分泌小泡與質膜融合所致。多數情況下，但不是所有情況，蛋白質被信號肽導入內質網，並進入分泌小泡。信號肽是順式作用序列，影響多肽鏈從細胞質轉運至膜結合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌進入胞外基質，或者留在質膜內。留在質膜內的多肽有一或多個跨膜結構域。在細胞機能中發揮中心作用的分泌性蛋白質的例子是細胞因子、激素、胞外基質蛋白(粘附分子)、蛋白酶、TNF樣蛋白質及生長和分化因子。
因此，分泌性蛋白質活性的改變為改變疾病表型提供了一種手段，這樣，鑑定新穎的分泌性蛋白質特別是TNF-樣分泌性蛋白質是有密切聯繫的，這是因為它們在某些疾病中起著一定作用，因而可用於研究新的療法。

發明內容
本發明基於如下發現INSP058蛋白質是TNF-樣分泌性蛋白質。
本發明第一方面一實施例提供一種多肽，該多肽(i)包括SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO12所示的胺基酸序列；(ii)是其片段，該片段是TNF-樣分泌性蛋白質，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
本發明第一方面第二實施例提供一種多肽，該多肽(i)由SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO12所示的胺基酸序列組成；(ii)是其片段，該片段具有TNF-樣分泌性蛋白質的功能，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
較佳地，第一或第二實施例的片段或功能等同物由SEQ ID NO9和/或SEQ ID NO16所示的胺基酸序列組成。
下文將具有SEQ ID NO8所示的序列的多肽稱為「INSP058多肽」。此處也將該蛋白質稱為TNF-樣分泌性蛋白質。鑑定該蛋白質為已知功能蛋白質的最接近聯繫物是補體1q蛋白質。補體1q(C1q)蛋白質是TNF相關蛋白質，這是因為晶體學研究已經揭示，TNF和小鼠ACRP30的球狀g C1q結構域有極其密切關係的三級結構和三聚組織，提示TNF與C1q家族之間有進化聯繫。到目前為止，人C1q基因家族包含13個成員，包括諸如CRF、ACRP30、CORS26、EMILIN-1、EMILIN-2等膠原成員、膠原蛋白VII和X以及諸如precerebellin和multimerin等非膠原成員。ACRP30是一種豐富的血清蛋白質，應答胰島素而在脂肪組織中合成，在肥胖的小鼠和人體內下調。關於C1q家族的最新綜述，可參見Bodmer等的文章(TRENDS in Biochemical Sciences27(1)19-26，2002)。
C1q家族成員可用來治療、預防和/或診斷醫學病症和疾病，譬如細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少症、血小板減少症、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎症疾病，包括過敏症、炎症性腸疾病、關節炎、銀屑病和呼吸道發炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化症、血栓症、敗血症、休克、再灌注損傷和缺血；神經系統疾病，包括中樞神經系統疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化症和疼痛；發育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質疏鬆和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質介導的病症，特別是由C1q家族蛋白質介導的那些。
可以預測，INSP058多肽由三個外顯子編碼(外顯子1編碼具有SEQ IDNO2所示序列的多肽，外顯子2編碼具有SEQ ID NO4所示序列的多肽，外顯子3編碼具有SEQ ID NO6所示序列的多肽)。現有技術已經公開了一個與SEQ ID NO8有一定相似性的序列，但該蛋白質沒有被注釋為帶有TNF-樣摺疊的分泌性蛋白質。此多肽序列在國際專利申請WO 00/68380中以SEQID NO8表示，明確地排除於本發明這一方面的範圍內。
下文將具有SEQ ID NO10所示的序列的多肽稱為「INSP058SV多肽」或「INSP058SV」。INSP058SV多肽是INSP058多肽的剪報變體，經由在外顯子3中間部分缺失產生(SEQ ID NO5)。此缺失以及外顯子3一部分的缺失，在核苷酸序列中引入了讀框移動，結果是一個早期終止密碼子，這樣，翻譯INSP058SV多肽的長度比INSP058多肽短得多(圖10)。INSP058SV蛋白質缺少一個與C1q結構域匹配的結構域，該結構域在全長INSP058可以找到，提示INSP058SV可以是INSP058的拮抗劑，例如起著與多肽INSP058譯本競爭受體上同一個結合位的作用。在這種機制中，INSP058SV多肽不會刺激受體，因此不會誘導正常的生物作用。所以，這種多肽可以是天然多肽的競爭抑制劑。
雖然申請人並不希望受此理論約束，但要求INSP058多肽和INSP058SV多肽各自的首15個胺基酸形成信號肽。
SEQ ID NO14是無信號序列的全長INSP058多肽序列。下文將具有SEQID NO14所示的序列的多肽稱為「INSP058成熟多肽」。
本文所用的術語「INSP058多肽」包括含有INSP058外顯子1多肽、INSP058外顯子2多肽、INSP058外顯子3多肽、INSP058多肽和INSP058成熟多肽的多肽。
SEQ ID NO16是無信號序列的全長INSP058SV多肽序列。下文將具有SEQ ID NO16所示的序列的多肽稱為「INSP058SV成熟多肽」。
本文所用的術語「INSP058SV多肽」包括含有INSP058SV成熟多肽的多肽。
本發明第二方面提供一種編碼本發明第一方面的多肽的純化核酸分子。該純化核酸分子最好包括SEQ ID NO7(編碼INSP058多肽)、SEQ ID NO9(編碼INSP058SV多肽)、SEQ ID NO11(編碼成熟INSP058外顯子1多肽)、SEQ ID NO13(編碼成熟INSP058多肽)、SEQ ID NO15(編碼成熟INSP058SV多肽)所示的核酸序列，或者是該序列的一個冗餘等同物或片段。
本發明還提供該純化核酸分子由SEQ ID NO7(編碼INSP058多肽)、SEQID NO9(編碼INSP058SV多肽)、SEQ ID NO11(編碼成熟INSP058外顯子1多肽)、SEQ ID NO13(編碼成熟INSP058多肽)、SEQ ID NO15(編碼成熟INSP058SV多肽)所示的核酸序列組成，或者是該序列的一個冗餘等同物或片段。
本發明第三方面提供一種在高度嚴謹條件下與本發明第二方面的核酸分子雜交的純化核酸分子。
本發明第四方面提供一種含有本發明第二或第三方面的核酸分子的載體，例如表達載體。
本發明第五方面提供一種用本發明第四方面的載體轉化的宿主細胞。
本發明第六方面提供一種特異性地結合本發明第一方面的多肽的配體。較佳地，所述配體抑制本發明第一方面的多肽的功能，後者是具有TNF--樣活性的分泌性蛋白質。本發明多肽的配體可以有各種形式，包括天然或修飾基質、酶、受體、有機小分子(如分子量最多為2000D最好800D或以下的天然或合成有機小分子)、肽模擬物、無機分子、肽、多肽、抗體、上述物質的結構或功能模擬物。
本發明第七方面提供一種化合物，它能有效地改變編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者能調節本發明第一方面的多肽的活性。
本發明第七方面的化合物可增加(激動)或者減少(拮抗)多肽的基因表達水平或活性。重要的是，對INSP058多肽功能的鑑定允許設計能夠鑑定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的篩選方法。本發明第六和第七方面的配體和化合物可用這樣的方法鑑定。這些方法包括在本發明範圍內。
本發明第八方面提供本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物在治療或診斷涉及TNF--樣分泌性蛋白質的疾病中的應用。這些疾病可包括但不限於細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少症、血小板減少症、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎症疾病，包括過敏症、炎症性腸疾病、關節炎、銀屑病和呼吸道發炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化症、血栓症、敗血症、休克、再灌注損傷和缺血；神經系統疾病，包括中樞神經系統疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化症和疼痛；發育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質疏鬆和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質介導的病症，特別是由C1q家族蛋白質介導的那些。這些分子也可用來製造治療上述疾病的藥物。本發明第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的一部分分子也可用製造治療上述疾病的藥物。
本發明第九方面提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評估所述病人組織中編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發明第一方面的多肽的活性，並將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法最好在體外進行。可用類似方法監測對病人疾病的治療，其中多肽或核酸分子的表達水平或活性在一段時間內趨向於對照水平，表示該疾病獲得緩解。
檢測本發明第一方面的多肽的優選方法包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽複合物的條件下，將本發明第六方面的一種配體，例如抗體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述複合物。
本領域的讀者將懂得，本發明第九方面的方法有很多種，例如，核酸與短探針雜交法、點突變分析法、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法以及使用抗體檢測異常蛋白水平的方法。類似方法的使用可以是短期或長期，以治療病人被監測的疾病。本發明還提供一些用於這些方法中診斷疾病的試劑盒。
較佳地，用本發明第九方面的方法診斷的疾病是涉及TNF-樣分泌性蛋白質的疾病，如上所述。
本發明第十方面提供本發明第一方面的多肽作為TNF-樣分泌性蛋白質的應用。
本發明第十一方面提供一種藥物組合物，該組合物含有本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物以及藥學上可接受的載體。
本發明第十二方面提供本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物在製造診斷或治療疾病的藥物中的應用。
較佳地，所述疾病是涉及TNF-樣分泌性蛋白質的疾病，如上所述。
本發明第十三方面提供一種治療病人疾病的方法，該方法包括把本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物給予該病人。
當與健康受試者中編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發明第一方面的多肽的活性相比，患病病人的該表達水平或活性較低的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、宿主細胞、配體或化合物應該是激動劑。相反，當與健康受試者中所述多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病病人的該表達水平或活性較高的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、宿主細胞、配體或化合物應該是拮抗劑。拮抗劑的例子包括反義核酸分子、核酶和配體，例如抗體。
較佳地，所述疾病是涉及TNF-樣分泌性蛋白質的疾病，如上所述。
本發明第十四方面提供轉基因或剔除非人動物，它們被轉化為表達本發明第一方面的多肽的更高水平、更低水平或不表達。這些轉基因動物是研究疾病極為有用的模型，也可用在鑑定有效治療或診斷該疾病的化合物的篩選方案中。
以下，給出為實施本發明而可採用的標準技術和步驟的概要。應明白，本發明並不限於所述的這些具體方法、方案、細胞系、載體和試劑。還應明白，本文所用的術語目的僅在於描述具體實施例，該術語不應該被看成為限定本發明的範圍。本發明的範圍只由所附權利要求書的術語限定。
本說明書中核苷酸和胺基酸使用標準縮寫。
除非另有指出，本發明的做法是採用分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學的常規技術，它們都已為本領域技術人員所掌握。
這些技術在有關文獻中已有詳細解釋。例如，可參考以下特別適用的文獻Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesS.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.HamesS.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein PurificationPrinciples and Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。
本文所用的術語「多肽」包括含有相互間以肽鍵或修飾肽鍵連接的兩個或以上胺基酸的任何肽或蛋白質，即肽同構物(isostere)。該術語指短鏈(肽和寡肽)和長鏈(蛋白質)。
本發明的多肽可以是成熟蛋白質形式，或者可以是前(pre-，pro-，prepro-)蛋白質，其可通過切割前部分而被激活，產生活性成熟多肽。這些多肽中的前序列可以是先導序列或者分泌序列或者是用來純化成熟多肽序列的序列。
本發明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，有利的往往包括一或多個附加胺基酸序列，這些附加胺基酸序列可含有分泌序列或先導序列、前序列(pro-sequences)、有助純化的序列、或者例如在重組生產中賦予蛋白質更高穩定性的序列。另一個選擇或者另一方面是，成熟多肽可與另一種化合物，例如與延長該多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。
