複合酶及其在製備多不飽和脂肪酸中的用途
2023-06-25 21:56:51 2
複合酶及其在製備多不飽和脂肪酸中的用途
【專利摘要】本發明涉及複合酶及其在製備多不飽和脂肪酸中的用途。本發明公開了編碼複合酶(即，具有至少兩種獨立的和可分的酶活性的單一多肽)的分離核酸片段和包含此類片段的重組構建體以及使用這些複合酶在植物和含油酵母中製備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法。
【專利說明】複合酶及其在製備多不飽和脂肪酸中的用途
[0001] 本申請是申請日為2008年4月3日的中國專利申請200880018608. X "複合酶及 其在製備多不飽和脂肪酸中的用途"的分案申請。
[0002] 相關申請
[0003] 本專利申請要求於2007年4月3日提交的第60/909790號美國臨時申請和2008 年2月12日提交的第61/027898號美國臨時申請的優先權，該臨時申請的公開內容全文以 引用方式併入本文。
【技術領域】
[0004] 本發明屬於生物【技術領域】。更具體地講，本發明涉及編碼複合酶的多核苷酸序列 及其在合成長鏈多不飽和脂肪酸（PUFA)中的用途。
【背景技術】
[0005] PUFA的重要性無可爭議。例如，某些PUFA是健康細胞的重要生物成分並被公 認為是："必需"脂肪酸，其不能由哺乳動物從頭合成，而是必須從飲食中獲得或者通過 進一步延長和去飽和亞油酸αΑ;18:2ω-6)或α-亞麻酸（ALA ;18:3c〇-3)來獲得；在 質膜中它們可以例如磷脂或三醯基甘油之類的形式存在；正常發育（尤其是在發育中的 嬰兒腦中）和組織形成及修復的必需物質；以及哺乳動物中幾種重要的具有生物活性的 類二十烷酸（如前列環素、類花生酸、白三烯和前列腺素）的前體。而且，攝入大量長鏈 ω-3 PUFA 產生心血管保護效果（Dyerberg 等人，Amer.J. Clin. Nutr. 28 :958-966 (1975); Dyerberg 等人，Lancet. 2(8081) :117-119(1978) ;Shimokawa，Η·，World Rev. Nutr. Diet 88:100-108(2001) ;von Schacky 等人，World Rev. Nutr. Diet 88:90-99(2001))。大量的 其他研究證明，針對多種症狀和疾病（如哮喘、牛皮癬、溼疹、糖尿病、癌）施用ω-3和/或 ω-6 PUFA賦予了廣泛的健康益處。
[0006] 目前正在研究包括植物、藻類、真菌和酵母在內的多種不同宿主作為經由多種不 同途徑商業化生產PUFA的手段。雖然宿主生物的天然PUFA生產能力有時對給定方法來說 是必要的，但基因工程也已證明能夠完全改變一些宿主的天然能力（甚至那些不能天然產 生LA和ALA脂肪酸的宿主）以產生高水平的不同長鏈ω -3/ ω -6 PUFA。不管該效應是天 然能力的結果還是重組技術的結果，花生四烯酸（ARA ;20 :4ω-6)、二十碳五烯酸（EPA ;20 : 5 ω-3)和二十二碳六烯酸（DHA ;22 :6 ω-3)均需要Λ 9延伸酶/ Λ 8去飽和酶途徑（該途徑 存在於一些生物中，如類眼蟲物種，並且其特徵在於產生二十碳二烯酸（EDA ;20 :2ω-6)和 /或二十碳三烯酸（ETrA ;20 :3 ω -3))或Λ 6去飽和酶/ Λ 6延伸酶途徑（該途徑主要存在 於藻類、苔蘚、真菌、線蟲動物和人類中，並且其特徵在於產生亞麻酸（GLA;18:3c〇-6) 和/或硬脂艾杜糖酸（STA ;18:4c〇-3))的表達（圖1)。還已知，Λ6延伸酶是C18/2Q延伸 酶。
[0007] 迄今已鑑定的Λ 8去飽和酶能夠將EDA轉化成二高亞麻酸（DGLA(也稱為 HGLA) ;20 :3, n-6)並將ETrA轉化成二十碳四烯酸（ETA ;20 :4, n-3)。ARA和EPA隨後分 別通過Λ 5去飽和酶進行的反應由DGLA和ETA合成。然而DHA合成需要隨後表達附加的 C20/22延伸酶和Λ 4去飽和酶。迄今已鑑定的大多數C2〇/22延伸酶主要能將ΞΡΑ轉化成DPA， 其次能將花生四烯酸（ARA ;20 :4ω-6)轉化成二十二碳四烯酸（DTA ;22 :4ω-6)，然而迄今 已鑑定的大多數Λ 4去飽和酶主要能將DPA轉化成DHA，其次能將成二十二碳四烯酸（DTA ; 22 :4 ω-6)轉化成 ω-6 二十二碳五烯酸（DPAn-6 ;22 :5 ω-6)。
