一種皮膚外用的重組人神經肽y納米乳及其製備方法

2023-12-05 19:15:41

專利名稱：一種皮膚外用的重組人神經肽y納米乳及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥保健領域，特別地涉及一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米 乳及其製備方法。
背景技術：
隨著人們物質生活的提高，很多人開始追求更高層面上的需求，美容整形就滿足 了人們心理高層次的需求。美容整形的現狀是百花齊放、日新月異，其未來的發展更是前景 廣闊。就今天的百花齊放來說，就是人們在增進人體美的手段上不斷進行摸索，推陳出新。乳房是女性的象徵和體形美的標準之一，隨著人類文明的發展，隆乳術日益盛行， 新的方法不斷湧現。回顧隆胸術的百年史，用於豐胸的材料了經過了液態的乳房假體、固 態的乳房假體以及自體組織這三個階段的發展，與之相應的出現了注射隆胸、假體隆胸和 自體脂肪隆胸這三種現今流行的隆胸手段。I、注射隆胸因為注射隆胸注入的是液體，會 與身體組織相容，出現問題後不可能完全取出，無論取出多少，剩下5%和50%同樣會對身 體有傷害，只是傷害的程度大小。此外，注射隆胸常伴發的併發症有①感染，表現為發熱、 發炎；②局部硬結、乳房變小；③注射的材料有遊走現象；④有可能導致乳腺癌；⑤局部隱 痛；⑥局部肌肉收縮功能損害。II、植入假體優點是一次到位，如果出現問題可完全取出， 缺點是要開刀，有切口，可能有排異反應，手感變硬，乳房變形。植入假體也不是終身的，一 般12年至15年後假體會出現破裂現象，需要更換。III、自體脂肪移植其優點是沒有刀口， 沒有排異反應；缺點是能採用這種方法的人要求比較胖，要有一定脂肪，要多次注射才能完 成，且有10%的人會出現包塊現象，導致和乳腺癌不易區別。一般移植自體的脂肪存活率在 50 %左右，如果注射量過大，會出現脂肪無菌性壞死，導致乳房進一步感染，甚至乳腺壞死， 也容易出現脂肪纖維化，即局部硬結現象。縱觀現有的各種整形豐胸技術中，自體脂肪移植被受人們的關注。自體脂肪來源 於自身組織，組織相容性好，無過敏反應，加之其能去除多餘的脂肪填充凹陷的特點，使全 身脂肪能夠合理「調配」，顯示了它作為軟組織充填材料的強大優勢。雖然目前移植後的脂 肪仍然存在著吸收率高、療效不穩定的缺點，但在臨床中已積累了許多經驗和觀點。應用自體脂肪顆粒移植治療組織缺損和發育不良歷史悠久。Neuber於1893年成 功進行脂肪游離移植。自體脂肪顆粒注射移植治療小乳症，即於身體脂肪豐厚部位，藉助 吸脂技術，吸取一定數量和大小的脂肪顆粒，經漂洗、純化後注射移植於乳房內或乳腺後間 隙；移植後乳房體積增大，彈性增加，手感和外形改善；同時，減去其他部位堆積的脂肪，重 塑體形。因此，自體脂肪顆粒移植隆乳將成為整形外科一個新興的發展方向。此外，自體 脂肪來源豐富，取材簡便，組織相容性優於人工組織替代品和異體異種材料，無免疫排斥反 應，是理想的組織填充材料。同時，吸脂隆乳術能減去其他部位堆積的脂肪，修整身體曲線， 重塑體形。採用注射移植具有創傷輕、痛苦少、遺留瘢痕小的優點，臨床應用越來越廣泛。但由於脂肪組織對缺血和創傷的耐受力較差，目前自體脂肪顆粒移植成活率較 低，移植後成活率不高。由於對於部分併發症的產生原因尚不了解，不當的操作會造成嚴重
4的併發症。如失明、中樞神經損傷、感染、血腫、肉芽腫、起皺、麻木、注射後局部硬結、液化、 壞死、纖維囊性化、水腫等。在自體脂肪移植隆乳術產生的併發症方面，臨床實踐表明，隆 乳的脂肪液化吸收率高達30%以上，大量的自體脂肪移植還可以產生囊腫和纖維鈣化，形 成硬結，對乳腺腫塊的自查有一定影響。同時，一次注射量大，常易形成中心壞死液化。因 此，自體脂肪移植用於隆乳需要慎重，應由具備熟練技術的醫生操作。如果有一種方法或 技術可以通過自體脂肪的增殖來達到隆乳的效果，那就可以避免自體脂肪移植所帶來的缺 陷如脂肪組織對缺血和創傷的耐受力較差，自體脂肪顆粒移植成活率較低，移植後成活率 不高，又可避免自體脂肪移植產生囊腫和纖維鈣化，形成硬結等。2007年美國科學家最近研製出一種轉移身體局部脂肪的藥物。在對老鼠的研究中 發現，該藥物能幫助把脂肪轉移到身體的其他部位，比如胸部。這項研究基於神經肽Y。神 經肽Y (Neurop印tide Y，簡稱NPY)是由36個胺基酸組成的神經遞質，其多肽分子結構中C 端有一酪氨醯胺殘基，對維持神經肽Y生物活性至關重要，N端一個酪氨酸殘基，則與穩定 神經肽Y結構和結合神經肽Y受體密切相關。神經肽Y基因通過轉錄、翻譯在神經細胞內 完成複製、並經軸索輸送至神經末梢並與去甲腎上腺素共存於交感神經的分泌囊泡。而神 經肽Y受體則屬於G蛋白偶聯受體家族成員，其受體亞型介導信息傳導均與G蛋白偶聯有 關。神經肽Y在合成和釋放後必須通過與神經肽Y受體結合後才能發揮其應有的生物學作 用，同樣，神經肽Y受體也只有在神經肽Y配體作用後才能通過與抑制性G蛋白(Gi)偶聯 抑制腺苷酸環化酶活性，最終動員或抑制Ca2+釋放。即神經肽Y在受到某些刺激原作用後 加快、加大合成與分泌和釋放，並迅速通過神經肽Y特異性受體發揮促腎上腺釋放因子、促 腎上腺皮質激素、黃體生成激素、生長激素等的合成與分泌，並直接影響著人體血管收縮、 血壓升高、攝食行為、激素分泌、心血管功能、調節體溫、生物節律、應激反應、性行為和情緒 等多種生物學功能。這一研究的領導者、喬治敦大學醫學中心生理學和生物物理學系教授左菲亞說 「在美國，60%的人患有不同程度的肥胖症。這個領域裡有兩種不同的觀點，一種認為肥胖 的原因在於吃太多富含糖和脂肪的食物，或者說『舒適』食物，也就是自己喜歡吃的東西。另 一種認為，壓力會導致肥胖。比如說人們在生病時，他們往往會承受更多的壓力，這些壓力 催生了人體內的荷爾蒙，而荷爾蒙又導致了肥胖。，，研究者嘗試解釋肥胖這一問題的根源，他們通過4年的研究，找到了一個壓力可 以促進體重增加的機制，這一機制可以解釋那些長期有壓力的人的體重增加比他們應該增 加的體重(根據吸收的卡路裡計算而來)要更多的原因。研究小組觀察了老鼠在荒野中遭 遇到各種類型長期壓力的影響，例如在一個兩周的期限內每天有一個小時站在冰冷的汙水 坑裡面，或者與一隻好鬥的老鼠打架，同時他們在實驗中依據一個正常的菜單和一個高脂 肪高糖的菜單給實驗鼠餵食。最終的結果是餵食正常菜單的受壓力動物沒有增加體重，但 餵食高脂肪菜單的有壓力動物大大增加了體重一與作為對照組的那些沒有壓力的動物相 比，儘管吃一樣的食物，增加的脂肪卻是後者的2倍。「如果考慮進化優點的話，這個發現就 很有意義如果你可以在艱難時期貯藏脂肪，你就有貯備可以轉化為能量以進行下一場戰 鬥，」左菲亞說，「同樣的機制可能也會發生在人類身上。長期積累的緊張因素，例如和你上 司意見不合，或者長期照顧一個有病的小孩，或者一直處於"公路憤怒症"(即由於堵車 等原因而導致的急躁和憤怒)，長時間拖延這種狀態就有可能演變為高卡路裡食物的放大