多肽可含有由天然過程，例如翻譯後加工，或者由本領域公知的化學修飾技術修飾的胺基酸，它們不同於20個基因編碼的胺基酸。在已知的修飾中，本發明的多肽通常帶有的修飾是糖基化、脂質附著、硫酸化、例如穀氨酸殘基的γ-羧酸化，羥基化和ADP-核糖基化。其它可能的修飾包括乙醯化、醯化、醯胺化、黃素的共價附著、血素分子的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質衍生物的共價附著、磷脂醯肌醇的共價附著、交聯、環化、二硫鍵形成、脫甲基、共價交聯形成、半胱氨酸形成、焦穀氨酸鹽形成、甲醯化、GPI錨著形成、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒醯化、轉移-RNA介導的蛋白質中插入胺基酸例如精氨醯化，以及遍在蛋白化。
修飾可發生於多肽的任何位置，包括肽骨架、胺基酸側鏈以及氨基或羧基末端。事實上，天然存在的肽和合成肽一般通過共價修飾封閉肽的氨基或羧基末端，或者封閉二者，這樣的修飾存在於本發明的多肽中。
發生在多肽內的修飾通常是隨製成該多肽而變化。對於重組製成的多肽，通過特定宿主細胞翻譯後修飾能力以及存在於所述多肽的氨基序列中的修飾信號來確定大部分修飾的性質和程度。例如，不同類型的宿主細胞之間糖基化型式是不同的。
本發明的多肽可以任何合適的方式製成。這些多肽包括分離的天然存在的多肽(例如自細胞培養基中純化而來)、重組產生的多肽(包括融合蛋白)、合成產生的多肽或者通過這些方法組合所產生的多肽。
本發明第一方面的功能等同多肽可以是與INSP058多肽同源的多肽。如果一個多肽的序列與另一個多肽的序列具有足夠高程度的同一性或相似性，本文就用術語「同源的」來形容該兩個多肽。「同一性」表示在比對序列的任何特定位置上，兩個序列之間的胺基酸殘基是相同的。「相似性」表示在比對序列的任何特定位置上，兩個序列的胺基酸殘基是相似的。同一性和相似性的程度不難計算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
所以，同源多肽包括INSP058多肽的天然生物變體(例如，產生多肽的物種內等位基因變體或地理變體)和突變體(例如，含有胺基酸取代、插入或缺失的突變體)。這些突變體可包括其一或多個胺基酸殘基被保守性或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)取代的多肽，這樣一個取代的胺基酸殘基可以或不必是遺傳密碼編碼的殘基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu之間；在Asn和Gln之間；在鹼性殘基Lys和Arg之間；或者在芳香族殘基Phe和Tyr之間。特別優選的是這樣一些變體有多個胺基酸，即5至10個胺基酸，1至5個胺基酸，1至3個胺基酸，1至2個胺基酸，或者僅有1個胺基酸以任意組合取代、缺失或插入的變體。特別優選的是不改變該蛋白質的性質和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特別優選的還有保守性取代。這些突變體也包括其中一或多個胺基酸殘基包括一取代基團的多肽。
通常，兩個多肽之間的同一性大於30％，就認為它們在功能上是等同的。本發明第一方面的功能等同多肽與INSP058多肽，或其活性片段的序列同一性優選大於80％。更好的多肽與INSP058多肽的序列同一性分別具有大於85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
本發明第一方面的功能等同多肽還可以是已用一或多種結構對比技術鑑定的多肽。例如，可以應用Inpharmatica Genome Threader技術(它構成用於產生Biopendium檢索資料庫的檢索工具的其中一部分，參見共同待審批PCT專利申請PCT/GB01/01105)來鑑定現時具有未知功能的多肽，這些多肽雖然與INSP058多肽具有較低的序列同一性，但由於與INSP058多肽序列共享較高水平的結構同源性，故可預計它們有TNF-樣分泌性蛋白質的功能。「較高水平的結構同源性」指用Inpharmatica Genome Threader預測兩個蛋白質確定共享10％和以上的結構同源性。
本發明第一方面的多肽還包括INSP058多肽的片段、INSP058多肽的功能等同物的片段，只要那些片段保留了TNF-樣分泌性蛋白質的功能，或者帶有與INSP058多肽相同的抗原性決定簇。
本文所用的術語「片段」指胺基酸序列與INSP058多肽或它的其中一種功能等同物的部分而非全部胺基酸序列相同的多肽。這些片段應包括所述序列的至少n個保守性胺基酸，取決於特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性決定簇。
全長INSP058多肽的片段可由1或多個相鄰外顯子序列的組合或者由部分外顯子序列的組合組成。例如，這樣的組合可包括INSP058多肽的外顯子1、2和外顯子3的部分序列，INSP058SV就是這樣的情況。
這些片段可以是「獨立的(free-standing)」，即不是其它胺基酸或多肽的一部分，也不與其它胺基酸或多肽融合，或者它們可包含在它們構成其中一部分或區域的較大多肽之內。當包含在較大多肽之內時，本發明的片段最好構成單個連續區域。例如，一些優選實施例涉及一個片段，其具有與該片段的氨基末端融合的前多肽區域，和/或具有與該片段的羧基末端融合的附加區域。然而，單一個較大多肽內可含有多個片段。
本發明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一個抗原性決定簇)可被應用來產生對這些多肽有免疫特異性的配體，例如多克隆或單克隆抗體。這些抗體可用於分離或鑑定表達本發明的多肽的克隆，或者用於親和力層析法純化這些多肽。抗體還可用來幫助診斷或治療，以及其它應用，這對本發領域技術人員是顯而易見的。
術語「免疫特異性」指抗體對本發明的多肽的親和力遠遠大於它們對現有領域其它相關多肽的親和力。本文所用的術語「抗體」指能夠與所述抗原性決定簇結合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，這些抗體與本發明第一方面的多肽結合。
「遠遠較大的親和力」指的是與已知的分泌性蛋白質的親和力相比，本發明多肽的親和力有可測量的增大。
較佳的是，對本發明多肽的親和力相對於已知的細胞表面受體多肽至少增大1.5倍，2倍，5倍，10倍，100倍，103倍，104倍，105倍、106倍。
如果需要多克隆抗體，可用本發明第一方面的多肽使一種選定哺乳動物免疫，例如小鼠、兔、山羊或馬。用來免疫動物的多肽可通過重組DNA技術產生，或者可通過化學方法合成。有需要的時候，可將多肽與一載體蛋白質連接。通過化學方法與多肽偶聯的常用載體包括牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔血藍蛋白。然後，用偶聯的多肽來免疫動物。採集該免疫動物的血清，再按公知的程序，例如免疫親和力層析法加以處理。
本領域技術人員可輕易地生產針對本發明第一方面的多肽的單克隆抗體。應用雜交瘤技術生產單克隆抗體的一般方法已為人所公知(例如，參見Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 472(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可針對各種性質，即同種型、表位、親和力等，篩選對本發明第一方面的多肽產生的多系列單克隆抗體。單克隆抗體特別用於純化它們所針對的各種多肽。另一方面，編碼感興趣的單克隆抗體的基因可通過例如本領域公知的PCR技術在雜交瘤中分離出來，並可在適當載體中克隆和表達。
還可使用嵌合抗體，其中非人的可變區與人穩定區連接或融合(例如，參見Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。
可對抗體進行修飾，例如通過使它人源化，以便在某一個體內的免疫原性減弱(參見ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的術語「人源化抗體」指非人供體抗體的重鏈和/或輕鏈可變區內CDR胺基酸和選定的其它胺基酸已經被人抗體的等同胺基酸所取代的抗體分子。所以，人源化抗體與人抗體極為相近，但具有與該供體抗體結合的能力。
另一個選擇是，抗體可以是「雙特異性」抗體，即它是一種有兩個不同抗原結合區的抗體，每一結合區針對不同表位。
可應用噬菌體展示技術選擇基因，所述基因編碼具有與本發明多肽結合的活性的抗體，多肽來自為具有相關抗體而篩選的以PCR技術擴增的人淋巴細胞V基因庫，或者天然文庫(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。這些抗體的親和力也可通過鏈改組加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
以上述技術產生的多克隆抗體或單克隆抗體有額外應用，因為它們可用作免疫測定法、放射性免疫測定法(RIA)或者酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中的試劑。這些應用可使用可分析檢測到的試劑，例如放射性同位素、螢光分子或酶來標記抗體。
本發明第二和第三方面的優選核酸分子是編碼SEO ID NO8所示的多肽序列和功能上等同的多肽的那些分子。這些核酸分子可用於本文描述的方法和應用中。本發明的核酸分子最好含有至少n個本文所公開的序列中的連續核苷酸，取決於特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。
本發明的核酸分子還包括上述核酸分子的補體序列(例如，用於反義或探測目的)。
本發明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因組DNA。這樣一些核酸分子可通過克隆、化學合成技術或其組合獲得。例如，核酸分子可通過應用諸如固相亞磷醯胺化學合成從基因組或cDNA文庫化學合成，或者從生物體中分離而製備。RNA分子的產生是運用DNA序列的體內或體外轉錄。
核酸分子可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈，也稱有義鏈，或者它可以是非編碼鏈，也稱反義鏈。
術語「核酸分子」還包括DNA和RNA類似物，例如含有修飾骨架的那些類似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的術語「PNA」指反義分子或反基因試劑，其含有長至少5個核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸與最好以賴氨酸為末端的胺基酸殘基肽骨架連接。該末端賴氨酸使組合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延長它們在細胞內的停留時間，在細胞內它們優先與補體單鏈DNA和RNA結合，並終止轉錄延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)AnticancerDrug Des.853-63)。
編碼SEQ ID NO8所示的多肽的核酸分子可與SEQ ID NO7所示的核酸分子的編碼序列相同。
這些分子還可以有另一個不同序列，因為遺傳密碼簡併性，該不同序列編碼SEQ ID NO8所示的多肽。這樣一些核酸分子可包括，但不限於，成熟多肽自身的編碼序列；成熟多肽的編碼序列加上附加編碼序列，例如編碼先導序列或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的編碼序列，加上或不加上前述附加編碼序列，再加上另外一些非編碼序列，包括非編碼5』和3』序列，例如在轉錄(包括終止信號)、核糖體結合和mRNA穩定性中發揮作用的轉錄非翻譯序列。核酸分子還包括編碼附加胺基酸的附加序列，例如提供附加功能的那些胺基酸。
本發明第二和第三方面的核酸分子也可編碼本發明第一方面的多肽及片段的片段或功能等同物。這樣一種核酸分子可以是天然存在的變體，例如天然存在的等位基因變體，或者該分子可以是未知是天然存在的變體。核酸分子的非天然存在的變體可通過誘變技術製成，包括適用於核酸分子、細胞或生物體的那些技術。
就此而言，這些變體是通過核苷酸取代、缺失或插入而不同於上述核酸分子的變體。取代、缺失或插入可涉及一或多個核苷酸。變體可在編碼區或非編碼區或者二者內發生變化。編碼區內的變化可產生保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或插入。
本發明的核酸分子也可以採用本領域公知的方法為多種原因而進行改造，這些原因包括修飾克隆、加工、和/或基因產物(多肽)的表達。可用來改造核苷酸序列的技術還包括應用隨機斷裂所作的DNA改組、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新裝配。可利用定點誘變插入新的限制位點，改變糖基化模式，修改密碼子偏向，產生剪接變體，引入突變等等。
編碼本發明第一方面的多肽的核酸分子可與異源序列連接，以致該組合核酸分子編碼融合蛋白。這樣一些組合核酸分子包括在本發明第二和第三方面之內。例如，要在肽庫中篩選抑制多肽活性的抑制劑，用這種組合核酸分子表達可被市售抗體識別的融合蛋白是有用的。融合蛋白還可被改造成含有位於本發明多肽的序列與異源蛋白質的序列之間的切割位點，這樣，切割該多肽，從該異源蛋白質中純化出來。
本發明的核酸分子還包括一些反義分子，它們與編碼本發明的多肽的核酸分子部分互補，因而與編碼核酸分子雜交。如本領域普通技術人員所知，這些反義分子，例如寡核苷酸，可設計成識別、特異性地結合以及防止編碼本發明多肽的靶核酸的轉錄(例如，參見Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。
本文所用的術語「雜交」指兩個核酸分子通過氫鍵相互締合。通常，將一個分子固定於固相支持物上，而另一個分子在溶液中游離。然後，在有利氫鍵鍵合的條件下使兩個分子相互接觸。影響鍵合的因素包括溶劑的類型和體積；反應溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相分子與固相支持物非特異性附著的試劑(Denhardt′s試劑或BLOTTO)；分子的濃度；提高分子締合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；雜交後洗滌條件的嚴謹程度(參見上述文獻Sambrook等)。
應用本領域公知的雜交測定法(例如，參見上述文獻Sambrook等，同上)，可檢查一個完全互補分子與靶分子雜交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152507-511)的教導，在不同嚴謹程度的條件下，使基本上同源的分子競爭並抑制完全同源的分子與靶分子的結合。
「嚴謹程度」指在雜交反應中與不同的分子締合相比，有利於極度相似的分子締合的條件。高度嚴謹雜交條件定義為42℃下在一溶液中培養過夜，該溶液含有50％甲醯胺、5XSSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升變性剪切鮭魚精子DNA，然後，約65℃下在0.1X SSC中洗滌過濾器。低度嚴謹條件涉及在35℃下進行的雜交反應(參見上述文獻Sambrook等)。雜交使用的優選條件是高度嚴謹雜交條件。
本發明該方面的優選例子是其全長至少有70％與編碼INSP058多肽(SEQID NO8)的核酸分子相同的核酸分子以及基本上與這些核酸分子互補的核酸分子。本發明該方面的優選核酸分子含有一區域，該區域的全長至少有97％與此編碼序列相同，或者是一個互補核酸分子。就此而言，特別優選的是其全長至少有98％，優選至少99％或以上與所述核酸分子相同的核酸分子。優選的例子是編碼基本上保留與INSP058多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。
