啤酒花品種的識別方法

2023-12-03 05:25:21

啤酒花品種的識別方法
【專利摘要】本發明涉及利用由品種間不同的至少一個單核苷酸多態性構成的識別標記的用於識別啤酒花品種的方法以及該識別標記的製備方法。本發明還提供用於該識別啤酒花品種的方法中使用的引物或探針及包含該識別標記的區域的核酸。本發明進一步提供檢測啤酒花試樣中不同品種混入的方法。
【專利說明】啤酒花品種的識別方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及利用了由品種間不同的至少一個單核苷酸多態性構成的識別標記的 用於識別啤酒花品種的方法以及該識別標記的製備方法。

【背景技術】
[0002] 啤酒花（學名：Humulus lupulus)為屬於大麻科的雌雄異株的蔓性（攀援）植物。 雌株具有稱為"球花"的像松果形的花的結構，該球花為啤酒的原料。未受精的球花中，有 稱為蛇麻素的黃色顆粒，其為啤酒獨特的香味、清爽苦味的來源。啤酒花具有賦予啤酒略帶 苦味、爽快的香味、提高泡持性、使啤酒的光澤（色澤）良好、抑制雜菌繁殖的作用，是啤酒 釀造中不可缺少的原料之一。
[0003] 啤酒花在以德國、美國為首的捷克、英國、法國、中國、斯洛維尼亞、南非、澳大利 亞、紐西蘭、日本等國栽培，其栽培品種也多種多樣。啤酒花品種中有香型啤酒花和苦型啤 酒花。香型啤酒花為賦予芬芳香味和溫和苦味的啤酒花，苦型啤酒花為賦予具有收斂性的 苦味的啤酒花。如此，啤酒花因各品種的香味、味道不同，所以在釀造高品質的啤酒時，篩選 符合目的的啤酒花品種非常重要。而且，為了穩定維持其品質，準確檢查所訂購的原料啤酒 花是否能正確進貨非常重要。至今為止，根據供貨商所提供的品質保證書、蛇麻素中所含有 的α酸等成分含量的不同、球花外觀上的差異進行確認。但是，在日本，通常是購入將啤酒 花的球花乾燥、粉碎、壓縮整形製成顆粒狀的啤酒花來用於啤酒釀造。因此，很難從球花外 觀上的特徵來識別品種。此外，從球花中得到的苦味成分、精油成分等的化學成分也易受環 境因素的影響，還有因品種關係而顯示近似值的啤酒花等，所以作為識別的指標具有局限 性。
[0004] 另一方面，近年來，開發了一些應用基因工程的品種識別方法。這些方法通過檢 測品種間鹼基序列的不同，即檢測多態性來進行品種識別。啤酒花中，國際公開公報（W0 1997/005281)中公開了以下方法，通過RAPD(隨機擴增多態性DNA)法尋找品種間不同的 DNA區域，設計可擴增該區域的引物，通過使用該引物的PCR來擴增多態性區域，通過分析 擴增片段的有無或其大小的差異來識別啤酒花品種，此外，日本特開平11 一 103895公報中 公開了以下方法，通過使用高濃度的氯化鋰，從啤酒花中高效提取?純化適合PCR的基因 組DNA，相對於該基因組DNA使用隨機引物、STS (序列標籤位點）標記的引物等的引物進行 PCR，擴增可識別啤酒花品種的DNA，通過擴增DNA的有無來判別啤酒花品種，而且，日本特 開2006 - 34142公報中還公開了以下方法，通過使用設計成可擴增包含品種間多態性的微 衛星區域的引物來進行PCR，擴增微衛星DNA，通過分析擴增DNA片段長度的差異來識別品 種。
[0005] 通過利用啤酒花基因組上的多態性來識別啤酒花品種的上述方法雖不受啤酒花 的栽培環境、收穫時期或保存方法的影響，為可準確識別啤酒花品種的有效手段，但因這些 方法均需從PCR擴增的有無或大小的差異來進行識別，所以易受酶反應、電泳、凝膠染色等 條件不統一的影響，在再現性上存在問題。即難於區別是因 PCR、染色的不良好而未出現條 帶，或還是因為原本就未擴增，所以，具有錯誤判斷結果的危險性。此外，上述方法因是通過 毛細管電泳及雷射的DNA片段檢測、通過凝膠電泳的試樣染色的檢測等，所以，即使可特定 作為被測物的啤酒花品種、甚至可推測有無不同品種混入，但還是難於推斷或特定混入品 種、分析混入品種的混入比例。而且，由於被測物的劣化、損傷等使DNA發生碎片化時，會降 低分析精度，有錯誤判斷結果的危險性。
[0006] 作為極為有用且容易利用的多態性標記，單核苷酸多態性（以下也稱為"SNP"。） 受人注目。SNP(single nucleotide polymorphism)是基於1個鹼基的不同的鹼基序列的 多態性。因 SNP不受反應條件不統一的影響，所以，無疑似結果，易判斷，且SNP數據可轉換 為（〇，1)的數位訊號來進行信息處理，所以，容易進行樣品處理和數據分析的自動化，可使 用龐大的SNP數據進行各種各樣的分析。此外，用設計具有各種各樣長度的非特異性Tail 的引物等的方法，可一次性進行大量的SNP分析。
[0007] 但是，啤酒花具有二倍體的20條（雙鏈為10對）染色體，基因組大小為約27? 30億鹼基對（2.7?3GB)，非常龐大，與結構基因的關聯性尚不明確。因此，還未實施過從 基因組分析的結果中找出可進行多品種識別程度的充分數量的啤酒花品種間SNP的工作， 至今為止，將SNP用作多態性標記的啤酒花品種的識別方法還不為人所知。
[0008] 現有技術文獻
[0009] 專利文獻
[0010] 專利文獻1國際公開公報第W01997/005281號公報
[0011] 專利文獻2日本特開平11 一 103895號公報
[0012] 專利文獻3日本特開2006 - 34142號公報


【發明內容】

[0013] 本發明提供利用由品種間的單核苷酸多態性組成的識別標記的用於識別啤酒花 品種的方法以及該識別標記的製備方法。
[0014] 強烈希望開發出如下啤酒花品種的識別方法，即在確認訂購的原料啤酒花是否為 所訂貨的品種且是否混入了不同品種時，可不受酶反應、電泳、凝膠染色等的條件不統一的 影響而準確特定品種，檢測有無不同品種混入，不僅如此，在不同品種混入時，還可推斷或 特定混入品種，可分析其混入比例。
[0015] 本
【發明者】為解決上述課題，對基於DNA分析的啤酒花品種的識別方法進行了深入 研究。對於DNA分析，至今為止已報導了 SSR(簡單重複序列）法、RAPD(隨機擴增多態性 DNA)法、RFLP(限制性片段長度多態性）法、AFLP(擴增片段長度多態性）法等、基於PCR 擴增產物、其限制性內切酶片段的大小的不同、有無的方法。但是，這些方法大多操作繁雜， 且易受酶反應、電泳、凝膠染色等的條件不統一的影響，再現性令人擔心，而且在其他品種 混入時其檢測大多較為困難。我們在近年來使用發達的超高速DNA序列分析技術獲得大量 的數據，更加廣泛且高效地搜索SNP，將這些作為識別標記，開發出了準確且簡便地進行啤 酒花品種識別的方法。
[0016] 即方式之一中，本發明可以為以下內容。
[0017] (1) 一種方法，其為啤酒花品種的識別方法，其特徵在於，所述方法包含以下工 序：
[0018] ⑴擴增來自被測物啤酒花的DNA中的包含品種識別區域的DNA片段的工序，該品 種識別區域包含由啤酒花品種間不同的至少一個單核苷酸多態性（SNP)構成的識別標記；
[0019] (ii)鑑定上述工序（i)中擴增的DNA片段中的單核苷酸多態性的基因型的工序；
[0020] (iii)將上述工序（ii)所鑑定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區域中的單核苷 酸多態性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應的區域中的單核苷酸多態性的基因型進 行對比，分析該區域中的單核苷酸多態性的基因型在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間 為一致或不一致的工序；
[0021] (iv)根據上述工序（iii)的分析結果，特定被測物啤酒花品種的工序。
[0022] (2)根據⑴中所述的方法，其特徵在於，工序（ii)如下進行，鑑定工序⑴中擴 增的DNA片段中的品種識別區域的鹼基序列，且
[0023] 工序（iii)如下進行，將工序（ii)所鑑定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區域 的鹼基序列與已知啤酒花品種DNA所對應的區域的鹼基序列進行對比，分析該區域中的識 別標記在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
[0024] (3)根據⑴中所述的方法，其特徵在於，工序（ii)為如下工序，通過使工序⑴ 中擴增的DNA片段與檢測啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性的探針及/或引物接觸，而 鑑定單核苷酸多態性的基因型。
[0025] (4)根據⑴?⑶中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為包含通過 包含以下工序的方法而製備的識別標記的區域：
[0026] (a)使用2個以上不同品種的啤酒花，進行轉錄組分析的工序；
[0027] (b)基於由上述工序（a)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對各品種進行組裝的 工序；
[0028] (C)將由上述工序（b)的結果得到的重疊群及/或單拷貝進行品種間對比，進行品 種間不同的單核苷酸多態性（SNP)的搜索的工序；
[0029] (d)根據上述工序（c)的SNP搜索的結果，選擇包含SNP的區域，設計用於擴增該 區域的引物的工序；
[0030] (e)通過使用上述工序（d)中設計的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認 上述工序（d)中選擇的區域可擴增，確定該鹼基序列，從而確定識別區域和可擴增該識別 區域的引物的工序；
[0031] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴增識別區域，確定識別區域的鹼基序列的工序；及
[0032] (g)將上述工序（f)中確定的識別區域的鹼基序列進行品種間對比，確定由用於 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構成的識別標記的工序。
[0033] (5)根據⑴?⑶中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為包含選自 序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個以上 的鹼基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態性 或插入缺失部分的至少一個的區域。
[0034] (6)根據⑴?⑶中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為選自包含 序列號9表不的喊基序列的區域、包含序列號10表不的喊基序列的區域、包含序列號11表 不的喊基序列的區域、包含序列號12表不的喊基序列的區域、包含序列號13表不的喊基序 列的區域、包含序列號14表示的鹼基序列的區域及包含序列號15表示的鹼基序列的區域 中的1個以上的區域。