5器ο進一步的研究，就是從分子水平上尋找壓力導致肥胖的化學機制。研究者找到了 這一機制發生作用的兩個主力參與者神經肽Y及其受體Υ2。當然，它們都與壓力有關。但 以往的研究認為，它們更可能是在大腦發生作用。為了選擇性地增加他們測試中的老鼠的 脂肪，研究人員把神經肽Y打在一個特定的區域一腹部。他們發現，在壓力過程中神經肽 Y受到刺激，導致老鼠腹部開始堆積脂肪，出現蘋果形的肥胖和代謝症候群。肥胖都出現在 實驗鼠的腹部區域，並且與以往科學家對神經肽的了解不同的是，神經肽Y在脂肪組織中 工作，而不是在大腦中工作。這意味著，通過調整身體各部位神經肽Y的濃度分布，人們可 以選擇性地控制脂肪在身體各部位的生長。而另一方面，神經肽Y要發生作用還必須藉助 於神經肽Υ2受體的幫忙。通過阻斷Y2R，神經肽Y將不再發生作用，從而在這一局部產生減 肥效應。研究人員說，這些發現的最快臨床應用，是美容和重新整形外科手術；長期來說， 則可以更好地控制代謝症候群，該症候群集合了增加病人誘發心臟病、中風和糖尿病機率 的危險因素。根據2004年美國疾病控制中心資助的一項研究，2000年大約有6000萬美國人 受到代謝症候群的影響，其中相當一部分最終導致肥胖。這四年裡實施的無數不同的實驗， 證實了起碼在老鼠身上它是可行的；最近的引導數據則說明了在猴子身上也有一個相似的 機制。左菲亞說，「通過對神經肽Y和Y2R的控制，我們可以減少老鼠腹部的脂肪，還可以減 少它們肝臟和骨骼肌上的脂肪，並幫助控制胰島素的抵抗、葡萄糖不耐性、血壓和炎症。阻 斷Y2R的作用可能對人類會起同樣的效果，但需要更多的研究來證明它。我想我們的研究 可以幫助人們減肥，同時也會對整個生命科學做出貢獻」。「目標性地增加脂肪對恢復面部青春、豐滿乳房、臀部和嘴唇增厚手術，以及面部 重新整形是十分有用的，」喬治敦大學醫院的整形外科副教授斯特芬說，「利用這項研究中 那些試驗的注射劑會讓脂肪移植變成可能，並且成本相對低廉，還不會引起永久性的排異 反應。給予神經肽Y可以增加目標地增加脂肪而阻斷Y2R的結果則是消除了局部的脂肪。 這是首個被描述為完好的機制，能夠不動手術而有效地增加或消除脂肪。」當然，這裡所說 的「脂肪轉移」 「脂肪消除」是一種間接的轉移和消除，即增加一些身體部位的神經肽Y，使 之接受身體的多餘能量；同時阻斷減肥的目標部位的Y2R作用，使之不再接受多餘脂肪，已 堆積的脂肪在得不到補充的情況下將很快消耗掉。這個發現不僅對於減肥有很大的作用， 對於整容和修復手術中填充人體組織的手術也將具有很大的幫助，比如豐胸。研究人員發 現，將包含神經肽Y的小球注入老鼠或猴子的皮膚後，老鼠和猴子就會變胖。這一技術將為 減肥、吸脂、臉部年輕化手術以及豐胸術提供新的方法，並且在未來可能替代各種整容和修 復手術。對於需要豐胸和乳房再造的女人來講，這能很好的改善她們身體的優美曲線。總而言之，通過對神經肽Y及其受體Υ2的操作，既可削弱由肥胖引起的負面影響 比如心臟病和糖尿病等；又能幫助把脂肪轉移到身體的其他部位如胸部、臀部等，不僅給想 通過健康方式減肥，又愛美的女士帶來佳音，而且該研究成果也將為整形外科醫生提供新 的手段。但神經肽Y作為一種多肽藥物，在體內容易降解，半衰期較短，必須頻繁給藥，這 給患者帶來不變。因此，發展相應的神經肽Y製劑及給藥方式是藥劑學面對的挑戰。神經 肽Y多肽藥物穩定性差，這和多肽藥物本身的結構有關，也和神經肽Y多肽製劑和給藥方式有關。1.引起多肽不穩定的自身原因(1)脫醯胺反應在脫醯胺反應中，Asn/Gln殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的 脫醯胺反應，與環境條件和多肽的結構有關。提高PH值、升高溫度都將有利於脫醯胺反應 的進行。在-Asn-Glu-結構中的醯胺基團更易水解，位於分子表面的醯胺基團也比分子內 部的醯胺基團易水解。(2)氧化多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過氧化物的汙染，二 是多肽的自發氧化。在所有的胺基酸殘基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分 壓、溫度和緩衝溶液對氧化也都有影響。(3)水解多肽中的肽鍵易水解斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷 裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽鍵。(4)形成錯誤的二硫鍵二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發生交換可形成錯誤的 二硫鍵，導致三級結構改變和活性喪失。(5)消旋除Gly外，所有胺基酸殘基的α碳原子都是手性的，易在鹼催化下發生 消旋反應。其中Asp殘基最易發生消旋反應。(6) β -消除β -消除是指胺基酸殘基中β碳原子上基團的消除。Cys、Ser、Thr、 Phe、Tyr等殘基都可通過β-消除降解。在鹼性PH下易發生β -消除，溫度和金屬離子對 其也有影響。(7)變性、吸附、聚集或沉澱變性一般都是與三維結構以及二級結構的破壞有 關。在變性狀態多肽往往更易發生化學反應，活性難以恢復。在多肽變性過程中，首先形成 中間體。通常中間體的溶解度低，易於聚集，形成聚集體，進而形成肉眼可見的沉澱。蛋白 質的表面吸附是其儲存、使用過程中遇到的另一個問題，如IL-2在進行灌注時會吸附在管 道表面，造成活性損失。2.給藥途徑對多肽藥物的影響吸收是指藥物透過人體的皮膚或黏膜進入到組織間隙，經毛細血管或毛細淋巴管 回流到血液循環的過程。因給藥部位不同，造成藥物吸收過程和進入循環後流經的臟器也 不同。這是藥物製備要考慮的重要方面。(1)靜脈注射藥靜脈注射藥則直接進入血液循環，但是藥物需要經肺循環和體 循環動脈到達靶部位而發揮作用，存在嚴重的副作用而且需頻繁給藥引起病人痛苦。(2) 口服給藥多肽類藥物分子量大，脂溶性差，難以透過生物膜，一般只能注射 給藥。但注射給藥、尤其是那些需要頻繁給藥的藥物，對病人來說是及其不便的。因此有必 要進行多肽的非注射給藥途徑研究。但是正常情況下，大多數肽類藥物很少或不能經胃腸 道吸收。其主要原因有①多肽分子量大，脂溶性差，難以通過生物膜屏障；②胃腸道中存 在著大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽；③吸收後易被肝臟消除；④存在化學和構象 不穩定問題。目前研究的重點放在克服前兩個障礙，既如何提高多肽的生物膜透過性和抵 抗蛋白酶降解這兩個方面。使用吸收促進劑來提高生物膜通透性是目前研究中採用的主要 方法。大量研究還表明吸收促進劑具有多肽特異性。提高生物膜通透性的其它方法還有 ①多肽與VB12連接，通過受體介導吸收；②用脂肪酸修飾多肽，提高脂溶性。克服多肽口 服吸收酶的途徑有①用PEG修飾多肽，抵抗酶解；②使用酶抑制劑；③應用微粒製劑；④應用納米粒製劑；⑤應用生物粘附性顆粒。