阿里紅中總三萜酸提取方法

2023-12-01 10:42:21

專利名稱：阿里紅中總三萜酸提取方法
技術領域：
本發明涉及阿里紅中總三萜酸提取方法。
背景技術：
阿里紅[Fomes off icinialis (Vill. ex. Fr. ) Ames]是多孔菌科層孔菌屬的真菌 子實體。俗名苦白蹄，新疆維文版的《維吾爾醫常用藥材》一書中稱阿里紅為「落葉松茸」， 維吾爾語為「哈裡坤」。外形呈馬蹄形，邊緣不規則，大小不等，大的直徑可達到30 40cm， 小的5 10cm，子實體外部為棕黃色或灰白色，內部白色。收載於中華人民共和國衛生部 藥品標準《維吾爾藥分冊》。阿里紅是新疆維吾爾民族醫生的常用藥物，民間驗方也用以治 病。維醫認為阿里紅入藥性燥、熱，有溫胃祛痰、降氣平喘、祛風除溼、消腫利尿之功用，是維 吾爾醫常用的治療慢性氣管炎的藥材之一。藥理實驗表明阿里紅具有溫肺化痰、降氣、活血 消腫、利尿作用。為維吾爾藥複方阿里紅片的主要成分之一，主要用於祛痰平喘。國外學者對阿里紅的化學成分研究表明其主要成分為三萜酸、脂肪酸等，《維吾爾 藥志》中報導其含有多種三萜、留體化合物，其中三萜酸含量可高達16%。三萜類成分是很多藥用真菌的有效成分之一，藥用真菌在提高人體免疫功能、抗 衰老及其他許多保健功能方面已受到高度重視，其種類多、分布廣、繁殖快，在中國現代醫 藥中起著重要作用，是中草藥的一個重要的組成部分。阿里紅中三萜酸類化合物有不少研 究，但對三萜化合物標準化的提取工藝研究及含量測定方法未見文獻報導，使提取物的質 量控制難以實現，生物活性的研究結果，也就變得難以肯定。因而我們設計了三水平四因素 正交試驗，進行了阿里紅三萜化合物的標準化提取方法研究。

發明內容
本發明的目的在於提供一種阿里紅的提取物的製備方法。本發明提供的阿里紅的提取物的製備方法，包括如下步驟取阿里紅，對所述阿里 紅用提取溶劑進行提取，收集提取液，得到所述阿里紅的提取物；所述提取溶劑是60% -95% (體積百分比)乙醇水溶液；所述提取溶劑的用量是 所述阿里紅質量的8-12倍；所述提取的溫度是80-100°C。為了充分提取，阿里紅可在提取之前先粉碎，過10目篩。上述提取的方法具體可以是回流提取，所述回流提取的次數是2-4次，每次1-4小 時，所述回流提取的溫度是80-100°C。在一個實施例中，上述提取溶劑可以是95% (體積百分比)的乙醇水溶液；所述 提取溶劑的用量是所述阿里紅質量10倍；所述回流提取的溫度是100°C ；所述回流提取的 次數是3次，每次1-3小時。在另一實施例中，上述提取溶劑是60-80% (體積百分比)的乙醇水溶液；所述提 取溶劑的用量是所述阿里紅質量8-10倍；所述回流提取的溫度是80-100°C;所述回流提取 的次數是2次，每次1.5-3小時。
進一步，上述回流提取的次數是2次，第1次回流提取的提取溶劑的用量是所述阿 裡紅質量的10倍，所述第1次回流提取的時間是3小時；第2次回流提取的提取溶劑的用 量是所述阿里紅質量的8倍，所述第2次回流提取的時間是1. 5小時；所述提取溶劑是60% 或70%或80% (體積百分比)的乙醇水溶液；所述回流提取的溫度是100°C。上述方法還包括將所述提取液經過減壓濃縮然後真空乾燥至恆重，得到作為所述 阿里紅的提取物的固體粉末。更進一步，上述製備方法還包括測定上述的固體粉末中總三萜酸含量，其步驟如 下a)往上述固體粉末中加入5%香草醛-冰醋酸和高氯酸，密塞混勻，在50-70°C條 件下反應20-30分鐘，然後迅速置於冰浴上停止反應，得到顯色溶液；所述5%香草醛-冰 醋酸是將5g香草醛溶於冰醋酸中，再用冰醋酸定容至100mL後得到的溶液；其中固體粉末 與5%香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是(0.03-0. 05)mg (0. 2-0. 8)ml (0.8-1.4) mL ；b)往步驟a)中的顯色溶液中加入冰醋酸定容，在554nm波長處測吸光度值，然後 根據標準曲線計算上述的方法製備得到的提取物中總三萜酸含量；其中定容後的體積與步 驟a)中的固體粉末的配比是10mL (0. 03-0. 05)mg。在步驟a)中，所述固體粉末與5%香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是 0. 04mg 0. 5mL 1. OmL ；所述反應溫度是60°C，反應時間是25分鐘。為了防止假陽性的出現，上述製備方法還包括測定上述的固體粉末中去氫硫色多 孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)含量，其步驟如下I)將上述固體粉末用甲醇作為溶劑進行溶解，得到樣品溶液；II)將步驟I)得到的樣品溶液稀釋後用濾膜過濾得到濾液；III)將步驟II)得到的濾液進行HPLC測定，根據去氫硫色多孔菌酸標準曲線，計 算出上述固體粉末中的去氫硫色多孔菌酸含量。在步驟I)中，所述甲醇與所述固體粉末的配比是(0.04-0. 06)g (10_75)mL，優 選配比是 0.05g (10-75mL)；在步驟II)中，所述濾膜的孔徑是0.45i!m;步驟III)中，所述HPLC條件是色譜 ft :Agilent Technologies ^w] Zorbax Eclipse XDB-C18 (250mmX 4. 6mm, 5 u m)；^ 動相乙腈-0. 4%磷酸水溶液(61 39)；流速1. OmL/min ；檢測波長:242nm ；柱溫25°C。正交實驗初步篩選顯示4個因素對其影響重要性依次為提取溶劑(A) >提取方 法(B) >提取次數(D) >提取時間(C)，直觀分析綜合評價R值，最佳提取工藝是A2B2C3Di， 即95%乙醇加熱回流提取3次，每次1小時。通過正交實驗初步篩選結果，並考慮到成本和試劑的安全性，選用乙醇最為經濟、 安全，以乙醇為溶劑作進一步選擇進行單因素分析。