[0035] (7)根據⑴?⑶中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為不僅包含 以下：包含序列號9表不的喊基序列的區域、包含序列號10表不的喊基序列的區域，及包含 序列號11表示的鹼基序列的區域的3種區域，且包含以下：序列號12及/或序列號14表 示的鹼基序列的一部分或全部，且還包含圖4中特定的單核苷酸多態性或插入缺失部分的 至少1個的區域。
[0036] (8)根據⑴?⑶中任一項所述的方法，其特徵在於，工序⑴通過使用以下引 物對的PCR反應來進行，為選自序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的組合、 序列號5及序列號6的組合及序列號7及序列號8的組合的引物對。
[0037] (9)根據⑴?⑶中任一項所述的方法，其特徵在於，工序⑴通過使用以下引 物對的PCR反應來進行：不僅為以下：序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的 組合以及序列號5及序列號6的組合的3種引物對，還為序列號7及序列號8的組合的引 物對。
[0038] (10) -種方法，其為由啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性的組合構成的識別標 記的製備方法，其特徵在於，所述方法包含以下工序：
[0039] (a)使用2個以上不同品種的啤酒花，進行轉錄組分析的工序；
[0040] (b)基於由上述工序（a)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對各品種進行組裝的 工序；
[0041] (C)將由上述工序（b)的結果得到的重疊群及/或單拷貝進行品種間對比，進行品 種間不同的單核苷酸多態性（SNP)的搜索的工序；
[0042] (d)根據上述工序（c)的SNP搜索的結果，選擇包含SNP的區域，設計用於擴增該 區域的引物的工序；
[0043] (e)通過使用上述工序（d)中設計的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認 上述工序（d)中選擇的區域可擴增，確定該鹼基序列，從而確定識別區域和可擴增該識別 區域的引物的工序；
[0044] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴增識別區域，確定識別區域的鹼基序列的工序；及
[0045] (g)將上述工序（f)中確定的識別區域的鹼基序列進行品種間對比，確定由用於 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構成的識別標記的工序。
[0046] (11) -種核酸，其特徵在於，包含通過（10)中所述的方法製備的識別標記的至少 一部分。
[0047] (12) -種核酸，其特徵在於，該核酸包含啤酒花的品種識別區域，而且，包含選自 序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個以上 的鹼基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態性 或插入缺失部分的至少一個。
[0048] (13) -種引物，其特徵在於，設計為可擴增（11)或（12)中所述的核酸。
[0049] (14) 一種引物，其特徵在於，由序列號1?8中任一個所記載的鹼基序列組成，在 此，該引物用於啤酒花的品種識別。
[0050] (15) -種探針，其特徵在於，用於檢測通過（10)中所述的方法鑑定的品種識別區 域中的啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性。
[0051] (16) -種探針，其特徵在於，可在選自序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、 序列號13、序列號14及序列號15中的1個以上的鹼基序列中，檢測圖1、圖2、圖3、圖4或 圖6中特定的位置中的至少1個單核苷酸多態性或插入缺失位點，且由此檢測啤酒花品種 間不同的單核苷酸多態性。
[0052] (17) -種方法，其為檢測啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以 下工序：
[0053] (i)擴增從被測物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識別區域的DNA片段的 工序，該品種識別區域包含由啤酒花品種間不同的至少一個單核苷酸多態性（SNP)構成的 識別標記；
[0054] (ii)分析上述工序⑴中擴增的DNA片段中的品種識別區域的鹼基序列，得到測 序數據的工序；
[0055] (iii)將上述工序（ii)中得到的測序數據中的構成識別標記的單核苷酸多態性 位點的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息進行對比的工序；及
[0056] (iv)確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 測序數據的單核苷酸多態性位點的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息一 致時，判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點 的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，判斷為有不同品種混入。
[0057] (18)根據（17)中所述的方法，其特徵在於，進一步包含接在工序（iv)後的以下工 序：
[0058] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的 信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，由上述工序（ii)中得到的 測序數據的單核苷酸多態性位點中出現的來自正常品以外的信息特定其鹼基的工序；及
[0059] (vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態性位點的與正常品不同的鹼基與識 別標記對照，從而推斷或特定混入品種的工序。
[0060] (19)根據（17)中所述的方法，其特徵在於，進一步包含接在工序（iv)後的以下工 序：
[0061] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的 信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，由上述工序（ii)中得到的 測序數據的單核苷酸多態性位點中出現的來自正常品以外的信息特定其鹼基，並求出混入 比例的工序；及
[0062] (vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態性位點的與正常品不同的鹼基與識 別標記對照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
[0063] (20)根據⑴?（9)中任一項所述的方法，其特徵在於，工序（iii)中包含有無 19?25鹼基的插入序列的分析。
[0064] 通過可利用由品種間的單核苷酸多態性組成的識別標記來識別啤酒花品種，在確 認訂購的原料啤酒花是否為所訂貨的品種且是否混入了不同品種時，可準確特定作為被測 物的啤酒花品種及檢測有無不同品種混入。而且不同品種混入時，不僅可分析有無混入，還 可推斷或特定混入品種，分析其混入比例
[0065] 此外，使用通過本發明的方法製備的構成識別標記的鹼基的信息，可製備用於識 別目標品種的引物、探針，通過使用利用該引物、探針的實時PCR法、新一代測序儀進行分 析，可期待能對不同品種的混入比例進行定量分析。
[0066] 由此，可穩定供給目標高品質的啤酒。此外，即使被測物劣化、損傷時，也可識別品 種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0067] 圖1為表示14品種啤酒花的Al區域中的SNP分析結果的圖及鹼基的編碼表。SNP 的位置表示從Al區域的共有序列（序列號9)的5'側開始數的SNP的位置。分析後的SNP 為24處。用於分析的14種啤酒花被分為9類型（type)的雙體型。
[0068] 圖2為表示14品種啤酒花的Bl區域中的SNP分析結果的圖。SNP的位置表示從 Bl區域的共有序列（序列號10)的5'側開始數的SNP的位置。分析後的SNP為10處。用 於分析的14種啤酒花被分為7類型的雙體型。有關A、G、C、T以外的鹼基的標記參照圖1 的編碼表。
[0069] 圖3為表示14品種啤酒花的Cl區域中的SNP分析結果的圖。SNP的位置表示從 Cl區域的共有序列（序列號11)的5'側開始數的SNP的位置。分析後的SNP為29處，其 中，序列號11的第129?134位的鹼基為插入缺失（indel)部分。用於分析的14種啤酒 花被分為3類型的雙體型。有關A、G、C、T以外的鹼基的標記參照圖1的編碼表。
[0070] 圖4為表不珍珠（Perle)及北釀（Northern Brewer)的Al - 2 - L區域及Al - 2 - R區域中的SNP分析結果的圖。SNP的位置表示分別從Al - 2 - L區域的2品種共有 序列（序列號12)及Al - 2 - R區域的2品種共有序列（序列號14)的5'側開始數的 SNP的位置。對Al - 2 - L區域進行分析後的SNP為21處，其中，序列號12的第186? 194及第399位的鹼基為插入缺失（indel)部分。對Al - 2 - R區域進行分析後的SNP 為67處，其中，序列號14的第57?59及第65位的鹼基為插入缺失（indel)部分。珍珠 (Perle)及北釀（Northern Brewer)表不不同的雙體型。
[0071] 圖5為歸納用於品種識別試驗的啤酒花品種和識別標記的雙體型的表。
[0072] 圖6為表示斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的 Al - 2 - L 區域及 Al - 2 - R 區域中的 SNP 分 析結果的圖。SNP的位置表示分別從Al - 2 - L區域的5品種共有序列（序列號13)及 Al - 2 - R區域的5品種共有序列（序列號15)的5'側開始數的SNP的位置。對Al - 2 - L區域進行分析後的SNP為23處，其中，序列號13的第12、第183?191及第396位 的鹼基為插入缺失（indel)部分。對Al - 2 - R區域進行分析後的SNP為28處，其中，序 列號15的第437位的鹼基為插入缺失（indel)部分。表示用於分析的5個品種啤酒花的 Al - 2 - L區域中的各個不同的雙體型，在Al - 2 - R區域中被分為4類型的雙體型。
