分析裝置以及分析方法

2023-12-02 18:51:56

分析裝置以及分析方法
【專利摘要】本發明提供分析裝置及分析方法。為了定量極微量的生物體分子而用磁微粒特異性捕捉生物體分子並對生物體分子進行螢光標識。磁微粒針對支承基板的高效率的固定反應和磁微粒的凝聚的消除是課題。為了將磁微粒吸引至支承基板而在支承基板背面設置切換接通/斷開的磁場產生裝置，並在支承基板表面設置保持磁微粒的粘接層。首先在支承基板表面的磁場斷開的狀態下將磁微粒的分散溶液放置於支承基板表面。接下來，接通磁場而將液中的磁微粒吸引至支承基板表面。使與支承基板碰撞的磁微粒固定於支承基板表面的粘接層，並且斷開磁場。由此，能夠保持磁微粒不變地消除凝聚，並能夠使支承基板上的磁微粒層為一層。
【專利說明】分析裝置以及分析方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及使用了磁微粒的生物體分子分析方法以及生物體分子分析裝置。

【背景技術】
[0002]近幾年，在癌診斷的領域中，為了早期知曉癌症發病的前兆而研宄了各種癌標記物，也進行了實用化。癌症標誌物是指來自癌細胞的分泌型生物體因子，與癌症的發展一起增加且在血中、尿中顯現。例如，公知有激素、細胞因子等蛋白質、微價仏(組⑶。價仏)等核酸。早期的癌症中這些癌症標誌物的量較小而難以檢測，原本表達量少的癌症標誌物存在的情況也相同。目前，主流的高靈敏度的癌症標誌物檢測方法是使用了抗體的免疫測定法，已知有211「法、納米粒子檢驗等方法。最近，雖然是研宄階段，但作為更高靈敏度的免疫測定法，開發了能以單分子夠檢測的數字￡11^(非專利文獻1〉。在檢測血液中的癌症標誌物的情況下，能夠從患者採取的血液量有限，要求從其中儘量多地捕捉並檢測極微量的癌症標誌物。例如，在從50 VI的血漿中進行檢測的情況下，早期的癌症中癌症標誌物為10—16?10 —121的濃度範圍，從而需要定量在50 V 1中有3000分子的靶分子的檢測靈敏度。這樣，要求能夠檢測低濃度的癌症標誌物的超高靈敏度的檢測裝置。
[0003]現有技術文獻
[0004]非專利文獻
[0005]非專利文獻1:0188111 01 61: &1，他 8101:6011010^7 (自然生物技術)，1111128(6) ^595-599(2010)


【發明內容】

[0006]發明所要解決的課題
[0007]為了定量極微量的生物體分子，用磁微粒特異性地捕捉生物體分子並對生物體分子進行螢光標記。將被磁微粒捕捉的生物體分子固定於支承基板而進行檢測。利用磁場將捕捉到液體中浮遊的生物體分子的磁微粒引向支承基板表面。在磁場的存在下，由於磁微粒本身帶磁，所以在支承基板表面上微粒彼此相互吸引，從而磁微粒凝集。若磁微粒凝集，則在支承基體上磁微粒沿與板的表面的垂直的方向重合。另外，凝聚的微粒將螢光標記捲入內部。
[0008]像這樣重疊的磁微粒、或者在內部捲入有螢光標記的磁微粒有在螢光觀察時無法精度良好地計數的問題。
[0009]用於解決課題的方案
[0010]為了將磁微粒吸引至支承基板而在支承基板背面設置可切換接通丨斷開的磁場產生裝置，在支承基板表面設置保持磁微粒的粘接層。首先，在支承基板表面的磁場斷開的狀態下將磁微粒的分散溶液放置於支承基板表面。接下來，接通磁場而將液中的磁微粒吸引至支承基板表面。使與支承基板碰撞的磁微粒固著於支承基板表面的粘接層，再斷開磁場。
[0011]發明的效果
[0012]根據本發明，能夠將液中的大部分磁微粒吸引至支承基體表面，並能夠由粘接層保持。進而，通過將磁場設為斷開的狀態，能夠消除磁微粒彼此的凝聚，並能夠使支承基板的磁微粒層為一層。通過使磁微粒為一層，對支承基體上的螢光色素的對焦能夠容易進行，通過防止磁微粒的凝聚所引起的螢光色素的吞沒來提高定量性。由於通過使用了本發明的生物體分子分析能夠大幅度提高解析對象的生物體分子捕獲率，從而與以往技術相比，能夠進行高靈敏度的檢測。此外，不需要具有複雜構造的儀器，從而與以往技術相比，非常簡便，通過與自動控制單元組合可得到生產率的大幅度提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是用於說明本實施例的解析方法的一個例子的圖。
[0014]圖2是用於說明本實施例的解析方法所使用的儀器的結構的一個例子的圖。
[0015]圖3是用於說明本實施例的解析方法所使用的儀器的結構的一個例子的圖。
[0016]圖4是用於說明本實施例的抗原分子的捕捉方法和抗原分子的螢光標記的方法的一個例子的圖。
[0017]圖5是用於說明本實施例的核酸片段的捕捉方法和核酸片段的螢光標記的方法的一個例子的圖。