[0008] 基於(：2(|/22延伸酶和Λ4去飽和酶在DHA合成中的作用，已經投入相當大的努力 鑑定和研究這些來自不同來源的酶。同樣，已將多個C 2(l/22延伸酶公開於公開文獻和專利 文獻（例如巴夫藻CCMP459 (GenBank登錄號AAV33630)、綠藻（GenBank登錄號AAV67798) 和假微型海鏈藻（GenBank登錄號AAV67800))中。同樣，已經公開了以下Δ4去飽和酶： 小眼蟲（SEQ ID NO :13;GenBank 登錄號 AAQ19605;Meyer 等人，Biochemistry，42(32): 9779-9788(2003));假微型海鏈藻（SEQ ID NO :29 ;GenBank 登錄號 AAX14506 ;Tonon 等 人，FEBS J. ,272(13) :3401-3412(2005));金黃色破囊壺菌（SEQ ID NO :27 ;GenBank 登 錄號AAN75707);海洋破囊壺菌（GenBank登錄號CAD42496;美國專利公開7, 087, 432); 聚合裂殖壺菌（SEQ ID NO :28 ;PCT公開W0 2002/090493);魯茲巴夫藻（GenBank登錄 號 AAQ98793);和綠光等鞭金藻（SEQ ID N0:30;GenBank 登錄號 AAV33631 ;Pereira 等人， Biochem.J·，384 (2) :357-366(2004) ;PCT 公開 TO 2002/090493)]。
[0009] 申請人:的受讓人有多個關於含油酵母（S卩，解脂耶氏酵母）中PUFA生產的專利申 請，包括例如：美國專利公開7, 238, 482和7, 125, 672 ;美國專利申請11/265, 761 (提交於 2005年11月2日）；美國專利申請11/264, 784(提交於2005年11月1日）；美國專利申 請11/264,737(提交於2005年11月1日）。
[0010] 與此相關，PCT公開W0 2004/071467(公布於2004年8月26日）關於植物中的 PUFA生產，而PCT公開W0 2004/071178(公布於2004年8月26日）關於膜聯蛋白啟動子 以及它們在植物轉基因表達中的用途。它們都是 申請人:的受讓人的共同未決的專利申請。
【發明內容】
[0011] 本發明涉及包括具有至少兩種獨立的和可分的酶活性的單一多肽的複合酶 (multizyme) 〇
[0012] 在第二實施方案中複合酶的酶活性可選自脂肪酸延伸酶、脂肪酸去飽和酶、醯基 轉移酶、醯基CoA合酶和硫酯酶。更具體地講，酶活性可包括連接到至少一種脂肪酸去飽和 酶的至少一種脂肪酸延伸酶。
[0013] 在第三實施方案中複合酶可包括連接到第二酶活性的第一酶活性，並且所述連接 選自多肽鍵 SEQ ID N0 :198 (EgDHAsynl 接頭）、SEQ ID NO :200 (EgDHAsyn2 接頭）、SEQ ID N0:235(EaDHAsynl接頭）、SEQ ID N0:438、SEQ ID N0:445、SEQ ID N0:472、和SEQ ID NO: 504。
[0014] 在第四實施方案中，本發明涉及編碼DHA合酶的分離多核苷酸，所述多核苷酸包 括：
[0015] (a)編碼具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於Clustal V比對方法在 與如 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:95、SEQ ID N0:96、或 SEQ ID N0:97 所示 出的胺基酸序列進行比較時，所述多肽具有至少80%的胺基酸同一性；
[0016] (b)編碼具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於BLASTN比對方法在 與如 SEQ ID N0 :11、SEQ ID N0 :205、SEQ ID N0 :21、SEQ ID N0 :91、SEQ ID N0 :92、SEQ ID NO :93、或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列進行比較時，所述核苷酸序列具有至少 80 %的序列同一性；
[0017] (C)編碼具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴格條 件下與如 SEQ ID N0 :11、SEQ ID N0 :205、SEQ ID N0 :21、SEQ ID N0 :91、SEQ ID N0 :92、 SEQ ID NO :93、或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列雜交；或