[0073] 圖7為歸納斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的Al - 2 - L區域（序列號13)中識別標記的雙 體型的表。
[0074] 圖8為表示分析薩茲（Saaz)及普萊米特（Premiant)的混合試樣的Al區域鹼基 序列的結果的電泳圖。Al區域的鹼基號根據序列號9中的鹼基號。

【具體實施方式】
[0075] 以下具體說明本發明，但本發明不限於這些。本發明涉及利用由品種間不同的至 少一個單核苷酸多態性（SNP)構成的識別標記的用於識別啤酒花品種的方法、該識別標記 的製備方法、檢測利用該識別標記的啤酒花試樣中不同品種混入的方法、該識別標記、設計 為可擴增具有該識別標記的區域的品種識別引物及用於檢測該識別標記的品種識別探針。
[0076]
[0077] 本申請涉及如下發明，其特徵在於，使用由品種間不同的至少1個SNP構成的識別 標記來識別啤酒花品種。具體而言，提取被測物啤酒花的DNA，分析具有與由SNP組成的識 別標記區域的鹼基序列對應的鹼基序列中的識別標記所對應位點的鹼基是否與識別標記 的鹼基一致，為一致時，即將被測物啤酒花品種特定為識別標記的品種。
[0078]
[0079] 本說明書中只要不特別定義，與本發明相關使用的科學用語及技術用語具有本領 域技術人員通常理解的意思。
[0080] 本說明書中，"識別標記"是指用於識別啤酒花品種的指標，由品種間不同的1以上 的單核苷酸多態性構成。為使本發明的識別標記在識別對象品種間不重複，將品種與識別 標記以一一對應的方式來確定，但也可根據作為識別對象的品種的數量、種類來變更構成 識別標記的單核苷酸多態性。例如，需要識別的品種僅為2品種時，使用由1個單核苷酸多 態性構成的識別標記即足夠，需要識別的品種為多個的情況下，通過多個單核苷酸多態性 的組合（根據情況為多個識別區域的多個單核苷酸多態性的組合）以不重複的方式來確定 識別標記。識別標記原則上以不重複的方式來確定，但根據識別的目的，也可將識別標記重 復的多個品種（即具有相同識別標記的多個品種）看成1個組，與1個識別標記對應而使 用。
[0081] 本說明書中，"識別區域"是指包含來自啤酒花DNA中的識別標記的區域。識別區 域不限於1個區域，也可為多個區域。而且，識別區域中，有時將品種識別時被測物的DNA 片段進行擴增的核酸區域特別記為"品種識別區域"。品種識別區域也可為與識別區域相同 的區域，還可根據品種識別的目的而另行設定。此外，品種識別區域不限於1個區域，也可 為多個區域。
[0082]
[0083] 本申請提供製備用於識別啤酒花品種的識別標記的方法。
[0084] 在方式之一中，本發明的識別標記如下製備，使用2個以上不同品種的啤酒花，進 行轉錄組分析，選定單核苷酸多態性（SNP)較多存在的區域，設計引物，確定識別區域和可 擴增該識別區域的引物。而後通過從識別對象的品種中提取DNA、使用所述引物、擴增識別 區域、確定鹼基序列、進行品種間對比，通過確定由識別對象品種的識別中必需的至少1個 SNP構成的識別標記而來製備。
[0085] 具體而言，製備用於識別啤酒花品種的識別標記的方法也可包含以下工序：
[0086] (a)使用2個以上不同品種的啤酒花，進行轉錄組分析的工序；
[0087] (b)基於由上述工序（a)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對各品種進行組裝的 工序；
[0088] (C)將由上述工序（b)的結果得到的重疊群及/或單拷貝進行品種間對比，進行品 種間不同的單核苷酸多態性（SNP)的搜索的工序；
[0089] (d)根據上述工序（c)的SNP搜索的結果，選擇包含SNP的區域，設計用於擴增該 區域的引物的工序；
[0090] (e)通過使用上述工序（d)中設計的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認 上述工序（d)中選擇的區域可擴增，確定該鹼基序列，從而確定識別區域和可擴增該識別 區域的引物的工序；
[0091] (f)使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴增識別區域，確定識別區域的鹼基序列的工序；及
[0092] (g)將上述工序（f)中確定的識別區域的鹼基序列進行品種間對比，確定由用於 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構成的識別標記的工序。但本發明不限於這些方 法，也可將通常已知的其他方法適當改變使用。
[0093] 對上述工序（a)?（g)如下進行說明。
[0094] (a)彳申用啤酒花分析轉錄糹的工序
[0095] 為了搜索識別標記中應含有的候選SNP，首先，使用2個以上不同品種的啤酒花， 分別對其進行轉錄組分析。
[0096] 轉錄組（transcriptome)是指某些特定狀態的組織、細胞中存在的總mRNA(或為 初級轉錄物、轉錄產物（transcripts))的總體。
[0097] 以下將本發明中轉錄組分析的順序作為一例進行說明，但不特別限定於此。首先， 分別從啤酒花的多個品種的組織中粗提取總RNA，純化總RNA中的總mRNA (poly (A)+RNA)， 進行以該mRNA為模板的cDNA的合成。因所得到的cDNA文庫中表達量多的和少的混合存 在，所以，需校正表達量的不同（均一化），進而進行以大小（size)為基準的純化。而後，使 用超高速DNA序列分析裝置進行cDNA的測序分析。
[0098] 作為提取上述總RNA的啤酒花的組織，適合使用構成芽、葉、莖、球花的各種組織， 但不特別限定於此。此外，從啤酒花植株上採集上述組織時，啤酒花植株的栽培方法、其生 長發育階段等也無特別限定。而且，作為啤酒花的組織，可為鮮組織，也可為乾燥組織，還可 以加工成例如顆粒狀。但是，因 RNA易分解，所以，優選立刻使用從啤酒花植株上採集的新 鮮組織，且作為富含RNA的組織，優選使用嫩葉。此外，在採集分析用試樣時，優選採取極力 防止RNA分解的措施，努力防止汙染。
[0099] 此外，轉錄組分析中使用的啤酒花品種可使用2品種以上的不同品種，所使用的 品種、數量可根據目的不同來選擇。另外，為了檢測更大量的SNP，優選使用3品種以上的不 同品種。此外，優選從識別對象品種中選擇使用。
[0100] 啤酒花組織中的總RNA的提取?CDNA的測序分析的轉錄組分析的各步驟可採用 通常採用的方法進行。
[01 01 ] (b)對各品種講_彳丁組裝的下序
[0102] 基於如上所述各品種中用轉錄組分析而明確的DNA片段（cDNA)的鹼基序列，對各 品種進行序列組裝。序列組裝是指由短的DNA片段再構建原本的長的鹼基序列。例如基於 由工序（a)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對是否具有相互重疊的鹼基序列進行聚類 分析（Clustering)，尋找聚類後的一系列DNA片段中的重疊部分進行拼接（組裝），而得到 一個序列。將如此組裝的序列總稱為"重疊群（contig) "，此外，將重疊群形成時未附加的 單端（single read)總稱為"單拷貝（singlet)"。通過序列組裝的重疊群的製備可通過通 常採用的方法進行。
[0103] (c)檢測品種間對應的喊某的不同的下序
[0104] 如上所述，基於對各品種進行轉錄組分析而明確的DNA片段的鹼基序列，以相互 重疊的序列部分為基礎進行組裝而製備重疊群。使用由此得到的重疊群序列及/或單拷貝 序列，檢測品種間對應的喊基的不同（在此為SNP)。
[0105] 檢測2品種以上品種間對應的鹼基的不同時，首先是將其中1品種作為參照序列 (參考序列）來選擇。而後，將所選擇的品種的重疊群及/或單拷貝（優選為重疊群，更優 選為重疊群及單拷貝）指定為參考序列，以此為基準，將其他品種的單端以是否具有共有 部分的方式分別作圖（mapping)。進而，從在分析軟體上開發的組裝信息中推斷出已作圖 (mapping)的單端成為構成要素的重疊群。將如此得到的參考序列與其他品種的重疊群及 /或單拷貝進行比對，以檢測SNP。另外，因僅1品種的參考序列中有忽略SNP的可能性，所 以，優選將其他品種分別作為參考序列，與上述同樣進行作圖（mapping)、比對而檢測SNP， 將這些結果綜合為SNP數據。通過將各種不同品種作為參考序列來檢測SNP，可檢測更多的 SNP，可選擇更適合作為識別標記的SNP。且在檢測出本發明中3品種以上的品種間對應的 喊基的不同時，在品種間對應的喊基中，至少任意2品種間不同時，即可視為SNP。在檢測品 種間對應的鹼基的不同時，可用通常採用的方法進行。上述方法為一例，但不限定於此。作 為其他方法，也可通過使用1品種的重疊群序列進行BLAST搜索，來檢測不同。
[0106] (d)詵擇含有SNP的區域設計引物的工序
[0107] 如此，由使用重疊群序列及/或單拷貝序列檢測SNP的結果，選擇可用於識別的 SNP存在的區域。以多個品種的識別為目的時，希望選擇SNP大量存在的區域。更具體而 言，可例示從分析的容易度出發，優選純合子（2倍體的各個雙鏈間鹼基序列為一致）中的 SNP存在的區域，且選擇單位重疊群中SNP數多的區域，但無特別限定。
[0108] 其後，設計可擴增該區域的引物。引物的設計可通過通常採用的方法進行。
[0109] (e)確定識別區域和可擴增該識別區域的引物的工序
[0110] 因如上所述設計的引物是基於從cDNA文庫中製備的重疊群序列或單拷貝序列而 設計的引物，所以，是否良好擴增包含啟動子區域、內含子的基因組的DNA還不得而知。因 此，需要使用從啤酒花中提取的基因組DNA來確認擴增。此外，即使在擴增時也要確認插入 缺失（indel)、微衛星的有無、目標SNP的存在，所以，需要進行根據雙脫氧測序法（SANGER) 等的鹼基序列的確認。因此，使用工序（d)中設計的引物，以啤酒花品種（優選為工序（a) 中使用的啤酒花品種）的顆粒、乾燥球花等中提取的基因組DNA為模板，擴增含有SNP的區 域並進行測序。由此，確認能以適當大小進行擴增及與基於所述轉錄組分析的鹼基序列進 行對比可適用於品種識別，以確定可用於識別的區域（識別區域）和可擴增該區域的引物。 由於內含子的存在等無法擴增時，擴增大小、鹼基序列中有不合適、不良好時，要進行選擇 區域的再探討、引物的再設計。
[0111] 另外，用於製備識別標記的識別區域不限於1個區域，也可選擇多個區域。通過選 擇多個區域可識別更多的品種。
[0112] 此外，識別區域中也可包含插入缺失（indel)部分。從廣義上講，單核苷酸多態性 (SNP)中也可包含插入缺失（indel)，本發明中，作為構成識別標記的SNP，也可利用插入缺 失（indel)部分。
[0113] (f)確定識別區域的鹼某序列的工序及（g)確定識別對象品種的識別標記的工序
[0114] 使用工序（e)中確定的可擴增識別區域的引物，以從識別對象品種中提取的基因 組DNA為模板分別擴增識別區域。