直徑為IOOnm的PEG納米粒在腸道中能大部分 被吸收，突破酶障和膜障。美國藥物開發公司應用Technosphere技術製備降鈣素的口服制 劑，在狗體內的絕對生物利用度達26 %。除環孢菌(環肽)外，至今還未見多肽口服製劑的臨床應用報導。據稱Cortecs 公司的降鈣素口服製劑已進入III期臨床研究，有望稱為第一個真正的多肽口服製劑。(3)直腸給藥有研究在5-甲氧基水楊酸鈉存在下，胰島素由直腸吸收後到達大 循環的途徑。直腸給藥後切開胸導管取淋巴管，測定淋巴液和血中胰島素，與具有完整胸導 管時比較，血中胰島素量降低很多，而淋巴液中含量甚高，證明胰島素在直腸吸收後主要經 淋巴系統進入血液循環。(4)鼻腔給藥鼻腔部位存在豐富的毛細血管和淋巴管，鼻腔黏膜上皮與血管壁 緊密相連，上皮細胞間間隙較大，毛細血管內皮具有空隙。所有毛細血管的基底膜呈漏孔 狀。小靜脈內膜雖完整，但其基底膜以及平滑肌細胞呈高度多孔性。藥物可以有兩種方式 穿過黏膜，一是通過水溶性細胞間隙；二是通過黏膜中的脂質載體通道。由於細胞間隙的直 徑一般為0. 4-0. 8nm，只有直徑大於0. 7nm的生物分子不能自由通過細胞間隙。這具有較 高的滲透性利於藥物吸收，藥物可直接進入血液循環，避免肝臟首過效應與胃腸道相比，鼻 腔黏膜處的PH值和酶對多肽、蛋白質破壞性要小，低分子量的藥物及易被吸收進入血液循 環。對分子量教大的多肽，如降鈣素、胰島素等，在合適的吸收促進劑幫助下，也可被吸收， 但生物利用度較低。鼻腔給藥的方式有滴鼻給藥法和噴霧給藥法，採用後一方法可獲得相 對較高的生物利用度。(5)肺部給藥肺的吸收表面積有140m2，血流量達5000ml/min，蛋白酶活性相對 於胃腸道較低，不存在肝臟首過效應。肺泡壁比毛細血管壁通透性好。(6)眼部給藥眼結膜含有豐富的毛細血管網和豐富的毛細淋巴管網，眼部給藥 與皮下和肌肉注射一樣吸收迅速，可以避免肝臟首過效應，眼組織與其它組織或器官相比， 對於免疫反應更不敏感。3.提高多肽穩定性的途徑(1)定點突變通過基因工程手段替換引起多肽不穩定的殘基或引入能增加多肽 穩定性的殘基，可提高多肽的穩定性。(2)化學修飾多肽的化學修飾方法很多，研究最多的是PEG修飾。PEG是一種水 溶性高分子化合物，在體內可降解，無毒。PEG與多肽結合後能提高熱穩定性，抵抗蛋白酶的 降解，降低抗原性，延長體內半衰期。選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可體質或提高原 生物活性。(3)添加劑通過加入添加劑，如糖類、多元醇、明膠、胺基酸和某些鹽類，可以提 高多肽的穩定性。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質周圍，因而提 高了多肽的穩定性。在凍幹過程中，上述物質還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩定多 肽的天然構象，而且還可以提高凍幹製品的玻璃化溫度。此外表面活性劑如SDS、Tween, Pluronic，能防止多肽表面吸附、聚集和沉澱。(4)凍幹多肽發生的一系列化學反應如脫醯胺、β -消除、水解等都需要水參與， 水還可以作為其它反應劑的流動相。另外，水含量降低可使多肽的變性溫度升高。因此，凍 幹可提高多肽的穩定性。
(5)其它劑型的改造也是肽類藥物製劑研究的方向。應用微粒、納米乳系統作為 載體是目前多肽藥物研究中的方向之一。目前國外一些生物技術製藥公司與相關的研究公 司利用各自的優勢進行合作，研究開發進展較快。近年來對多肽的非注射途徑給藥研究雖取得一些進展，但面臨的困難仍很多。幾 乎所有多肽藥物的黏膜傳遞都需要滲透促進劑，其種類繁雜，存在的問題是如何降低其刺 激作用、長期使用是否影響上皮完整性以及如何提高功效成分通過生物膜等問題。隨著生物技術的發展，肽類藥物日益受到重視，尤其是基因重組技術的發展使得 這些藥物能大規模、產業化生產。然而肽類藥物在實際應用中受到一定的限制，這是由於肽 類藥物容易被各種蛋白酶迅速降解，而且半衰期短，通常採用靜脈頻繁給藥方式，使用不方 便，同時肽類藥物穿過生物屏障的能力弱，這些是因為肽類藥物的弱擴散作用和低分配系 數。為了解決這些問題，對於肽類藥物的安全而有效的靜脈給藥以及局部給藥，人們迫切希 望提供一種的新的載藥系統。近年來出現的納米乳載體系統具有很好的應用前景。納米乳也稱微乳 (microemulsion, ME)，由油相、水相、表面活性劑及助表面活性劑組成的，只要四相的組成 適當，即可形成均勻透明或略顯乳光的液體，為熱力學穩定體系。按結構可分為水包油(0/ W)型、油包水(W/0)型和雙連續型納米乳。因為納米乳作為載體具有良好的局部給藥和透 皮特性，所以從20世紀90年代開始，納米乳作為透皮給藥系統的研究成為藥劑學研究的熱 點。納米乳粒徑小，具有良好的透皮性和穩定性，其透皮給藥系統優於普通的乳劑。納米乳 所具備的很多特性使其非常適合做成透皮製劑，它粒徑小易被皮膚吸收、具有很好的皮膚 觸感、視覺、實用效果等。因此，納米乳載體系統在透皮外用製劑方面是有極大發展前景的 運載工具，納米乳的分散相可載入功效成分，能維持較高的功效成分濃度，提高了納米乳與 皮膚間的功效成分濃度梯度，可以大大增加功效成分的穩定性和透皮速率。而納米乳體系作為藥物的載體，是一種新型的藥物輸送和控制體系，其包封和釋 藥的機制是通過將活性物質包裹於納米乳滴內部或納米乳滴中，利用納米乳滴的小尺寸特 點，使得肽類藥物穿透組織間隙並被細胞吸收，進而可通過人體的毛細血管，也可以通過生 物膜屏障。並且納米乳載體能提高肽類藥物的穩定性和生物利用度，是多肽和蛋白類藥物 的優良運輸載體，有著獨特的優勢。

發明內容
本發明的目的是針對背景技術中存在的缺點和問題加以改進、創新，提供一種皮 膚外用的重組人神經肽Y納米乳及其製備方法。神經肽Y分子量大，親水性高，半衰期短， 脂溶性差，局部用藥時不能有效地穿過生物膜，而目前採用靜脈給藥途徑，存在嚴重的副作 用而且病人治療痛苦。口服給藥也容易被胃腸道的蛋白水解酶降解、生物利用度低和不易 通過生物膜等，其臨床的應用受到很大限制，而目前運載多肽類藥物的體系嚴重缺乏，迫切 需要開發新的給藥載體以滿足需求。為此，對於肽類藥物的給藥途徑，國內外學者一直致力 於非注射給藥劑型的研發。本發明可大大提高重組人神經肽Y的穩定性；提高重組人神經肽Y的生物活性，延 長半衰期，不需頻繁給藥；改變了神經肽Y肽類藥物的傳統給藥載體，方便，而且減少了風 險和由其產生的副作用；另外納米乳的粘滯性，高分散性延長了藥物與黏膜的接觸時間，使
9藥物能更好地通過皮膚屏障，可以很長時間維持治療濃度，生物利用度高。
本發明一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳，由重組人神經肽Y、海藻糖、肉豆 蔻酸異丙酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3- 二油酸酯、蒸餾水組成的液_液分散體 系，其特徵是由下述重量百分比的原料製成重組人神經肽Y海藻糖肉豆蔻酸異丙酯辛酸癸酸聚乙醇甘油酯 聚甘油-3- 二油酸酯