本發明還提供一種檢測本發明核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)在雜交條件下，將本發明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；以及(b)檢測所形成的任何雙鏈體。
下文另外討論關於本發明可採用的測定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因組DNA的雜交探針，分離編碼INSP058多肽的全長cDNA和基因組克隆，以及分離與編碼該多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因組克隆。
在這點上，可以使用以下技術，其中包括已為本領域技術人員所知的，為了舉例說明討論如下。DNA的測序和分析方法已為人公知，在本領域中可以得到，事實上這些方法也用於以下討論的本發明很多實施例中。這些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列諾片段測序酶(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐熱T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者這些酶的組合，以及校讀外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE擴增系統中找到的那些外切核酸酶。優選的測序方法可應用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、PeltierThermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化劑以及373和377 DNA測序儀(Perkin Elmer)等儀器進行自動操作。
一種分離編碼具有與INSP058多肽等同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本領域公認的標準程序用天然或人工設計的探針探測基因組或cDNA文庫(例如，參見″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，GreenePublishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特別有用的探針含有至少15個，優選至少30個，更好是至少50個鄰接鹼基，這些鹼基對應於，或者與適當的編碼基因的核酸序列(SEQ ID NO7)互補。使用可分析檢測到的試劑標記探針，方便鑑定。有用的試劑包括，但不限於，放射性同位素、螢光染料和能夠催化待檢測產物形成的酶。有了這些探針，本領域普通技術人員就能夠從人、哺乳動物或其它動物來源中分離出感興趣的基因組DNA、cDNA或RNA聚核苷酸編碼蛋白質的互補拷貝，並能夠在這些來源中篩選出有關序列，例如該家族、類型和/或亞型的額外成員。
多數情況下，分離的cDNA序列是不完整的，因為編碼多肽的區域通常在5』端被截短。現時有一些方法可獲得全長cDNA，或者將短cDNA延長。應用部分核苷酸序列和本領域公知的方法檢測上遊序列，例如啟動子和調控組件，可將這些序列延長。例如，可採用的一種方法是基於快速擴增cDNA末端的方法(RACE；例如參見Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)對這種技術進行了改進，例如使較長cDNA的檢索大大簡化。另一種稍稍不同的技術稱為「限制位點」PCR，它使用通用探針檢索鄰接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2318-322)。以基於已知區域的趨異性引物，也可用反向PCR來擴增或延長序列(Triglia，T.等，(1988)Nucleic Acids Res.168186)。捕捉PCR是可使用的另一種方法，它涉及通過PCR技術擴增鄰接人和酵母人工染色體DNA中已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用來檢索未知序列的另一種方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic Acids Res.193055-3060)。另外，人們可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文庫來查看基因組DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。這種方法不需篩選文庫，可用於尋找內含子/外顯子接合。
當篩選全長cDNA時，最好用已經按大小進行選擇包含了較大cDNA的文庫。優選的還有隨機引物文庫，因為它們含有較多含基因5』區的序列。對於寡d(T)文庫不能產生全長cDNA的情形，最好使用隨機引物文庫。基因組文庫可用來將序列延伸進入5』非轉錄調控區。
在本發明一實施例中，本發明的核酸分子可用來進行染色體定位。在這一技術中，核酸分子特異性靶向，並能與單個人染色體的特定位置雜交。對本發明染色體的相關序列作圖譜，是確認那些序列與基因相關疾病相互關係的重要步驟。一旦將序列與準確染色體位置在圖譜反映出來，就可以將染色體上序列的物理位置與基因圖譜數據關聯起來。這些數據例如可以在人類孟德爾遺傳學資料庫中找到(Johns Hopkins大學韋爾奇醫學庫在線提供)。然後，通過連鎖分析(物理相鄰基因的共同繼承)確定基因與定位在同一個染色體區的疾病之間的關係。這為研究人員用定位克隆或其它基因發現技術檢索疾病基因提供了有價值的信息。一旦通過遺傳連鎖分析粗略確定了疾病或症候群位於特定基因組區，定位在該區域的任何序列代表相關或調控基因，可作進一步研究。核酸分子還可用來檢測由於正常、載體或染病個體之間移位、反轉等造成染色體位置的差異。
本發明的核酸分子對於組織定位也是有價值的。這些技術通過檢測編碼多肽的mRNA可以確定該多肽在組織中的表達模式。這些技術包括原位雜交技術和核苷酸擴增技術，例如PCR。從研究中獲得的結果可知道生物體中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表達模式與突變基因編碼的mRNA的正常表達模式之間的比較研究為理解突變多肽在疾病中的作用提供了有價值的認知。不適當表達可以是時間、空間或量化。
還可採取基因沉默方法使編碼本發明多肽的基因內源表達下調。一種方法是RNA幹擾(RNAi)(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)，可用來使序列特異性翻譯後基因沉默。短dsRNA寡核苷酸在體外合成，並導入細胞中。這些dsRNA寡核苷酸的序列特異性結合引發靶mRNA降解，從而減少或消除靶蛋白質表達。
評估上述基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上測量多肽的表達(例如，Western印跡)。
本發明的載體包含本發明的核酸分子，可以是克隆或表達載體。本發明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，它們可用本發明的載體轉化、轉染或轉導。
本發明的多肽的製備可以重組形式在宿主細胞所含的載體內表達它們的編碼核酸分子。這些表達方法已為本領域技術人員公知，很多方法已由上述的Sambrook和Fernandez與Hoeffler的書(1998，eds.″Gene expression systems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)詳細敘述。
一般而言，可使用適合維持、繁殖或表達核酸分子在一所需宿主內產生多肽的任何系統或載體。應用各種公知的常規技術，例如上述Sambrook中描述的技術，可將適當的核苷酸序列插入一表達系統中。通常，可使編碼基因受控於調控組件，例如啟動子、核糖體結合位點(對於細菌表達)，任選地是操縱子，以便將編碼所希望的多肽的DNA序列轉錄至轉化宿主細胞的RNA內。
例如，適當的表達系統的例子包括染色體系統、附加體系統和病毒衍生系統，包括例如衍生自以下物質的載體細菌質粒、噬菌體、轉位子、酵母附加體、插入組件、酵母染色體組件、病毒，例如杆狀病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆轉錄病毒，或者其組合，例如從質粒和噬菌體遺傳因子所產生的載體，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色體(HACs)也可用來輸送質粒中所含有和表達的較大DNA片段。
特別適合的表達系統包括微生物，例如用重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達系統轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；用病毒表達載體(例如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒CaMV；菸草花葉病毒TMV)或者用細胞表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或者動物細胞系統。無細胞翻譯系統也可用來產生本發明的多肽。
參照許多標準實驗手冊，例如Davis等(Basic Methods in Molecular Biology(1986))和上述Sambrook等中描述的方法，可將編碼本發明的多肽的核酸分子導入宿主細胞內。特別適合的方法包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉位、微量注射、陽離子質粒介導的轉染、電穿孔、轉導、劃痕加載、彈導導入或感染(參見上述Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，GoldmanLeinwald，1998)。在真核細胞中，表達系統可以是暫時的(例如附加體)或者永久的(染色體整合)，取決於該系統的需要。
編碼核酸分子可以包括或不包括編碼調控序列例如信號肽或先導序列的序列，有需要的時候，例如將翻譯的多肽分泌到內質網腔、胞質間隙或胞外環境中。這些信號可以與該多肽內源，或者它們可以是異源信號。先導序列可在翻譯後加工中被細菌宿主除去。
除了調控序列之外，希望可以加入能調節與宿主細胞生長有關的多肽表達的調節序列。調節序列的例子是對化學和物理刺激，包括調節化合物的存在，或者對各種溫度或代謝條件的應答可引起基因的表達增大或減少的序列。調節序列是載體的那些非翻譯區，例如增強子、啟動子以及5』和3』非翻譯區。它們與宿主細胞蛋白質相互作用，進行轉錄和翻譯。這些調節序列的強度和特異性可以是不同的。取決於所用的載體系統和宿主，可使用任何數量的適當轉錄和翻譯組件，包括組成型和誘導型啟動子。例如在細菌系統內克隆時，可使用誘導型啟動子，例如Bluescript噬菌粒的雜交lacZ啟動子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM質粒(Gibco BRL)等等。在昆蟲細胞內可用杆狀病毒多角體蛋白啟動子。由植物細胞基因組(例如，熱激、RUBISCO和貯藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒啟動子或先導序列)衍生而來的啟動子或增強子可克隆到載體中。哺乳動物細胞系統優選使用哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。如果需要產生含有序列的多個拷貝的細胞系，可使用基於SV40或EBV的載體和一適當選擇性標記物。
構建一個表達載體，用適當的調節序列可以使特定核酸編碼序列位於該載體內，所述編碼序列相對於調節序列的定位和方向使得該編碼序列在該調節序列的「控制」下轉錄，即與DNA分子結合的RNA聚合酶在調節序列下轉錄該編碼序列。在一些情況下，有需要將序列修飾成它可以適當方向附著於調控序列，即維持讀框。
調控序列和其它調節序列可在插入載體之前先連接到核酸編碼序列。另一個選擇是，直接將編碼序列克隆到已經含有調控序列和適當限制位點的表達載體中。
對於長時間高得率地生產重組多肽，最好有穩定的表達。例如，穩定地表達感興趣的多肽的細胞系可以用含有病毒來源複製的表達載體和/或同一個或不同載體上的內源性表達組件和選擇性基因轉化。導入載體之後，允許細胞先在富集培養基中生長1-2天，再轉移到選擇培養基中。選擇性標記物的目的是為選擇帶來抗性，它的存在可以使成功表達導入序列的細胞生長和恢復。穩定轉化的細胞的抗性克隆可應用適合細胞類型的組織培養技術進行增殖。
本領域技術人員已知哺乳動物細胞系可用作表達宿主，而哺乳動物細胞系包括美國典型菌種保藏中心(ATCC)的許多無限增殖化細胞系，包括但不限於，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎(COS)細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK 293細胞、Bowes黑色素瘤細胞和人肝細胞癌(例如Hep G2)細胞以及其它許多細胞系。
杆狀病毒系統中，用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的物質在市場上以試劑盒形式提供，可以購自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(「MaxBac」試劑盒)。這些技術對本領域技術人員而言是眾所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特別適合該系統使用的宿主細胞包括昆蟲細胞，例如果蠅S2細胞和草地夜蛾Sf9細胞。
本領域已經知道很多植物細胞培養基和全植物遺傳表達系統。合適的植物細胞遺傳表達系統的例子包括美國專利US 5,693,506；US 5,659,122；和US5,608,143中描述的系統。植物細胞培養基的遺傳表達的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具體地說，可使用分離和培養原生質體得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有轉移基因。特別是所有植物可從培養細胞或組織中再生，包括但不限於甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其它樹木、豆類和蔬菜的所有主要種屬。
特別優選的細菌宿主細胞的例子包括鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈黴菌和枯草芽孢桿菌細胞。
特別適合真菌表達的宿主細胞的例子包括酵母細胞(例如釀酒酵母)和麴黴菌細胞。
本領域已經知道許多選擇系統，它們都可用來回收轉化細胞系。例如，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等人，(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy，I.等人，(1980)Cell 22817-23)基因可分別用在tk-或aprt±細胞中。