[0115] 本說明書中，識別對象品種是指作為識別的對象而選擇的啤酒花品種，包含2個 以上不同品種。啤酒花只要是被分類為學名Humulus lupulus的植物，無特別限定。例如 可列舉以德國、美國、捷克、英國、法國、中國、斯洛維尼亞、南非、澳大利亞、紐西蘭、日本等 為原產國的啤酒花。
[0116] 作為歐洲原產的啤酒花的例子，可列舉薩茲（Saaz)、斯拉德克（Slddek)、普萊米 特（Premiant)、傳統（Tradition)、斯派爾特（Spalter)、斯派爾特精選（Spalter Select)、 珍珠（Perle)、泰特南（Tettnang)、金釀（Brewer，s Gold)、北釀（Northern Brewer)、馬格 努門（Magnum)、海格立斯（Herkules)、德國努格特（German Nugget)、陶若斯（Taurus)、阿 德米瑞（Admiral)、奧羅拉（Aurora)、赫斯布魯克（Hersbrucker)、哈拉道默克（Hallertau Merkur)、Hallertau Mittelfrueh、塔格特（Target)等，但不限於這些。
[0117] 作為美國原產的啤酒花的例子，可列舉阿瑪裡洛（Amarillo)、卡斯卡特 (Cascade)、世紀（Centennial)、奇努克（Chinook)、克雷斯特（Cluster)、哥倫布 (Columbus)、水晶（Crystal)、富格爾（Fuggle)、格林納（Galena)、哥爾丁（Golding)、 Horizon、自由（Liberty)、胡德峰（Mount Hood)、努格特（Nugget)、Santiam、斯特林 (Sterling)、薩米特（Summit)、超級格林納（Super Galena)、泰特楠捷（Tettnanger)、戰斧 (Tomahawk)、烏爾特拉（Ultra)、威廉麥特（Willamette)、宙斯（Zeus)等，但不限於這些。
[0118] 根據識別的目的不同，可自由設定對象品種的種類、數量。例如，可選擇與栽培地 鄰近的品種等，可根據其各個時期的目的不同而選擇對象品種。
[0119] 作為方式之一，識別對象品種為實施例1的表4中所示的以德國及捷克為原產國 的14種啤酒花。
[0120] 對於此種根據目的而選擇的識別對象品種，進行擴增DNA片段的測序，確定鹼基 序列。
[0121] 對工序（f)中確定的各識別對象品種的識別區域的鹼基序列進行比對，提取SNP 部分。為使識別對象品種間不重複，以品種和識別標記為一一對應的方式來組合所提取的 SNP，確定識別標記。
[0122] 在此，上述工序（f)及（g)可根據以下（1)?（11)中所示的順序進行。
[0123] (1)啤酒花的獲得
[0124] 本發明中使用的"DNA"可通過從啤酒花的組織中提取DNA來得到。作為啤酒花的 組織，適合使用構成芽、葉、莖、球花的各種組織，但不特別限定於此。此外，從啤酒花植株上 採集上述組織時，對啤酒花植株的栽培方法、其生長發育階段等也無特別限定。而且作為啤 酒花的組織，可為鮮組織，也可為乾燥組織，此外，也可為例如加工成顆粒狀的啤酒花的組 織。
[0125] (2) DNA 的提取
[0126] DNA的提取可使用CTAB(十六燒基三甲基溴化銨：Cetyltrimethyl ammonium bromide)法、市售試劑盒的Qiagen DNeasy Tissue Kit(QIAGEN公司）、IS0PLANT II(日本 基因公司）等本領域技術人員公知的方法提取。從操作性和經濟性的方面考慮，優選CTAB 法。
[0127] (3) DNA片段的擴增
[0128] 通過PCR法擴增如上所述提取的DNA。本發明中使用的PCR法無特別限定，不僅包 含公知的PCR法，還包含各種改良方法。以下為其中一例。
[0129] 即除了引物對、模板DNA以外，混合Tris - HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合 酶等的試劑類，作為PCR反應液。PCR的1個循環由熱變性、退火、通過DNA聚合酶的DNA鏈 的延伸（合成）反應的3步組成。各步反應各有不同，根據情況需要同一反應溫度和反應 時間，這些可通過應擴增的DNA區域的鹼基序列、其長度等適當確定。此種操作可使用市售 的基因擴增儀進行。
[0130] 作為本發明中使用的引物，使用所述工序（e)中確定的可擴增識別區域的引物 對。例如可使用本
【發明者】確定的引物對（Al - 3L/A1 - 3R(序列號1及2))、引物對（BI - 1L/B1 - 1R(序列號3及4))、引物對（Cl 一 1L/C1 一 1R(序列號5及6))及/或引物對 (Al - 2 - 1L/A1 - 2 - 1R(序列號 7 及 8))。
[0131] (4)通過PCR的擴增的確認
[0132] 作為PCR結果（PCR產物）的評價方法，使用可鑑定特定DNA片段的任意方法，例如 電泳、凝膠過濾、雜交，確認目的大小的DNA片段進行了擴增。例如，分別確認出使用引物對 (Al - 3L/A1 - 3R(序列號1及2))時，擴增到大小為651鹼基長；使用引物對（BI - IL/ Bl - 1R(序列號3及4))時，擴增到大小為729鹼基長；使用引物對（Cl 一 1L/C1 一 IR(序 列號5及6))時，擴增到大小為646鹼基長；使用引物對（Al - 2 - 1L/A1 - 2 - IR(序列 號7及8))時，擴增到大小為約1500鹼基長。
[0133] (5) PCR產物的純化
[0134] 所擴增的PCR產物因作為循環測序反應的模板使用，所以與剩餘的引物等的在反 應中使用的成分分離。該純化例如可使用市售的QIAquick PCR Purific ation Kit (QIAGEN 公司），根據其產品中附帶的實驗方法來進行。
[0135] (6)循環測序反應及測序產物的純化
[0136] 因進行如上所述純化的PCR產物的測序，所以，以其為模板，進行循環測序反應。 該方法為如下方法，與PCR法類似，使用基因擴增儀，重複進行熱變性、退火、通過DNA聚合 酶的DNA鏈的延伸反應的3步，使用其中任意1種引物，在用各個鹼基不同的4種螢光色素 標記的終止子存在下，合成長度不同的各種單鏈DNA。循環測序的方法例如可使用市售的 BigDye Terminator vl. ICycle Sequencing Kit (Life Technologies) 〇 具體而言，可根據 該試劑盒的日語版實驗方法（P. 22 "單鏈DNA、雙鏈DNA的循環測序"、p. 25 "GeneAmpPCR System9700, 9600, 2700, 2400 中的循環測序"及 ρ· 38 - 40 "旋轉柱（和 Spin Plate)中的 純化法"）實施。且所使用的引物的鹼基序列可與通過目的DNA片段的PCR的擴增中使用的 鹼基序列相同。即在根據需要用滅菌蒸餾水稀釋PCR產物的純化液後加入規定的物質，制 備循環測序反應液。將其加入PCR用微型離心管中，安裝在PCR裝置上，進行變性（例如， 96°C、1分鐘）後，重複進行例如25次變性（例如，96°C、10秒）、退火（例如，50°C、5秒）、 鏈延伸（例如，60°C、4分鐘）的反應。另外，反應終止後，不立即取出樣品時，可降低樣品模 塊的溫度來保持。
[0137] 其後，從上述中得到的反應液中，純化測序產物、即單鏈DNA的混合液，製備以 後的用於測序儀的試樣。作為該方法的一例，可列舉使用CENTRISEP Spin C〇lumn(Life Technologies)的方法，根據附帶的實驗方法進行操作，得到目的試樣。
[0138] (7) DNA片段的測序
[0139] 對於用上述Dye Terminator法得到的測序產物進行測序。作為方法，通常使用電 泳法，作為一例，可列舉使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer進行電泳，利用標記中使用 的螢光物質在各個鹼基中的不同，通過雷射螢光檢測儀依次確定鹼基序列。
[0140] (8)鹼基序列的分析
[0141] 分析所確定的鹼基序列，得到測序數據。對照分別得到的測序數據，確定正確的鹼 基序列。
[0142] (9)鹼基序列的比對
[0143] 對如上所述得到的識別對象品種的測序數據進行比對。
[0144] (10)全部識別對象品種的上述鹼基序列中保守的鹼基除外
[0145] 如此，比對的結果，從上述鹼基序列中，將由全部識別對象品種的上述鹼基序列中 保守的1個或其以上的鹼基形成的位點除外。如此，通過將全部的上述鹼基序列中保守的 鹼基位點除外，可明確地確認單核苷酸多態性的存在，而且，在之後的工序中，可容易地進 行基於單核苷酸多態性的識別標記的確定。
[0146] 具體而言，從通過比對而得到的數據中，提取全部識別對象品種的鹼基序列中鹼 基保守的位點。"鹼基保守"是指所得到的比對數據的縱列在全部識別對象品種的鹼基序列 中均為相同的鹼基。將所提取的位點全部除外。將所保守的位點全部除外的理由如下。
[0147] 即對比啤酒花品種的鹼基序列時，認為大部分的鹼基在全部識別對象品種中共有 存在。但是，本發明的特徵在於，著眼於除去與全部識別對象品種共有的部分的單核苷酸多 態性的部分，基於該單核苷酸多態性與品種具有相關性，從而製備識別標記。
[0148] 提取的方法只要是可提取全部識別對象品種的鹼基序列中保守的鹼基的方法，也 可使用目測、機械操作等的任何方法。
[0149] (11)識別標記的確定
[0150] 使用進行了上述除外後剩餘的SNP，確定識別標記。如前所述，為使本發明的識別 標記在識別對象品種間不重複，以一一對應的方式確定品種和識別標記。另外，識別標記每 次均需根據其使用目的、即作為識別對象的品種的數量、種類，而確定構成識別標記的SNP。 例如，僅識別特定的2品種時，可選擇1處可進行該2品種識別的SNP來作為識別標記。此 夕卜，需要識別多個品種時，可通過將多處的SNP (根據情況，將多個識別區域的多處的SNP) 組合，確定識別標記，使其在該品種間不重複。
[0151] 例如，將以下實施例1中記載的如表4中所示的14品種啤酒花作為識別對象時， 該14品種中，Al區域（序列號9)中存在的24處SNP可分為9類型，Bl區域（序列號10) 中存在的10處SNP可分為7類型，Cl區域（序列號11)中存在的29處SNP(其中，相當於 序列號11的第129?134位的鹼基的6處為插入缺失部分）可分為3類型，通過將這些組 合，可將14品種分為13類型。即對14品種中的12品種，可通過Al區域、Bl區域、Cl區域 中分別存在的SNP，使識別標記和品種一一對應。而且因剩餘的1類型適合類似的2品種， 所以，作為識別這些類似的2品種的區域，可通過Al - 2 - L區域（序列號12)中存在的 21處SNP (其中，10處為插入缺失部分）及Al - 2 - R區域（序列號14)中存在的67處 SNP(其中，4處為插入缺失部分）的任一個，使識別標記與2品種對應。如此，在識別上述 的14品種時，可將Al區域的24處SNP、Bl區域的10處SNP、Cl區域的29處SNP (其中，6 處為插入缺失部分）以及Al - 2 - L區域及Al - 2 - R區域中的任意1個的SNP的合計 64處SNP確定為識別標記。此外，例如從上述14品種中選擇一些品種作為識別對象時，也 可從上述64處SNP中選擇用於識別該識別對象品種所必需的SNP，而確定為識別標記。
