人工合成的美洲商陸抗病毒蛋白(pap)抗原、抗體及其製備方法、應用的製作方法

2023-12-05 11:25:01 1

專利名稱：人工合成的美洲商陸抗病毒蛋白(pap)抗原、抗體及其製備方法、應用的製作方法
技術領域：
本發明專利屬於生物學和生物技術領域，特別是涉及利用人工合成的多肽作為抗原，製備得到美洲商陸抗病毒蛋白多克隆抗體的技術。
背景技術：
美洲商陸抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein, PAP)是從美洲商陸 (Phytolaccaamericana L.)植株春天葉片中分離出的單鏈(I型)核糖體失活蛋白 (Ribosome InactivatingProteins, RIPs)，分子量約為 30kD。RIPs 具有獨特的 rRNA-N 糖苷酶活性，能夠水解真核生物核糖體28S大亞基RNA GAGA莖環(stemloop)結構上特定位點的腺嘌呤殘基，從而使核糖體失活，幹擾核糖體與延伸因子的結合，繼而抑制蛋白質的生物合成(Irvin, J. D. &Uckun, F. Μ. Pokeweed antiviral protein :ribosome inactivation and therapeutic applications. Pharmacol. Ther. 1992，55 :279-302)。自Duggar等1925年發現商陸中存在著一種潛在的能阻礙植物病毒傳播的因子，Kassanis等從美洲商陸葉片中分離、純化了該阻礙因子，並初步描述了其特性後，人們開始了一系列研究。研究發現PAP是目前所有Rib中最為有效的抗病毒蛋白，低濃度就具有很強的抗性。其不僅對7個病毒組的7種植物病毒有抑制作用，還對包括愛滋病毒(human immunodeficiencyvirus 1，HIV 1)在內的多種動物病毒、真菌、細菌的侵染有一定的抑制作用，在體外，該蛋白可以阻礙脊髓灰質炎病毒和流感病毒的複製，在體外無細胞蛋白質合成系統(兔網織紅細胞)中，可以阻礙真核生物蛋白質的合成(Kassanis， B.，&A.Kleczkowski. The isolationand some properties of a virus-inhibiting protein from Phytolacca esculents. J.Gen. Microbiol. Academic Press，N. Y. 1948 ； Tomlinson. J. A. et al. , The inhibition ofinfection by cucumber mosaic virus and influenza virus by extract of Phytolaccaamericana,J. Gen. Virol 1974，22，225-232 ; Aron G M， Irvin J D， Antimicrob. AgentsChemother. 1980,17 :1032-1033 ；Zarling J M， Moran P A， Haffar 0 et al.Inhibitionof HIV replication by pokeweed antiviral protein targeted to CD4 cells by monoclonalantibodies· Nature，1990，347 :92-95 ； Chen Z C, White R F,Antoniw J F，et al. Effectof pokeweed antiviral protein (PAP) on the infection of plant viruses. Plant Pathology,1991,40 :610-612 ；Oalson， M.S. Ramakrishnan, T. Anand, Ribosomal inhibitory proteins from plants inhibits HIV—lrepIication in acutely infected peripheral bloodmononucIear cells， AIDS Res. Hum. Retrovir. 1991，7，1025-1030)。正是由於PAP有著這種廣譜性的抑制危害動、植物及人體的病原真菌、細菌和病毒的作用，因此其越來越引起人們的好奇和重視，不斷的促使人們對其進行深入研究，並希望在不久的將來在農業和醫學領域發揮其特殊的作用和實用價值。成熟的PAP全長262個胺基酸，其中N端22個胺基酸組成信號肽，負責將PAP從核糖體向細胞膜運輸，C端25個胺基酸為毒性區(Nonzingo, A. F. E. J. Collons, The 2.5Astructure of plokeweed antiviral protein, J. Mol. Biol. 1993,233,705-715)。 