另外，選擇的基礎可以是抗代謝物、抗生素或除草劑抗性；例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予氨基糖苷新黴素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等人，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)，als或pat分別賦予綠黃隆和草丁膦乙醯轉移酶抗性。此外，還描述了其它選擇性基因，它們的例子為本領域技術人員所知。
雖然標記基因表達的存在或不存在提示感興趣的基因也是存在的，但它的存在和表達有待確認。例如，如果在一標記基因序列中插入相關的基因，標記基因功能不存在則可以確定含有適當序列的轉化細胞。另一個選擇是，在單個啟動子控制下將標記基因與編碼本發明的多肽的序列串聯放置。標記基因應答誘導或選擇的表達通常也表示串聯基因的表達。
另外，含有編碼本發明的多肽的核酸序列，並表達所述多肽的宿主細胞可通過本領域技術人員公知的各種程序進行鑑定。這些程序包括但不限於DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質生物分析，例如，螢光激活細胞分類術(FACS)或免疫測定技術(例如，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和放射性免疫測定法(RIA))，包括用來檢測和/或定量分析核酸或蛋白質的膜、溶液或晶片技術(參見Hampton，R.等人，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等人，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本領域技術人員公知的各種各樣標記和連接技術可用在不同的核酸和胺基酸試驗中。產生標記雜交的裝置或者檢測與編碼本發明的多肽的核酸分子有關的序列的PCR探針包括，寡標記、鎳翻譯、末端標記或使用標記聚核苷酸的PCR擴增。另外，也可將編碼本發明的多肽的序列克隆到載體內，以產生mRNA探針。這些載體是本領域公知的，可通過商業途徑獲得，加入諸如T7、T3或SP6等適當RNA聚合酶和標記核苷酸可在體外合成RNA探針。這些步驟使用市場上供應的各種試劑盒(PharmaciaUpjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))進行。
易於檢測的合適報導分子或標記包括放射性核、酶和螢光、化學發光或發色試劑和物質、協同因子、抑制劑、磁性粒子等等。
本發明的核酸分子還可用來製造轉基因動物，特別是齧齒動物。這些轉基因動物構成本發明的另一方面。這可通過局部修飾體細胞，或者通過種系治療引入遺傳修飾來實現。這些轉基因動物特別適用於製作動物模型，分析作為本發明多肽的調節劑的藥物分子。
從重組細胞培養基中回收和純化多肽的方法是公知的，包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陽離子或陰離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水基相互作用層析法、親和力層析法、羥磷灰石層析法和血凝素層析法。高效液相層析法特別適用於純化。當分離和/或純化期間多肽發生變性時，可應用蛋白質再摺疊的公知技術來再產生活性構象。
也可利用特異性載體結構來幫助蛋白質純化，有需要的時候，將編碼本發明的多肽的序列與編碼有利於可溶性蛋白質純化的多肽結構域的核酸序列連接。有利於純化的結構域的例子包括金屬螯合肽，例如允許在固定金屬上純化的肌氨酸-色氨酸組件，允許在固定免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，以及用在FLAGS延伸/親和純化系統(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的結構域。為了方便純化，可以採用可切割接頭序列的內含物，例如在純化結構域與本發明的多肽之間的對XA因子或腸激酶有特異性的序列。一種這樣的表達載體為融合蛋白的表達提供準備，所述融合蛋白含有本發明的多肽，與硫氧還蛋白或腸激酶切割位點前面的多個肌氨酸殘基融合。肌氨酸殘基有利於固定金屬離子親和力層析法(IMAC)的純化，參見Porath，J.等人的描述(Prot.Exp.Purif.3263-281，(1992))，而硫氧還蛋白或腸激酶切割位點為從融合蛋白純化多肽提供了一種手段。Kroll，D.J.等人對含有融合蛋白的載體進行了討論(1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
如果多肽的表達是用在篩選測定法中，通常最好是在它表達的宿主細胞表面上產生該多肽。在此情況下，宿主細胞可在用於篩選測定法之前，例如用螢光激活細胞分類術(FACS)或免疫測定技術之前收穫。如果多肽分泌到培養基中，可回收該培養基以便回收和純化表達多肽。如果多肽是在細胞內產生，則回收多肽之前必須先溶解細胞。
本發明的多肽可用來篩選各種藥物篩選技術使用的化合物庫。這些化合物可以激活(激動)或抑制(拮抗)本發明多肽的基因的表達水平或活性，構成本發明的另一方面。優選的化合物是能有效地改變編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者調節本發明第一方面的多肽的活性。
激動劑或拮抗劑化合物可從，例如，細胞製劑、無細胞製劑、化學庫或天然混合產物中分離出來。這些激動劑或拮抗劑可以是天然的或者是經修飾的物質、配體、酶、受體或者結構或功能類似物。關於這些篩選技術的綜述，可參見Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
最有可能成為良好拮抗劑的化合物是與本發明的多肽結合但在結合後又不會誘導該多肽生物作用的分子。潛在的拮抗劑包括有機小分子、肽、多肽和抗體，它們與本發明的多肽結合，由此抑制或消除它的活性。以這種方式，多肽與正常細胞結合分子的結合可被抑制，從而抑制該多肽的正常生物活性。
用在此篩選技術中的本發明的多肽可以在溶液中游離，附著於固相支持物上，留在細胞表面或位於細胞內。一般而言，這些篩選程序可涉及使用表達與測試化合物接觸的多肽的適當細胞或細胞膜，觀察結合、或功能反應的刺激或抑制。再將與測試化合物接觸的細胞和不接觸測試化合物的對照細胞的功能反應作比較。藉助適當檢測系統，這種測定方法可以評估測試化合物是否導致多肽激活產生一個信號。一般情況下，在已知激動劑的存在下分析激活的抑制劑，在測試化合物存在下觀察激活對激動劑的影響。
一種鑑定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優選方法包括(a)在允許與多肽結合的條件下，將在其表面上表達本發明第一方面的多肽的細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結合之後提供可檢測信號的第二成分締合。
(b)通過測定化合物與多肽相互作用所產生的信號水平來確定該化合物是否結合和激活或抑制該多肽。
另一種鑑定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優選方法包括(a)在允許與多肽結合的條件下，將在其表面上表達本發明第一方面的多肽的細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結合之後提供可檢測信號的第二成分締合。
(b)通過對化合物與多肽相互作用所產生的信號水平與在該化合物不存在下的信號水平作比較來確定該化合物是否結合和激活或抑制該多肽。
在另一優選實施例中，上述的通用方法還包括在多肽的標記或無標記配體存在下對激動劑或拮抗劑進行鑑定。
在另一實施例中，鑑定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑的方法包括在允許結合多肽的條件和候選化合物存在下，測定配體與其表面上帶有本發明的多肽的細胞、或者與含有這樣一種多肽的細胞膜結合的抑制，並測定與該多肽結合的配體數量。能夠引起配體結合減少的化合物就認為是激動劑或拮抗劑。配體最好是帶標記的。
更具體地說，篩選多肽拮抗劑或激動劑化合物的方法包括以下步驟(a)使標記的配體與在細胞表面上表達本發明的多肽的全細胞，或者含有本發明的多肽的細胞膜培養，(b)測定與全細胞或細胞膜結合的標記配體數量，(c)在步驟(a)的標記配體和全細胞或者細胞膜的混合物中加入候選化合物，使該混合物達到平衡；(d)測定步驟(c)之後與全細胞或細胞膜結合的標記配體數量；以及
(e)比較步驟(b)和(d)中結合的標記配體之差值，將引起步驟(d)的結合減少的化合物看成激動劑或拮抗劑。
上述一些實施例可應用簡單結合測定法，其中測試化合物與帶有多肽的表面的附著是運用與該測試化合物直接或間接結合的標記檢測，或者可應用涉及與標記競爭物競爭的測定法檢測。另一個實施例採用競爭藥物篩選測定法，其中能夠結合多肽的中和抗體與測試化合物特異性地競爭結合。以此方式可用抗體檢測對多肽有特異性結合親和力的任何測試化合物的存在。
另外，如果本發明的野生型多肽(INSP058)本質上與受體正常結合，那麼在本發明另一方面中，本發明的多肽可以是該野生型多肽的拮抗劑。一般認為，這種多肽的例子是INSP058SV。本發明此方面中，本發明的多肽能夠與INSP058多肽競爭受體上同一個結合位。INSP058SV多肽不會刺激受體，因此不會誘導正常的生物作用。所以，本發明的多肽是天然多肽的競爭抑制劑。較佳地，本發明此方面的競爭抑制劑包括或由SEQ ID NO10或SEQ IDNO16所示的胺基酸序列組成。本領域技術可輕易對上述篩選拮抗劑的方法作適應性修改，以篩選競爭抑制劑。
也可把測定法設計成檢測加入的測試化合物對細胞內編碼多肽的mRNA產生的作用。例如，ELISA可構建成通過本領域公知的標準方法以單克隆抗體或多克隆抗體測量多肽的分泌水平或細胞相關水平，這可用來檢索抑制或增強在適當操縱的細胞或組織中產生多肽的化合物。然後，測定多肽與測試化合物之間的結合複合物的形成。
本發明包括的測定法是在過表達或切除檢測中涉及使用本發明的基因和多肽的方法。這些測定法涉及細胞內這些基因/多肽水平的操縱，以及該操縱事件對被操縱細胞生理的影響的評估。例如，這些實驗揭示與特定基因/多肽有關聯的信號傳導和代謝通道的詳細信息，產生關於與待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，並提供調節相關基因和蛋白質的方法的思路。
可採用另一種藥物篩選技術，它高通量篩選對感興趣的多肽具有適當結合親和力的化合物(參見國際專利申請WO84/03564)。在這一方法中，在固相基質上合成大量不同的小測試化合物，它們再與本發明的多肽反應，洗滌。一種固定多肽的方法是用非中和抗體。以本領域公知的方法可檢測結合多肽。純化的多肽也可直接鋪在板上，用於上述藥物篩選技術中。
通過本領域公知的標準受體結合技術，例如配體結合和交聯測定法，本發明的多肽可用來鑑定膜結合或可溶性受體，在配體結合和交聯測定法中，多肽用放射性同位素標記，以化學方法修飾，或者與有利於它的檢測或純化的肽序列融合，並與推定受體來源(例如，細胞組合物、細胞膜、細胞上清液、組織抽提物或體液)一起培育。結合的效率可用生物物理技術，如表面胞質基因共振和光譜測定。結合測定法用於純化和克隆受體，但也可鑑定多肽的激動劑和拮抗劑，這些激動劑和拮抗劑與其受體競爭結合多肽。進行篩選測定的標準方法已為本領域所熟悉。
本發明還包括一種篩選試劑盒，它可用在鑑定上述的激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質、酶的方法中。
本發明包括激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質和酶以及通過上述方法發現的能調節本發明多肽的活性或抗原性的其它化合物。
本發明還提供一些藥物組合物，其含有本發明的多肽、核酸、配體或化合物，以及合適的藥物載體。這些組合物適合用作治療或診斷試劑、疫苗、或其它免疫原性組合物，下文將作詳細說明。
根據本文所用的術語，當組合物中以X+Y的總重量計時至少85％是X，就認為含有多肽、核酸、配體或化合物[X]的組合物「基本上不含」雜質[本文以Y表示]。優選X佔組合物中X+Y總重量的至少約90％，更好至少約95％、98％或者甚至99％(重量)。
藥物組合物最好含有治療有效量的本發明的多肽、核酸分子、配體或化合物。本文所用的術語「治療有效量」指需要治療、緩解、或預防目標疾病或病症，或者具有可檢測的治療或預防作用的治療藥劑的用量。任何一種化合物的有效治療劑量最初可在例如腫瘤細胞的細胞培養測定法、或者動物模型通常是小鼠、兔、狗、或豬模型中估計。動物模型還可用來確定適當的濃度範圍和給藥途徑。有了這些信息，就可以確定給予人的有用給藥劑量和途徑。
人受試者的準確有效劑量取決於疾病狀態的嚴重程度、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應靈敏度，以及治療耐受性/反應。該用量可以常規實驗測定，由醫生判斷。通常，有效劑量從0.01毫克/千克至50毫克/千克，優選從0.05毫克/千克至10毫克/千克。組合物可單獨給予病人，或者與其它藥劑、藥物或激素結合給予。
一種藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體，作為治療試劑給予。這些載體包括抗體和其它多肽、基因和其它治療試劑，例如脂質體，只要該載體本身不會誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，而且載體的給予不會產生過高毒性。合適的載體可以是大的代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和失活病毒顆粒。
還可使用藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；以及有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)對藥學上可接受的載體作了詳盡討論。
治療組合物中藥學上可接受的載體也可含有水、鹽水、甘油和乙醇等液體。另外，這些組合物還可含有輔助物質，例如，溼潤劑或乳化劑、pH緩衝物質等等。這些載體能將藥物組合物配製成供病人攝取的片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等等。
一旦配成以後，本發明的組合物可直接給予受試者。接受治療的受試者可以是動物；特別是人受試者。
本發明使用的藥物組合物可以任何途徑給予，包括但不限於，口服、靜脈內、肌內、動脈內、脊髓內、鞘內、心室內、透皮或經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹腔內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。本發明的藥物組合物也可用基因槍或無針注射器給予。一般將治療組合物製成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以製成適合注射前溶解或懸浮於液體介質中的固體形式。
通過注射可將組合物直接輸送到皮下、腹腔內、靜脈內或肌內，或者送到組織間質空間。組合物也可施加在病變部位。劑量治療可分單劑或多劑。