[0152] 此外，例如僅將上述類似2品種作為識別對象品種時，可將Al - 2 - L區域及 Al - 2 - R區域中的任一個SNP確定為識別標記。而且，將如以下實施例1中記載的表4 中所示的14品種啤酒花中的斯拉德克（Slddek)、斯派爾特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特 南（Tettnang)及北釀（Northern Brewer)的5品種作為識別對象品種時，可將Al - 2 - L區域（序列號13)中存在的23處SNP(其中，11處為插入缺失部分）確定為識別標記。
[0153] 上述記載中，作為識別對象品種，將實施例1的表4中所示的以德國及捷克為原產 國的14種啤酒花的情況作為例子來進行說明，包含以美國為原產國的品種的更多品種的 識別方式希望參照實施例5。如表20中所示，方框中所包圍的22鹼基（鹼基號64 - 85) 被認定是普萊米特（Premiant)和薩米特（Summit),相對於此，宙斯（Zeus)中不存在其插 入序列。如此，插入序列的有無也可作為品種識別的要素。插入序列的長度無特別限制，例 如為19?25鹼基。而且，該插入序列中也確認有SNP (鹼基號64位、67位、75位），也可 將插入序列中的SNP作為識別標記。作為進一步的識別要素，該插入序列之後直到鹼基號 141的（CA)或（TA)的重複序列的長度也成為識別要素。例如，與普萊米特（Premiant)和 宙斯（Zeus)相比，薩米特（Summit)為12鹼基長的結構。
[0154] 此外，如上所述，將表4中所示的14品種啤酒花作為識別對象時，Bl區域（序列號 10) 中存在的10處SNP可分為7類型，包含以美國為原產國的品種（例如格林納（Galena)) 時，第245?248位的鹼基也為SNP，成為識別標記。
[0155] 而且，如上所述，將表4中所示的14品種啤酒花作為識別對象時，Cl區域（序列號 11) 中存在的29處SNP可分為3類型，包含以美國為原產國的品種（例如格林納（Galena)) 時，第 76 ?80、93、136、138、163、165、245、313、321、373、376、435、438位的鹼基也5咿，成為 識別標記。
[0156] 在其他方式中，本發明的識別標記也可使用來自2個以上不同品種啤酒花的基因 組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA來製備。優選為也可使用來自2個以上不同品種啤酒花的 基因組DNA。
[0157] 在製備用於使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA識別啤酒花品種的識別標記 時，製備識別標記的方法也可包含以下工序：
[0158] (a-Ι)從2個以上不同品種的啤酒花的組織中提取基因組DNA、線粒體DNA或葉綠 體DNA的工序；
[0159] (a-2)隨機切割由上述工序（a-Ι)的結果得到的DNA，篩選適合尺寸的片段的工 序；
[0160] (a-3)確定上述工序（a-2)中得到的DNA片段的鹼基序列的工序；
[0161] (b)基於由上述工序（a-3)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對各品種進行組裝 的工序；
[0162] (C)將由上述工序（b)的結果得到的重疊群及/或單拷貝進行品種間對比，進行品 種間不同的單核苷酸多態性（SNP)的搜索的工序；
[0163] ⑷根據上述工序（c)的SNP搜索的結果，選擇包含SNP的識別區域，設計用於擴 增該區域的引物的工序；
[0164] (f)使用上述工序（d)中設計的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為 模板擴增識別區域，確定識別區域的鹼基序列的工序；及
[0165] (g)將上述工序（f)中確定的識別區域的鹼基序列進行品種間對比，確定由用於 識別識別對象品種所必需的SNP的組合構成的識別標記的工序。
[0166] 工序（a-Ι)?（a-3)可通過本領域技術人員已知的方法進行。特別是為了得到大 量的DNA片段，在確定DNA片段的鹼基序列時，優選使用超高速DNA序列分析裝置。
[0167] 工序（b)?（d)及（f)?（g)可用作為上述記載的方式的通過轉錄組分析的方法 中說明的方法來進行。
[0168] 此外，通過轉錄組分析的方法中，基於不含內含子的mRNA搜索翻譯區域或5'或3' 非翻譯區域的SNP，相對於此，在使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA的方式中，進行 包含內含子的DNA的全部區域的SNP搜索。由此，使用基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA 時，可省略如下工序（e)，相當於在通過轉錄組分析的識別標記的製備方法中，確認通過用 於擴增含有SNP的區域而設計的引物的該區域的擴增的工序。
[0169] 使用上述轉錄組的方式及使用基因組DNA(核基因組）、線粒體DNA或葉綠體DNA 的方式中，首先，用以下2步方法製備識別標記，即在開始使用2種以上不同的啤酒花品種 進行SNP搜索而確定識別區域和引物後，使用全部識別對象品種，對比識別區域的鹼基序 列，確定適合識別標記的SNP，但也可從最初開始，使用全部識別對象品種進行SNP搜索而 確定識別區域和引物後，對比該識別區域的鹼基序列，確定適合識別標記的SNP。即在上述 記載的2個方式中，從開始即使用全部識別對象品種時，不需要確定識別對象品種的識別 區域的喊基序列的工序（f)。
[0170]
[0171] 本發明還提供用於識別啤酒花品種的方法。具體而言，啤酒花品種的識別方法還 可包含以下工序：
[0172] ⑴擴增來自被測物啤酒花的DNA中的包含品種識別區域的DNA片段的工序，該品 種識別區域包含由啤酒花品種間不同的至少一個單核苷酸多態性（SNP)構成的識別標記；
[0173] (ii)鑑定上述工序（i)中擴增的DNA片段中的單核苷酸多態性的基因型的工序；
[0174] (iii)將上述工序（ii)所鑑定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區域中的單核苷 酸多態性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應的區域中的單核苷酸多態性的基因型進 行對比，分析該區域中的單核苷酸多態性的基因型在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間 為一致或不一致的工序；
[0175] (iv)根據上述工序（iii)的分析結果，特定被測物啤酒花品種的工序。
[0176] 被測物啤酒花只要是被分類為學名Humulus lupulus的植物，無特別限定。例如， 可列舉識別標記的製備方法的項目中列舉的歐洲原產的啤酒花、美國原產的啤酒花，但不 限於這些。
[0177] 作為方式之一，被測物啤酒花為實施例1的表4中所示的14種啤酒花。
[0178] 對上述的工序（i)?（iv)，如下進行說明。
[0179] (i)擴增何含品種識別區域的DNA片段的工序
[0180] 包含品種識別區域的DNA片段：從需要識別品種的被測物啤酒花中提取基因組 DNA，以其為模板，使用可擴增具有作為基準的識別標記的區域的品種識別引物擴增包含品 種識別區域的DNA片段。基因組DNA的提取及DNA片段的擴增例如可根據上述中的"（f)確定識別區域的鹼基序列的工序及（g)確定識別對象品種的識別 標記的工序"的項目中（1)啤酒花的獲得?（3)DNA片段的擴增中所記載的方法或按照該方 法來進行。
[0181] 品種識別區域為包含通過上述識別標記的製備方法製備的識別標記的區域。構成 識別標記的單核苷酸多態性存在於多個區域中時，品種識別區域也可為該多個區域。此外， 存在多個構成識別標記的單核苷酸多態性時，品種識別區域可以為存在這些全部的1個區 域，還可以為具有多個存在至少1個單核苷酸多態性的區域。作為具體的品種識別區域，可 列舉包含
[0182] 序列號 9(A1 區域）的鹼基序列的第 74、77、87、103、116、118、121、125、134、135、 148、192、195、197、199、203、204、226、230、235、306、316、330、532 位；
[0183] 序列號 10(B1 區域）的鹼基序列的第 178、204、227、234、370、426、439、547、562、 624 位；
[0184] 序列號 11 (Cl 區域）的鹼基序列的第 3、13、17、87、88、129、130、131、132、133、134、 254、331、356、375、380、396、398、399、421、460、474、475、476、477、480、481、500、547 位（第 129?134位為插入缺失（indel)部分）；序列號12 (Al - 2 - L區域）的鹼基序列的第34、 101、118、124、164、168、171、186、187、188、189、190、191、192、193、194、392、398、399、459、 502位（第186?194及第399位為插入缺失（indel)部分）；
[0185] 序列號 13 (Al - 2 -L 區域）的鹼基序列的第 2、12、31、98、115、121、161、165、168、 183、184、185、186、187、188、189、190、191、389、395、396、456、499位（第12、183?191及第 396位為插入缺失（indel)部分）；
[0186] 序列號 14(A1 - 2 - R區域）的鹼基序列的第 1、2、3、5、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、20、21、25、26、27、28、29、30、31、33、35、36、37、38、41、42、43、44、46、47、48、50、51、 56、57、58、59、63、65、68、72、78、79、84、86、88、90、92、118、153、154、191、205、206、226、228、 2 33、254、289、315、 35〇、392、4〇5 位（第 57 ?59 及第 65 位為插入缺失（indel)部分）；
[0187] 序列號 15(A1 - 2 - R 區域）的鹼基序列的第 2、6、12、13、18、20、22、24、26、36、 52、87、88、125、139、140、160、162、167、188、223、249、273、284、326、339、421、437位（第437 位的插入缺失（indel)部分）；