缺失C端毒性區的PAP突變體對細胞的毒性很低，仍具有較強的抗病毒活性(Jennifer K. Lodge, Nilgun Ε. Turner. Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressingpokeweed antiviral protein. 1993,90 :7089-7093.)。Lodge 等 Mf PAP 基因導入菸草和馬鈴薯，獲得的轉基因植株及其後代具有廣譜的抗病毒特性，包括對機械和蚜蟲傳播的病毒如馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y， PVY)、馬鈴薯卷葉病(Potato leaf roll virus, PLRV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、菸草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、苜蓿花葉病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)等均有抗性(Jennifer K. Lodge, Nilgun E. Turner. Broad-spectrum virus resistance in transgenicplants expressing pokeweed antiviral protein. 1993,90 7089-709；3)。國內學者在油菜、番茄等作物上也獲得了對蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、TMV、CMV、PVX有抗性的轉基因植株(張海燕，黨本元，周奕華等用微束雷射穿刺技術將PAP導入油菜獲得抗病毒轉基因植株中國雷射，1999，沈(1) :1053-1056.；傅道林，王蘭嵐，張海燕等用微束雷射穿刺技術將商陸抗病病毒蛋白(PAP) cDNA導入馬鈴薯的研究光子學報，2000，四(11) :970-974.)。本實驗室也克隆到了缺失C、N端的PAP基因，並構建原核生物、真核生物表達載體，通過室內搖瓶發酵製備了 PAP，並分別將缺失型PAP基因導入小麥、玉米、棉花和矮牽牛，獲得了抗病植株(陳定虎，王錫鋒，李莉等，美洲商陸抗病毒蛋白在畢赤酵母中的表達及其抗病毒活性的測定[J]。農業生物技術，2003，11 O) 183-186 ；周倩，王錫鋒，李莉，周廣和，高必達.2003畢赤酵母Mut+和Muts重組子表達美洲商陸抗病毒蛋白基因的比較，植物病理學報，33( :425-似8。)。在PAP基因及製劑的研究應用過程中，經常需要明確PAP基因是否表達，以及表達的情況。比如在轉基因植株的檢測、PAP原核和真核表達產物的檢測、PAP與寄主植物的互作因子等研究中，都需要高效價、特異性的PAP抗血清。Schlick等從美洲商陸植株中分離、純化了 PAP，製備PAP的多克隆抗血清，能有效的檢測PAP，但由於PAP在美洲商陸 (Phytolacca americana)植株內的含量有限，純化步驟繁瑣、費時，使得PAP的提取非常困難(Jean-LucSchlick, Philippe Dulieu, Development of a double sandwich ELISA able to discriminatebetween free PAP and complexed PAP in leaf extracts. Plant Science 1999，140 :1_8.)。本實驗室曾利用原核表達產物製備了多克隆抗血清，但特異性差，不能滿足轉基因植株和PAP表達產物檢測的需要。

發明內容
本發明應用人工合成多肽與具有免疫原性的載體蛋白(馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白)的偶聯產物作為抗原，製備得到了兔多克隆抗體，該抗體可應用於PAP製劑、PAP 基因原核和真核表達產物、轉基因再生植株、PAP與寄主植物的互作因子等研究中，能夠採用免疫學手段檢測PAP及其基因的表達情況，為PAP的檢測提供物質基礎。人工合成的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗原，包括具有免疫原性的載體蛋白和與其偶聯的人工合成的多肽，所述多肽的胺基酸序列為SEQ ID NOl或/^PSEQ ID N02。所述具有免疫原性的載體蛋白為馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin, KLH)。所述的抗原製備得到的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗體。其中抗體為兔多克隆抗體。