[0018]圖6是用於說明本實施例的生物體分子分析裝置的結構的一個例子的圖。
[0019]圖7是用於說明使用了本實施例的磁鐵的磁微粒固定方法的一個例子的圖。
[0020]圖8是使用本實施例的磁鐵而進行了固定的磁微粒的顯微鏡觀察圖像。

【具體實施方式】
[0021]本發明的一個實施例的核酸分析儀器中，解析對象的生物體分子被磁微粒捕捉，並具有用於以二維的方式呈現該微粒的平滑的支承基板，在支承基板的表面存在用於固定帶抗體的磁微粒的粘接層。作為支承基板，很好透過磁力的較薄的石英玻璃基板、矽基板等較好，根據粘接層的種類適當使用堆積有金屬薄膜的石英玻璃基板、矽基板。用於固定以蛋白質修飾了的磁微粒的粘接面是疏水性的粘接層、或者導入有生物素的粘接層，作為疏水性的粘接劑，使用烷基自組裝膜。另外，作為可逆地切換粘接層的粘接力的強弱的粘接劑，公開了使用光響應性的偶氮苯。對於用於固定於支承基板的官能團而言，若基板是石英或者氧化處理後的矽基板則官能團使用矽烷醇基，若基板是金屬堆積基板則官能團使用硫醇基，若基板是氧化鈦堆積基板則官能團使用磷酸基。在支承基板的正下方設置有用於將帶生物體分子的磁微粒引向粘接層的磁場產生裝置，並且磁場產生裝置具有切換磁場的接通/斷開或強弱的功能。磁場產生裝置能夠從電磁鐵、可動式永久磁鐵、可動式電磁鐵、在支承基板與磁鐵之間具備可動式磁場遮擋板的永久磁鐵、或者電磁鐵選擇。該儀器通過以在固定有拍攝裝置的狀態下能夠掃描並螢光觀察支承基板整個面的方式在可動工作檯上設置支承基板而進行使用。
[0022]對觀察順序進行說明。首先，在支承基板上配置含有捕捉有目的的生物體分子的磁微粒的反應液，接著，接通磁場產生裝置而產生磁場，將反應液內的全部磁微粒引向支承基體上，並將與粘接層接觸的磁微粒固定在支承基板上。對於在第一次中未與粘接層接觸的磁微粒而言，通過反覆操作磁場的接通/斷開、或強弱，來增加磁微粒與粘接層的碰撞機會。在將磁微粒固定於粘接層後，通過流動清洗液來衝洗浮遊的未反應的螢光標記抗體。對固定在支承基板上的磁微粒和與其結合的被螢光標記了的抗原照射激發光並進行拍攝。通過對觀察到的亮點數進行計數來求出目的的生物體分子濃度。
[0023]對於使用具有使粘接層的粘接力可逆變化的功能的儀器的觀察順序而言，在固定磁微粒時，對偶氮苯照射紫外光而使之預先成為順式，並在切斷磁場的狀態下放入一定量的反應液。之後產生磁場，而將反應液中的磁微粒引向支承基體上，與粘接層接觸的磁微粒固定在支承基板上。在將磁微粒固定於粘接層後，通過流動清洗液來衝洗浮遊的未反應的螢光標記抗體。對固定在支承基板上的磁微粒和與其結合的被螢光標記了的抗原照射激發光而進行拍攝，並通過對觀察到的亮點數進行計數來求出目的的生物體分子濃度。在觀察結束後，通過對支承基板施加可見光或熱，來使偶氮苯親水化而從支承基板剝離磁微粒。對於紫外光、可見光照射準備與檢測系統不同的光源和波長分離濾波器，而能夠對支承基板整個面進行照射。作為施加熱的方法，在流路流通加熱後的溫水。清洗結束後，再次照射紫外光而返回順式，放入新的試料而以相同的方式進行固定以及觀察。為了減少第二次之後的試料的帶入，反覆實施清洗。或者，通過在每次測定時改變用於標識的螢光色素的波長和檢測濾波器來除去汙染。
[0024]實施例中，公開解析對象的生物體分子是肽、蛋白質、核酸片段組。公開如下一種免疫學的分析方法，其特徵在於，準備解析對象的抗原，使結合有針對抗原的抗體的磁微粒及被螢光體標記了的抗體與上述解析對象的抗原結合，對被標記了的螢光體進行檢測。或者，公開一種核酸分析方法，其特徵在於，準備解析對象的核酸片段組，使具有已知的鹼基序列且進行了螢光體標記的核酸分子與上述解析對象的核酸片段組雜交，對雜交的核酸分子檢測被標記的螢光體進行。
[0025]另外，實施例中，就上述生物體分子分析方法而言，公開了一種核酸分析方法，其特徵在於，上述螢光體標記是包括按照每種解析對象的生物體分子的種類而配合比例不同的多種螢光體的微粒。另外，實施例中，就上述生物體分子分析方法而言，公開了一種生物體分子分析方法，其特徵在於，對於特定的分子種類以外的分子種類使用相同的螢光體標記，對每種上述分子計算螢光亮點數，並且計算每種特定的分子種類的亮點數相對於總亮點數的比，從而對上述每種特定的分子種類的存在量進行評價。另外，實施例中，就上述核酸分析方法而言，公開了一種生物體分子分析方法，其特徵在於，包括對解析對象的生物體分子群實施共有的螢光體標記、並使由螢光波長或螢光強度不同於上述螢光體的螢光體標記的生物體分子特異性結合反應的工序，通過計算前者與後者的螢光體的亮點數的比，來對上述解析對象的生物體分子的每種種類的存在量進行評價。