[0188] 中記號η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域。
[0189] 在方式之一中，品種識別區域可為包含序列號9 (Al區域）的鹼基序列的一部分或 全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態性的至少一個的區域，品種識別區域也可為包含 序列號9的鹼基序列的區域。或品種識別區域可為包含序列號10 (BI區域）的鹼基序列的 一部分或全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態性的至少一個的區域，品種識別區域也 可為包含序列號10的鹼基序列的區域。或品種識別區域可為包含序列號11 (Cl區域）的 鹼基序列的一部分或全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分 的至少一個的區域，品種識別區域也可為包含序列號11的鹼基序列的區域。進而，品種識 別區域可為包含序列號12或13 (Al - 2 - L區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含 記號η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域，品種識別區域 也可為包含序列號12或13的鹼基序列的區域。此外，品種識別區域可為包含序列號14或 15 (Al - 2 - R區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含記號η所示的單核苷酸多態性 或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域，品種識別區域也可為包含序列號14或15的 喊基序列的區域。
[0190] 在其他方式中，品種識別區域可為選自以下區域的2個以上的區域，為包含序列 號9(A1區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態性的至少一個 的區域；為包含序列號10 (BI區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷 酸多態性的至少一個的區域；為包含序列號11 (Cl區域）的鹼基序列的一部分或全部且還 包含η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域；為包含序列號 12或13 (Al - 2 - L區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態性 或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域；及為包含序列號14或15 (Al - 2 - R區域） 的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的 至少一個的區域。或品種識別區域可為選自以下區域的2個以上、3個以上、4個以上或5個 全部的區域，包含序列號9(A1區域）的鹼基序列的區域、包含序列號10(B1區域）的鹼基 序列的區域、包含序列號11 (Cl區域）的鹼基序列的區域、包含序列號12或13 (Al - 2 - L區域）的鹼基序列的區域及包含序列號14或15 (Al - 2 - R區域）的鹼基序列的區域。
[0191] 而且在其他方式中，品種識別區域不僅為選自以下區域的1以上的區域，為包含 序列號9 (Al區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態性的至少 一個的區域，為包含序列號10 (BI區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單 核苷酸多態性的至少一個的區域及為包含序列號11 (Cl區域）的鹼基序列的一部分或全部 且還包含η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域，還可為以 下區域，為包含序列號12或13 (Al - 2 - L區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η 所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域或為包含序列號14或 15 (Al - 2 - R區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多態性或插 入缺失（indel)部分的至少一個的區域。或品種識別區域不僅為選自以下的1個以上、優選 為2個以上、進一步優選為3個全部的區域，包含序列號9 (Al區域）的鹼基序列的區域，包 含序列號1〇(Β1區域）的鹼基序列的區域及包含序列號11(C1區域）的鹼基序列的區域， 還可為以下序列，為包含序列號12或13 (Al - 2 - L區域）的鹼基序列的一部分或全部且 還包含η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域或為包含序列 號14或15(A1 - 2 - R區域）的鹼基序列的一部分或全部且還包含η所示的單核苷酸多 態性或插入缺失（indel)部分的至少一個的區域。或品種識別區域不僅為選自以下的1個 以上、優選為2個以上、進一步優選為3個全部的區域，包含序列號9 (Al區域）的鹼基序列 的區域、包含序列號10 (BI區域）的鹼基序列的區域及包含序列號11 (Cl區域）的鹼基序 列的區域，還可為以下區域，包含序列號12或13(A1 - 2 - L區域）的鹼基序列的區域或 包含序列號14或15 (Al - 2 - R區域）的鹼基序列的區域。
[0192] 品種識別引物可為製備識別標記時確定的可擴增識別區域的引物，還可為為了可 擴增含有識別標記的區域（品種識別區域）而另行設計的引物。構成識別標記的單核苷酸 多態性存在於多個區域中時，品種識別引物也可為可擴增各個區域的引物。此外，存在多個 構成識別標記的單核苷酸多態性時，品種識別引物可為可擴增存在這些全部的1個區域的 引物，還可為可分別擴增存在至少1個單核苷酸多態性的多個區域的多個引物。
[0193] 作為品種識別引物而可利用的引物中，包含由序列號1?8中記載的鹼基序列組 成的引物。工序（i)中用於DNA片段擴增的引物對的例子，可列舉選自以下的1個以上的 組合的引物對，由序列號1及2的鹼基序列組成的引物的組合、由序列號3及4的鹼基序列 組成的引物的組合、由序列號5及6的鹼基序列組成的引物的組合以及由序列號7及8的 鹼基序列組成的引物的組合。
[0194] 在其他方式中，工序（i)通過使用選自以下組合的1個以上、優選為2個以上、進 一步優選為3個全部的引物對的PCR反應來進行，由序列號1及2的鹼基序列組成的引物 的組合、由序列號3及4的鹼基序列組成的引物的組合以及由序列號5及6的鹼基序列組 成的引物的組合。
[0195] 在另一方式中，工序（i)不僅通過使用以下3個組合的引物對的PCR反應來進行， 由序列號1及2的鹼基序列組成的引物的組合、由序列號3及4的鹼基序列組成的引物的 組合以及由序列號5及6的鹼基序列組成的引物的組合，還通過使用由序列號7及8的鹼 基序列組成的引物的組合引物對的PCR反應來進行。
[0196] (ii)鑑定單核苷酸多傑件的某閔型的工序
[0197] 鑑定工序（i)中擴增的DNA片段中的單核苷酸多態性的基因型。
[0198] 在方式之一中，單核苷酸多態性的基因型的鑑定可通過鑑定包含品種識別區域的 DNA片段的鹼基序列來進行。鹼基序列的分析例如可根據上述中 的"（f)確定識別區域的鹼基序列的工序及（g)確定識別對象品種的識別標記的工序"的項 目中的（5)PCR產物的純化?（8)鹼基序列的分析中記載的方法或也可按照該方法來進行。
[0199] 在其他方式中，單核苷酸多態性的基因型的鑑定可通過使所擴增的DNA片段與構 成識別標記的檢測啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性的探針及/或引物接觸來進行。檢 測單核苷酸多態性的探針及/或引物可根據本領域技術人員公知的方法來設計及製備。使 用如此得到的探針的單核苷酸多態性的基因型的鑑定例如可利用DNA微陣列法等的本領 域技術人員公知的方法進行。此外，使用引物的單核苷酸多態性的基因型的鑑定除了根據 序列分析以外，還可根據SNaPshot (註冊商標）法（Life Technologies公司）等，利用使 用如下設計的引物的鑑定方法，根據應檢測的單核苷酸多態性，產生長度不同的擴增產物。 而且，使用探針及引物的單核苷酸多態性的基因型的鑑定可利用並用MGB(Minor Groove Binder)探針（Life Technologies公司）和設計為夾著該探針的引物的實時PCR法等。
[0200] (iii)對比、分析品種識別區域中的單核苷酸多傑件的某閔型的工序
[0201] 工序（iii)中，將被測物啤酒花DNA中的品種識別區域中的構成識別標記的單核 苷酸多態性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應的區域中的單核苷酸多態性的基因型 進行對比。且在該對比中，分析構成識別標記的單核苷酸多態性的基因型在被測物啤酒花 和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
[0202] 對比可通過視覺檢查、數學計算來進行。或也可使用電腦程式。此外，對比也可 通過將包含品種識別區域的DNA片段的鹼基序列與已知啤酒花品種DNA所對應的區域的鹼 基序列進行對比來進行。對比可通過通常在被測物的基因上具有的單核苷酸多態性的檢驗 (SNP分型）中所採用方法來進行。
[0203] 以下，將直接對比鹼基序列時的具體的對比方法使用分析用電腦程式的情況進 行例示。即準備包含表示通過上述識別標記的製備方法得到的識別標記的鹼基的數據和表 示所述鹼基的鹼基序列位置的數據的識別標記表，存儲到SeqScape (Life Technologies) 等的分析用電腦程式運行的計算機中。所存儲的識別標記表可為1個或多個。且將包含 表示從作為被測物的啤酒花中得到的鹼基的數據的被測物鹼基序列的序列表存儲到所述 計算機中。
[0204] 且參照所述識別標記表的表示所述鹼基序列位置的數據，將表示被測物鹼基序列 的序列表與所述識別標記表之間對應的鹼基序列位置上的鹼基的數據用所述計算機進行 對比。對比通過將運用所述分析用電腦程式的兩組鹼基序列進行比對來進行。
[0205] (iv)特定被測物啤酒花品種的工序
[0206] 工序（iv)中，根據工序（iii)的分析結果，特定被測物啤酒花品種。
[0207] 具體而言，分析相當於被測物鹼基序列中的識別標記的位點的鹼基與所述識別標 記的鹼基是否完全一致，完全一致時，被測物特定為所述識別標記的品種。