結果顯示阿里紅中三萜酸類成分的 最佳提取工藝為80%乙醇加熱回流提取兩次，第一次加10倍量乙醇提取3h，第二次加8倍 量乙醇提取1.5h，此時提取物中總三萜酸含量平均值達84. 03士0. 77%，提取率平均值達 22. 45士0. 38 (%)，去氫硫色多孔菌酸含量達5. 17士0. 10%。大多數文獻報導的對其他藥材中三萜(酸)類成分提取方法優選中，僅對總三萜 含量或提取率為指標進行分析，未考慮提取條件對其中某種有藥理活性的單體成分含量，這樣可能出現假陽性結果，使優選出的方法不可靠。本發明中為避免此現象的幹擾，在測定 總三萜酸含量並考慮其提取率同時，採用其中特徵性成分去氫硫色多孔菌酸為對照品，測 定該種三萜單體成分含量，進行綜合分析評價，最終確定阿里紅中三萜酸類化合物的標準 化提取方法。


圖1去氫硫色多孔菌酸結構式。圖2對照品去氫硫色多孔菌酸高效液相色譜圖。圖3阿里紅藥材供試品溶液高效液相色譜圖。圖4去氫硫色多孔菌酸對照品在242nm波長處紫外吸收光譜圖。圖5供試品保留時間為9. 774min時在242nm波長處紫外吸收光譜圖。圖6去氫硫色多孔菌酸對照品標準曲線。圖75%香草醛-冰醋酸用量考察結果。圖8供試品及對照品薄層色譜圖，1.供試品I ;2.去氫硫色多孔菌酸對照品；3.供 試品II；4.去氫硫色多孔菌酸對照品。圖9去氫硫色多孔菌酸對照品(A)及供試品溶液(B)顯色後可見光譜掃描圖。圖10去氫硫色多孔菌酸對照品標準曲線(總三萜酸含量測定)。圖11正交實驗1中阿里紅藥材水提取時供試品溶液高效液相色譜圖。圖12正交實驗2中阿里紅藥材水提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖13正交實驗3中阿里紅藥材水提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖14正交實驗4中阿里紅藥材95%乙醇提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖15正交實驗5中阿里紅藥材95%乙醇提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖16正交實驗6中阿里紅藥材95%乙醇提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖17正交實驗7中阿里紅藥材二氯甲烷提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖18正交實驗8中阿里紅藥材二氯甲烷提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖19正交實驗9中阿里紅藥材二氯甲烷提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖20阿里紅藥材60%乙醇提取供試品溶液的高效液相色譜圖。圖21阿里紅藥材70%乙醇提取時供試品溶液高效液相色譜圖。圖22阿里紅藥材80%乙醇提取時供試品溶液高效液相色譜圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。阿里紅2007年10月購於新疆維吾爾醫院，經新疆藥物研究所劉慶華研究員鑑定 為多孔菌科層孔菌屬阿里紅[Fomes officinialis (Vill. ex. Fr.)Ames]的子實體；為了便 於提取阿里紅中的成分，在以下實施例中先將阿里紅粉碎成粗粉(過10目篩)。純化後的去氫硫色多孔菌酸對照品(純度99.5% )，去氫硫色多孔菌酸的結構 式如圖1所示。其中純化後的對照品的製備方法阿里紅乾燥子實體5Kg，用95%的乙醇 回流提取2次，合併提取液回收溶劑後得浸膏約700克，浸膏溶於適量95%的乙醇中，用100-200目矽膠拌樣，依次以石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮和甲醇洗脫，其中氯仿萃取物 240g(Fr. B)。Fr. B經矽膠柱色譜，氯仿-甲醇(10 0 6 4 0 10)梯度洗脫，分為 Fr. 1 6六個部分。Fr. 3部分經反覆矽膠柱色譜(氯仿-甲醇10 1 6 4 0 10) 得到去氫硫色多孔菌酸粗品，將去氫硫色多孔菌酸粗品溶於少量吡啶中，C18矽膠色譜柱經 甲醇-水(5 5) 400mL平衡，溼法加樣，以甲醇-水(6 4 7 3 8 2)梯度洗脫， 收集各濃度梯度洗脫液。按每份250mL接收洗脫流份，分別得流份(1)-(11)，(12)-(15)， (16)-(24)。各流份減壓蒸乾溶劑後用少量甲醇溶解，進行薄層檢識，展開劑為氯仿-甲醇 (9 1)，顯色劑為10%硫酸。根據薄層色譜斑點位置與去氫硫色多孔菌酸對照品比較， 點樣後與對照品在相同位置顯現紫色斑點，且未見雜質斑點，表明為目標化合物，將其溶劑 揮幹並真空乾燥，得白色固體粉末，即為純化後的對照品，經檢測純化後的對照品中純度為 99. 5%。實施例1、阿里紅中去氫硫色多孔菌酸含量測定方法的建立及其檢測一、阿里紅中去氫硫色多孔菌酸含量測定方法的建立1、提取溶劑的選擇精密稱取阿里紅粗粉6份，各2g，分置6個50mL具塞三角瓶中，分別加入50mL甲 醇、70%甲醇、無水乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水，密塞，稱定重量，均超聲(35kHz)提取lh， 放冷，再稱重，用各溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，濾渣再分別以各自溶劑重複操作一 次，分別合併濾液，減壓蒸乾，殘渣以甲醇轉溶至25mL量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻， 用0. 