[0026]另外，實施例中，公開了一種生物體分子分析裝置，其特徵在於，具備:二維地展開並固定解析對象的生物體分子的儀器；搭載有儀器的生物體分子分析裝置；用於測定上述焚光體的焚光的機構。
[0027]以下，參照附圖對上述以及其它的本發明的新的特徵和效果進行說明。此處，為了完全理解本發明，對特定的實施方式進行詳細的說明，但本發明不限於此處記載的內容。
[0028]實施例1
[0029]使用圖1對本實施例的解析方法以及儀器的結構的一個例子進行說明。首先，預先用磁微粒捕捉欲檢測的生物體分子，接著用螢光標記貼標籤。這些反應全部在常溫下、在緩衝液中進行，磁微粒和生物體分子的反應、螢光標記和生物體分子的反應哪一個都可以在先進彳丁，也可以同時進彳丁。捕獲的磁微粒的製作法、焚光標記的方法在實施例3和實施例4中詳細記載。
[0030]本實施例中，以欲檢測的生物體分子是抗原101、利用帶抗體的磁微粒102來捕捉抗原101並且利用螢光標記抗體103來貼標籤的方法為例，並使用圖1對反應方法進行說明。首先，在反應容器110內放入帶抗體的磁微粒102，預先充分攪拌。向該溶液倒入放入有欲檢測的抗原101的溶液，之後充分混合而保溫幾分鐘。此時，通過使反應容器上下旋轉、或振動攪拌來加速反應。混合的比率以帶抗體的磁微粒102與抗原101相比過剩的方式混合。進一步，向該反應液放入螢光標記抗體103，之後保育幾分鐘。在這樣反應後的混合液中，存在大量的未反應的磁微粒102和螢光標記抗體103，並在其中少量存在磁微粒102、抗原101以及螢光標記抗體103的混合體。以下將該混合液稱為反應液八。通過在支承基板上二維地展開反應液八，而進行螢光檢測來測定抗原量。
[0031]接下來使用圖1對螢光檢測用的儀器的結構進行說明。該儀器具有用於二維呈現磁微粒102的平滑的支承基板104，在支承基板104的表面存在用於固定磁微粒102的粘接層105。作為支承基板104，良好地透過磁力的薄石英玻璃基板、矽基板等是好的，根據粘接層105的種類適當使用堆積有金屬薄膜的石英玻璃基板、矽基板。由蛋白質修飾的磁微粒102良好地吸附於疏水性的層，從而通過將烷基固定於支承基板104的表面來形成粘接層105。作為粘接劑，能夠使用帶官能團的烷基鏈。對於官能團而言，若支承基板104的材質是石英或者氧化處理後的矽基板則官能團使用矽烷醇基，若支承基板104的材質是金堆積基板則官能團使用硫醇基，若支承基板104的材質是氧化鈦堆積基板則官能團使用磷酸基。若進行反應，則官能團被固定於支承基板104，烷基鏈因烷基鏈稀疏水的相互作用而密集，從而在支承基板104表面形成自集成膜(^1)。通過該方法能夠在支承基板104上均勻地疏水化。在支承基板104的正下方設置有用於向粘接層105吸引磁微粒102的磁場產生裝置106。進一步，磁場產生裝置106帶切換磁場的接通/斷開或強弱的功能。該儀器以能夠掃描支承基板104整個面的方式在可動工作檯107上設置而進行使用。
[0032]以下，對儀器的作用和觀察順序進行說明。首先，在支承基板104上通過移液器108載置反應液八。通過作成包圍支承基板104上的四方的側壁，能夠嚴密地調整每單位支承基板面積的溶液量，與保持原樣地載置液滴的方法相比，能夠使液厚均勻。就是說，能夠使磁微粒102的固定均勻。在磁場產生裝置106接通的狀態下，由於從放入的位置開始吸引磁微粒102，所以不均勻地固定。因此，當放入反應液八時斷開，並在放入後接通磁場產生裝置106而產生磁場，而將反應液糹內的全部磁微粒102吸引至支承基體104上。與粘接層105接觸的磁微粒102在支承基板104上固定。本研宄中使用的帶抗體的磁微粒102是順磁性體，從而通過從外部給予磁場來進行磁性化。但是，若各個磁微粒102磁性化，則相互吸引且以串珠狀地連接的方式凝聚。因此若在從外部給予了磁場的狀態下進行觀察，則磁性微粒102相對於支承基板104朝向垂直方向具有立體的構造，從而在觀察時焦點難以對準，或者螢光標記抗體103被捲入凝聚體內部，由此激發光變得不均勻而損害本來的定量性。因此，斷開磁場，而消除磁微粒102彼此的凝聚，從而僅固定於粘接層105的磁微粒102在支承基板104上呈現，能夠形成一層磁微粒層。該情況下，未與粘接層105接觸的磁微粒不在支承基板104上呈現，但若通過反覆進行磁場的接通/斷開、或者強弱來增加碰撞機會，則將絕大多數的磁微粒102固定於粘接層105。在將磁微粒102固定於粘接層105後，通過流動清洗液能夠衝洗浮遊的未反應的全部螢光標記抗體103。其中，對於未反應的螢光標記抗體103而言，也可以預先在反應容器110內進行。對在支承基板104上固定一層的磁微粒102和與其結合的螢光標記後的抗原101照射激發光而進行拍攝。通過計算觀察到的亮點數能夠求解抗原濃度。