如果本發明的多肽的活性在一特定疾病狀態中是過度的，有多種方法可採用。其中一種方法包括把上述抑制劑化合物(拮抗劑)與藥學上可接受的載體一起給予受試者，抑制劑化合物的量為通過例如阻斷配體、基質、酶、受體的結合，或者抑制第二信號而抑制多肽的功能，從而緩解異常狀況的有效量。這些拮抗劑優選是抗體。這些拮抗劑最好是嵌合抗體和/或人源化抗體，如前所述，可使它們的免疫原性減至最低。
另一種方法是給予保留了對上述配體、基質、酶、受體有結合親和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相關部分的片段的形式給予。
在一替換方法中，應用表達封閉技術，例如用內部產生或另外給予的反義核酸分子(如上所述)，抑制編碼多肽的基因表達。設計多肽的編碼基因的調控區、5』區或調節區(信號序列、啟動子、增強子和內含子)的互補序列或反義核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可獲得對基因表達的修飾。類似地，用「三螺旋體」鹼基成對方法可實現抑制。三螺旋體成對是有用的，這是因為它能抑制雙螺旋體充分打開以結合聚合酶、轉錄因子或調節分子的能力。應用三螺旋DNA的治療取得最新進展，在文獻中已有描述(Gee，J.E.等人，(1994)InHuber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，FuturaPublishing Co.，Mt.Kisco，NY)。互補序列或反義分子還可設計成防止轉錄子與核糖體結合，從而封閉mRNA的翻譯。這些寡核苷酸可給予，或在體內表達中原位產生。
另外，使用對它的編碼mRNA序列有特異性的核糖體，可防止表達本發明的多肽。核糖體是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，參見Usman，N等人，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可設計合成核糖體，在選定位置上特異性切割mRNA，從而防止mRNA翻譯為功能多肽。核糖體通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然鹼基合成。另一個選擇是，核糖體可用非天然骨架，例如2』-氧-甲基RNA合成，保護核糖核酸酶免於降解，還可含有經修飾的鹼基。
可對RNA分子進行修飾，以增加胞內穩定性和延長半衰期。可能的修飾包括但不限於，在分子的5』和/或3』末端加入側翼序列或在分子的骨架內使用硫代磷酸或2』-氧-甲基而不用磷酸二酯酶連鎖。這一概念對於產生PNA是固有的，可延伸至所有這些分子中，方法是包含非常規鹼基，例如肌苷、核苷(queosine)和高修飾鳥苷(butosine)以及乙醯基-、甲基-、硫代-、及類似修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它們不易被內源性內切核酸酶識別。
有一些方法治療與本發明的多肽表達不足夠或與其活性相關的異常症狀。其中一種方法包括把治療有效量的能激活該多肽的化合物，即上述激動劑給予病人，緩解異常徵狀。另外，也可以給予治療量的多肽與適當藥物載體，以恢復多肽的相關生理平衡。
基因療法可用來在受試者體內通過相關細胞內源性產生多肽。基因療法以修正治療基因置換缺陷基因，永久治療多肽的不適當產生。
本發明的基因療法可發生於體內或體外。體外基因療法需要分離和純化病人的細胞，導入治療基因，以及將經基因改造的細胞再引入病人體內。與之相反，體內基因療法不需要分離和純化病人的細胞。
治療基因往往被「包裝」以方便給予病人。基因輸送賦形劑可以是非病毒，例如脂質體，或者複製缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美國專利US 5,252,479所述的腺伴隨病毒(AVV)載體。例如，可對編碼本發明的多肽的核酸分子進行改造，以在複製缺陷型逆轉錄病毒載體中表達。然後，分離這種表達構建體，導入用含有編碼多肽的RNA的逆轉錄病毒質粒載體轉導的包裝細胞內，使該包裝細胞現在能產生含有感興趣的基因的感染病毒粒子。將這些生產細胞給予病人，體內改造細胞和體內表達多肽(參見「Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches」(納入作為文獻參考)，Human MolecularGenetics(1996)，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd)。
另一種方法是給予「裸露DNA」，其中治療基因直接注入血流或肌肉組織。
對於本發明的多肽或核酸分子是引起疾病的試劑的情形，本發明提出它們可用在疫苗中，產生針對疾病引發劑的抗體。
本發明的疫苗可以是預防性(即預防感染)或者是治療性的(即治療感染後疾病)。這些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白質或核酸，通常與前述藥學上可接受的載體結合，包括本身不會誘導產生對接受該組合物的個體有害的任何載體。這些載體還可用作免疫刺激劑(「輔助劑」)。此外，抗原或免疫原可與細菌類毒素例如來自白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌和其它致病原的類毒素偶聯。
因為多肽可以在胃內分解，所以含有多肽的疫苗最好腸胃外給予(例如皮下、肌內、靜脈內、或皮內注射)。適合腸胃外給予的製劑包括無菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑和使製劑與接受者的血液等滲的溶解物，以及無菌水懸浮液或非水懸浮液，其可包括懸浮劑或增稠劑。
本發明的疫苗製劑可製成單劑或多劑容器。例如，密封安瓿和小瓶可儲存於凍幹條件下，只要在使用之前加入無菌液體載體。劑量取決於疫苗的比活性，通過常規實驗可輕易測定。
還可通過基因傳送與本發明多肽結合的抗體，例如參見國際專利申請WO98/55607。
在配製疫苗組合物時也可使用「快速注射」技術(例如見www.powderject.com)。
國際專利申請WO 00/29428描述了許多接種疫苗和疫苗輸送系統的合適方法。
本發明還涉及本發明的核酸分子作為診斷試劑的用途。檢測以本發明核酸分子(該核酸分子與功能障礙相關)為特點的基因突變形式提供了一種診斷工具，它可加入或限定因為基因的表達不足、過度表達或者空間或時間表達發生改變而引起的疾病或疾病易感性的診斷。通過各種技術可在DNA水平上檢測攜帶基因突變的個體。
用於診斷的核酸分子可從受試者的細胞中獲得，例如從血液、尿、唾液、組織活體或屍體材料中獲得。基因組DNA可直接用作檢測，或者在分析前用PCR、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)或者其它擴增技術酶解擴增(參見Saiki等人，Nature，324，163-166(1986)；Bej等人，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等人，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一實施例中，本發明該方面提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評估編碼本發明的多肽的天然基因的表達水平，並將所述表達水平與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法包括以下步驟(a)在允許本發明的核酸分子和核酸探針形成雜交複合物的嚴謹條件下，將病人的組織樣品與探針接觸；(b)在與步驟(a)相同的條件下，將對照樣品與所述探針接觸；(c)以及檢測所述樣品中是否存在雜交複合物。
其中，檢測到病人樣品中雜交複合物的水平與對照樣品中雜交複合物不同，表示患病。
本發明另一方面包括一種診斷方法，其包括以下步驟(a)從待測試疾病的病人中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離本發明的核酸分子；(c)通過檢測與疾病相關的核酸分子是否存在突變，診斷病人疾病。
為了幫助上述方法檢測核酸分子，可包括擴增步驟，例如利用PCR技術。
將擴增產物大小的變化與正常基因型比較，可檢測到缺失或插入。將擴增DNA與本發明的標記RNA，或者與本發明的標記反義DNA序列雜交，可以鑑定點突變。以核糖核酸酶消化或評估熔點溫度的差異，區分完全匹配的序列與錯配的雙鏈體。病人是否存在突變可這樣檢測將DNA與在嚴謹條件下和該DNA雜交的核酸探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應於與疾病相關的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；檢測探針鏈的未雜交部分是否存在即表示該DNA鏈的對應部分存在或不存在與疾病相關的突變。
這樣的診斷特別適用於產前，甚至新生兒測試。
參考基因與「突變體」基因之間的點突變和其它序列差異可通過公知技術鑑定，例如，直接DNA測序或單鏈構象多態性(參見Orita等人，Genomics，5，874-879(1989))。例如，測序引物可與改良PCR產生的雙鏈PCR產物或單鏈模板分子一起使用。以使用放射性標記核苷酸的常規程序或者通過使用螢光標記的自動測序程序，進行序列測定。克隆DNA節段也可用作檢測特異性DNA片段的探針。當與PCR結合時該方法的靈敏度大大提高。另外，點突變和其它序列變異，例如多態性，可參照上述方法檢測，例如使用等位基因特異性寡核苷酸對不同於單個核苷酸的序列進行PCR擴增。
在變性試劑存在或不存在下改變DNA片段的凝膠電泳遷移率，或直接對DNA測序都可以檢測到DNA序列的差異(例如Myers等人，Science(1985)2301242))。特定位置的序列變化可通過核酸酶保護測定法揭示，例如RNase和S1保護，或者化學切割方法發現(Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401)。
除了常規凝膠電泳和DNA序列測定之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突變也可用原位分析加以檢測(例如，參見Keller等人，DNA Probes，2nd Ed.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，換言之，可分析細胞內DNA或RNA序列的突變，無需分離或固定在膜上。螢光原位雜交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的綜述已有很多報導(例如，參見Trachuck等人，Science，250，559-562(1990)，and Trask等人，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。
本發明另一實施例中，構建了包括本發明核酸分子的寡核苷酸探針陣列，對遺傳變體、突變和多態性進行有效篩選。陣列技術方法是公知的，獲得廣泛應用，可用來解釋分子遺傳方面的各種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異性(例如，參見M.Chee等人，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在一實施例中，按照PCT申請WO95/11995(Chee等人)；Lockhart，D.J.等人((1996)Nat.Biotech.141675-1680))；以及Schena，M.等人((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9310614-10619))描述的方法製作和使用陣列。寡核苷酸對的範圍從2至1,000,000以上。應用光引導化學法在基質的指定區域上合成低聚物。基質可以是紙、尼龍或其它種類的膜、過濾器、晶片、玻璃載片或其它任何合適的固相支持物。另外，參照PCT申請WO95/25116(Baldeschweiler等人)中描述的方法，使用化學偶聯程序和噴墨應用裝置可在基質表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系統、熱學、紫外線、機械或化學結合程序，以類似斑點(或狹線)印跡的「柵格」陣列將cDNA片段或寡核苷酸設置和連接於基質表面上。陣列，例如上述的那些陣列，可用人手或現有設備(斑點印跡或狹線印跡裝置)、材料(任何合適的固相支持物)和機器(包括自動儀器)製作，它們可含有8、24、96、384、1536或6144個寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之間的任何數目，該數目能夠使陣列有效地應用於市場上買到的儀器中。
除了上述討論的方法之外，通過包括測定受試者樣品中多肽或mRNA水平異常增加或減少的方法可以診斷疾病。採用本領域公知的任何方法可以在RNA水平上測定表達減少或增加，以便對聚核苷酸作定量分析，例如核酸擴增，如PCR、RT-PCR、RNase保護、Northern印跡和其它雜交方法。
可用來確定從宿主獲得的樣品中本發明的多肽水平的測定技術已為本領域技術人員所知，在上文提到的一些文獻中已有討論(包括放射性免疫測定法、競爭結合測定法、Western印跡分析和ELISA試驗)。本發明該方面提供一種診斷方法，其包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽複合物的條件下，將上述一種配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述複合物。
測定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS還可為診斷多肽表達的變化或異常水平提供基礎。在適合形成複合物的條件下將正常哺乳動物受試者，優選是人的體液或細胞抽提物與針對多肽的抗體結合，確立多肽表達的正常或標準值。標準複合物形成的數量可用各種方法定量測定，例如光度計裝置。
特異性結合本發明多肽的抗體可用來診斷以多肽表達為特點的症狀或疾病，或者用在測定法中監測以本發明的多肽、核酸分子、配體和其它化合物治療的病人。用於診斷目的的抗體可以用上述關於治療所述的相同方法製成。對多肽的診斷分析包括利用抗體和標記檢測人體液或者細胞或組織抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修飾或不作修飾，將它們與報導分子共價或非共價結合加上標記。可以應用本領域已知的各種各樣報導分子，其中一些已在上文作了描述。
將在受試者活體組織獲得的對照樣品和患病樣品中表達的多肽數量與標準值作比較。標準值與受試者值之間的偏差建立診斷疾病的參數。可通過診斷分析法區分多肽不存在、存在和過度表達，並監測治療幹預期間多肽水平的調節。這些分析也可用來評估動物研究、臨床試驗或個體病人的監測治療中特定治療方案的療效。
本發明的一種診斷試劑盒可包括(a)本發明的核酸分子；(b)本發明的多肽；或者(c)本發明的配體。
本發明一方面提供一種診斷試劑盒，該試劑盒可包括第一容器，其含有在嚴謹條件下與本發明的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，其含有用來擴增該核酸分子的引物；以及該探針和引物的使用說明書，方便診斷疾病。這種試劑盒還可包括裝有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