45 y m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得六種溶劑提取所得的供試品溶液，各進樣5 u L， 採用HPLC測定各峰面積值，以峰面積代表其中去氫硫色多孔菌酸含量。其中HPLC 檢測條件是色譜柱:Agilent Technologies 公司 Zorbax EclipseXDB-C18(250_X4. 6mm，5iim)分析柱；流動相乙腈-0. 4%磷酸水溶液(61 39)； 流速1. OmL/min ；檢測波長:242nm ；柱溫25°C。結果見表1所示甲醇提溶液去氫硫色多孔菌酸的峰面積最大，其中去氫硫色多 孔菌酸含量最高，且過濾時間相對較短，水溶液去氫硫色多孔菌酸含量最低，故最終優選甲 醇為供試品溶液製備的最佳提取溶劑。表1不同溶劑提取考察結果 2、提取方法的選擇在步驟1已經確定甲醇為提取溶劑的基礎上，設置以下三組實驗來確定最佳的提 取方法1)超聲提取法取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，置100mL具塞三角瓶中，加入 甲醇60mL，密塞，稱定重量，超聲(35kHz)提取lh，放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾渣重複操作一次，合併濾液，減壓濃縮，再用甲醇定容至25mL量瓶中，搖勻，用 0. 45um微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。2)回流提取法取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，置於圓底燒瓶中，加入甲醇 60mL,稱定重量，加熱回流lh，放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾渣重複 操作一次，合併濾液，減壓濃縮，再用甲醇定容至25mL量瓶中，搖勻，用0. 45 y m微孔濾膜濾 過，即得供試品溶液。3)索氏提取法取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，置於索氏提取器中，加入甲醇 70mL,索氏提取3h，提取液減壓濃縮至適量，再用甲醇定容至25mL量瓶中，搖勻，用0. 45 y m 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。以上供試品溶液各進樣5 y L，採用HPLC(檢測條件與步驟1相同)測定各峰面積 值，以峰面積代表其中去氫硫色多孔菌酸含量。表2不同提取方法考察結果 結果如表2所示，超聲法對藥材中去氫硫色多孔菌酸的提取率最高，且操作時間 相對較短，較為簡單方便，故選擇超聲法為供試品溶液製備的最佳提取方法。3、提取時間的選擇在步驟1和2的基礎上，設置不同提取時間的實驗精密稱取3份阿里紅藥材粗粉，各2g，分置100mL具塞三角瓶中，加入甲醇60mL， 密塞，稱定重量，分別超聲(35kHz)處理20min、40min、60min，放冷，再稱重，用甲醇補足 減失的重量，搖勻，濾過，濾液減壓濃縮至近幹，再用甲醇定容至25mL量瓶中，搖勻，用 0. 45um微孔濾膜濾過，取續濾液，即得不同提取時間的供試品溶液，均各進樣5 y L，採用 HPLC(檢測條件與步驟1相同)測定各峰面積值，以峰面積代表其中去氫硫色多孔菌酸含 量。表3不同提取時間考察結果 結果如表3所示，超聲提取60min可將阿里紅藥材中的去氫硫色多孔菌酸較完全 地提取出，故最終選擇以甲醇超聲提取60min為供試品溶液製備最佳提取方法。4、阿里紅中去氫硫色多孔菌酸含量測定的最佳方法1)對照品溶液的製備精密稱定去氫硫色多孔菌酸5. 57mg,置於10mL容量瓶中，加甲醇溶解，再用甲醇 稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每lmL含去氫硫色多孔菌酸對照品0. 557mg)。2)供試品溶液的製備
取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，置於100mL具塞三角瓶中，加入甲醇60mL，密 塞，稱定重量，超聲(35kHz)處理60min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻， 濾過，濾液減壓濃縮至近幹，再用甲醇定容至25mL量瓶中，搖勻。從中精密吸取0. 5mL置於 10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，再將其稀釋兩倍，用0. 45 y m微孔濾膜濾過，取續濾液，即 得供試品溶液。3)檢測將步驟1)的對照品溶液和步驟2)的供試品溶液各進樣10iU，採用HPLC(色譜條 件與步驟1相同)進行測定，記錄去氫硫色多孔菌酸峰面積值，外標法計算含量。對照品溶液及供試品溶液的高效液相色譜圖分別如圖2和圖3所示，去氫硫色多 孔菌酸的出峰時間分別是9. 871min和9. 833min。對照品溶液及收集的保留時間為9. 774分鐘時的供試品溶液在242nm波長處紫外 吸收光譜圖分別如圖4和圖5所示，發現供試品溶液與對照品溶液均在242nm波長處有最 大吸收，且空白對照無幹擾，故最終選擇242nm作為阿里紅中去氫硫色多孔菌酸含量測定 的檢測波長。二、阿里紅中去氫硫色多孔菌酸含量測定方法的檢測1、標準曲線的製備分別精密吸取步驟一中的去氫硫色多孔菌酸對照品溶液(0. 557mg/mL) 0.2， 0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 2mL分置於5mL量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列去 氫硫色多孔菌酸對照品溶液。