[0033]實施例2
[0034]接下來，使用圖2對與流路組合的螢光檢測用的儀器的結構進行說明。該儀器與實施例1同樣地具有用於二維呈現磁微粒201的平滑的支承基板203，在支承基板203的表面設置用於固定磁微粒201的粘接層204，並在支承基板203的正下方設置能夠切換用於向粘接層204吸引磁微粒201的磁場的接通丨斷開、或者強弱的磁場產生裝置205。進而，在支承基板203的四方設置側壁206，並在其上用平滑且透明的罩部件207進行覆蓋。例如，作為側壁206的材料，能夠使用？013 (聚二甲基矽氧烷)，罩部件207的材料能夠使用石英。在側壁的兩個位置安裝用於出入溶液的軟管208。作為軟管208的材料，能夠使用矽橡膠。在支承基板203的正下方設置用於向粘接層204吸引磁微粒201的磁場產生裝置205。該儀器以能夠掃描支承基板203整個面的方式在可動工作檯209上設置而進行使用。或者，在物鏡210側附加可動機構而進行掃描。
[0035]以下，對儀器的作用和觀察順序進行說明。首先，在磁場斷開的狀態下放入一定量的反應液八。之後產生磁場，而將反應液八中的磁微粒201吸引至支承基板203上。並將與粘接層204接觸的磁微粒201固定在支承基板203上。在將該磁微粒201固定於粘接層204後，通過流動清洗液211，能夠衝洗浮遊的未反應的全部螢光色素202。對在支承基板203上固定一層的磁微粒201和與其結合的螢光色素202照射激發光而進行拍攝。通過計算觀察到的亮點數能夠求出生物體分子濃度。
[0036]實施例3
[0037]接下來，使用圖3對具有使粘接層304的粘接力可逆變化的功能的儀器的結構進行說明。該儀器與實施例2同樣地具備用於二維呈現磁微粒302的平滑的支承基板303，在支承基板303的表面設置用於固定磁微粒302的粘接層304，並在支承基板303的正下方設置能夠切換用於向粘接層304吸引磁微粒302的磁場的接通丨斷開、或者強弱的磁場產生裝置305。進一步，在支承基板303的四方設置側壁306，並在其上用平滑的罩部件307進行覆蓋。在側壁306的兩個位置安裝用於出入溶液的軟管。在支承基板303的正下方設置用於向粘接層304吸引磁微粒302的磁場產生裝置305。進而，由使粘接層304的粘接力可逆變化的物質形成。例如，將利用溫度、熱而將表面的水潤溼性從疏水性變化為親水性或者從親水性變化為疏水性的物質用作粘接劑。通過使粘接層304的粘接力可逆地變化，在觀察後能夠從固定有磁微粒302的支承基板303剝離清洗磁微粒302，並且通過再次恢復吸附力能夠觀察新的試樣。就是說，能夠多次再利用支承基板303。作為實現再利用的粘接劑，能夠使用光響應性的烷基偶氮苯。偶氮苯具有在兩個偶氮基上附有兩個苯環的構造，若照射紫外光308則異構化為順式體，通過給予可見光310或熱而異構化為更加穩定的反式體。例如，準備在烷基鏈的一端結合有偶氮苯、在另一端結合有與基板側反應的官能團的帶官能團的烷基偶氮苯。若基板是石英或者氧化處理後的矽基板則官能團使用矽烷醇基，若基板是金堆積基板則官能團使用硫醇基，若基板是氧化鈦堆積基板則官能團使用磷酸基。若進行反應，則官能團固定於基板，烷基鏈因烷基鏈疏水的相互作用而密集，從而在基板表面形成自集成膜。通過該方法能夠在基板上均勻地導入偶氮苯。在固定磁微粒302時向偶氮苯照射5分鐘左右紫外光308而使之成為順式。
[0038]以下，對儀器的作用和觀察順序進行說明。首先，在磁場斷開的狀態下放入一定量的反應液八。之後產生磁場，而將反應液八中的磁微粒302吸引至支承基體上。與粘接層304接觸的磁微粒302固定在支承基板303上。在將該磁微粒302固定於粘接層304後，通過流動清洗液309，能夠衝洗浮遊的未反應的全部螢光標記抗體。對在支承基板303上固定一層的磁微粒302和與其結合的螢光標記後的抗原照射激發光而進行拍攝。通過計算觀察到的亮點數能夠求出抗原濃度。
[0039]通過對固定有觀察結束了的磁微粒302的支承基板303給予可見光310或熱，來使偶氮苯親水化而從支承基板303剝離磁微粒302。可見光310的照射準備與檢測系統不同的光源和波長分離濾波器，能夠對支承基板303整個面進行照射。為了給予熱，對流路流通加熱至351:以上的溫水。在任一個親水化的方法中，通過一邊流動含有表面活性劑的水溶液一邊進行，能夠得到更高的磁微粒302的除去效果。清洗結束後，再次照射5分鐘左右紫外光308使之成為順式，放入新的試樣而同樣地進行固定以及觀察。