本發明另一方面也提供一種診斷試劑盒，該試劑盒可包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是本發明的核酸分子。
為了檢測本發明的多肽，一種診斷試劑盒可包括一或多種與本發明的多肽結合的抗體；一種用來檢測該抗體與多肽之間結合反應的試劑。
這些試劑盒都可用於診斷疾病或疾病易感性，譬如是細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少症、血小板減少症、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎症疾病，包括過敏症、炎症性腸疾病、關節炎、銀屑病和呼吸道發炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化症、血栓症、敗血症、休克、再灌注損傷和缺血；神經系統疾病，包括中樞神經系統疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化症和疼痛；發育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質疏鬆和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質介導的病症，特別是由C1q家族蛋白質介導的那些。
以下，將通過舉例說明，特別是結合INSP058多肽對本發明的各個方面和實施例進行描述。
應明白，在不脫離本發明的範圍的情況下可以作出改型。


圖1使用SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)在NCBI非冗餘資料庫獲得的前10個BLAST結果。
圖2以BLAST對SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)與最接近序列(大麻哈魚的otolin-1)產生的序列對比。
圖3使用SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)獲得的前20個GenomeThreader結果。前3個結果的PDB代碼表示下列蛋白質結構1c28鏈A、B和C。補體-1q家族蛋白質的晶體結構提示與腫瘤壞死因子有進化聯繫。
圖4以Genome Threader對SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)與圖3中第一個PDB結構(1c28)產生的結構性對比。
圖5AINSP058多肽序列(SEQ ID NO8)所含信號肽的SignalP-NN預測序列。
圖5BINSP058多肽序列(SEQ ID NO8)所含信號肽的SignalP-HMM預測序列。
圖6INSP058的預測核苷酸序列與翻譯。
圖7採用INSP058-CP1和INSP058-CP2為引物克隆的PCR產物的核苷酸序列與翻譯。
圖8pCRII-TOPO-INSP058SV的圖譜。
圖9INSP058克隆核苷酸序列(INSP058SV)與預測的INSP058序列之間的序列對比。
圖10INSP058預測胺基酸序列與克隆INSP058SV胺基酸序列之間的序列對比。
圖11表達載體pEAK12d的圖譜。
圖12Gateway載體pDONR201的圖譜。
圖13pEAK12d-INSP058SV-6HIS的圖譜。
具體實施例方式
實施例1 INSP058以SEQ ID NO8作為NCBI非冗餘序列資料庫的BLAST查詢序列。與該查詢序列最接近的匹配是大麻哈魚的otolin-1(圖1)。圖2所示為INSP058查詢序列與大麻哈魚的otolin-1序列的對比。圖3所示為使用SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)獲得的前20個Genome Threader結果。前3個結果的PDB代碼表示下列蛋白質結構1c28鏈A、B和C。補體-1q家族蛋白質的晶體結構提示與腫瘤壞死因子有進化聯繫。圖4所示為以Genome Threader對SEQ IDNO8(INSP058多肽序列)與圖3中第一個PDB結構(1c28)產生的結構性對比。
採用SignalP v2.0(見網址www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0所描述，這是一個預測不同有機體胺基酸序列中信號肽切割位點是否存在及其位置的程序)對INSP058多肽序列(SEQ ID NO8)進行分析。SignalP v2.0包含兩個信號肽預測方法SignalP-NN(基於神經網絡)和SignalP-HMM(基於隱馬爾可夫模型)。圖5A和5B所示為INSP058多肽序列(SEQ ID NO8)的SignalP結果。圖5A和5B顯示，INSP058多肽序列(SEQ ID NO8)的最可能切割位點在位置15與16之間。
實施例2 INSP058剪接變體1.1 cDNA文庫人cDNA文庫(在噬菌體λ載體中)購自Stratagene或Clontech，或者由Serono Pharmaceutical Research Institute根據製造商方案(Stratagene)在λZAP或λGT10載體中製成。噬菌體λDNA按照製造商(Promega，Corporation，Madison WI.)的說明用Wizard Lambda Preps DNA純化系統在小規模的感染大腸桿菌宿主菌株培養基中製備。使用的文庫和宿主菌株列於表1中。隨後的PCR反應採用了代表26個不同庫的7個集合體(100ng/μl噬菌體DNA)或者各個庫的噬菌體DNA。
表1人cDNA文庫

1.2對噬菌體文庫DNA的虛擬cDNA進行PCR擴增設計基因特異性PCR擴增引物(INSP058-CP1和INSP058-CP2，圖6和表2)，擴增一個990bp產物，該產物預期含有INSP058的差不多全長預測編碼序列。這些引物用在針對表1所示噬菌體cDNA文庫集合體的PCR中。用MJ Research DNA Engine在50μl終體積中進行PCR擴增，該終體積含有1XAmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、克隆引物各50pmole、2.5單位AmpliTaqTM(Perkin Elmer)和噬菌體文庫集合體DNA各100ng，程序如下94℃循環40次，1分鐘；以及72℃，1分鐘；然後，72℃循環1次，7分鐘，4℃持續循環。
表2 INSP058克隆和測序引物

下劃線序列＝Kozak序列粗體＝終止密碼子斜線序列＝His標籤在1X TAE緩衝液(Invitrogen)中的0.8％瓊脂糖凝膠上看到各個擴增產物，並用Wizard PCR Preps DNA純化系統(Promega)從凝膠純化。這些PCR產物在50μl無菌水中洗脫出來，直接被亞克隆或儲存於-20℃。
1.3用於PCR的基因特異性克隆引物設計長度為18至25個鹼基的PCR引物對，以便運用引物設計軟體(ScientificEducational Software，PO Box 72045，Durham，NC 27722-2045，USA)擴增INSP058 cDNA的部分序列。將PCR引物優化至溫度接近55±10℃，GC含量為40-60％。選擇對靶序列INSP058有高度選擇性的引物(幾乎沒有不是非特異性引發)。由於PCR引物設計的優化，INSP058-CP1缺少INSP058預測克隆序列的前8bp。
1.4 PCR產物的亞克隆用購自Invitrogen Corporation的TA克隆試劑盒，在製造商指定的條件下將PCR產物亞克隆到拓樸異構酶I修飾的克隆載體(pCRII TOPO)中。簡言之，從人文庫集合體P擴增反應中取4μl凝膠純化的PCR產物，室溫下與1μlTOPO載體和1μl鹽溶液培養15分鐘。再按以下方法將反應混合物轉化到大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen)中50μl One Shot TOP10細胞等分試樣在冰上解凍，加入2μl TOPO反應物。該混合物冰上培育15分鐘，再在42℃培育熱激剛好30秒。將樣品送回冰上，加入250μl溫熱SOC培養基(室溫)。樣品在37℃搖動培育(220rpm)1小時。然後，將轉化混合物鋪在含有氨比西林(100μg/ml)的L-broth(LB)板上，37℃培育過夜。
1.5氨比西林抗性集落的選擇選擇大量氨比西林抗性集落，將細胞穿刺到96孔板的各個孔中，每孔帶有含氨比西林(100μg/ml)的L-broth板。
1.6質粒DNA的製備和測序由穿刺培養基製備小量製備(Miniprep)質粒DNA，用GATC Biotech AG(Jakob-Stadler-Platz 7，D-78467 Konstanz)以T7為引物對該質粒DNA進行DNA測序。克隆cDNA片段的序列見圖7。
2.含有INSP058SV的cDNA文庫/模板的鑑定用λcDNA文庫集合體P(人胸腺、脾、外周血單核細胞和睪丸)鑑定了用INSP058-CP1和INSP058-CP2獲得的PCR產物，所述產物以453bp遷移，小於預期大小。圖8所示為克隆PCR產物(pCRII-TOPO-INSP058)(質粒IDnumber 12917)的質粒圖譜。該克隆序列缺失INSP058預測克隆序列的前8bp，但一直到核苷酸位置267都與預測INSP058序列相同，由於存在一個538bp缺失，所以它在核苷酸位置267與預測序列不同(圖9)。最長ORF(包括5』端缺失的8bp)的翻譯產生一個長99個胺基酸的蛋白質，其中1-89個胺基酸與INSP058預測序列相同(圖11)。所以，克隆序列對應於INSP058的短剪接變體(稱INSP058SV)。
3.在HEK293/EBNA細胞中表達INSP058SV的質粒的構建通過DNA測序鑑定了一個含有INSP058SV編碼序列(ORF)的pCRII-TOPO克隆(圖7)，再運用GatewayTM克隆方法(Invitrogen)以此克隆將插入片段亞克隆到哺乳動物細胞表達載體pEAK12d(圖11)中。
3.1與符合讀框的6HIS標籤序列融合的Gateway兼容性INSP058 ORF的產生Gateway克隆方法的第一階段涉及二步PCR反應，該反應用attB1重組位點和Kozak序列在5』末端側翼，以及用編碼符合讀框的6組氨酸(6HIS)標記、終止密碼子和attB2重組位點(Gateway相容的cDNA)在3』末端側翼產生INSP058 ORF。第一次PCR反應(在50微升終體積中)含有1.5μl(約25ng)pCR II TOPO-INSP058SV(質粒12917，圖8)、1.5μl dNTPs(10mM)、5μl 10XPfx聚合酶緩衝液、1μl MgSO4(50mM)、基因特異性引物各0.5μl(100μM)(INSP058-EX1正向，INSP058-EX1反向)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。在95℃首次變性步驟進行PCR反應1分鐘，然後94℃循環10次15秒；55℃30秒，以及68℃2分鐘，4℃持續循環。按照生產商的指示，用Wizard PCR prep DNA純化系統(Promega)直接在反應混合物中純化PCR產物。第二次PCR反應(在50微升終體積中)含有10μl純化PCR產物、1.5μldNTPs(5mM)、5μl 10X Pfx聚合酶緩衝液、1μl MgSO4(50mM)、Gateway轉化引物各0.5μl(100μM)(GCP正向，GCP反向)和0.5μl of Platinum PfxDNA聚合酶。第二次PCR反應的條件是95℃1分鐘；94℃循環4次15秒；50℃30秒以及68℃2分鐘；94℃循環25次15秒；55℃30秒和68℃3.5分鐘；然後4℃持續循環。參照上述方法純化PCR產物。
3.2 Gateway相容的INSP058SV ORF亞克隆到Gateway入門載體pDONR201和表達載體pEAK12dGateway克隆方法的第二階段按如下方法將Gateway修飾的PCR產物亞克隆到Gateway入門載體pDONR201(Invitrogen，圖12)將5μl純化的PCR產物與1.5μl pDONR201載體(0.1μg/μl)、2μl BP緩衝液和1.5μl BP克隆酶混合物(Invitrogen)室溫培育1小時。加入蛋白酶K(2μg)終止反應，37℃培育多10分鐘。取該反應的一等分試樣(2μl)，採用Biorad Gene PulserTM電穿孔儀通過電穿孔法轉化到大腸桿菌DH10B細胞。轉化物鋪在LB-卡那黴素板上。用Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promega)自1-4個獲得的集落製備質粒Miniprep DNA，重組反應使用1.5μl質粒洗脫液，所述反應的10μl終體積含有1.5μl pEAK12d載體(圖9)(0.1μg/μl)、2μl LR緩衝液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)。混合物在室溫培育1小時，加入蛋白酶K(2μg)終止反應，37℃培育多10分鐘。取該反應的一等分試樣(1μl)，通過電穿孔法轉化到大腸桿菌DH10B細胞。
如上所述通過進行集落PCR鑑定了含有正確插入序列的克隆，但使用的PCR引物是pEAK12d(pEAK12d F和pEAK12d R)。用Qiaprep Turbo 9600自動化系統(Qiagen)或人工操作使用Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promegacat.no.1460)由含有正確插入序列的克隆分離出質粒Miniprep DNA，並且以pEAK12d F和pEAK12d R引物確認序列。
從序列已被確認的克隆取500ml培養基，製備用氯化銫梯度純化的質粒pEAK12d-INSP058SV-6HIS(質粒ID number 13081，圖13)maxi-prep DNA，製備方法參照Sambrook J.等人的方法(Molecular Cloning，a LaboratoryManual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，將質粒DNA以1μg/μl重懸於無菌水中，-20℃儲存。
此外，現在用pEAK12d-INSP058SV-6HIS表達載體進行其它實驗。運用此載體轉染哺乳動物細胞系能夠使INSP058SV蛋白質獲得高水平表達，因而能夠對INSP058SV多肽的功能特點進行連續研究。以下材料和方法是適合這些實驗用的其中一個例子。
細胞培養基表達埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎腎293細胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)維持懸浮在無Ex-cell VPRO血清的培養基中(種子儲備，維持培養基，JRH)。轉染前16至20小時(第1天)，將細胞接種在2x T225燒瓶中(每個燒瓶50毫升，接種在含有2％FBS移種培養基(JRH)的DMEM/F12(1∶1)中，密度為2×105個細胞/毫升)。第二天(轉染第0天)，用JetPEITM試劑進行轉染(2μl/μg質粒DNA，PolyPlus-transfection轉染試劑)。每個燒瓶中，質粒DNA與GFP(螢光報導基因)DNA共轉染。再將轉染混合物加入2x T225燒瓶中，37℃(5％CO2)培育6天。在第1和第6天進行定性螢光檢驗，確認陽性轉染(Axiovert 10 Zeiss)。