[0018] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由 相同數目的核苷酸組成並且1〇〇 %互補。
[0019] 在第五實施方案中，本發明涉及編碼具有DHA合酶活性的多肽的多核苷酸，其中 所述核苷酸序列包括 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、SEQ ID NO :93、或 SEQ ID NO :410。
[0020] 在第六實施方案中，本發明涉及具有DHA合酶活性的多肽，其中所述多肽的氨基 酸序列包括 SEQ ID N0 :12、SEQ ID N0 :22、SEQ ID N0 :95、SEQ ID N0 :96、或 SEQ ID N0 : 97〇
[0021] 在第七實施方案中，本發明涉及編碼C20延伸酶的分離多核苷酸，所述多核苷酸 包括：
[0022] (a)編碼具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於Clustal V比對方法 在與如 SEQ ID N0 :12、SEQ ID N0 :22、SEQ ID N0 :95、SEQ ID N0 :96、SEQ ID N0 :97、SEQ ID N0:202(EgDHAsynl C20 延伸酶結構域）、SEQ ID N0:204(EgDHAsyn2 C20 延伸酶結構 域）、SEQ ID NO :231 (EaDHAsynl C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :232 (EaDHAsyn2 C20 延 伸酶結構域）或SEQ ID N0:233(EaDHAsyn3 C20延伸酶結構域）所示出的胺基酸序列進行 比較時，所述多肽具有至少80%的胺基酸同一性；
[0023] (b)編碼具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於BLASTN比對方法 在與如 SEQ ID N0 :11、SEQ ID N0 :21、SEQ ID N0 :91、SEQ ID N0 :92、SEQ ID N0 :93、SEQ ID N0:183、SEQ ID N0:188、SEQ ID N0:201(EgDHAsynl C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO: 206(EgDHAsynl*C20 延伸酶結構域）、SEQ ID N0:203(EgDHAsyn2 C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :227 (EaDHAsynl C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :228 (EaDHAsyn2 C20 延伸酶結構 域）、SEQ ID N0:229(EaDHAsyn3 C20 延伸酶結構域）或 SEQ ID N0:230(EaDHAsyn4 C20 延伸酶結構域）所示出的核苷酸序列進行比較時，所述核苷酸序列具有至少80%的序列同 一I"生；
[0024] (c)編碼具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴格 條件下與如 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:93、 SEQ ID N0:183、SEQ ID N0:188、SEQ ID N0:201(EgDHAsynl C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :206 (EgDHAsynl*C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :203 (EgDHAsyn2 C20 延伸酶結構域）、 SEQ ID NO :227 (EaDHAsynl C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :228(EaDHAsyn2 C20 延伸酶結 構域）、SEQ ID N0:229(EaDHAsyn3 C20 延伸酶結構域）或 SEQ ID N0:230(EaDHAsyn4 C20 延伸酶結構域）所示出的核苷酸序列雜交；或
[0025] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由 相同數目的核苷酸組成並且100 %互補。