[0040]在像這樣反覆進行固定和除去的情況下，在上一次固定的螢光色素301殘留，而在第二次之後的定量時有被合算的可能性。為了防止該情況，預先要求能夠完全除去磁微粒302或將磁微粒302除去至允許的量的清洗條件。在對極微量的試樣進行定量的情況下，存在幾個亮點的差別對定量結果產生較大影響的情況。此時，通過每次測定改變用於標記的螢光色素301的波長和檢測濾波器，能夠完全除去汙染。
[0041]實施例4
[0042]使用圖4對本實施例的試樣調整方法進行說明。在欲檢測的生物體分子是抗原401的情況下，預先用帶抗體402的磁微粒403進行捕捉，進一步用螢光標記抗體405貼標籤。這些反應全部在常溫下、反應用緩衝液(作匕緩衝液(邱8.0),5011)1 ^01,0.1%1^661120)中進行。帶抗體402的微粒和抗原401的反應、以及焚光標記抗體405和抗原401的反應哪一個都可以在先進行，也可以同時進行。抗原401能夠使用任何種類，抗體402選擇對抗原401特異性高的物質較好。例如，在作為抗原401而選擇前列腺癌症的腫瘤標記符亦即？前列腺特異抗原)的情況下，需要？「抗體。抗體分別需要與磁微粒側結合和螢光色素標記。抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，與抗原401的種類對照地選擇適當的抗體。
[0043]在抗體402與磁微粒403結合的情況下，準備能夠保持抗體402的活性不變地結合的蛋白質八、或者蛋白質6修飾的磁微粒403。這些磁微粒403是在市場上出售的，能夠容易得到。例如，能夠利用作為順磁性微粒的八(161111:6011公司的蛋白質4修飾八(16111-磁珠(30011111)。對蛋白質八修飾磁微粒403混合約10倍以上的八抗體並進行保育。接下來，由磁鐵捕捉磁微粒403後除去溶液並利用清潔的緩衝液使之懸浮。反覆進行該操作直至能夠除去未反應的抗體402。作為磁微粒403，能夠使用鏈黴親和素的修飾磁微粒403。例如，能夠利用八(161111:6(311公司的鏈黴親和素修飾4(16111-磁珠(10011111，200鹽，30011111)。在使用該磁微粒403的情況下，使用生物素化後的抗體402，使抗體402結合於磁微粒403表面。使用的磁微粒403的直徑優選選自比激發波長小的直徑，能夠防止磁微粒403的散射光所引起的背景的增加。
[0044]螢光標記抗體405在市場上出售各種種類。例如，公知有？1扣、八註冊商標)、(:?等。但是，本研宄中為了能夠檢測至少一分子的抗原401，優選利用亮度較高、且消光時間較長的螢光色素。作為這樣的螢光色素，例如能夠使用幾百分子的螢光色素與一個枝狀的碳鏈結合的樹枝型螢光色素、量子點404。
[0045]對本實施例中使用了量子點404的抗體的螢光標記方法進行說明。量子點404是直徑幾納米至幾十納米的半導體微粒。與以往的螢光色素相比，高壽命且高亮度，並且因粒徑不同而產生不同的波長的螢光。量子點404在市場上由多個製造商出售，並由各種官能團修飾。作為能夠結合任意的焚光標記抗體405的量子點404，例如能夠利用1鮮11:1~08611公司的㈨註冊商標)抗體標記試劑盒。該試劑盒中通過使在表面導入有硫醇基的量子點404、和還原了二硫鍵的焚光標記抗體405混合反應，能夠在焚光標記抗體405標記量子點 404。
[0046]使用如上製作出的帶抗體402的磁微粒403和螢光標記抗體405來進行抗原401的捕捉和檢測。首先，在反應容器內放入帶抗體402的磁微粒403，預先充分攪拌。向該溶液倒入放入有欲檢測的抗原401的溶液，之後充分混合而保育1個小時。此時，通過使反應容器上下旋轉、或振動攪拌來加速抗原401和抗體402的反應。混合的比率以帶抗體402的磁微粒403與抗原401相比變得過剩的方式混合。具體而言，相對於假定的抗原量而放入100至10000倍量的帶抗體402的磁微粒403。接下來，向該反應液放入螢光標記抗體，進一步保育幾分鐘。螢光標記抗體405也相同地以相對於抗原量變得過剩的方式投入100至10000倍量。通過分別過量放入，來提高與抗原401的碰撞頻度，並提高抗原401的捕捉率和螢光標記率。與實施例3的反應液相同地對像這樣反應後的混合液進行觀察，並對抗原401進行定量。
[0047]實施例5
[0048]使用圖5對本研宄的試樣調整方法進行說明。在欲檢測的生物體分子是核酸片段的情況下，由磁微粒507捕捉檢測對象的試樣核酸片段501，進而利用具有互補序列的帶螢光色素506的核酸片段505對試樣核酸片段501貼標籤。這些反應是雜交所引起的特異性反應，在反應用緩衝液(^88緩衝液(邱7.4)，50禮?II就1,0.1% 1^66=20)中進行。帶核酸的磁微粒507和試樣核酸片段501的反應、以及帶螢光色素506的核酸片段505和試樣核酸片段501的反應哪一個都可以在先進行，也可以同時進行。核酸片段505能夠使用單鏈的0嫩、觀八。作為具體的解析對象以微觀八為例，說明詳細內容。