在第6天(收穫天)，將兩個燒瓶中的上清液(100ml)合併，離心(4℃，400g)，並置於帶有獨特鑑定器的器皿內。保留一等分試樣(500μl)，對6His標籤蛋白作QC(內部生物加工QC)。
參照BP/PEI/HH/02/04中稱之「懸浮細胞PEI轉染」的方案，以Polysciences的聚乙烯亞胺為轉染劑進行放大批量生產。
純化方法含有C端帶6His標籤的重組蛋白質的培養基樣品用冷凍緩衝液A(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；8.7％(重量/體積)甘油，pH 7.5)稀釋。樣品經無菌過濾器(Millipore)過濾，4℃儲存於無菌方形培養瓶中(Nalgene)。
4℃下用連接到樣品自動裝載器(Labomatic)的VISION工作站(AppliedBiosystems)進行純化。純化程序由兩個連續步驟組成在裝有鎳離子的Poros20MC(Applied Biosystems)柱(4.6×50mm，0.83ml)上進行金屬親和力層析，再在Sephadex G-25培養(Amersham Pharmacia)柱(1.0×10cm)上進行凝膠過濾。
第一個層析步驟的金屬親和柱用30柱體積的EDTA溶液(100mM EDTA；1M NaCl；pH 8.0)再生，用15柱體積的100mM硫酸鎳溶液洗滌重新裝載鎳離子，用10柱體積的緩衝液A和7柱體積的緩衝液B(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；8.7％(重量/體積)400mM甘油；咪唑，pH 7.5)洗滌，最後用15柱體積含15mM咪唑的緩衝液A平衡。樣品用Labomatic的樣品裝載器轉移到200毫升定量環，然後以10ml/min的速率裝到鎳金屬親和柱上。親和柱再用12柱體積的緩衝液A和28柱體積含20mM咪唑的緩衝液A洗滌。在20mM咪唑洗滌期間，附著比較鬆散的汙染蛋白質從柱中洗脫出來。重組的His標籤蛋白質最後用10柱體積的緩衝液B洗脫，流速為2ml/min，收集洗脫出來的蛋白質。
第二層析步驟的Sephadex G-25凝膠過濾柱用2毫升緩衝液D(1.137M氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；pH 7.2)再生，然後用4柱體積的緩衝液C(137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；20％(重量/體積)甘油；pH 7.4)平衡。從鎳柱洗脫出來的峰值餾分自動通過連接到VISION的整合型樣品裝載器裝在Sephadex G-25柱上，蛋白質用緩衝液C洗脫，流速為2ml/min。該餾分經過無菌離心過濾器(Millipore)過濾，凍存於-80℃。取樣品的一等分試樣以SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝膠；Novex)Western印跡和抗His抗體進行分析。NuPAGE凝膠可用0.1％考馬斯亮藍R250染色溶液(30％甲醇，10％乙酸)室溫染色1小時，然後用20％甲醇，7.5％乙酸去色，直至背景澄清，蛋白質帶清晰可見。
電泳後將蛋白質從凝膠電轉移到硝基纖維素膜上。室溫下用5％在緩衝液E(137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；0.1％Tween 20，pH 7.4)中的奶粉封閉纖維素膜1小時，再於4℃在緩衝液E中的2.5％奶粉中與2種兔多克隆抗His抗體(G-18和H-15，各0.2μg/ml；SantaCruz)混合物培養過夜。室溫再培養1小時之後，膜用緩衝液E(3×10分鐘)洗滌，再與結合HRP的第二抗兔抗體(DAKO，HRP 0399)室溫培養2小時，第二抗體用含2.5％奶粉的緩衝液E稀釋至1/3000。用緩衝液E(3×10分鐘)洗滌之後，膜用ECL試劑盒(Amersham Pharmacia)顯影1分鐘。然後，將膜與超膜(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)接觸，使超膜顯影，對Western印跡影像作目測分析。
對於由考馬斯亮藍染色檢測到蛋白質帶的樣品，採用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce)可確定它們所含蛋白質的濃度，以牛血清白蛋白為標準。
此外，細胞系中INSP058SV多肽過度表達或表達下調都可用來確定轉錄激活對宿主細胞基因組的影響。把免疫沉澱法與Western印跡分析結合以及免疫沉澱法與質譜結合，都可鑑定INSP058SV多肽的二聚配偶體、共激活劑和共抑制劑。
序列表SEQ ID NO1(INSP058核苷酸序列外顯子1)1 ATGAGGATCT GGTGGCTTCT GCTTGCCATT GAAATCTGCA CAGGGAACAT51 AAACTCACAG GACACCTGCA GGCAAGGGCA CCCTGGAATC CCTGGGAACC101 CCGGTCACAA TGGTCTGCCT GGAAGAGATG GACGAGACGG AGCGAAGGGT151 GACAAAGGCG ATGCAGSEQ ID NO2(INSP058蛋白質序列外顯子1)1 MRIWWLLLAI EICTGNINSQ DTCRQGHPGI PGNPGHNGLP GRDGRDGAKG51 DKGDAGSEQ ID NO3(INSP058核苷酸序列外顯子2)1 GAGAACCAGG ACGTCCTGGC AGCCCGGGGA AGGATGGGAC GAGTGGAGAG51 AAGGGAGAAC GAGSEQ ID NO4(INSP058蛋白質序列外顯子2)1 EPGRPGSPGK DGTSGEKGER GSEQ ID NO5(INSP058核苷酸序列外顯子3)1 GAGCAGATGG AAAAGTTGAA GCAAAAGGCA TCAAAGGTGA TCAAGGCTCA51 AGAGGATCCC CAGGAAAACA TGGCCCCAAG GGGCTTGCAG GGCCCATGGG101 AGAGAAGGGC CTCCGAGGAG AGACTGGGCC TCAGGGGCAG AAGGGGAATA
151 AGGGTGACGT GGGTCCCACT GGTCCTGAGG GGCCAAGGGG CAACATTGGG201 CCTTTGGGCC CAACTGGTTT ACCGGGCCCC ATGGGCCCTA TTGGAAAGCC251 TGGTCCCAAA GGAGAAGCTG GACCCACGGG GCCCCAGGGT GAGCCAGGAG301 TCCGGGGAAT AAGAGGCTGG AAAGGAGATC GAGGAGAGAA AGGGAAAATC351 GGTGAGACTC TAGTCTTGCC AAAAAGTGCT TTCACTGTGG GGCTCACGGT401 GCTGAGCAAG TTTCCTTCTT CAGATATGCC CATTAAATTT GATAAGATCC451 TGTATAACGA ATTCAACCAT TATGATACAG CAGCGGGGAA ATTCACGTGC501 CACATTGCTG GGGTCTATTA CTTCACCTAC CACATCACTG TTTTCTCCAG551 AAATGTTCAG GTGTCTTTGG TCAAAAATGG AGTAAAAATA CTGCACACCA601 AAGATGCTTA CATGAGCTCT GAGGACCAGG CCTCTGGCGG CATTGTCCTG651 CAGCTGAAGC TCGGGGATGA GGTGTGGCTG CAGGTGACAG GAGGAGAGAG701 GTTCAATGGC TTGTTTGCTG ATGAGGACGA TGACACAACT TTCACAGGGT751 TCCTTCTGTT CAGCAGCCCGSEQ ID NO6(INSP058蛋白質序列外顯子3)1 ADGKVEAKGI KGDQGSRGSP GKHGPKGLAG PMGEKGLRGE TGPQGQKGNK51 GDVGPTGPEG PRGNIGPLGP TGLPGPMGPI GKPGPKGEAG PTGPQGEPGV101 RGIRGWKGDR GEKGKIGETL VLPKSAFTVG LTVLSKFPSS DMPIKFDKIL151 YNEFNHYDTA AGKFTCHIAG VYYFTYHITV FSRNVQVSLV KNGVKILHTK201 DAYMSSEDQA SGGIVLQLKL GDEVWLQVTG GERFNGLFAD EDDDTTFTGF251 LLFSSP
SEQ ID NO7(INSP058全核苷酸序列)1 ATGAGGATCT GGTGGCTTCT GCTTGCCATT GAAATCTGCA CAGGGAACAT51 AAACTCACAG GACACCTGCA GGCAAGGGCA CCCTGGAATC CCTGGGAACC101 CCGGTCACAA TGGTCTGCCT GGAAGAGATG GACGAGACGG AGCGAAGGGT151 GACAAAGGCG ATGCAGGAGA ACCAGGACGT CCTGGCAGCC CGGGGAAGGA201 TGGGACGAGT GGAGAGAAGG GAGAACGAGG AGCAGATGGA AAAGTTGAAG251 CAAAAGGCAT CAAAGGTGAT CAAGGCTCAA GAGGATCCCC AGGAAAACAT301 GGCCCCAAGG GGCTTGCAGG GCCCATGGGA GAGAAGGGCC TCCGAGGAGA351 GACTGGGCCT CAGGGGCAGA AGGGGAATAA GGGTGACGTG GGTCCCACTG401 GTCCTGAGGG GCCAAGGGGC AACATTGGGC CTTTGGGCCC AACTGGTTTA451 CCGGGCCCCA TGGGCCCTAT TGGAAAGCCT GGTCCCAAAG GAGAAGCTGG501 ACCCACGGGG CCCCAGGGTG AGCCAGGAGT CCGGGGAATA AGAGGCTGGA551 AAGGAGATCG AGGAGAGAAA GGGAAAATCG GTGAGACTCT AGTCTTGCCA601 AAAAGTGCTT TCACTGTGGG GCTCACGGTG CTGAGCAAGT TTCCTTCTTC651 AGATATGCCC ATTAAATTTG ATAAGATCCT GTATAACGAA TTCAACCATT701 ATGATACAGC AGCGGGGAAA TTCACGTGCC ACATTGCTGG GGTCTATTAC751 TTCACCTACC ACATCACTGT TTTCTCCAGA AATGTTCAGG TGTCTTTGGT801 CAAAAATGGA GTAAAAATAC TGCACACCAA AGATGCTTAC ATGAGCTCTG851 AGGACCAGGC CTCTGGCGGC ATTGTCCTGC AGCTGAAGCT CGGGGATGAG901 GTGTGGCTGC AGGTGACAGG AGGAGAGAGG TTCAATGGCT TGTTTGCTGA951 TGAGGACGAT GACACAACTT TCACAGGGTT CCTTCTGTTC AGCAGCCCG
SEQ ID NO8(INSP058全蛋白質序列)1 MRIWWLLLAI EICTGNINSQ DTCRQGHPGI PGNPGHNGLP GRDGRDGAKG51 DKGDAGEPGR PGSPGKDGTS GEKGERGADG KVEAKGIKGD QGSRGSPGKH101 GPKGLAGPMG EKGLRGETGP QGQKGNKGDV GPTGPEGPRG NIGPLGPTGL151 PGPMGPIGKP GPKGEAGPTG PQGEPGVRGI RGWKGDRGEK GKIGETLVLP201 KSAFTVGLTV LSKFPSSDMP IKFDKILYNE FNHYDTAAGK FTCHIAGVYY251 FTYHITVFSR NVQVSLVKNG VKILHTKDAY MSSEDQASGG IVLQLKLGDE301 VWLQVTGGER FNGLFADEDD DTTFTGFLLF SSPSEQ ID NO9(INSP058SV全核苷酸序列)ATGAGGATCTGGTGGCTTCTGCTTGCCATTGAAATCTGCACAGGGAACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCAGGAGAACCAGGATGTCCTGGCAGCCCGGGGAAGGATGGGACGAGTGGAGAGAAGGGAGAACGAGGAGCAGATGGAAAAGTTGAAGCAAAAGGCATCAAAGGAATGTTCAGGTGTCTTTGGTCAAAAACGGAGTAASEQ ID NO10(INSP058SV全蛋白質序列)MRIWWLLLAIEICTGNINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGCPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGMFRCLWSKTESEQ ID NO11(成熟INSP058和INSP058SV核苷酸序列外顯子1)AACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCAGSEQ ID NO12(成熟INSP058和INSP058SV蛋白質序列外顯子1)NINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGSEQ ID NO13(成熟INSP058核苷酸序列)AACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCA
GGAGAACCAGGACGTCCTGGCAGCCCGGGGAAGGATGGGACGAGTGGAGAGAAGGGAGAACGAGGAGCAGATGGAAAAGTTGAAGCAAAAGGCATCAAAGGTGATCAAGGCTCAAGAGGATCCCCAGGAAAACATGGCCCCAAGGGGCTTGCAGGGCCCATGGGAGAGAAGGGCCTCCGAGGAGAGACTGGGCCTCAGGGGCAGAAGGGGAATAAGGGTGACGTGGGTCCCACTGGTCCTGAGGGGCCAAGGGGCAACATTGGGCCTTTGGGCCCAACTGGTTTACCGGGCCCCATGGGCCCTATTGGAAAGCCTGGTCCCAAAGGAGAAGCTGGACCCACGGGGCCCCAGGGTGAGCCAGGAGTCCGGGGAATAAGAGGCTGGAAAGGAGATCGAGGAGAGAAAGGGAAAATCGGTGAGACTCTAGTCTTGCCAAAAAGTGCTTTCACTGTGGGGCTCACGGTGCTGAGCAAGTTTCCTTCTTCAGATATGCCCATTAAATTTGATAAGATCCTGTATAACGAATTCAACCATTATGATACAGCAGCGGGGAAATTCACGTGCCACATTGCTGGGGTCTATTACTTCACCTACCACATCACTGTTTTCTCCAGAAATGTTCAGGTGTCTTTGGTCAAAAATGGAGTAAAAATACTGCACACCAAAGATGCTTACATGAGCTCTGAGGACCAGGCCTCTGGCGGCATTGTCCTGCAGCTGAAGCTCGGGGATGAGGTGTGGCTGCAGGTGACAGGAGGAGAGAGGTTCAATGGCTTGTTTGCTGATGAGGACGATGACACAACTTTCACAGGGTTCCTTCTGTTCAGCAGCCCGSEQ ID NO14(成熟INSP058蛋白質序列)NINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGRPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGDQGSRGSPGKHGPKGIAGPMGEKGLRGETGPQGQKGNKGDVGPTGPEGPRGNIGPLGPTGLPGPMGPIGKPGPKGEAGPTGPQGEPGVRGIRGWKGDRGEKGKIGETLVLPKSAFTVGLTVLSKFPSSDMPIKFDKILYNEFNHYDTAAGKFTCHIAGVYYFTYHITVFSRNVQVSLVKNGVKILHTKDAYMSSEDQASGGIVLQLKLGDEVWLQVTGGERFNGLFADEDDDTTFTGFLLFSSPSEQ ID NO15(成熟INSP058SV核苷酸序列)AACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCAGGAGAACCAGGATGTCCTGGCAGCCCGGGGAAGGATGGGACGAGTGGAGAGAAGGGAGAACGAGGAGCAGATGGAAAAGTTGAAGCAAAAGGCATCAAAGGAATGTTCAGGTGTCTTTGGTCAAAAACGGAGTAASEQ ID NO16(成熟INSP058SV蛋白質序列)NINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGCPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGMFRCLWSKTE
權利要求
1.一種多肽，其特徵在於，所述多肽(i)包括SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO14所示的胺基酸序列；(ii)是其片段，該片段具有TNF-樣分泌性蛋白質功能，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，所述多肽(i)由SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO14所示的胺基酸序列組成；(ii)是其片段，該片段具有TNF-樣分泌性蛋白質功能，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
3.一種多肽，它是如權利要求1或2的(iii)部分所述的功能等同物，與與SEQ ID NO8所示的胺基酸序列同源。
4.一種多肽，它是如權利要求1至3中任何一項所述的片段或功能等同物，與SEQ ID NO8所示的胺基酸序列或其活性片段具有80％以上的序列同一性，優選85％、90％、95％、98％或99％以上的序列同一性。
5.一種多肽，它是如權利要求1至4中任何一項所述的功能等同物，與具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列的多肽有高度的結構同源性。
6.一種多肽，它是如權利要求1、2或4中所述的片段，所述片段具有與權利要求1至4中任何一項的(i)部分所述的多肽相同的抗原決定簇，由SEQ ID NO8所示胺基酸序列的7或以上個胺基酸殘基組成。
7.如權利要求1或2所述的多肽，它由SEQ ID NO10和/或SEQ ID NO16所示的胺基酸序列組成。
8.一種編碼上述權利要求中任何一項所述的多肽的純化核酸分子。
9.如權利要求8所述的純化核酸分子，其特徵在於所述核酸分子具有SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15所示的核酸序列，或者是其冗餘等同物或片段。
10.一種純化核酸分子，它在高度嚴謹條件下與權利要求8或9的核酸分子雜交。
11.一種載體，它含有權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子。
12.一種用權利要求11所述的載體轉化的宿主細胞。
13.一種配體，它特異性地結合權利要求1至7中任何一項所述的多肽。
14.如權利要求13中所述的配體，其特徵在於所述配體是一種抗體。
15.一種化合物，它增加或降低權利要求1至7中任何一項所述的多肽的表達水平或活性。
16.如權利要求15所述的化合物，其特徵在於所述化合物與權利要求1至7中任何一項所述的多肽結合，並且不會誘導該多肽的任何生物作用。
17.如權利要求15或16所述的化合物，其特徵在於所述化合物是天然或修飾的基質、配體、酶、受體或者結構或功能類似物。
18.如權利要求1至7中任何一項所述的多肽、權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權利要求11所述的載體、權利要求12所述的宿主細胞、權利要求13或14所述的配體、或者權利要求15至17中任何一項所述的化合物，在治療或診所疾病中的應用。
19.一種診斷病人疾病的方法，其特徵在於所述方法包括評估所述病人組織中編碼權利要求1至7中任何一項所述的多肽的天然基因的表達水平或者評估所述病人組織中權利要求1至7中任何一項所述的多肽的活性，並將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於所述方法在體外進行。
21.如權利要求19或20所述的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽複合物的條件下，將權利要求13或14所述的配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述複合物。
22.如權利要求19或20所述的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(a)在允許權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子和核酸探針之間形成雜交複合物的嚴謹條件下，將病人的組織樣品與該探針接觸；(b)在步驟(a)使用的相同條件下，將對照樣品與所述探針接觸；以及(c)檢測所述樣品中是否存在雜交複合物，其中，檢測到病人樣品中雜交複合物的水平與對照樣品中雜交複合物水平不同，表示患病。
23.如權利要求19或20所述的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(a)在允許權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子和核酸引物之間形成雜交複合物的嚴謹條件下，將病人組織的核酸樣品與該引物接觸；(b)在步驟(a)使用的相同條件下，將對照樣品與所述引物接觸；以及(c)擴增樣品中的核酸；(d)檢測病人和對照樣品中擴增核酸的水平；其中，檢測到病人樣品的擴增核酸水平與對照樣品的擴增核酸水平明顯不同，表示患病。
24.如權利要求19或20所述的方法，其特徵在於所述方法包括(a)從有待測試疾病的病人中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子；以及(c)通過檢測核酸分子與疾病相關的突變是否存在，診斷病人疾病。
25.如權利要求24所述的方法，其特徵在於所述方法還包括擴增核酸分子以形成擴增產物，以及檢測該擴增產物中是否存在突變。
26.如權利要求24或25所述的方法，其特徵在於所述病人是否存在突變是這樣檢測的將所述核酸分子與在嚴謹條件下和所述核酸分子雜交的核酸探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應於與疾病相關的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；以及檢測探針鏈的未雜交部分是否存在，表示與疾病相關的突變存在或不存在。
27.如權利要求19至26中任何一項所述的方法，其特徵在於所述疾病包括但不限於細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少症、血小板減少症、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎症疾病，包括過敏症、炎症性腸疾病、關節炎、銀屑病和呼吸道發炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化症、血栓症、敗血症、休克、再灌注損傷和缺血；神經系統疾病，包括中樞神經系統疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化症和疼痛；發育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質疏鬆和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質介導的病症，特別是由C1q家族蛋白質介導的那些。
28.如權利要求1至7中任何一項所述的多肽作為TNF-樣分泌性蛋白質的應用。
29.一種藥物組合物，其特徵在於所述組合物含有權利要求1至7中任何一項所述的多肽、權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權利要求11所述的載體、權利要求12所述的宿主細胞、權利要求13或14所述的配體、或者權利要求15至17中任何一項所述的化合物。
30.一種疫苗組合物，其特徵在於所述組合物含有權利要求1至7中任何一項所述的多肽或權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子。
31.如權利要求1至7中任何一項所述的多肽、權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權利要求11所述的載體、權利要求12所述的宿主細胞、權利要求13或14所述的配體、權利要求15至17中任何一項所述的化合物、或者權利要求29所述的藥物組合物在製備治療以下疾病的藥物中的應用細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少症、血小板減少症、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎症疾病，包括過敏症、炎症性腸疾病、關節炎、銀屑病和呼吸道發炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化症、血栓症、敗血症、休克、再灌注損傷和缺血；神經系統疾病，包括中樞神經系統疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側索硬化症和疼痛；發育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質疏鬆和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質介導的病症，特別是由C1q家族蛋白質介導的那些。
32.一種治療病人疾病的方法，其特徵在於所述方法包括把權利要求1至7中任何一項所述的多肽、權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權利要求11所述的載體、權利要求12所述的宿主細胞、權利要求13或14所述的配體、權利要求15至17中任何一項所述的化合物、或者權利要求29所述的藥物組合物給予該病人。
33.如權利要求32所述的方法，其特徵在於當與健康受試者中多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病病人的該表達水平或活性是較低的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是激動劑。
34.如權利要求32所述的方法，其特徵在於當與健康受試者中多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病病人的該表達水平或活性是較高的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是拮抗劑。
35.一種監測病人疾病治療的方法，其特徵在於所述方法包括在一段時間內監測病人組織中權利要求1至7中任何一項所述的多肽的表達水平或活性、或權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子的表達水平，若在該時間內所述表達水平或活性趨向於對照水平，表示該疾病獲得緩解。
36.一種鑑定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的方法，其特徵在於所述方法包括將權利要求1至7中任何一項所述的多肽、或者權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子與懷疑對所述多肽或核酸分子有結合親和力的一或多種化合物接觸，以及選擇能特異性地結合所述核酸分子或多肽的化合物。
37.一種診斷疾病的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括第一容器，它含有在嚴謹條件下與權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，它含有用來擴增該核酸分子的引物；以及該探針和引物的使用說明書，方便診斷疾病。
38.如權利要求37所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括裝有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
39.一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是權利要求8至10中任何一項所述的核酸分子。
40.一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括一或多種與權利要求1至7中任何一項所述的多肽結合的抗體；以及一種用來檢測所述抗體與所述多肽之間結合反應的試劑。
41.一種轉基因或剔除非人動物，其特徵在於所述動物被轉化為表達更高水平、更低水平或不表達權利要求1至7中任何一項所述的多肽。
42.一種篩選有效治療疾病的化合物的方法，其特徵在於所述方法包括將權利要求41所述的非人轉基因動物與候選化合物接觸，並測定該化合物對動物疾病的影響。
43.如權利要求32至36或權利要求42中任何一項所述的方法，其特徵在於所述疾病是權利要求27所列出的其中一種疾病。
全文摘要
本發明涉及新穎蛋白質INSP058，它經本發明鑑定為TNF－樣分泌性蛋白質；本發明還涉及該蛋白質和編碼基因的核酸序列在診斷、預防和治療疾病中的應用。
文檔編號C07K16/18GK1816565SQ03826818
公開日2006年8月9日 申請日期2003年5月21日 優先權日2003年5月21日
發明者S·N·菲茲傑拉德, R·J·法根, C·B·菲爾普斯, C·鮑爾, M·伊伯森, M·優克 申請人:阿雷斯貿易股份有限公司