上述六個濃度對照品溶液分別進樣lOiil，採用HPLC測定 各峰面積值(結果見表4)，以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪製標準曲 線，得回歸方程為y = 6450. 95x+5. 48972，r = 0. 9997，結果表明去氫硫色多孔菌酸在 0. 0223-0. 1337mg/ml範圍內呈良好的線性關係。標準曲線見圖6。表4去氫硫色多孔菌酸標準曲線數據測定結果 2、精密度試驗精密稱取阿里紅粗粉2g，按照步驟一的步驟4中的方法製成供試品溶液，按照步 驟一中的色譜條件進行HPLC檢測。重複進樣5次，測定峰面積。結果如表5所示，相對標 準偏差(RSD)為0. 37% (n = 5)，精密度良好。表5精密度試驗結果(n = 5) 3、穩定性試驗精密稱取阿里紅粗粉2g，按照步驟一的步驟4中的方法製成供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8，12，24h進樣lOyl，採用HPLC測定各峰面積值。結果如表6所示，平均峰面積 為539. 01，其穩定性的RSD為1. 80%，表明供試品溶液在24h內基本穩定。表6穩定性試驗結果(n = 7) 4、重複性試驗分別精密稱取5份阿里紅藥材粗粉2g，按照步驟一的步驟4中的方法製備5份供 試品溶液，各進樣10 yl，並進對照品溶液10 iil，採用HPLC測定各峰面積值，用外標法計算 其中去氫硫色多孔菌酸含量。結果如表7所示，其方法重複性的RSD為1. 20% (n = 5)。表7重複性試驗結果(n = 5) 5、加樣回收率試驗精密稱取已知去氫硫色多孔菌酸含量為3. 9124%的阿里紅藥材粗粉6份，每份 0. 025g，加入一定量去氫硫色多孔菌酸對照品，分別加入甲醇20mL，密塞，稱定重量，超聲 (35kHz)處理60min，放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用甲醇定容至25mL 量瓶中，搖勻，0. 45 ym微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。樣品與對照品溶液均各進樣10 yl， 採用HPLC測定峰面積值，計算去氫硫色多孔菌酸含量，其加樣回收率均值為100. 68%,RSD =1.97% (n = 6)。結果見表 8。表8加樣回收率試驗結果(n = 6) 0.025180.98510.961.935898.95實施例2、阿里紅總三萜酸成分含量測定方法的建立及其檢測一、阿里紅總三萜酸成分含量測定方法的建立1、顯色劑(5%香草醛_冰醋酸)用量的選擇供試品溶液的製備取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，置於索式提取器中，加入 二氯甲烷70mL，提取2. 5h，提取液減壓蒸乾，殘渣用甲醇溶解並定容至25mL量瓶中，搖勻， 即得本實施例的供試品溶液。再精密吸取0. lmL供試品溶液置於25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。從中 分別精密吸取0. 2，0. 5，0. 8，1. 1，1. 4mL分置10mL具塞試管中，水浴蒸乾，取出放至室溫，分 別精密加入5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. OmL,搖勻，密塞，置60°C水浴中恆溫加熱 20min，取出，立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，隨 行空白溶液對照，分別在554nm波長處測定吸光度。表95%香草醛-冰醋酸用量考察結果 結果如表9和圖7所示，隨著取樣量成倍數增大，吸光度成比例增加，且線性關係 良好，r = 0. 9985。證明0. 5mL香草醛-冰醋酸可與所取樣品中的三萜酸類成分完全反應， 且取用0. 5mL操作方便準確，故顯色劑用量為0. 5mL較為合適。2、顯色劑(高氯酸)用量的選擇精密稱取阿里紅藥材粗粉2g，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備供試品 溶液，再精密吸取0. lmL置於25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0. 5mL,共 6份，分置10mL具塞試管中，水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5 %香草醛-冰醋酸 0. 5mL，再各精密加入依次為高氯酸0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 2，1. 4mL，混勻，密塞，置60°C水浴 中加熱20min，取出立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖 勻，隨行空白溶液對照，分別在554nm波長處測定吸光度。表10高氯酸用量用量考察結果 結果如表10所示，隨著高氯酸用量的上升，吸光度增加，達到1. OmL時吸光度最 大，此後再增加其用量吸光度降低，故選擇1. OmL為高氯酸最佳用量。3、水浴溫度(反應溫度)的選擇精密稱取阿里紅藥材粗粉2g，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備供試品 溶液，再精密吸取0. lmL置於25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0. 