[0049]微I？嫩是20郵1~左右的單鏈的核酸片段。最簡單的檢測方法是對試樣核酸片段501直接進行螢光標記的方法。該情況下，在試樣核酸片段501的3』末端側結合生物素化如丁？，而製作生物素化後的試樣核酸片段501。使抗生物素蛋白標記的量子點與該試樣核酸片段501反應。同樣，預先製作帶有試樣核酸片段501的互補鏈的磁微粒507，並使之和與量子點反應後的試樣核酸片段501反應。根據螢光色素504測定被磁微粒507捕獲的試樣核酸片段501的量。
[0050]當欲測定全部的微總量中特定的微量時，預先在作為試樣核酸片段501的微的末端通過連接附加含有共有序列503和捕捉序列508的核酸片段。共有序列503是指與種類無關用於對全部微進行螢光標記的序列，捕捉序列是指用於被磁微粒507捕捉的序列。共有序列以及捕捉序列與欲測定的試樣的1?值對應而能夠任意合成含量和鹼基長度。以下，將含有共有序列和捕捉序列的核酸片段稱作標籤片段502。首先，準備在共有序列的互補鏈標記有螢光色素504的片段和在試樣核酸片段501的互補鏈標記有螢光色素506的片段。將這些與附加有標籤分子502的試樣核酸片段501混合併使之雜交。此時，在存在多種試樣核酸片段501的情況下，對每個種類準備試樣核酸片段501的互補鏈，並預先進行分別不同波長的螢光標記。利用帶捕捉序列的磁微粒507捕捉像這樣螢光標記後的試樣核酸片段501。該反應也通過雜交來進行。將補足有螢光標記後的試樣核酸片段501的磁微粒507固定於支承基板上的粘接層，而與實施例1、2相同地進行亮點觀察。此時，共有序列數側的螢光亮點相當於微的全數，試樣側的螢光亮點數相當於試樣核酸片段501的分子數。將兩者的亮點數的比判斷為各種核酸試樣分子的存在比率在欲調查僅特定的核酸分子的表達量時也有效。
[0051]磁微粒507是市場上出售的，能夠容易得到。例如，能夠使用作為順磁性微粒的^(161111:6011公司的鏈黴親和素的修飾磁微粒。例如，能夠利用八(161111:6011公司的鏈黴親和素修飾八(16111-磁珠(巾10011111，20011111，30011111)。在使用該磁微粒的情況下，使用生物素化後的核酸片段，而使核酸與磁微粒507表面的抗生物素蛋白509結合。使用的磁微粒507的直徑優選選自比激發波長小，能夠防止磁微粒507的散射光所引起的背景的增加。螢光色素在市場上出售各種種類。例如，公知有？1扣、八16^(註冊商標)415等。但是，本研宄中為了能夠檢測至少一分子的試樣核酸片段501，優選利用亮度較高、且消光時間較長的螢光色素。作為這樣的螢光色素，例如，能夠使用幾百分子的螢光色素與一個枝狀的碳鏈結合的樹枝型螢光色素、量子點。對本實施例中使用了量子點的核酸片段的螢光標記方法進行說明。例如，能夠利用公司的鏈黴親和素修飾如01:(註冊商標)。量子點和核酸片段的結合在混合後保育30分鐘以上即可，在反應後利用臨界值(⑶如打)501^1)8的核酸純化柱除去未反應的核酸片段。
[0052]使用如上製作的帶捕捉序列的磁微粒507和螢光色素標記核酸片段來捕捉試樣核酸片段501。首先，在反應容器內放入帶捕捉序列的磁微粒507，預先充分攪拌。向該溶液倒入放入有欲檢測的試樣核酸片段501的溶液，之後充分混合而保育6個小時。此時，通過使反應容器上下旋轉、或振動攪拌來加速雜交反應。混合的比率以磁微粒507與目的的核酸片段相比變得過剩的方式混合。具體而言，相對於假定的試樣分子數而放入100至10000倍量的磁微粒507。與實施例1、2相同地觀察如上處理後的反應液。
[0053]實施例6
[0054]本實施例中，參照圖6對生物體分子分析裝置的優選的結構的一個例子進行說明。本實施例的生物體分子分析裝置具備:向用於二維地展開生物體分子的支承基板601供給解析對象的生物體分子溶液、清洗液的機構；用於將磁微粒吸引至支承基板上的機構；用於將磁微粒保持在支承基板上的機構；用於對支承基板中清洗液進行加熱的溫度調節的機構；向支承基板照射光的機構；對帶螢光標記的分子的螢光體的螢光進行測定的發光檢測機構；以及掃描支承基板601的機構。