0. 0003% 0. 0006%
3% 5% 15% 25% 32% % 12% 蒸餾水
45% 52%上述原料的總重量百分比為100%。本發明所述皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳，其特徵是由下述優選重量百分比 的原料製成重組人神經肽Y0. 0005%海藻糖2%肉豆蔻酸異丙酯10%辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30% 聚甘油-3- 二油酸酯
10%蒸餾水47.9995%上述原料的總重量百分比為100%。本發明的另一目的是提供一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳的製備方法①重組人神經肽Y水溶液配製根據配方量將重組人神經肽Y和海藻糖溶於蒸餾 水，將此溶液作為水相(I )；②用分析天平準確稱取配方量的肉豆蔻酸異丙酯，置於另一個經過洗消過的三角 燒瓶之中並用記號筆清楚標記為油相(II )；③按照事先已設計好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3- 二油酸酯(C)油酸釅
曰？
=3 1的比例，分別準確稱取配方量的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油-3-. 並將這兩者原料置於第三個經過洗消過的潔淨三角燒瓶之中；加蓋，並將此三角燒瓶迅速 置於液體快速混合器上，充分混合均勻，使之形成乳化劑/助乳化劑(S/C)混合物，3-5min 後，關閉液體快速混合器，取下三角燒瓶，並用記號筆清楚標記為S/C混合物(III)；④按照油相(II ) S/C混合物(III)水相(I ) = 10% 40% 50%的比 例，先分別取水相(I )、s/c混合物(III)置於第四個經過洗消過的潔淨三角燒瓶之中；⑤將上述水相(I )、S/C混合物(III)兩液相充分混合後，再在室溫25°C條件下 或者自然室溫中，將其放入超聲振蕩器中震蕩並超聲2min左右，或者在室溫25°C條件下或 者自然室溫中，啟動定時恆溫磁力攪拌器，以200rpm ^mirT1的轉速磁力攪拌5min，然後，再 在此容器中直接加入油相(II )，並將整個體系在超聲振蕩器中超聲5min左右，或者在室溫 25°C條件下或者自然室溫中，啟動定時恆溫磁力攪拌器，以200rpm · mirT1的轉速磁力攪拌 20min ；⑥關閉超聲振蕩器或者定時恆溫磁力攪拌器，取下三角燒瓶，觀察其外觀如是清
10亮無色、流體性和分散性好、有明顯可見乳光者，即為皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳；⑦將此皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳迅速分裝於不同規格的避光玻璃容器 之中，迅速加蓋，包裝，並置於4°C冰箱中密閉保存即可。本發明的組方原則本發明皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳是由神經肽Y、肉豆蔻酸異丙酯、辛酸癸 酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3- 二油酸酯、蒸餾水組成的液_液分散體系。神經肽Y由36個胺基酸組成的多肽，它屬於胰多肽家族，分子量為4215。其N端和 C端各有一個酪氨酸殘基和酪氨醯胺殘基，C端的醯基化對神經肽Y的生物活性至關重要，N 端的酪氨酸殘基與穩定神經肽Y的三級結構和結合神經肽Y受體密切相關。X射線晶體結 構圖像顯示神經肽Y有2個相互逆平行的螺旋區，1個富含脯氨酸的螺旋和1個α _螺旋， 2個螺旋區都有兩性電離的特點，2個螺旋之間借疏水鍵維持其穩定的三級結構。當某種因 素造成分子三級結構發生改變時神經肽Y的生物活性便消失。其廣泛分布於中樞神經的紋 狀體、杏仁核、孤束核、下丘腦、海馬、間腦及脊髓等，以及外周神經組織的頸上神經節、星狀 神經節、腹腔神經節等交感神經節細胞中。此外神經肽Y也存在於組織、器官及腺體中，如 骨骼肌、血管、心、肝臟、脾臟、肺、腎上腺、甲狀腺及頌下腺中，而胰臟和腎中較少。神經肽Y可作用於下丘腦，具有增強食慾，改變機體代謝環境，激活脂肪組織的脂 蛋白酶，促進脂肪的合成和儲存等作用。中樞神經系統是攝食行為的重要調節者，調節能量 代謝的部位多集中在下丘腦。下丘腦中神經肽Y是一種很強的食慾刺激劑，對機體能量攝 入、貯存和消耗及能量平衡起重要作用。神經肽Y能幫助把脂肪轉移到身體的其他部位，比如胸部。神經肽Y可以幫助身體 儲存脂肪。研究人員將神經肽Y製成的小球植入獼猴的皮膚下，結果發現，小球的周圍都長 出了脂肪。神經肽Y有助於美容手術，如讓一個上了年紀的人臉頰上豐滿起來等。控制神 經肽Y將為整形外科醫生提供新的手段，如"可以把臀部的脂肪轉移到胸部或面頰"。進 而很好的改善身體的優美曲線。與傳統的自體脂肪移植相比，這種方法的併發症會更少。神經肽Y藥物在實際應用中受到一定的限制，這是由於肽類藥物容易被各種蛋白 酶迅速降解，而且半衰期短。為此我們在組方中加入海藻糖，它對生物大分子具有非特異性 保護作用，它能有效地保護肽類藥物的結構，使肽類藥物在異常情況下免受損傷，大大提高 了神經肽Y在體外的穩定性。對海藻糖的介紹如下。海藻糖(trehalose, a-D-glucopyranosyl-a-glucopyranoside)是由兩個葡萄糖 基分子通過半縮醛基縮合而成的非還原性雙糖，在自然界中廣泛分布，尤其是那些具有較 強抗脫水作用的生物體，這些生物體甚至在喪失了身體99%水分的情況下仍能生存。1832 年Wigger從黑麥的麥角菌中首次分離得到海藻糖。由於海藻糖化學性質穩定、安全無毒、 甜味適中、並且在高溫、冷凍、乾燥失水、高滲透壓等不良環境下可保護生物體的組織和大 分子的功能和活性，使得海藻糖在食品、醫藥工業、化妝品和農業等領域有著廣闊的應用前
旦