5mL,共 6份，分置10mL具塞試管中，水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5 %香草醛-冰醋酸 0. 5mL,高氯酸1. OmL,混勻，密塞，分別置於40,50,60,70,80,90°C水浴中反應20min，取出， 立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，隨行空白溶液對 照，分別在554nm波長處測定吸光度。表11不同溫度考察結果 結果如表11所示，在40-90°C範圍內隨水浴溫度的上升，吸光度增加，而在 50-70 °C範圍內吸光度相對比較穩定，故選擇60 V作為顯色時的水浴溫度。4、顯色時間的選擇精密稱取阿里紅藥材粗粉約2g，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備供試 品溶液，再精密吸取0. lmL置於25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0. 5mL, 共6份，分置10mL具塞試管中，水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5%香草醛-冰醋酸 0. 5mL,高氯酸1. OmL,混勻，密塞，分別置於60°C水浴中，依次加熱5，10，15，20，25，30min, 取出，立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，隨行空白 溶液對照，分別在554nm波長處測定吸光度。表12不同顯色時間考察結果 結果如表12所示，在5-25min範圍內，隨顯色加熱時間的延長，吸光度增加，當超 過25min後吸光度下降，而在20-30min範圍內吸光度相對比較穩定，故選擇25min作為顯 色時間。最終選擇用5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. 0mL，60°C加熱顯色25分鐘為阿 裡紅中總三萜酸成分最佳顯色方法。5、二氯甲烷作為提取溶劑的可行性分析精密稱取阿里紅藥材粗粉2. 0053g，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備 供試品溶液。精密稱取去氫硫色多孔菌酸對照品2. 02mg，置於10mL量瓶中，加適量甲醇超聲使 溶解，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0. 202mg/mL的去氫硫色多孔菌酸對照品溶液。分別吸取供試品及去氫硫色多孔菌酸對照品溶液(0. 202mg/mL)，點樣於同一矽膠 G薄層板上，以氯仿-甲醇(9 1)為展開劑，展開，取出，晾乾。噴以10%硫酸溶液，加熱 至斑點顯色清晰，供試品與去氫硫色多孔菌酸對照品溶液薄層色譜相應的位置上，顯相同 的紫色斑點。置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品及對照品色譜中均未出現螢光斑點。表 明用二氯甲烷作溶劑可將阿里紅中三萜酸類成分較完全地提取出來。其薄層色譜見附圖8。6、檢測波長的選擇取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備 供試品溶液，再精密吸取0. lmL置於25mL量瓶中，精密吸取對照品溶液2mL置於10mL量瓶 中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取稀釋後的供試品溶液0. 5mL與對照品溶液1. OmL, 分置10mL具塞試管中，分別水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5 %香草醛-冰醋酸 0. 5mL，高氯酸1. OmL,搖勻，密塞，置60 V水浴中恆溫加熱20min，取出，立即置冰水浴中冷 卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。隨行空白溶液對照，分別在400 800nm波長範圍內掃描，發現供試品溶液與對照品溶液均在554nm波長處有最大吸收，且空 白對照無幹擾，故最終選擇554nm作為阿里紅總三萜酸類成分含量測定的檢測波長。其可 見光譜掃描圖見圖9。二、阿里紅總三萜酸成分含量測定方法的檢測1、標準曲線的製備精密稱取去氫硫色多孔菌酸對照品2. 02mg，置於10mL量瓶中，加適量甲醇超聲使 溶解，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。再分別精密吸取0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 2mL置 於6個10mL具塞試管中(表13中編號分別是1、2、3、4、5和6)，水浴蒸乾，取出放至室溫， 分別精密加入5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. OmL,混勻，密塞，置60°C水浴中恆溫加 熱25min，取出，立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。 以不加供試品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. OmL，用冰醋酸稀釋至刻 度的混合溶液為空白對照，分別在554nm波長處測吸光度值(其結果見表13)，以對照品溶 液濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪製標準曲線，得回歸方程為A = 23. 84C+0. 0297， r = 0. 9989，結果表明去氫硫色多孔菌酸標準品在0. 0040-0. 