[0026] 在第八實施方案中，本發明涉及編碼Λ4去飽和酶的分離多核苷酸，所述多核苷 酸包括：
[0027] (a)編碼具有Λ4去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於Clustal V比對方 法在與如SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:95、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:97、SEQ ID N0:193、SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:221、SEQ ID N0:239、SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO：24U SEQ ID NO：246, SEQ ID NO：247, SEQ ID NO：248, SEQ ID NO ：249, SEQ ID NO ：382,SEQ ID NO ：384,SEQ ID NO ：386,SEQ ID NO ：388,SEQ ID NO ：404,SEQ ID NO :406、或SEQ ID NO :408所示出的胺基酸序列進行比較時，所述多肽具有至少80%的氨 基酸同一I"生；
[0028] (b)編碼具有Λ 4去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基於BLASTN比對方法 在與如 SEQ ID Ν0 :11、SEQ ID Ν0 :21、SEQ ID Ν0 :91、SEQ ID Ν0 :92、SEQ ID Ν0 :93、SEQ ID NO ：192,SEQ ID NO ：214,SEQ ID NO ：216,SEQ ID NO ： 220,SEQ ID NO ： 236,SEQ ID NO： 237,SEQ ID NO ：238,SEQ ID NO ：242,SEQ ID NO ：243,SEQ ID NO ：244,SEQ ID NO ：245,SEQ ID N0：38USEQ ID NO ： 383, SEQ ID NO ： 385, SEQ ID NO ： 387, SEQ ID NO ： 403, SEQ ID NO： 405、或SEQ ID NO :407所示出的核苷酸序列進行比較時，所述核苷酸序列具有至少80%的 序列同一性；
[0029] (c)編碼具有Λ 4去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴 格條件下與如 SEQ ID Ν0 :11、SEQ ID Ν0 :21、SEQ ID Ν0 :91、SEQ ID Ν0 :92、SEQ ID Ν0 : 93,SEQ ID NO ：214,SEQ ID NO ：216,SEQ ID NO ：220,SEQ ID NO ：236,SEQ ID NO ：237,SEQ ID NO ：238,SEQ ID NO ： 242,SEQ ID NO ： 243,SEQ ID NO ： 244,SEQ ID NO ： 245,SEQ ID NO： 381、SEQ ID N0:383、SEQ ID N0:385、SEQ ID N0:387、SEQ ID N0:403、SEQ ID N0:405、或 SEQ ID NO :407所示出的核苷酸序列雜交；或
[0030] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由 相同數目的核苷酸組成並且1〇〇 %互補。
[0031] 在第九實施方案中，本發明涉及編碼DHA合酶的分離多核苷酸，所述多核苷酸包 括如SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、SEQ ID NO :93、或SEQ ID NO :410中任一種所示出的序列。
[0032] 在第十實施方案中，本發明涉及編碼C20延伸酶的分離多核苷酸，所述分離多核 苷酸編碼C20延伸酶，所述多核苷酸包括如SEQ ID N0 :183、SEQ ID N0 :188、SEQ ID N0 : 201(EgDHAsynl C20延伸酶結構域、SEQ ID N0:206(EgDHAsynl*C20延伸酶結構域）、SEQ ID NO :203 (EgDHAsyn2 C20 延伸酶結構域）、SEQ ID NO :227 (EaDHAsynl C20 延伸酶結構域）、 SEQ ID N0:228(EaDHAsyn2 C20 延伸酶結構域）、SEQ ID N0:229(EaDHAsyn3 C20 延伸酶結 構域）或SEQ ID N0:230(EaDHAsyn4 C20延伸酶結構域）中任一種所示出的序列。