[0208] 如此，使用本發明的識別標記時，可特定作為被測物的啤酒花品種。使用計算機進 行分析時，預先記錄具有與多個品種相關的識別標記的區域的鹼基序列，通過將被測物的 鹼基序列依次與各品種的鹼基序列進行對比？分析，可簡便且迅速特定作為被測物的啤酒 花品種。
[0209] 另外，通過將作為識別標記而確定的特定的鹼基著色，也可容易地進行上述對比。 即首先，將具有著色的對照鹼基（識別標記）的鹼基序列與被測物的鹼基序列進行比對後， 僅將著色的鹼基抽出，製成將兩者進行對比的表。由此可容易地識別鹼基的種類和存在的 位置是否完全一致，可容易的辨別作為被測物的啤酒花是否為其識別標記的品種。另外，因 該方法可同時分析多個被測物，所以優選。
[0210]
[0211] 本發明還提供如下核酸，其包含通過製備上述識別標記的方法製備的識別標記的 至少一部分。
[0212] 在此，"核酸"是指由2種以上的核苷酸構成的脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸 (RNA)。本領域技術人員應理解的是，對於DNA的鹼基序列中記載的核酸意指RNA時，可將 DNA的鹼基序列的胸腺嘧啶取代為尿嘧啶。此外，核酸可為單鏈，也可為與互補鏈雜交的雙 鏈。
[0213] 具體而言，包含識別標記的至少一部分的核酸也可為如下核酸，包含選自以下的 鹼基序列的一部分，序列號9 (Al區域）、序列號10 (BI區域）、序列號11 (Cl區域）、序列號 12或13 (Al - 2 - L區域）、序列號14或15 (Al - 2 - R區域），且在該喊基序列中包含記 號η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個。優選為包含識別標記的 至少一部分的核酸也可為包含選自以下鹼基序列的核酸，序列號9 (Al區域）、序列號10 (BI 區域）、序列號11 (Cl區域）、序列號12或13 (Al - 2 - L區域）及序列號14或15 (Al - 2 一 R區域）。
[0214]
[0215] 本發明也提供如下引物，其可擴增包含上述識別標記的至少一部分的核酸。
[0216] 引物只要是設計為可擴增包含上述識別標記的至少一部分的核酸的引物，無特別 限定。
[0217]
[0218] 本發明還提供如下探針，其用於檢測構成識別標記的單核苷酸多態性。
[0219] 探針為可檢測例如選自序列號9 (Al區域）、序列號10 (BI區域）、序列號11 (Cl區 域）、序列號12或13 (Al - 2 - L區域）及序列號14或15 (Al - 2 - R區域）的鹼基序列 中η所示的單核苷酸多態性或插入缺失（indel)部分的至少一個。
[0220]
[0221] 在擔心不同品種混入時，利用本發明的識別標記，例如可用以下所述的方法檢測 不同品種混入。
[0222] 其為檢測啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以下工序：
[0223] ⑴擴增從被測物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識別區域的DNA片段的 工序，該品種識別區域包含由啤酒花品種間不同的至少一個單核苷酸多態性（SNP)構成的 識別標記；
[0224] (ii)分析上述工序⑴中擴增的DNA片段中的品種識別區域的鹼基序列，得到測 序數據的工序；
[0225] (iii)將上述工序（ii)中得到的測序數據中的構成識別標記的單核苷酸多態性 位點的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息進行對比的工序；及
[0226] (iv)確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 測序數據的單核苷酸多態性位點的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息一 致時，判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點 的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，判斷為有不同品種混入。
[0227] 而且，通過在（iv)之後繼續進行以下的工序，可進行混入品種的推斷或特定。即 包含
[0228] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的 信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，由上述工序（ii)中得到的 測序數據的單核苷酸多態性位點中出現的來自正常品以外的信息特定其鹼基的工序；及
[0229] (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態性位點的與正常品不同的鹼基與識 別標記對照，從而推斷或特定混入品種的工序。
[0230] 此外，通過進一步在（iv)之後繼續進行以下的工序，可分析混入比例。即包含
[0231] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的 信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，由上述工序（ii)中得到的 測序數據的單核苷酸多態性位點中出現的來自正常品以外的信息特定其鹼基，並求出混入 比例的工序；及
[0232] (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態性位點的與正常品不同的鹼基與識 別標記對照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
[0233] 在此，測序數據的單核苷酸多態性位點的信息是指例如由測序的結果得到的單核 苷酸多態性位點的形狀、數值，具體而言，可列舉由測序的結果得到的單核苷酸多態性位點 的電泳圖（測序的時得到的表示各鹼基的顏色分開的波形），將擴增片段克隆到大腸桿菌 等中，對所得到的多個克隆進行測序，通過對這些序列進行對比而得到的單核苷酸多態性 位點上的鹼基的含有比率等。
[0234] 此外，此處的正常品是指為單一品種，指已確立構成識別標記的單核苷酸多態性 位點的信息的啤酒花品種。根據情況，所謂正常品的記載也有時指包含已確立構成識別標 記的單核苷酸多態性位點的信息的僅單一品種的試樣。
[0235] 使用電泳圖檢測不同品種混入時，由於在作為被測物的啤酒花試樣的電泳圖中重 疊出現與正常品的波形不同的其他波形，所以，可確認不同品種的存在。且通過由單核苷酸 多態性位點上出現的與正常品不同的波形特定其鹼基，與識別標記對照，從而可推斷或特 定混入品種。只要各識別標記（SNP)中的其品種上特徵性的鹼基完全被確認，即可特定混 入品種。而且，通過將這些波形的重疊狀況、高度等與另外實施的預先已知混入比例的其他 品種混合品的分析結果進行對比，可求出不同品種大約的混入比例。
[0236] 此外，在使用將擴增片段克隆到大腸桿菌等中而得到的多個克隆的測序數據時， 通過將其多個克隆的序列進行比對，求出各單核苷酸多態性位點的鹼基的含有比率，可檢 測不同品種的混入。即如未混入不同品種，則所有位點均與正常品的鹼基為同樣鹼基的含 有比率應為100*%，在不同品種混入時，與正常品的喊基同樣的喊基不為100*%，可看出其 他的鹼基的含有比率。如此，通過將與正常品的鹼基不同的鹼基與識別標記對照，可特定混 入品種，求出含有比率。但是，在大腸桿菌上克隆的方法因需要分析大量的克隆，所以，會產 生需要大量勞力和時間的操作。
[0237] 作為求出各單核苷酸多態性位點的鹼基的含有比率的其他方法，通過將包含作為 被測物的啤酒花試樣的品種識別區域的DNA片段使用具有下一步驟中必需的附加序列的 特異性引物進行擴增，並將其用新一代測序儀大量測序，將這些進行比對，求出各單核苷酸 多態性位點的鹼基的含有比率，從而可更準確地進行混入品種的特定和求出混入比率。
[0238] 此外，還具有將引物在馬上進行多態性（SNP)分析之前進行設定，對僅使一鹼基 伸長而摻入的鹼基的種類進行多態性分型的方法。例如，稱為SNaPshot (註冊商標）法 (Life Technologies公司）的方法。此外，還有可使用MGB(Minor Groove Binder)探針 (Life Technologies公司），用實時PCR法對不同品種進行定量分析的方法。
[0239] 實施例
[0240] 以下，通過實施例進一步具體說明本發明。但本發明不限於這些實施例。
[0241] 實施例1識別標記的制各
[0242] (a)轉錄糹目分析
[0243] 為了得到啤酒花品種識別技術開發中必需的品種間DNA多態性區域，認為需要使 用新一代測序儀得到大量的測序數據，從其中廣泛搜索SNP (檢測人基因組時的SNP的頻率 認為是 1 個/100 - 300 喊基；http://www.eubios.info/hmba ck.htm)。因此，本
【發明者】著 眼於轉錄組。轉錄組分析與以全部基因組為對象時相比，以大約1/100左右的數據處理即 可實現，因而可控制交貨期、成本。而且雖然與全基因組相比可以說為少數，然而在我們的 計算中，可利用1萬5千個SNP數據。因此，設想得到了多品種識別所必需的SNP，利用本方 法，實施品種間的SNP分析。
[0244] (1)試樣的採集?保管
[0245] 從下一項表4中記載的識別對象品種中選擇3品種（從方便上，記為品種A、B、C)， 採集該品種的啤酒花鮮葉。即用以下所示的方法進行採樣·保管。
[0246] a.組織一儘可能採集嫩葉（小、黃綠色、柔軟）。但表面上附著白色異物的葉除外。
[0247] b.方法一為了防止RNAse的附著，用帶上手術用手套的手採集葉。採集的同時，在 防止RNA分解用的試劑中浸漬。
[0248] C.保管一常溫下，至少1星期左右RNA為穩定，但到進行轉錄組分析及SNP序列分 析的期間，儘可能放入冰箱內保管。
[0249] (2)轉錄鉬分析
[0250] 對於如上所述採集的試樣，委託Eurofins公司進行轉錄組分析。具體而言， 進行了總RNA的提取、mRNA的純化、cDNA文庫的構建、表達量的差的均一化、大小調整 (500?700bp)、GS FLX測序儀用的cDNA文庫的製備、通過使用"Titanium Chemistry"的 Roche/454Genome Sequencer FLX 進行測序。
[0251] (b)糹目裝（重疊群的制各）
[0252] 使用轉錄組數據的SNP分析
[0253] 使用通過上述轉錄組分析而得到的測序數據，委託Eurofins公司進行重疊群的制 備。具體而言，基於各啤酒花品種的DNA片段的鹼基序列，進行聚類和組裝。其結果，從各 品種中得到合計為約42000?45000種的重疊群（cDNA的一部分）的鹼基序列。其中，具 有IOOObp以上的長度的重疊群為約4500?6700個。