0242mg/ml範圍內線性關係 良好。標準曲線見圖10。表13去氫硫色多孔菌酸標準曲線數據測定結果 2、精密度試驗取上述步驟1中編號為4的經顯色後的對照品溶液，在554nm波長處連續測其吸 光度5次，結果見表14，RSD為0. 17% (n = 5)，精密度良好。表14精密度試驗結果(n = 5) 3、重複性試驗分別取5份阿里紅藥材粗粉各約2g，精密稱定，按本實施例的步驟一中的步驟1的 方法製備供試品溶液，精密吸取0. lmL置於25mL量瓶中，再從中精密吸取0. 5mL，分置10mL 具塞試管中。水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸 1. OmL，混勻，密塞，置60°C水浴中恆溫加熱25min，取出，立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL 量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。以不加供試品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸 0. 5mL，高氯酸1. OmL，用冰醋酸稀釋至刻度的混合溶液為空白對照，分別在554nm波長處測 吸光度值，隨行去氫硫色多孔菌酸對照品進行吸光度測試，計算阿里紅中總三萜酸含量，結 果見表15，其方法重複性的RSD為2. 82% (n = 5)。表15重複性試驗結果(n = 5) 4、穩定性試驗取阿里紅藥材粗粉約2g，精密稱定，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備 供試品溶液，再精密吸取0. lmL置於25mL量瓶中。水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入 5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. OmL,混勻，密塞，置60°C水浴中恆溫加熱25min，取出， 立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。以不加供試品溶 液而直接加5%香草醛-冰醋酸0. 5mL，高氯酸1. OmL,用冰醋酸稀釋至刻度的混合溶液為空 白對照，分別在554nm波長處測吸光度值，隨行去氫硫色多孔菌酸對照品進行吸光度測試，分別在0、10、20、30、60、90、120和150分鐘時，波長554nm處測吸光度，結果見表16。表16穩定性試驗結果 結果表明阿里紅中總三萜酸成分經顯色後60min內，吸光度變化較小，RSD為 2. 59%，90min時RSD上升至3. 32%，隨著時間延長，吸光度不斷下降，所以該方法測定應在 顯色後60min內完成，此期間溶液穩定性較好。5、加樣回收率試驗精密稱取已知含量的阿里紅粗粉6份，每份約0. 004g，加入一定量去氫硫色多孔 菌酸對照品，按本實施例的步驟一中的步驟1的方法製備供試品溶液，水浴蒸乾，取出放至 室溫，分別精密加入5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. OmL,混勻，密塞，置60°C水浴中恆 溫加熱25min，取出，立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖 勻。以不加供試品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸0. 5mL，高氯酸1. OmL，用冰醋酸稀釋至 刻度的混合溶液為空白對照，分別在554nm波長處測吸光度值，隨行去氫硫色多孔菌酸對 照品進行吸光度測試，在波長554nm處測吸光度，計算阿里紅中總三萜酸含量，其加樣回收 率均值為 98. 56%, RSD = 1. 89% (n = 6)。結果見表 17。表17加樣回收率試驗結果(n = 6)
實施例3、阿里紅中三萜酸成分的標準化提取方法研究一、針對提取溶劑、提取方法、提取時間和提取次數進行正交試驗的研究1、幹浸膏的製備取阿里紅藥材，粉碎成粗粉(過10目篩)，精密稱取共27份，每份約5g，按表19 的正交實驗設計方案進行提取，每個樣本重複提取操作3次。每次均加入10倍量各溶劑， 稱定重量，用各溶劑補足減失的重量，搖勻，將提取物粗濾後收集提取液，將3次提取液合 並減壓濃縮，置已乾燥至恆重的蒸發皿中，進行真空乾燥(_0.09MPa)。其中95%乙醇提取 物乾燥12h，二氯甲烷提取物乾燥5h，水提取物乾燥40h以上，得固體粉末，分別稱重，即可 2、阿里紅中總三萜酸成分含量的測定分別精密稱取各提取物幹浸膏粉末，每份約0. Olg，置25mL量瓶中，用適量甲醇溶 解，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻。然後提取物如果是水提取物，從25mL量瓶中精密吸取0. 5mL,分置10mL具塞試管 中，水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5%香草醛-冰醋酸0. 5mL，高氯酸l.OmL，混勻， 密塞，置60°C水浴中恆溫加熱25min，取出，立即置冰水浴中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入 冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。以不加供試品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸0. 5mL,高氯酸 1. OmL，用冰醋酸稀釋至刻度的混合溶液為空白對照，分別在554nm波長處測吸光度值。如果提取物是有機溶劑提取物，其與水提取物的區別在於在水浴蒸乾步驟之 前，先從25mL量瓶中精密吸取2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取 0. 5mL，分置10mL具塞試管中，之後操作及測定方法同水提取物。將吸光度值代入回歸方程，計算各樣品中總三萜酸含量及提取率。正交實驗結果 見表20，方差分析見表21。通過正交實驗提取及含量測定後，直觀分析結果(見表20)表明以阿里紅中總 三萜酸提取率為指標，4個因素對其影響重要性依次為提取溶劑(A) >提取方法(B) >提 取次數⑶ >提取時間(C)，由直觀分析計算得出其最佳提取工藝是A2B2C3Di，即95%乙醇 加熱回流提取3次，每次1小時。方差分析結果(見表21)顯示溶劑類型對提取率有非常