所述的抗體的製備方法，其特徵在於將權利要求1或2所述的抗原免疫兔子，然後取其靜脈血或全血，分離抗血清純化即可。所述抗原採用下述方法製得人工合成SEQ ID NOl或/和SEQ ID N02所示的多肽，將其與馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白偶聯得到。所述免疫的程序為1)首免600ug/只，將權利要求1或2所述的抗原溶液加等體積弗氏完全佐劑乳化後皮下6點注射，幻二免、三免、四免分別在第21、35和49天注射，每次400ug/只，權利要求1或2所述的抗原溶液加等體積弗氏不完全佐劑乳化後皮下4點注射。所述兔子為紐西蘭大白兔。所述的美洲商陸抗病毒蛋白抗體在天然的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)或缺失型 PAP基因的表達產物或轉基因美洲商陸抗病毒蛋白基因的植株檢測中的應用。本發明根據本實驗室改造的缺失了 N端信號肽及C端毒性區的美洲商陸抗病毒蛋白(缺失型PAP)基因片段推測的胺基酸的序列(Genbank No. AF338910)，序列如SEQ ID N03所示，通過在GenBank的BLAST比對，選擇免疫原性和親水性均較好、線性表位可能性大、且預測無二級結構的多肽序列(SEQ. ID NO. 1 :DISGTERQDVETTLC和SEQ. IDN0. 2 CRYPTLESKAGVKSR)。人工合成多肽片段，並與具有免疫原性的載體蛋白匙孔嘁血藍蛋白偶聯，免疫紐西蘭大白兔，製備得到了抗體，該抗體可特異性的檢測美洲商陸植株內的天然 PAP、缺失型PAP基因在原核和真核生物內的表達產物、以及其在轉基因植物的表達情況。本發明的抗原有三個，其中的一個是採用SEQ ID NOl所編碼的多肽與馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白偶聯得到，另一個是採用SEQ ID N02所編碼的多肽與馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白偶聯得到，還有一個是採用上述兩個抗原的混合體作為抗原。上述抗原分別製備得到了三種兔多克隆抗體antiPAPl、antiPAP2和antiPAP3，其中antiPAPl效價最高，說明SEQ ID NOl所示的多肽偶聯得到的抗原，其免疫原性最好。應用該抗體檢測美洲商陸植株、缺失型PAP基因在酵母中的表達產物、及轉基因矮牽牛中的 PAP表達情況，均獲得了成功。


圖1. SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化後的抗體其中泳道1 中分子量蛋白非預染MarkerIV泳道2 抗原親和純化抗SEQ ID NOl多肽的兔多克隆抗體(antiPAPl)圖2抗體的特異性檢測其中泳道1 預染SDS-PAGE低分子量標準蛋白質；泳道2 陰性對照(非轉基因矮牽牛植株)；泳道3 轉缺失型PAP基因矮牽牛植株；泳道4 缺失型PAP基因在酵母中的表達產物圖3轉缺失型PAP基因矮牽牛植株的檢測其中泳道1 預染SDS-PAGE低分子量標準蛋白質；泳道2 陰性對照(非轉基因矮牽牛植株)；泳道3 美洲商陸春天植株；泳道4-9 轉缺失型PAP基因矮牽牛植株；泳道10 缺失型PAP基因在酵母中的表達產物
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。下述實施例中所用的方法如無特殊說明均為常規方法。試劑和儀器用於多肽偶聯的載體蛋白馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白試劑盒(ImjectR MaleimideActivated mcKLH Kit)、免疫動物的完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為Pierce ^W] (PierceBiotechnology, USA) /^[Ρπ。 Μ ^ 青白勺 CNBr—activated Sepharose 4B購自GE Healthcare Life Science, Protein A凝膠為北京康為世紀生物科技有限公司 (CffBIO)產品。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(H+L)購自Promega公司。TMB 底物顯色試劑盒OOx)、中分子量蛋白非預染Marker IV為北京康為世紀生物科技有限公司(CWBIO)產品。HD-4層析工作站出自上海滬西儀器廠，層析柱為Wiamacia產品，DEM-3 型自動洗板機為北京拓普分析儀器有限責任公司產品，酶標儀為BIO-RAD (680型)產品。免疫用紐西蘭大白兔，體重約^g，來自北京市海澱區興隆實驗動物養殖廠。PAP在酵母中的表達產物和轉基因矮牽牛植株保存在本實驗室，可以向公眾提供。