[0055]更具體而言，將支承基板601放置在可動工作檯604上，使設有流路的流路部件在其上貼合，從而形成反應腔605。就流路部件而言，例如能夠使用聚二甲基矽氧烷)。輸液泵607與注入口 606連接，從解析對象的生物體試樣溶液槽602、清洗液槽603依次向支承基板601供給生物體試樣溶液和清洗液，使用後廢棄於廢液槽612。若生物體試樣溶液進入反應室內，則磁場產生裝置608產生磁場，向支承基板601表面吸引磁微粒。被吸引的磁微粒與支承基板表面的粘接層接觸，並固定。從輸液泵607向反應腔605內放入清洗液並進行清洗。清洗後，進行螢光檢測。激發光源609能夠根據使用的螢光體的種類而適當選擇。例如，在作為螢光標記用的螢光色素而使用量子點的情況下，光源能夠用雷射)、或者水銀燈來對應。從激發光源609產生的激發濾波器616和激發光通過透鏡617，由分色鏡610導向物鏡611，並向支承基板601上照射。從支承基體601上的帶螢光標記的分子發出的螢光相反地進入與激發光同軸的光路，由物鏡611聚集後通過分色鏡610，並通過成像透鏡比613而成像在二維照相機614的感光面上。激發光的散射光由吸收濾波器615除去。為了提高定量性，需要增加觀察的亮點數。通過使可動工作檯604動作，掃描支承基板601整個面，能夠增加亮點數。如上述那樣，通過利用輸液泵607、注入口 606、激發光源609以及螢光檢測單元、磁場產生裝置608、可動工作檯604組裝生物體分子分析裝置，能夠進行自動分析從而實現高速化。
[0056]實施例7
[0057]本實施例中，關於用於磁微粒701的固定的磁鐵與支承基板的配置，參照圖7，對優選在與實施例1?5的組合中使用的一個結構進行說明。本發明中使用的裝置由於對平滑的支承基板702的表面進行掃描，從而單位面積固定的磁微粒701越多在生產率的方面越有利。另一方面，若單位面積的磁微粒701過多，則變得多層化，不在物鏡的焦點深度內的磁微粒701增加，檢測數降低。因此，為了實現高效的檢測，優選磁微粒701高密度地固定，且形成薄的層。因此，發明了使用具有與支承基板702平行的磁力線704的強力的磁鐵703來對磁微粒701進行固定的固定方法。
[0058]配置方法如下述。如圖7所示，首先，在支承基板702上載置磁微粒701，接下來在磁場產生裝置703上配置支承基板702。預先調查磁鐵703的磁力線的朝向和強度，並以支承基板702表面的中央部分的磁力線704的方向平行的方式配置有支承基板702。進一步，通過進行幾秒鐘固定反應，能夠如圖8所示線狀地固定磁微粒701。專心研宄以上的配置位置的結果，可知通過將支承基板702配置於磁鐵703的表面並且儘量配置於兩極間的中央部分，通過使用比支承基板702大的磁鐵703，進一步通過使用磁通密度較高的磁鐵703，能夠更加均勾且迅速地進行固定。
[0059]固定原理如下述。如圖7所示，通常的磁鐵在兩極間形成描繪弧那樣的磁力線704。此時，在磁鐵703表面的中央部分，在兩極間形成平行地連接的帶狀的磁力線704。由於本實施例中使用的磁微粒701具有順磁性，所以通過從外部給予磁場來分別磁化，隨著平行的磁力線704而磁微粒701彼此形成串珠狀的直鏈(圖8)。此時，在磁鐵703的中心產生的平行的磁力與在兩極產生的磁力相比，非常弱。因此，配置的磁微粒701優選以不被向兩極拉拽的方式與極充分空開距離。就是說，優選在兩極的中央部分配置，通過充分空開距離能夠減少固定的偏斜。此處所述的充分是指，例如，能夠通過將4皿見方的支承基板702的中心離各極的距離設為40臟來實現。另外，在磁鐵703的中心部產生的平行磁場為了在支承基板702上固定磁微粒701，而需要與磁鐵703垂直的磁力成分。因此，通過選擇具有比較強力的磁力的磁鐵703能夠提高固定速度。這在高密度固定磁微粒701的方面也有利，具體而言優選0.1I以上的表面磁通量密度。本實施例中使用了且0.51的釹磁鐵和4皿見方的支承基板702。若在磁鐵703的極附近吸引磁微粒，則磁微粒的鏈沿與支承基板垂直的方向延伸。實際上，向相同體積內(4^4^0.13111111)導入等量(20131)的磁微粒701 ( 300^)，並分別給予與支承基板702平行的磁通量和與支承基板702垂直的磁通量，該情況下，對於在支承基板702表面的相同焦點深度內的磁微粒密度而言，平行的磁通量一方約高8倍。由此能夠確認到平行的磁通量對磁微粒的高密度固定有效。
[0060]符號的說明
[0061]101、401—抗原，102、201、302、403、507—磁微粒，103、405—螢光標記抗體，104、203、303、406、601—支承基板，105、204、304、407、511—粘接層，106、205、305、608—磁場產生裝置，107、209、604—可動工作檯，108—移液器，109、210、611—物鏡，110—反應容器，202、301、504、506—螢光色素，206、306—側壁，207、307—罩部件，208—軟管，211、309—清洗液，308—紫外光，310—可見光，311—捕捉分子，402—抗體，404—量子點，501—試樣核酸片段，502—標籤分子，503—共有序列，505—核酸片段，508—捕捉序列，509—抗生物素蛋白，510—支承基體，602—生物體試樣溶液槽，603—清洗液槽，605—反應腔，606—注入口，607—輸液泵，609—激發光源，610—分色鏡，612—廢液槽，613—成像透鏡，614—二維