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求得幹浸膏粉末量。其中表19的正交試驗方案中的各因素水平如表18所示，採用常規的四因素三水 平正交設計法，選用L9(34)正交實驗表，以提取溶劑、提取方法、提取時間和提取次數為實 驗因素，每個因素設3個水平，以藥材中總三萜酸的提取率及去氫硫色多孔菌酸含量為指 標進行提取工藝條件的初步篩選。表18正交實驗因素和水平表
法法法 聲流漬 超回浸14/17 頁
顯著的影響(P提取方法(B) >提取次數(D) >提取時間(C)，直觀分析綜合評價R值，最佳提取工藝是 A2B2C3Di，即95%乙醇加熱回流提取3次，每次1小時。方差分析(見表24)表明溶劑類型 對實驗結果有非常顯著的影響(P< 0.01)，其他因素的影響不顯著。方差分析可得R2 = 0. 992(調整的R2 = 0. 969)，說明該多因素方差模型對三萜酸類成分綜合評價數據的總體 擬合程度較高。表23正交實驗結果與分析(III) 表24方差分析(II) F010(2，2) =9.0 F0 05 (2，2) = 19. 0 F0 01(2，2) =99.0二、不同濃度的乙醇作為提取溶劑的考察考慮到實際生產省時及成本問題，進行單因素實驗，考察不同濃度乙醇對阿里紅 中總三萜酸含量、提取率以及去氫硫色多孔菌酸含量的影響。為便於實驗設計和工業生產， 按常規提取方法將提取次數選定為兩次。1、幹浸膏的製備取阿里紅藥材，粉碎成粗粉(過10目篩)，精密稱取共9份，每份約5g。分別用 60%、70%和80%的乙醇加熱回流提取兩次，第1次加10倍量乙醇，提取3h，第二次加8倍 量乙醇，提取1. 5h，每個樣本重複提取操作3次。9份樣品每次提取時均在放冷後補充損 失的溶劑至原重量，搖勻。將提取物粗濾後收集提取液，將3次提取液合併減壓濃縮，置已 乾燥至恆重的蒸發皿中，真空乾燥(-0. 09MPa)，60 %、70 %和80 %的乙醇提取物分別乾燥 30h、22h、16h，得固體粉末，分別稱重，即可求得幹浸膏粉末重量。2、總三萜酸成分含量的測定分別精密稱取提取物幹浸膏粉末，每份約0. Olg,置25mL量瓶中，用適量甲醇溶
解並定容至刻度，搖勻。從中精密吸取2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再
精密吸取0. 5mL，分置10mL具塞試管中，水浴蒸乾，取出放至室溫，分別精密加入5%香
草醛_冰醋酸0. 5mL,高氯酸1. 0mL(即粉末與5%香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是
0. 04mg 0.5ml 1. 0ml)，混勻，密塞，置60°C水浴中恆溫加熱25min，取出，立即置冰水浴
中冷卻，轉移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀釋至刻度，搖勻。以不加供試品溶液而直接加5%香草醛-冰醋酸0. 5mL，高氯酸l.OmL，用冰醋酸稀釋至刻度的混合溶液為空白對照，分 別在554nm波長處測吸光度值，利用回歸方程計算各樣品中總三萜酸含量及提取率。結果 見表25。表25不同濃度乙醇對提取的影響結果(I) (n = 3) 根據表20中正交實驗結果與分析以及表25中不同濃度乙醇對提取率的影響可以 看出，用80%乙醇時的提取率平均值為22.4874% (RSD = 1.69%, n = 3)，與正交實驗中 提取率最大值(23. 4006% )相近，該方法穩定、可行。3、去氫硫色多孔菌酸含量的測定取已製得的提取物幹浸膏粉末，60%乙醇提取物、70%乙醇提取物、80%乙醇提取 物每份分別約0. 05g,精密稱定，置10mL量瓶中，用適量甲醇溶解，並定容至刻度，搖勻。其 中70%乙醇提取物再從中精密吸取5mL於10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。80%乙 醇提取物從中精密吸取2mL於10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。各溶液均用0. 45 y m 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按照實施例1中的色譜條件進行HPLC檢測，進樣量10ii L。60%、70%、80%乙醇 提取的供試品溶液高效液相色譜圖如圖20-圖22所示。根據峰面積值及對照品去氫硫色 多孔菌酸線性回歸方程，計算各樣品中去氫硫色多孔菌酸含量及提取率。結果見表26。表26不同濃度乙醇對提取的影響結果(II) (n = 3) 根據表25及表26中的結果以及本實施例中的綜合評價方法可計算得出，用80 %
乙醇時綜合評價分值為17. 2902，與正交實驗中最大值(18. 1349)接近，方法可行。同時考
慮到總三萜酸提取率及指標成分去氫硫色多孔菌酸含量的影響，故確定阿里紅中三萜酸類