ο海藻糖對生物體和生物大分子具有非特異性保護作用，它能有效地保護細胞膜和 蛋白質的結構，使生物體在異常情況下，如高溫、乾燥、高滲透壓、冷凍時仍保持細胞內溼 潤，防止細胞因失水而造成養分的損失和細胞的損傷。而且體外海藻糖同樣具有穩定生物 膜和蛋白質結構的特性。其作用機制有以下幾種學說。①水替代學說生物體中的蛋白質、核酸、脂質和其他大分子物質周圍，均被一層水膜包圍並保護著。該層水膜是維持這些物質 的結構和功能不可缺少的基礎。在乾燥過程中，海藻糖能夠替代水分子，與蛋白質和膜脂質 形成氫鍵，取代由水分子形成的氫鍵，從而抑制膜脂質的融合及蛋白質的變性。②玻璃態學 說海藻糖具有較高的玻璃態轉變溫度，容易以玻璃態形式存在。當生物分子乾燥時，海藻 糖緊密地包住相鄰的分子，形成一種在結構上與玻璃狀的冰相類似的碳水化合物玻璃體， 其擴散係數很低，分子運動和分子變性非常微弱，能夠使生物分子維持一定的空間結構。玻 璃態的形成不僅可以防止冷凍過程中冰晶的產生，還可以穩定蛋白質的結構。③優先排阻 學說糖類能夠在於燥和溶液條件下對蛋白質起一定的穩定和保護作用。海藻糖與其他一 些小分子糖類一樣，不直接與蛋白質結構相互作用，而是優先與水結合，使它們從蛋白質分 子中的溶劑化層中排除出來，導致蛋白質的溶劑化層半徑縮小，分子結構更趨緊密，構象更 穩定，從而抵禦外界極端環境的影響III。由於海藻糖的水化體積比蔗糖、麥芽糖大2. 5倍， 因此，分子排阻效應更明顯，在較低濃度下就能實現蛋白質的優先排阻，產生比其他雙糖更 強的穩定效果。④多種機制協同作用學說=Crowe等的研究表明，單純玻璃態形成並不能發 揮海藻糖的保護作用，只有在玻璃態形成與水分子替代作用的協同作用時才能更好地發揮 海藻糖的保護作用。海藻糖具有獨特的保護生物分子的功能，是生物分子的特效保護劑和組織細胞的 穩定劑，它將為醫用生物製品，如血液製品、酶、菌苗、疫苗、病毒、激素、細胞膜、單克隆抗 體、載藥脂質體、抗血清、外科手術所需貯存的皮膚、器官、重組人體蛋白、離體細胞和組織 等的乾燥保存、運輸和使用帶來極大的方便，且具有其它種類的保護劑都達不到的保護效^ ο所以本發明以納米乳作為給藥載體形成重組人神經肽Y。可以把重組人神經肽Y 包裹在乳滴核中，使重組人神經肽Y免受PH、溫度、光照、氧濃度等對神經肽Y穩定性的影 響，另外組方中海藻糖可以作為重組人神經肽Y的穩定劑，保證了長距離運輸重組人神經 肽Y仍可保持相當高的活性。所以在雙重的保護下，重組人神經肽Y生物活性可以得到很 好的保護。本發明的分析鑑定1.本發明的肉眼外觀觀察皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳外觀清涼無色、流 體性和分散性好、有明顯可見乳光者。2.本發明納米乳粒徑大小、分布測定採用馬爾文測定方法，取皮膚外用的重組 人神經肽Y納米乳2ml注入測試杯中，通過粒徑分析儀測定納米乳粒子的粒徑大小和分布。 納米乳粒子的平均粒徑為在IOOnm以下，粒徑分布在10 IOOnm之間。3.本發明納米乳類型的鑑定採用染色法鑑定納米乳的類型的主要原理是通過 蘇丹紅(油性染料)和亞甲藍(水溶性染料)在納米乳中紅色或藍色的擴散快慢來判斷納 米乳的類型水溶性染料在0/W納米乳擴散快，因為0/W納米乳連續相為水相，水溶性染料 在水相比在油相擴散快，同樣道理，油溶性染料在W/0納米乳擴散快。經鑑定本發明皮膚外 用的重組人神經肽Y納米乳是0/W納米乳。4.本發明的穩定性鑑定本發明製備的重組人神經肽Y納米乳熱力學穩定性好， 手外環境影響小，可很好地保護重組人神經肽Y的生物活性。另外本發明納米乳本身具有 防腐性能，不需要添加防腐劑，就有很好的防腐能力，保質期長。
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①對在不同溫度條件下的穩定性實驗取皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳產 品，置於玻璃磨口扁形瓶中，同時置於0°C、4°C、25°C、40°C、60°C、80°C溫度下30天，按0、5、 10,15,30天取樣。經過測定相關指標，本發明在不同溫度條件下穩定性很好。②對光照的穩定性實驗取皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳產品，置於玻璃磨 口扁形瓶中，同時置於日光燈和自然光下連續照射30天，按0、5、10、15、30天取樣。經過測 定相關指標，本發明對光的穩定性很好。③高速離心實驗取皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳產品，並置於高速離心機 所配套的離心管中，以10000-16000rpm · mirT1的速度離心30min，沒有發現皮膚外用的重 組人神經肽Y納米乳分層，說明皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳穩定。④神經肽Y生物活性的測試分別按照本發明的製備方法製備出的和傳統的液體 製劑製備方法，在完全相同的條件下將同種具有生物活性的神經肽Y分別配製成皮膚外用 的重組人神經肽Y納米乳和神經肽Y液體製劑，在完全相同的存放條件下分別於放置30天 前後分別測定神經肽Y活性，結果發現，皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳中的神經肽Y的 生物活性明顯高於普通液體製劑中的神經肽Y，說明本發明能更好地保持神經肽Y肽的生 物活性。綜上所述，本發明具有以下有益效果1.本發明用納米乳系統作為藥物的載體，是一種新型的藥物輸送和控制體系，其 包封和釋藥的機制是通過將活性物質包裹於納米乳滴內部或納米乳滴中，利用納米乳滴的 小尺寸特點，使得肽類藥物穿透組織間隙並被細胞吸收，進而可通過人體的毛細血管，也可 以通過生物膜屏障。並且納米乳載體能提高肽類藥物的穩定性和生物利用度，是多肽和蛋 白類藥物的優良運輸載體，有著獨特的優勢。2.本發明的皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳穩定性大大提高。本發明以納米乳 作為載體形成重組人神經肽Y納米乳，可以把重組人神經肽Y包裹在乳滴核中，使重組人神 經肽Y免受PH、溫度、光照、氧濃度等對其的影響。所以本發明熱力學穩定性好，可顯著地提 高其穩定性，大大延長其有效期。3.本發明提高了重組人神經肽Y的生物利用度。本發明改變了 NPY肽類藥物的給 藥載體，而且減少了靜脈注射所帶來的風險和由其產生的副作用，本發明納米乳的粘滯性， 高分散性延長了藥物與黏膜的接觸時間，使藥物能更好地通過生物屏障，可以很長時間維 持治療濃度，生物利用度高。4.本發明的皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳組方中的海藻糖可以作為神經肽 Y生物活性物質的穩定劑，保證了長距離運輸神經肽Y仍可保持相當高的活性，大大降低神 經肽Y的貯存及運輸成本。5.本發明製備的重組人神經肽Y納米乳，其分散性、流動性、均勻性、穩定性、透皮 吸收性、與皮膚接觸的面積增大、作用時間延長等共同影響，使的本發明皮膚外用的重組人 神經肽Y納米乳的應用效果將會更加明顯。6.本發明製備的皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳中的重組人神經肽Y生物活 性可以得到明顯的提高。