[0033] 在第十一實施方案中，本發明涉及編碼Λ4去飽和酶的分離多核苷酸，所述多核 苷酸包括如 SEQ ID N0:192、SEQ ID N0:214、SEQ ID N0:220、SEQ ID N0:236、SEQ ID N0: 237、SEQ ID NO :238、SEQ ID NO :242、SEQ ID NO :243、SEQ ID NO :244、SEQ ID NO :245、 SEQ ID N0：38USEQ ID NO ：383,SEQ ID NO ：385,SEQ ID NO ：387,SEQ ID NO ：403,SEQ ID NO :405、或SEQ ID NO :407所示出的序列。
[0034] 在第十二實施方案中，本發明涉及包括本發明任何可操縱地連接到至少一個調控 序列上的分離多核苷酸的重組構建體。
[0035] 在第十三實施方案中，本發明涉及在其基因組中包括本發明重組構建體的宿主 細胞。更具體地講，宿主細胞是包括本發明複合酶的重組微生物宿主細胞，其中第一酶活性 是Λ9延伸酶，第二酶活性是Λ8去飽和酶。在另一方面，第一酶活性是C20延伸酶，第二 酶活性是Λ 4去飽和酶。
[0036] 在第十四實施方案中，本發明涉及包括本發明重組構建體的轉化過的耶氏酵母菌 種。
[0037] 在第十五實施方案中，本發明涉及用於轉化細胞的方法，所述方法包括用本發明 重組構建體轉化細胞以及選擇那些用所述重組構建體轉化過的細胞。
[0038] 在第十六實施方案中，本發明涉及用於生產轉化植物的方法，所述方法包括用本 發明的任何多核苷酸轉化植物細胞以及從轉化過的植物細胞再生植物。
[0039] 在第十七實施方案中，本發明涉及用於生產酵母的方法，包括用本發明的任何多 核苷酸轉化酵母細胞以及從轉化過的酵母細胞生長酵母。
[0040] 在第十八實施方案中，本發明涉及在其基因組中包括本發明重組構建體的植物。 還關注獲自此類植物的種子，獲自此類種子的油，摻入此類油的食物或飼料，以及摻入本發 明的油的飲料。
[0041] 在第十九實施方案中，本發明涉及編碼如SEQ ID Ν0:183所示出的C20延伸酶的 分離核酸分子，其中至少147個密碼子是經密碼子優化的以用於在耶氏酵母菌種中表達。
[0042] 在第二十實施方案中，本發明涉及編碼如SEQ ID N0:188所示出的C20延伸酶的 分離核酸分子，其中至少134個密碼子是經密碼子優化的以用於在耶氏酵母菌種中表達。
[0043] 在第二i^一實施方案中，本發明涉及編碼如SEQ ID N0 :192所示出的Λ 4去飽和 酶的分離核酸分子，其中至少285個密碼子是經密碼子優化的以用於在耶氏酵母菌種中表 達。
[0044] 在第二十二實施方案中，本發明涉及用於製備複合酶的方法，所述方法包括：
[0045] (a)使第一多肽與至少第二多肽連接，其中每個多肽具有獨立的和可分的酶活性； 並且
[0046] (b)評估步驟（a)產物的獨立的和可分的酶活性。
[0047] 在第二十三實施方案中，本發明涉及用於改變油料種子植物的脂肪酸分布型的 方法，所述方法包括：
[0048] a)用本發明重組構建體來轉化油料種子植物細胞；
[0049] b)從步驟（a)的轉化油料種子植物細胞來再生植物，其中所述植物具有改變了的 脂肪酸分布型。
[0050] 在第二十四實施方案中，本發明涉及編碼DGLA合酶的分離多核苷酸，所述多核苷 酸包括：
[0051] (a)編碼具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽在SEQ ID N0 : 441、SEQ ID NO :454、SEQ ID NO :461、SEQ ID NO :464、SEQ ID NO :471、SEQ ID NO :515、 SEQ ID NO :516、SEQ ID NO :517、SEQ ID NO :518、或 SEQ ID NO :519 中示出；
[0052] (b)編碼具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在SEQ ID N0:440、SEQ ID N0:446、SEQ ID N0:453、SEQ ID N0:460、SEQ ID N0:463、SEQ ID N0:470、 5Ε0ΙΟΝΟ:492、5Ε0ΙΟΝΟ:493、5Ε0ΙΟΝΟ:494、5Ε0ΙΟΝΟ :495、*5Ε0ΙΟΝΟ:496 φ* 出；