成分的最佳提取工藝為80%乙醇加熱回流提取兩次，第一次加10倍量乙醇提取3h，第二次
加8倍量乙醇提取1. 5h。 提取過程中有機溶劑提取效率明顯高於水提取，80%乙醇提取可減少水溶性雜 質，有利於進一步分離純化，並且溶劑無毒、殘留、可回收反覆利用，生產成本較低。該提取 工藝提取率較高，以期成為阿里紅中三萜類成分的標準化提取方法，為篩選阿里紅藥理活 性提供穩定可靠的樣品製備方法。
權利要求
一種阿里紅的提取物的製備方法，包括如下步驟取阿里紅，對所述阿里紅用提取溶劑進行提取，收集提取液，得到所述阿里紅的提取物；所述提取溶劑是60％-95％(體積百分比)乙醇水溶液；所述提取溶劑的用量是所述阿里紅質量的8-12倍；所述提取的溫度是80-100℃。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述提取的方法是回流提取，所述回流提取 的次數是2-4次，每次1-4小時，所述回流提取的溫度是80-100°C。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述提取溶劑是95% (體積百分比)的乙醇水溶液；所述提取溶劑的用量是所述阿里 紅質量10倍；所述回流提取的溫度是100°C ；所述回流提取的次數是3次，每次1-3小時；所述提取溶劑是60-80% (體積百分比)的乙醇水溶液；所述提取溶劑的用量是所述 阿里紅質量8-10倍；所述回流提取的溫度是80-100°C ；所述回流提取的次數是2次，每次 1. 5-3小時。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述回流提取的次數是2次，第1次回流提 取的提取溶劑的用量是所述阿里紅質量的10倍，所述第1次回流提取的時間是3小時；第 2次回流提取的提取溶劑的用量是所述阿里紅質量的8倍，所述第2次回流提取的時間是 1.5小時；所述提取溶劑是60%或70%或80% (體積百分比)的乙醇水溶液；所述回流提 取的溫度是100°C。
5.如權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於所述方法還包括將所述提取液經 過減壓濃縮然後真空乾燥至恆重，得到作為所述阿里紅的提取物的固體粉末。
6.如權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵在於所述製備方法還包括測定權利要 求5所述的固體粉末中總三萜酸含量，其步驟如下a)往權利要求5所述的固體粉末中加入5%香草醛-冰醋酸和高氯酸，密塞混勻，在 50-70°C條件下反應20-30分鐘，然後迅速置於冰浴上停止反應，得到顯色溶液；所述5% 香草醛_冰醋酸是將5g香草醛溶於冰醋酸中，再用冰醋酸定容至100mL後得到的溶液； 其中固體粉末與5%香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是(0.03-0.05)mg (0.2-0.8) mL (0. 8-1. 4)mL ；b)往步驟a)中的顯色溶液中加入冰醋酸定容，然後在554nm波長處測吸光度值，然後 根據標準曲線計算權利要求1-5中任一所述的方法製備得到的提取物中總三萜酸含量；其 中定容後的體積與步驟a)中的固體粉末的配比是10mL (0.03-0. 05)mg。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟a)中，所述固體粉末與5%香草醛-冰 醋酸以及高氯酸的配比是0.04mg 0. 5mL 1. OmL ；所述反應溫度是60°C，反應時間是25 分鐘。
8.如權利要求1-7中任一所述的方法，其特徵在於所述製備方法還包括測定權利要 求5所述固體粉末中去氫硫色多孔菌酸含量，其步驟如下I)將權利要求5所述的固體粉末用甲醇作為溶劑進行溶解，得到樣品溶液；II)將步驟I)得到的樣品溶液稀釋後用濾膜過濾得到濾液；III)將步驟II)得到的濾液進行HPLC測定，根據去氫硫色多孔菌酸標準曲線，計算出 權利要求5所述的固體粉末中的去氫硫色多孔菌酸含量。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於步驟I)中，所述甲醇與所述固體粉末的配比是(0. 04-0. 06) g (10_75)mL，優選配比是 0. 05g (10_75mL)。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特徵在於步驟II)中，所述濾膜的孔徑 是0. 45iim ；步驟III)中，所述HPLC條件是色譜柱Agilent Technologies公司 ZorbaxEclipse XDB-C18(250mmX4. 6mm, 5 u m)分析柱；流動相乙腈 _0. 4 % 磷酸水溶液 (61 39)；流速1.0mL/min;檢測波長242nm;柱溫25°C。
全文摘要
本發明公開了一種阿里紅中總三萜酸提取方法。該方法包括如下步驟取阿里紅，對所述阿里紅用提取溶劑進行提取，得到所述阿里紅的提取物；所述提取溶劑是60％-95％(體積百分比)乙醇水溶液；所述提取溶劑的用量是所述阿里紅藥材質量的8-12倍；所述提取的溫度是80-100℃。結果顯示阿里紅中三萜酸類成分的最佳提取工藝為80％乙醇加熱回流提取兩次，第一次加10倍量乙醇提取3h，第二次加8倍量乙醇提取1.5h，此時提取物中總三萜酸含量平均值達84.03±0.77％，提取率平均值達22.45±0.38(％)，去氫硫色多孔菌酸含量達5.17±0.10％。
文檔編號G01N30/02GK101862353SQ201010198879
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者於萍, 吳霞, 徐碩, 羅容, 鄒海豔 申請人:首都醫科大學