由肉豆蔻酸異丙酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3-二油酸 酯、蒸餾水組成的納米乳液-液分散體系，可以把重組人神經肽Y包裹在納米乳滴核中，使 重組人神經肽Y免受PH、溫度、光照、氧濃度等對神經肽Y穩定性的影響，另外本發明組方中海藻糖可以作為重組人神經肽Y的穩定劑，保證了長距離運輸重組人神經肽Y仍可保持相 當高的活性。所以在雙重的保護下，重組人神經肽Y生物活性可以得到很好的保護。7.安全性得到提高。近年來對多肽的非注射途徑給藥研究雖取得一些進展，但面 臨的困難仍很多。幾乎所有多肽藥物的黏膜傳遞都需要滲透促進劑，而其種類繁雜，存在刺 激黏膜和影響皮完整性的問題。而本發明製備的產品不需要添加滲透促進劑就具有滲透作 用，使應用的安全性得以提高。8.而本發明的配製成分精簡、成本低廉、製備工藝簡單、實際操作容易、製備高效 快速、不需要特殊儀器設備、節省原材料、降低環境汙染、低碳環保。本發明的製備注意事項1.產品配製時所用的容器必須按照規定嚴格清洗和消毒，最好採用強酸浸泡後水 衝，再清水洗滌乾淨，後用蒸餾水浸泡晾乾，再置於烘箱高溫消毒乾燥後備用；另外，在進行 產品配製時，所用容器均要特別注意防止含有雜質或金屬離子及微生物等汙染，以免影響 產品質量和穩定性。2.重組人神經肽Y為丁克祥教授神經肽Y研究團隊自行設計合成的功效成分，其 設計和合成非常不易，因此，在配製時應及時與丁教授溝通聯繫，以便該課題組能完成足夠 量的重組人神經肽Y合成與製備。3.嚴格按照上述劑量和方法進行配製。在進行該產品配製時，應根據上述流程順 序添加，其添加劑量務必要求準確無誤，而且，在其它原料的添加上，一定要等上一種加入 的原料充分溶解後才能再加入下一種原料，以免出現渾濁，影響整個納米乳體系的配製。4.在配製外用重組人神經肽Y納米乳時需要選擇和確定S/C質量比(km值)，而 確定S/C質量比(km值)1、2、3、4，是需要進行滴定水油兩相的二元液試驗並通過偽三元相 圖分析後才能最後確定，只有在確定並計算出得到最大的納米乳區域的km值，才是較為理 想的km值。上述製備方法已通過試驗確定Km值為3，但在實際進行產品配製時，表面活性 劑(S)和助表面活性劑按此比例仍須在進行混合後還要再充分混勻，以免影響配製效果和 質量。5.由於液態溶液的比重或密度不同的關係，在進行產品配製時，所選配製容器的 容量一定要稍大於實際配製的產品量，如配製IOOg產品，需要選擇150-200mL的配製容器， 這樣既便於各成分充分混合和溶解，也便於超聲震蕩或者攪拌混勻，而不至於往外溢出。6.空白納米乳本身雖具有一定的抑制細菌生長的特點，本產品配方中未有另外添 加防腐劑，故在進行產品配製時，除配製容器必須進行嚴格清洗和消毒外，具體配製時也應 嚴格按照操作規程，儘可能在無菌條件下並按照無菌操作要求進行操作，避免該納米乳樣 品受到汙染，影響產品質量。7.配製完成的樣品務必用避光包裝，並儘可能置於陰涼乾燥通風避光處保存，要 遠離火源或熱源。另外，產品平時使用後，無須置於低溫或冰箱保存，但務必加蓋密封嚴實， 放置於自然室溫避光保存即可。8.本品可能對皮膚有刺激性，如使用部位出現明顯反應請立即暫停使用；在實際 使用過程中，切勿將本品弄入眼內；皮膚受傷、有傷口或紅腫不得使用、使用後如有持續紅 腫，應停止使用；嬰兒和兒童不得使用；皮膚敏感者，使用前應做皮膚敏感性測試，測試完 全無刺激性反應方可使用。
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9.重組人神經肽Y為肽類物質，因此該固態原料需要-20°C左右冷藏較為適宜，臨 用臨配，且每次配製量不宜太大，配製重組人神經肽Y水溶液後，儘量現配現用，如用不完， 應置於2-8°C冰箱短期保存。10.重組人神經肽Y納米乳放入冰箱後會出現渾濁，但恢復室溫後能自行形成納 米乳，不影響使用。


圖1.重組人神經肽Y的誘導表達。圖2.重組人神經肽Y的親和層析純化。圖3.重組人神經肽Y純化生的Western Blot鑑定。圖4. 一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳的製備工藝流程及技術路線。
具體實施例方式實施例1 為了克服動物來源神經肽Y的免疫源性和純度不高的穩定，本研究團隊 在前期根據Gene bank中收錄的NPY基因序列，設計該基因上下遊序列，經過PCR反應合成 NPY的cDNA，然後與pET28a+載體重組，篩選陽性克隆和DNA序列分析鑑定，DNA序列分析 顯示克隆的DNA片段是人NPY基因。且所克隆的基因共編碼36個胺基酸，分子量為4. 2KD， 與GenBank中NPY基因序列同源性達100%。重組神經肽Y的製備1材料和方法1.1 材料E. coli BL21 (DE3)、含有測序正確的重組質粒pET28a_NPY的保存菌均由本室保 存；蛋白marker購自TaKaRa公司；鼠抗人Anti-6XHis抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記 的山羊抗小鼠IgG均購於天根生化科技有限公司；鎳離子親和層析預裝柱及化學發光顯色 試劑購於QIAGEN公司；蛋白電泳儀、電轉移儀(Bio-Rad公司)；cientz-IID超聲細胞粉碎 機為寧波新芝科器研究所產品；其它所用試劑均為國產分析純試劑。1.2 方法1.2. 1重組人NPY融合蛋白的誘導表達用接種環沾取少量含有重組質粒pET28a_NPY的保存菌，於LB (Kan+)平板上劃線， 37°C倒置培養過夜。次日挑取單菌落，接種於5ml LB (Kan+)液體培養基，37°C振蕩培養過 夜。次日取培養過夜菌液500 μ 1再接種於50ml選擇性LB液體培養基中，振蕩培養至0D600 值達0. 6。吸取Iml後加入IPTG，終濃度為lmmol/L，37°C繼續誘導培養4h。取加IPTG前 和後的菌液各lml，12000rpm離心5min，收集菌體沉澱，並於沉澱中加50 μ 1蒸餾水，混勻 後再加2 X SDS-PAGE上樣緩衝液50 μ 1，混勻，沸水浴5min，12000rpm離心lOmin，每個樣品 取20 μ 1上樣於15%的SDS-PAGE膠上電泳，電泳結束後取考馬斯亮蘭R250染色2h，然後 脫色，拍照記錄結果。1.2. 2包涵體的釋放據上所述，在2000ml的搖瓶中裝500ml的LB液體培養基擴大誘導規模。將誘導表 達菌液，4°C以5000rpm離心15min，收集菌體沉澱；加入25mlPBS，吹打充分懸浮菌體沉澱，40C 12000rpm離心30min，棄去上清，依此反覆衝洗菌體沉澱3次；加入細胞裂解液25ml， 吹打使菌體沉澱均勻懸浮；將菌體沉澱懸浮液置-20°C冷凍，再於室溫融化，如此反覆凍融 3次；4°C 12000rpm離心細菌凍融液30min，棄去上清，在沉澱中加入超聲裂解液25ml，吹 打混勻；置冰上對細菌凍融液進行超聲處理，IOmin/次，處理時間30min ；超聲處理後，於 40C 12000rpm離心30min，棄去上清，沉澱為菌細胞裂解沉澱物.1.2. 