[0053] (c)編碼具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴格條 件下與如 SEQ ID N0 :440、SEQ ID N0 :446、SEQ ID N0 :453、SEQ ID N0 :460、SEQ ID N0 : 463、SEQ ID N0:470、SEQ ID N0:492、SEQ ID N0:493、SEQ ID N0:494、SEQ ID N0:495、或 SEQ ID NO :496所示出的核苷酸序列雜交；或
[0054] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由 相同數目的核苷酸組成並且1〇〇 %互補。
[0055] 在第二十五實施方案中，本發明涉及用於將亞油酸轉化成二高亞麻酸的方 法，所述方法包括
[0056] a)提供一種重組微生物宿主細胞，所述宿主細胞包括：
[0057] i)DGLA合酶，它包括：
[0058] 1)至少一個編碼Λ 9延伸酶的多肽；
[0059] 2)至少一個編碼Λ 8去飽和酶的多肽；並且
[0060] 3)多膚接頭；
[0061] 其中所述接頭插入Λ 9延伸酶和Λ 8去飽和酶之間；以及
[0062] ii)亞油酸源；並且
[0063] b)使（a)的宿主細胞在使得能產生二高亞麻酸的條件下生長。
[0064] 在第二十六實施方案中，本發明涉及用於將α-亞麻酸轉化成二十碳三烯酸的 方法，所述方法包括：
[0065] a)提供一種重組微生物宿主細胞，所述宿主細胞包括：
[0066] i)DGLA合酶，它包括：
[0067] 1)至少一個編碼Λ 9延伸酶的多肽；
[0068] 2)至少一個編碼Λ 8去飽和酶的多肽；並且
[0069] 3)多膚接頭；
[0070] 其中所述接頭插入Λ 9延伸酶與Λ 8去飽和酶之間；以及
[0071] ii)a-亞麻酸源；以及
[0072] b)使（a)的宿主細胞在使得能產生二十碳三烯酸的條件下生長。
[0073] 在第二十七實施方案中，本發明涉及用於將二十碳五烯酸轉化成二十二碳六烯酸 的方法，所述方法包括：
[0074] a)提供一種重組微生物宿主細胞，所述宿主細胞包括：
[0075] i)DHA合酶，其包括：
[0076] 1)至少一個編碼C20延伸酶的多肽；
[0077] 2)至少一個編碼Λ 4去飽和酶的多肽；並且
[0078] 3)多膚接頭；
[0079] 其中所述接頭插入C20延伸酶與Λ 4去飽和酶之間；並且
[0080] ii)二十碳五烯酸源；並且
[0081] b)使（a)的宿主細胞在使得能產生二十二碳六烯酸的條件下生長。
[0082] 在第二十八實施方案中，本發明涉及用於將花生四烯酸轉化成二十二碳五烯酸的 方法，所述方法包括：
[0083] a)提供一種重組微生物宿主細胞，所述宿主細胞包括：
[0084] i)DHA合酶，它包括：
[0085] 1)至少一個編碼C20延伸酶的多肽；
[0086] 2)至少一個編碼Λ 4去飽和酶的多肽；以及
[0087] 3)多膚接頭；
[0088] 其中所述接頭插入C20延伸酶與Λ 4去飽和酶之間；並且
[0089] ii)花生四烯酸源；以及
[0090] b)使（a)的宿主細胞在使得能產生二十二碳五烯酸的條件下生長。
[0091] 在第二十九實施方案中，本發明涉及用於鑑定具有改善的Λ4去飽和酶活性的多 肽的方法，所述方法包括：
[0092] a)提供一種野生型Δ 4去飽和酶多肽，它分離自Euglena anabena，具有基線Δ 4 去飽和酶活性；
[0093] b)使（a)的野生型多肽截短約1至約200個胺基酸以形成截短的突變型多肽，它 具有比基線Λ4去飽和酶活性更高的Λ4去飽和酶活性。
[0094] 在第三十實施方案中，本發明涉及微生物宿主細胞，所述宿主細胞產生多不飽和 脂肪酸並表達編碼在以下連續途徑中的酶的多肽：
[0095] 1) Λ 9去飽和酶，
[0096] 2) Λ 12去飽和酶，
[0097] 3) Λ 9 延伸酶，
[0098] 4) Λ 8去飽和酶，
[0099] 5) Δ 5去飽和酶，
[0100] 6) Λ 17去飽和酶，
[0101] 7)C2Q/22 延伸酶，和
[0102] 8) Δ 4去飽和酶；
[0103] 其中所述多肽包括至少一個複合酶、包括融合在至少一對相鄰酶之間的融合區 域。
[0104] 牛物保藏
[0105] 下列生物材料保藏於美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection) (ATCC) (10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，並具有下 列名稱、保藏號和保藏日期（表1)。