[0254]【表1】
[0255]

【權利要求】
1. 一種方法，其為啤酒花品種的識別方法，其特徵在於，所述方法包含以下工序： (i) 擴增來自被測物啤酒花的DNA中的包含品種識別區域的DNA片段的工序，該品種識 別區域包含由啤酒花品種間不同的至少一個單核苷酸多態性即SNP構成的識別標記； (ii) 鑑定上述工序（i)中擴增的DNA片段中的單核苷酸多態性的基因型的工序； (iii) 將上述工序（ii)所鑑定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區域中的單核苷酸多 態性的基因型與已知啤酒花品種DNA所對應的區域中的單核苷酸多態性的基因型進行對 t匕，分析該區域中的單核苷酸多態性的基因型在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一 致或不一致的工序； (iv) 根據上述工序（iii)的分析結果，特定被測物啤酒花品種的工序。
2. 根據權利要求1中所述的方法，其特徵在於，工序（ii)如下進行，鑑定工序（i)中擴 增的DNA片段中的品種識別區域的鹼基序列，且 工序（iii)如下進行，將工序（ii)所鑑定的被測物啤酒花DNA中的品種識別區域的鹼 基序列與已知啤酒花品種DNA所對應的區域的鹼基序列進行對比，分析該區域中的識別標 記在被測物啤酒花和已知啤酒花品種之間為一致或不一致。
3. 根據權利要求1中所述的方法，其特徵在於，工序（ii)為如下工序，通過使工序（i) 中擴增的DNA片段與檢測啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性的探針及/或引物接觸，而 鑑定單核苷酸多態性的基因型。
4. 根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為包含通過包 含以下工序的方法而製備的識別標記的區域： (a) 使用2個以上不同品種的啤酒花，進行轉錄組分析的工序； (b) 基於由上述工序（a)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對各品種進行組裝的工 序； (c) 將由上述工序（b)的結果得到的重疊群及/或單拷貝進行品種間對比，進行品種間 不同的單核苷酸多態性即SNP的搜索的工序； (d) 根據上述工序（c)的SNP搜索的結果，選擇包含SNP的區域，設計用於擴增該區域 的引物的工序； (e) 通過使用上述工序（d)中設計的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認上述 工序（d)中選擇的區域可擴增，確定該鹼基序列，從而確定識別區域和可擴增該識別區域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為模板 擴增識別區域，確定識別區域的鹼基序列的工序；及 (g) 將上述工序（f)中確定的識別區域的鹼基序列進行品種間對比，確定由用於識別 識別對象品種所必需的SNP的組合構成的識別標記的工序。
5. 根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為包含選自序 列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個以上的 鹼基序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態性或 插入缺失部分的至少一個的區域。
6. 根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為選自包含序 列號9表不的喊基序列的區域、包含序列號10表不的喊基序列的區域、包含序列號11表不 的喊基序列的區域、包含序列號12表不的喊基序列的區域、包含序列號13表不的喊基序列 的區域、包含序列號14表不的喊基序列的區域及包含序列號15表不的喊基序列的區域中 的1個以上的區域。
7. 根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其特徵在於，品種識別區域為不僅包含以 下：包含序列號9表不的喊基序列的區域、包含序列號10表不的喊基序列的區域及包含序 列號11表示的鹼基序列的區域的3種區域，且包含以下：序列號12及/或序列號14表示 的鹼基序列的一部分或全部，且還包含圖4中特定的單核苷酸多態性或插入缺失部分的至 少1個的區域。
8. 根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其特徵在於，工序（i)通過使用以下引物 對的PCR反應來進行，為選自序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的組合、序 列號5及序列號6的組合及序列號7及序列號8的組合的引物對。
9. 根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其特徵在於，工序（i)通過使用以下引物 對的PCR反應來進行：不僅為以下：序列號1及序列號2的組合、序列號3及序列號4的組 合以及序列號5及序列號6的組合的3種引物對，還為序列號7及序列號8的組合的引物 對。
10. -種方法，其為由啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性的組合構成的識別標記的 製備方法，其特徵在於，所述方法包含以下工序： (a) 使用2個以上不同品種的啤酒花，進行轉錄組分析的工序； (b) 基於由上述工序（a)的結果得到的DNA片段的鹼基序列，對各品種進行組裝的工 序； (c) 將由上述工序（b)的結果得到的重疊群及/或單拷貝進行品種間對比，進行品種間 不同的單核苷酸多態性即SNP的搜索的工序； (d) 根據上述工序（c)的SNP搜索的結果，選擇包含SNP的區域，設計用於擴增該區域 的引物的工序； (e) 通過使用上述工序（d)中設計的引物，以從啤酒花中提取的DNA為模板，確認上述 工序（d)中選擇的區域可擴增，確定該鹼基序列，從而確定識別區域和可擴增該識別區域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中確定的引物，以從識別對象品種的啤酒花中提取的DNA為模板 擴增識別區域，確定識別區域的鹼基序列的工序；及 (g) 將上述工序（f)中確定的識別區域的鹼基序列進行品種間對比，確定由用於識別 識別對象品種所必需的SNP的組合構成的識別標記的工序。
11. 一種核酸，其特徵在於，包含通過權利要求10中所述的方法製備的識別標記的至 少一部分。
12. -種核酸，其特徵在於，該核酸包含啤酒花的品種識別區域，而且，包含選自序列號 9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號14及序列號15中的1個以上的鹼基 序列的一部分或全部，且還包含圖1、圖2、圖3、圖4及圖6中特定的單核苷酸多態性或插入 缺失部分的至少一個。
13. -種引物，其特徵在於，設計為可擴增權利要求11或12中所述的核酸。
14. 一種引物，其特徵在於，由序列號1?8中任一個所記載的鹼基序列組成，在此，該 引物用於啤酒花的品種識別。
15. -種探針，其特徵在於，用於檢測通過權利要求10中所述的方法鑑定的品種識別 區域中的啤酒花品種間不同的單核苷酸多態性。
16. -種探針，其特徵在於，可在選自序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號 13、序列號14及序列號15中的1個以上的鹼基序列中，檢測圖1、圖2、圖3、圖4或圖6中 特定的位置中的至少1個單核苷酸多態性或插入缺失位點，且由此檢測啤酒花品種間不同 的單核苷酸多態性。
17. -種方法，其為檢測啤酒花試樣中的不同品種混入的方法，所述方法包含以下工 序： (i) 擴增從被測物啤酒花試樣中提取的DNA中的包含品種識別區域的DNA片段的工序， 該品種識別區域包含由啤酒花品種間不同的至少一個單核苷酸多態性即SNP構成的識別 標記； (ii) 分析上述工序⑴中擴增的DNA片段中的品種識別區域的鹼基序列，得到測序數 據的工序； (iii) 將上述工序（ii)中得到的測序數據中的構成識別標記的單核苷酸多態性位點 的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息進行對比的工序；及 (iv) 確定啤酒花試樣中有無不同品種混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的測序 數據的單核苷酸多態性位點的信息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息一致時， 判斷為無不同品種混入，或上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的信 息與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，判斷為有不同品種混入。
18. 根據權利要求17中所述的方法，其特徵在於，進一步包含接在工序（iv)後的以下 工序： (v) 上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的信息 與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，由上述工序（ii)中得到的測序 數據的單核苷酸多態性位點中出現的來自正常品以外的信息特定其鹼基的工序；及 (vi) 將上述工序（v)中特定的單核苷酸多態性位點的與正常品不同的鹼基與識別標 記對照，從而推斷或特定混入品種的工序。
19. 根據權利要求17中所述的方法，其特徵在於，進一步包含接在工序（iv)後的以下 工序： (v)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的測序數據的單核苷酸多態性位點的信息 與正常品所對應的單核苷酸多態性位點的信息不一致時，由上述工序（ii)中得到的測序 數據的單核苷酸多態性位點中出現的來自正常品以外的信息特定其鹼基，並求出混入比例 的工序；及 (Vi)將上述工序（V)中特定的單核苷酸多態性位點的與正常品不同的鹼基與識別標 記對照，從而推斷或特定混入品種和其混入比例的工序。
20. 根據權利要求1?9中任一項所述的方法，其特徵在於，工序（iii)中包含有無 19?25鹼基的插入序列的分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104350151SQ201380029975
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年6月7日 優先權日:2012年6月7日
【發明者】山內啟正, 古久保進 申請人:三得利控股株式會社