3包涵體的提純於菌細胞裂解沉澱物中加入含4mol/L尿素的包涵體提純液25ml，吹打混勻，室溫 靜置30min，12000rpm離心30min，反覆3次，即得到包涵體沉澱物。1.2. 4包涵體的裂解於包涵體沉澱物中加入包涵體裂解液25ml，吹打混勻，室溫靜置6h，使包涵體充 分裂解，2000rpm離心30min，收集上清液，即為包涵體裂解物。1.2. 5變性蛋白的復性將收集的包涵體裂解物上清液加入到處理過的透析袋中，紮緊透析袋兩端；將透 析袋整體浸沒於蛋白復性液，在4°C條件下透析；復性液中的尿素濃度從7m0l/L-lm0l/L依 次遞減，在每個尿素濃度梯度復性液中透析3-4h。每次更換不同尿素濃度復性液之前，需要 將透析袋內的樣品吸出，在4°C 12000rpm離心30min，再把上清液加入透析袋內，重新紮緊 進行透析；透析完畢後，將樣品取出，4°C 12000rpm離心30min，再將上清液加入透析袋，在 4°C預冷的PBS中透析20h ；取出透析好的樣品，4°C 12000rpm離心30min，收集上清液即為 復性產物。-70°C保存。1.2. 6復性產物的純化①上樣將復性產物緩慢加於已用PBS緩衝液平衡的鎳離子親和層析預裝柱中， 加樣所用的流速要控制在lmL/min以內；②衝洗PBS洗滌除去未結合蛋白，衝洗流速應控 制在5mL/min以內；③洗脫分別用含50、100、150mmol/L咪唑PBS緩衝液洗脫融合蛋白，流 速5mL/min。純化後取20 μ 1上樣於15%的SDS-PAGE膠上電泳。1. 2. 6 純化產物 Western blot 檢測取純化後產物20 μ 1上樣於15%的分離膠SDS-PAGE電泳後，電轉移至硝酸纖維素 膜上膜上，進行Western blot印跡分析。一抗為鼠抗人Anti-6 XHis (1 1000稀釋)，二 抗為辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG抗體(1 5000稀釋)，採用化學發光法顯影，於X 光片上曝光。2 結果2. 1 誘導 pET28a_NPY 表達 NPY 結果pET28a-NPY表達的NPY在N端有非NPY的36個胺基酸的融合蛋白，其中有6個組 氨酸的tag(HiS-tag)，目的蛋白NPY有36個胺基酸組成，由於設計NPY引物時在編碼NPY 第36個胺基酸的鹼基後緊接著插入了一個終止密碼子，因此，pET28a-NPY表達的NPY在C 端的最後一個胺基酸為目的蛋白NPY的第36個胺基酸。即pET28a-NPY表達的完整融合蛋 白由72個胺基酸組成，分子量約小於10KD。pET28a-NPY經IPTG誘導結果見圖1，在低於 IOKD的位置有明顯的誘導蛋白表達，NPY重組菌在IPTG誘導前幾乎無表達。2. 2融合蛋白純化後的鑑定NPY蛋白在含150mmol/L咪唑PBS緩衝液可以完全被洗脫，分別進行15 %的SDS-PAGE電泳鑑定(圖2)。2. 3純化蛋白的Western Blot結果用化學發光法顯影，X光片曝光後可見一清晰條帶，表明目的蛋白得到有效表達和 純化，如圖3示。我們利用DNA重組技術克隆了 NPY基因，且將其與pET28a載體連接後表達於DE3 中。即以BL21(DE3)/pET228a+作為表達體系。pET_28a表達載體在N端含有His-Tag寡聚 組氨酸鏈，因此，表達出的融合蛋白在多種情況下都可以便利地和經濟地進行純化。我們所 設計的NPY融合蛋白N端為36個胺基酸組成的非目的蛋白，其中包含一個His-tag，其後 的目的NPY蛋白也有36個胺基酸。即pET28a-NPY表達的融合蛋白共由72個胺基酸組成， 分子量約IOKD左右。用6Xhis-tag抗體進行western blot鑑定，表明有大量融合蛋白產 生。其分子量與NPY融合蛋白相符。實施例2 皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳製備技術1)配製主要原料⑴空白納米乳原料及來源①肉豆蔻酸異丙酯(IPM)為上海 潤捷化學試劑有限公司或者上海國藥集團化學試劑有限公司產品，含量> 98% )，原料購 買電話021-52511155。②辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)為法國GATTEF0SSE公 司產品，代理商上海森君化工製藥輔料有限公司，原料購買電話021-51611173。③聚甘 油-3-二油酸酯(Plurol Oleique CC497):為法國GATTEF0SSE公司產品，代理商上海森 君化工製藥輔料有限公司，原料購買聯繫電話021-51611173。④蒸餾水實驗室自製。(2)皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳中主要功效成分及本樣品原料來源神經 肽Y (本課題組自行設計、合成並製備)。2)配製主要器材及軟體分析天平、電子天平、液體快速混合器、定時恆溫磁力攪 拌器、超聲震蕩儀、石英管玻璃雙重蒸餾水器、一定規格的容器、燒瓶、燒杯、吸管、滴定管 等。另外，還有分析軟體Origin 7. 0圖形分析系統(美國Microcal公司)。3)完整配方組成及精確用量(以配製IOOg為例)神經肽Y納米乳的配方組成及 用量肉豆蔻酸異丙酯10g，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30g，聚甘油-3-二油酸酯10g，海藻 糖2g，神經肽Y水溶液48g，共計100g。4)重組人神經肽Y納米乳的具體製備方法及實施舉例(*以配製IOOg為例，如需 要擴大配製，可以依此類推)①重組人神經肽Y水溶液配製將0. 0005g神經肽Y和2g海藻糖溶於47. 9995g 蒸餾水。將此溶液作為水相50g( I )。②用分析天平準確稱取IOg重量的肉豆蔻酸異丙酯，置於另一個經過洗消過的 50mL三角燒瓶之中並用記號筆清楚標記為油相(II )10g。③按照事先已設計好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3- 二油酸酯(C) =3 1的比例，分別準確稱取30g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和IOg聚甘油-3-二油酸酯， 並將這兩者原料置於第三個經過洗消過的IOOmL潔淨三角燒瓶之中；加蓋，並將此三角燒 瓶迅速置於液體快速混合器上，打開液體快速混合器，並將其調至II檔，充分混合均勻，使 之形成乳化劑/助乳化劑(S/C)混合物，3-5min後，關閉液體快速混合器，取下三角燒瓶，並 用記號筆清楚標記為S/C混合物(III )40g。④按照油相(II ) S/C混合物(III)水相(I ) = 10% 40% 50%的比