照相機，615—吸收濾波器，616—激發濾波器，617—透鏡，701—磁微粒，702—支承基板，703一磁鐵，704一磁力線(磁通量)。
【權利要求】
1.一種分析裝置，其為使用螢光色素對生物體關聯分子進行定量的分析裝置， 具備:支承基體；設為用於在該支承基體上對捕捉有生物體關聯分子的磁微粒進行粘接的粘接層；激發螢光色素的激發機構；檢測螢光的檢測機構；以及能夠對所述支承基體切換磁力的接通/斷開、或磁力的強弱的磁場產生機構。
2.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 設有使支承基體移動的可動工作檯。
3.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 在支承基體上具備流路，該流路具備連接有輸液泵的取水口和排水口。
4.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 作為所述螢光色素而使用量子點。
5.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 作為所述粘接層的材料，使用從烷基鏈狀分子、生物素分子中任一個選擇的物質。
6.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 作為所述粘接層的材料，使用響應熱、光而在疏水性與親水性間可逆變化的物質。
7.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 作為所述磁場產生裝置，使用電磁鐵、可動式永久磁鐵、組合有可動式磁場遮擋物的電磁鐵、以及組合有可動式磁場遮擋物的永久磁鐵中任一個。
8.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 作為所述檢測機構，使用反射型光學顯微鏡。
9.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 使用同時識別兩種以上的螢光色素的反射型光學顯微鏡。
10.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 所述生物體關聯分子是抗原分子，所述磁微粒的捕捉通過抗原抗體反應來實施。
11.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 所述生物體關聯分子是核酸分子，所述磁微粒的捕捉通過雜交來實施。
12.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 所述螢光色素包括根據解析對象的生物體分子的每個種類而配合比例不同的多種螢光體。
13.根據權利要求1所述的分析裝置，其特徵在於， 對特定的生物體關聯分子以外的生物體關聯分子使用相同的螢光色素，對每種所述生物體關聯分子計算螢光亮點數後，算出每種特定的生物體關聯分子的亮點數相對於總亮點數的比，從而對每種所述特定的生物體關聯分子的存在量進行評價。
14.一種分析方法，其為使用螢光色素對生物體關聯分子進行定量的分析方法， 在設有粘接層的支承基體上配置磁微粒，所述粘接層用於對捕捉有生物體關聯分子的磁微粒進行粘接， 通過磁力，使磁微粒與支承基體碰撞， 斷開磁力或者使磁力變弱， 激發螢光色素而檢測螢光。
15.根據所述權利要求1?13中任一項所述的生物體分子分析裝置，其特徵在於， 在將所述磁微粒固定於所述支承基板時所使用的磁場產生機構配置為，給予與支承基板表面平行的磁通量。
16.根據所述權利要求1?13中任一項所述的生物體分子分析裝置，其特徵在於， 所述磁場產生裝置給予支承基板的表面磁通量密度為0.1T以上。
【文檔編號】G01N21/64GK104471380SQ201380035891
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年6月12日 優先權日:2012年7月6日
【發明者】濱崎孝伸, 齋藤俊郎 申請人:株式會社日立高新技術