[0106] Μ 1
[0107] ATCC 保藏
[0108]
【權利要求】
1. 包含單一多肽的複合酶，所述多肽具有至少兩種獨立的和可分的酶活性，其中所述 酶活性是Λ 4去飽和酶和C2(l/22延伸酶，並且其中所述Λ 4去飽和酶和C2(l/22延伸酶通過連接 相連接，並且所述連接選自 SEQ ID NO :198、SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :235、SEQ ID NO : 438、SEQ ID NO :472、SEQ ID NO :445 和 SEQ ID NO :504。
2. 編碼權利要求1的複合酶的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸包含： (a) 編碼具有與 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:95、SEQ ID NO : 96 或 SEQ ID NO :97至少80%相同的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列； (b) 如 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、 SEQ ID NO :93或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列；或 (c) 在嚴格條件下與如 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、 SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :93或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
3. 權利要求2的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQ ID NO :12、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :96 或 SEQ ID NO :97 的核苷酸序列。
4. 權利要求3的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :93 或 SEQ ID NO :410 所示 出的核苷酸序列。
5. 包含權利要求2-4中任一項的分離多核苷酸的重組構建體，所述多核苷酸被可操作 地連接到至少一種調控序列上。
6. 包含權利要求5的重組構建體的宿主細胞。
7. 權利要求6的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞。
8. 權利要求7的宿主細胞，其中所述植物細胞是油料種子植物細胞。
9. 權利要求6的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
10. 權利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞是含油酵母細胞。
11. 權利要求10的宿主細胞，其中所述宿主細胞是耶氏酵母細胞。
12. 用於轉化細胞的方法，所述方法包括使用權利要求5的重組構建體來轉化細胞以 及選擇那些用所述重組構建體轉化過的細胞。
13. 用於生產轉化過的植物的方法，所述方法包括使用權利要求5的重組構建體來轉 化植物細胞以及從所述轉化過的植物細胞再生植物。
14. 包含權利要求5的重組構建體的植物。
15. 權利要求14的植物，其中所述植物是油料種子植物。
16. 權利要求15的植物，其中所述植物是大豆植物或向日葵植物。
17. 獲自權利要求14的植物的種子，其中所述種子包含所述重組構建體。
18. 用於將二十碳五烯酸轉化成二十二碳六烯酸的方法，所述方法包括： a) 提供包含權利要求5的重組構建體的重組微生物宿主細胞，和二十碳五烯酸源；並 且 b) 使（a)的宿主細胞在使得能產生二十二碳六烯酸的條件下生長。
【文檔編號】C12R1/645GK104152423SQ201310495325
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2008年4月3日 優先權日:2007年4月3日
【發明者】H.G.達穆德, A.J.金尼, K.G.裡普, Q.Q.朱 申請人:納幕爾杜邦公司