17例，先分別取水相(I ) 50g、S/C混合物(III) 40g置於第四個經過洗消過的200mL潔淨三 角燒瓶之中。⑤將上述水相(I )、S/C混合物(III)兩液相充分混合後，再在室溫25°C條件下 或者自然室溫中，將其放入超聲振蕩器中震蕩並超聲2min左右，或者在室溫25°C條件下或 者自然室溫中，啟動定時恆溫磁力攪拌器，以200rpm ^mirT1的轉速磁力攪拌5min，然後，再 在此容器中直接加入油相(II )10g，並將整個體系在超聲振蕩器中超聲5min左右，或者在 室溫25°C條件下或者自然室溫中，啟動定時恆溫磁力攪拌器，以200rpm · mirT1的轉速磁力 攪拌20min。⑥關閉超聲振蕩器或者定時恆溫磁力攪拌器，取下200mL三角燒瓶，觀察其外觀 如是清亮無色、流體性和分散性好、有明顯可見乳光者，即為IOOg皮膚外用的重組人神經 肽Y納米乳。⑦將此IOOg皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳迅速分裝於不同規格的避光玻璃 容器之中，迅速加蓋，包裝，並置於4°C冰箱中密閉保存即可。⑧按照國際或國內或企業相關標準和要求，從上述分裝產品中隨機抽樣，首先採 用馬爾文儀器檢測該納米乳樣品的顆粒分布及粒徑大小，在符合納米乳的質量標準後，再 按照國家有關部門的具體要求，進行相關指標的系統檢測；待判斷或評價其完全符合國家 相關規定和標準及批准文號後，即可作為產品上市銷售或在美容院內專用。本發明所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行的描述，並非對本發明 構思和範圍進行限定，在不脫離本發明設計思想的前提下，本領域中工程技術人員對本發 明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入本發明的保護範圍，本發明請求保護的技 術內容，已經全部記載在權利要求書中。
權利要求
一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳，由重組人神經肽Y、海藻糖、肉豆蔻酸異丙酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油 3 二油酸酯、蒸餾水組成的液 液分散體系，其特徵是由下述重量百分比的原料製成重組人神經肽Y0.0003％～0.0006％海藻糖 1％～3％肉豆蔻酸異丙酯 5％～15％辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 25％～32％聚甘油 3 二油酸酯7％～12％蒸餾水 45％～52％上述原料的總重量百分比為100％。
2.根據權利要求1所述皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳，其特徵是由下述優選重量百分比的原料製成重組人神經肽Y0. 0005%海藻糖2%肉豆蔻酸異丙酯10%辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30%聚甘油-3-二油酸酯10%蒸餾水47.9995%上述原料的總重量百分比為100%。
3.根據權利要求1和權利要求2所述的皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳，其特徵在 於所述的皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳的製備方法包括以下步驟①重組人神經肽Y水溶液配製根據配方量將重組人神經肽Y和海藻糖溶於蒸餾水，將 此溶液作為水相(I )；②用分析天平準確稱取配方量的肉豆蔻酸異丙酯，置於另一個經過洗消過的三角燒瓶 之中並用記號筆清楚標記為油相(II )；③按照事先已設計好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3-二油酸酯(C)= 3 1的比例，分別準確稱取配方量的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油-3-二油酸酯，並 將這兩者原料置於第三個經過洗消過的潔淨三角燒瓶之中；加蓋，並將此三角燒瓶迅速置 於液體快速混合器上，充分混合均勻，使之形成乳化劑/助乳化劑(S/C)混合物，3-5min後， 關閉液體快速混合器，取下三角燒瓶，並用記號筆清楚標記為S/C混合物(III)；④按照油相(II) S/C混合物(III)水相(I ) = 10% 40% 50%的比例，先 分別取水相(I )、S/C混合物(III)置於第四個經過洗消過的潔淨三角燒瓶之中；⑤將上述水相(I)、S/C混合物(III)兩液相充分混合後，再在室溫25°C條件下或 者自然室溫中，將其放入超聲振蕩器中震蕩並超聲2min左右，或者在室溫25°C條件下或者 自然室溫中，啟動定時恆溫磁力攪拌器，以200rpm ^mirT1的轉速磁力攪拌5min，然後，再在 此容器中直接加入油相(II )，並將整個體系在超聲振蕩器中超聲5min左右，或者在室溫 25°C條件下或者自然室溫中，啟動定時恆溫磁力攪拌器，以200rpm · mirT1的轉速磁力攪拌 20min ；⑥關閉超聲振蕩器或者定時恆溫磁力攪拌器，取下三角燒瓶，觀察其外觀如是清亮無色、流體性和分散性好、有明顯可見乳光者，即為一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳；⑦將此一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳迅速分裝於不同規格的避光玻璃容器 之中，迅速加蓋，包裝，並置於4°C冰箱中密閉保存即可。
4.根據權利要求3所製備出的一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳，其特徵在於所 述的皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳的乳液滴粒徑為10 lOOnm。
全文摘要
本發明提供一種皮膚外用的重組人神經肽Y納米乳及其製備方法。本發明使重組人神經肽Y免受溫度、光照、氧濃度等對其的影響，可長久保持重組人神經肽Y的生物活性。重組人神經肽Y納米乳皮膚外用給藥可避免注射給藥給患者帶來的副作用，還可避免口服給藥容易被胃腸道蛋白水解酶降解、首過效應的問題，此外利用納米乳的小尺寸特點，納米乳的粘滯性，高分散性延長了與皮膚的接觸時間，使得重組人神經肽Y容易穿透皮膚組織，克服了傳統透皮製劑的透皮率小，生物利用度低的情況。另外本發明提供的重組人神經肽Y納米乳製備方法可靠易行、製備工藝簡單、實際操作容易、不需要特殊儀器設備、可降低環境汙染、低碳環保，具有廣闊的市場前景。
文檔編號A61K9/107GK101897956SQ20101022576
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者丁克祥, 丁宇, 左夏林, 朱曉亮, 楊永鵬, 董萍 申請人:董萍;丁克祥