其它生化試劑均為進口或國產分析純。實施例11. 1多肽序列的設計和合成根據本實驗室改造的缺失型PAP基因片段(缺失了 N端信號肽及C端致毒區)推測的胺基酸的序列(Genbank No. AF338910) (SEQ ID N03)，通過BLAST與Genbank檢索的序列進行同源比對分析，利用DNAMar和Biosum等分析軟體進行蛋白的二級結構和抗原表位預測，選擇了 2個免疫原性和親水性均較好、線性表位可能性大、且預測無二級結構的多肽序列，SEQ ID NOl :DISGTERQDVETTLC 和 SEQ ID N02 :CRYPTLESKAGVKSR。多肽由上海吉爾多肽有限公司(Shanghai GL peptide Ltd.)合成。1. 2多肽偶聯製得抗原由於小分子多肽沒有免疫原性，需要偶聯到一個具有免疫原性的載體蛋白上， 將偶聯物作為抗原，用於免疫動物。本發明用於多肽偶聯的載體蛋白為匙孔嘁血藍蛋白 (Keyhole LimpetHemocyanin，KLH)，偶聯步驟按照試劑盒(ImjectR Maleimide Activated mcKLH Kit)的說明進行，偶聯結束後通過電泳檢測偶聯效率。1.3抗血清的製備1. 3. 1動物免疫免疫前，每隻兔子耳緣靜脈取血0. 5-lml，分離抗血清，4°C保存，備用。用IXPBS緩衝液將偶聯物稀釋到lmg/ml，用於免疫紐西蘭大白兔。分別以序列為 SEQID NOUSEQ ID N02、SEQ ID NOl/SEQ ID N02的多肽偶聯物為抗原免疫三隻動物，動物編號分別為R01、R02和R03，獲得的血清分別編號為antiPAPl、antiPAP2、antiPAP3。每隻兔子總共免疫4次。1)首免600ug/只，抗原溶液加等體積弗氏完全佐劑乳化後皮下6點注射。2、二免、三免、四免分別在第21、35和49天注射，每次400ug/只，抗原溶液加等體積弗氏不完全佐劑乳化後皮下4點注射。1. 3. 2抗血清的效價測定和收集4次免疫結束後10天，每隻兔子耳緣靜脈取血0. 5-lml，分離抗血清，間接ELISA 檢測免疫後血清效價。抗原為人工合成的多肽，一抗為免疫後的抗血清。抗血清分別稀釋 200 倍、1000 倍、5000 倍、25000 倍、125000 倍、625000 倍、3125000 倍。空白對照為 PBS 緩衝液，陰性對照為免疫前血清，稀釋10000倍。二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG，稀釋10000 倍使用。當效價達到要求後，以心臟穿刺的方式採取兔子的全血，分離PAP抗血清。1. 3. 3抗血清的效價測定間接ELISA檢測步驟1)以2ug/ml的人工合成的PAP多肽包被酶標板，IOOul/ 孔，4°C冰箱過夜J)PBST洗滌3次，每次振板5秒；3)5%脫脂奶封閉，300111/孔，37°C孵育 2h ；4)PBST洗滌3次力)將稀釋後的待檢測抗血清(一抗)或免疫前血清加入酶標板中， IOOul/孔，37°C，孵育Ih ；6) PBST洗滌3次；7)加入二抗，即HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋 10000倍，IOOul/孔，370C，孵育40min ；8) PBST洗滌3次；9)加入現配的TMB底物顯色工作液，IOOul/孔，顯色IOmin ；10)加入2M H2SO4終止顯色反應，50ul/孔；11)酶標儀測450nm 波長的OD值。1. 3. 4PAP特異性抗體IgG的純化和純度測定採用抗原親和純化方法從PAP抗血清中純化特異性抗體IgG。抗體純化採用 ftOteinA凝膠和CnBr-activated Sepharose 4B,以人工合成的PAP多肽為抗原，使其與親和層析填料偶聯製備親和柱，層析純化與抗原特異性結合的抗體，並進行洗脫、回收。純化後的PAP抗體保存在0. OlM PBS, pH7. 2中，用蛋白定量檢測儀測定特異抗體濃度。抗體純化由北京康為世紀生物科技有限公司(CWBIO)完成。採用SDS-PAGE電泳檢測純化後抗體的純度。SDS-PAGE電泳的上樣量是8ug，分離膠12 %、濃縮膠4 %，濃縮膠電泳電壓60V，分離膠電泳電壓80V，電泳結束後，採用0. 05 %的考馬斯亮藍R250染色，甲醇、冰醋酸溶液脫色後，凝膠成像系統照相。1. 3. 5ffestern bolt 檢測首先從美洲商陸植株、轉基因矮牽牛再生植株和缺失型PAP基因在酵母中的表達產物、以及非轉基因矮牽牛植株中提取總蛋白，通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，其中分離膠 12%,濃縮膠4%，濃縮膠電泳電壓60V，分離膠電泳電壓80V。隨後，在37V恆壓情況下，4。C 過夜，將蛋白電轉移到蛋白雜交膜上。將膜在5%脫脂奶粉37°C封閉》!