一種用於鑑定白肉靈芝的引物對及其應用的製作方法

2023-12-02 01:22:26

本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段鑑定中藥的方法，具體為一種用於鑑定白肉靈芝的引物對及其應用。
背景技術：
：靈芝是中國名貴中藥材，靈芝在我國已有2000多年的藥用歷史，被歷代醫藥家視為滋補強壯、扶正固本的神奇珍品，經過大量臨床研究，靈芝具有調節免疫、抗腫瘤、保肝解毒、防止心血管系統疾病、抗衰老、抗神經衰弱、降血糖血壓和抗過敏等功效。2015版《中國藥典》收錄靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的乾燥子實體(國家藥典委員會，2015)。關於中國目前廣泛藥用的赤芝，其拉丁學名一直存在爭議。藥典裡用的名稱最早是1907年法國真菌學家在我國貴州採集得靈芝標本後鑑定命名的，沿用迄今。但近年來的研究發現，我國藥用的赤芝和靈芝模式種存在差異，已於2012年被吳聲華等分類學家定名為g.lingzhi。目前，在民間常做藥用的芝類除了藥典裡的赤芝、紫芝外，還有松杉靈芝、四川靈芝、樹舌靈芝、血芝(假芝屬內多個種的商品名統稱，因新鮮子實體創傷會有血樣分泌物流出而得名)等。白肉靈芝是新發現的靈芝屬中國特有種，是廣東省微生物研究所助理研究員胡慧萍等人於2011年在調查西藏林芝地區的野生食藥用菌資源時，採集到的生長在青岡樹上的野生靈芝。通常夏秋季散生至群生於青岡樹腐木上，靠近樹幹基部，分布於西藏與四川等西南地區，可藥用，目前藥材市場上與靈芝混淆使用。但是近幾年，西藏林芝地區在白肉靈芝栽培過程中備受菌種混淆、串種及交叉感染之苦，白肉靈芝菌種相對較弱，從母種到原種再到栽培種的栽培全程均有可能受到其他菌種的侵襲而成批被取代，在菌絲體階段肉眼是完全無法辨別的，等到出芝觀察菌肉才發現種瓜得豆，為時已晚。技術實現要素：本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種鑑定白肉靈芝的有效方法，為白肉靈芝的大規模生產提供保障，本發明提供了一種用於鑑定白肉靈芝的引物對及其應用。技術方案：一種用於鑑定白肉靈芝的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優選的，所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發卡結構序列名稱序列(5』-3』)seqidno.p1-fgcagatctgcgaagcgtgct1p1-rgcagaggagccgaccgacag2p2-fgttcagtttccgtgcca3p2-rcgtcttccgacaggtta4p3-fgtcccacgactgttgaaatacg5p3-rgtgttgtgagcttcgaccat6發卡結構cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在製備鑑定白肉靈芝試劑盒中的應用。優選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100～1000倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優選的，所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優選的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。有益效果：(1)本發明所述引物對的特異性良好，僅能擴增出白肉靈芝的特異性條帶；(2)本發明所述引物對靈敏度高，能夠快速準確鑑定白肉靈芝。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑑定結果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產物鑑定結果；2為實施例2pcr產物鑑定結果；3為實施例3pcr產物鑑定結果。具體實施方式實施例1一種用於鑑定白肉靈芝的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定白肉靈芝試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋1000倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例2一種用於鑑定白肉靈芝的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定白肉靈芝試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋600倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋20倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例3一種用於鑑定白肉靈芝的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5』端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定白肉靈芝試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產物進行電泳檢測，條帶清晰可見，產物單一。sequencelisting蘇州市李良濟健康產業有限公司一種用於鑑定白肉靈芝的引物對及其應用7patentinversion3.3120dna人工序列1gcagatctgcgaagcgtgct20220dna人工序列2gcagaggagccgaccgacag20317dna人工序列3gttcagtttccgtgcca17417dna人工序列4cgtcttccgacaggtta17522dna人工序列5gtcccacgactgttgaaatacg22620dna人工序列6gtgttgtgagcttcgaccat20740dna人工序列7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當前第1頁12