，PBST洗滌3次，加入一抗(PAP抗體，稀釋3000倍)，室溫孵育池，PBST洗滌3次，每次lOmin，加入二抗(HRP 標記的山羊抗兔IgG，稀釋5000倍)，室溫孵育lh，PBST洗滌3次，每次lOmin，採用DAB顯色液顯色，待到信號清晰後，終止反應。2、結果與分析2、1抗血清的效價檢測以人工合成的多肽，SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02)製備抗原，採用間接酶聯免疫吸附法(間接EILSA)分別對三隻相應動物免疫獲得的PAP抗血清進行檢測，血清的稀釋倍數分別為200倍、1000倍、5000倍、25000倍、125000倍、625000倍、 3125000倍；以免疫前同只動物的血清稀釋10000倍，作為陰性對照，以PBS緩衝液為空白對照，在450nm波長下的讀取OD值，實驗重複2次。當同一被測樣品2次重複的讀數均為陰性對照2.0倍以上時(且OD值>0.1)，該樣品的稀釋倍數即為抗血清的效價。檢測結果表明當antiPAPl稀釋125000倍時2次重複的0D450值分別是0. 613和0. 541，是對照的7. 1和6. 0倍；當antiPAP2稀釋25000倍時2次重複的0D450值分別是0. 223和0. 208， 是對照的2. 3和2. 1倍；antiPAP3稀釋25000倍時2次重複的0D450值分別是0. 183和 0. 178，是對照的22和2. 0倍。因此，antiPAPl效價最高，是1 125000，說明該段多肽偶聯物抗原性較好，免疫動物後，產生了較強的應答，適於準備抗血清；antiPAP2和antiPAP3 的效價稍差，均為1 25000，說明多肽SEQ ID N02的偶聯物不僅免疫原性稍差，當與SEQ ID NOl的多肽偶聯物同時注射動物時，不能起到增強免疫原性的作用，還幹擾了動物對SEQ ID NOl的多肽偶聯物的應答(表1)。表1間接ELISA檢測免疫後血清效價(0D值)結果
權利要求
1.人工合成的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗原，包括具有免疫原性的載體蛋白和與其偶聯的人工合成的多肽，所述多肽的胺基酸序列為SEQ ID NOl或/^PSEQ ID N02。
2.根據權利要求1所述的抗原，所述具有免疫原性的載體蛋白為馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)。
3.權利要求1或2所述的抗原製備得到的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗體。
4.權利要求3所述的抗體，其中抗體為兔多克隆抗體。
5.權利要求4所述的抗體的製備方法，其特徵在於將權利要求1或2所述的抗原免疫兔子，然後取其靜脈血或全血，分離抗血清純化即可。
6.權利要求5所述的製備方法，所述抗原採用下述方法製得人工合成SEQID NOl或 /^PSEQ ID N02所示的多肽，將其與馬來醯胺活化的匙孔嘁血藍蛋白偶聯得到。
7.權利要求5所述的製備方法，所述免疫的程序為1)首免600ug/只，將權利要求1 或2所述的抗原溶液加等體積弗氏完全佐劑乳化後皮下6點注射，幻二免、三免、四免分別在第21、35和49天注射，每次400ug/只，權利要求1或2所述的抗原溶液加等體積弗氏不完全佐劑乳化後皮下4點注射。
8.權利要求5所述的製備方法，所述兔子為紐西蘭大白兔。
9.權利要求3或4所述的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗體在天然的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)或缺失型PAP基因的表達產物或轉基因美洲商陸抗病毒蛋白基因的植株檢測中的應用。
全文摘要
本發明涉及「人工合成的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗原、抗體及其製備方法、應用」，屬於生物技術領域。人工合成的美洲商陸抗病毒蛋白抗原，包括具有免疫原性的載體蛋白和與其偶聯的人工合成的多肽，所述多肽的胺基酸序列為SEQ ID NO1或/和SEQ ID NO2。本發明應用該人工合成多肽與匙孔嘁血藍蛋白的偶聯物作為抗原，製備得到了三種PAP抗血清，可應用於PAP製劑、PAP基因原核表達和真核表達產物、轉基因再生植株等檢測，能夠採用免疫學手段檢測PAP及其基因的表達情況，為PAP的檢測提供物質基礎。
文檔編號C07K14/795GK102286097SQ20111016533
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者劉豔, 吳蓓蕾, 周廣和, 李羽, 李莉, 王錫鋒 申請人:中國農業科學院植物保護研究所