新肽及其製備方法以及含有該肽的藥物組合物的製作方法
2023-12-05 19:07:56 1
專利名稱：新肽及其製備方法以及含有該肽的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及新肽、其製備工序、含有其的藥物組合物，及其醫藥品、作為消炎藥和抗肉瘤劑的應用。肽作為以治療和/或預防肉瘤以及炎症性疾病為目的醫藥品尤其有用。肽從咖啡豆中提取，分離。
背景技術：
在本說明書中作為參考而引入的在美國專利5,572,923號、美國專利5,170,697號以及美國專利4,776,104號中公開的裝置中，含有從麥芽、大豆等材料中提取有效成分的提取裝置。該裝置是由以下構成微細化微粒發生槽，其包括用於將水的蓄留槽加熱至所設定溫度的設備(手段)以及用於將水微細化或霧化的設備；提取裝置，其與所述微細化微粒發生槽連接，並且當微細化的微粒子通過原料層中時，收納附著有原料有效成分的原料層；凝結裝置，其與所述提取裝置連接，用於將通過原料層並從原料層中提取了有效成分的微細化微粒進行液化；儲備槽(リザ一ブタンク)，在所述凝結裝置內液化的水流入其中；鼓風機，其用於將提取裝置內的原料層進行減壓，裝備在儲備槽和微細化微粒發生槽間的流路上；冷卻設備，其用於對凝結裝置以及儲備槽進行冷卻。
在作為參考在此引入的同族(同時係屬中)美國系列序號09/981064號中公開了如下的方法可以通過乾燥或冷凍乾燥等容易地將用前述裝置配製的提取液和/或用裝備有改良型凝結裝置和/或改良型乾燥機的裝置配製的提取物固化。對藥物組合物或化妝品、香水和/或香味促進劑的配製有用的其他組成物，可以通過固體或乾燥提取物容易地配製。而且，乾燥提取物的分析，與對原樣提取物進行分析相比，使用非營養性吸收劑材料進行固化來分析較容易。
本發明者此次發現，從咖啡豆中提取的新的生物活性肽具有抗癌活性以及抗炎症活性。
因此，本發明的目的之一在於提供具有有益的生物活性的肽。
本發明的另一目的在於提供含有前述肽的藥物組合物。
本發明的另一目的在於提供具有抗肉瘤活性的肽。
本發明的另一目的在於提供具有抗炎症活性的肽。
發明內容
本發明通過提供特別具有抗癌活性以及抗炎症活性的生物活性肽以及用它配製的組合物，以及該肽和組合物的製備方法，解決了現有技術的問題點。本發明的肽優選利用有效回收來自原料的衍生物的加熱、提取以及凝結裝置而獲得。優選的是，凝結裝置至少由2個適合的圓筒容器形成，為了使從空氣流生成的水分凝結，至少1個容器中具有冷卻材料。還可以任意追加第3個容器。使所得的液體提取物與吸收劑材料接觸，然後使浸透了提取物的材料乾燥。或者將植物或動物的餌料的原料浸入到提取物中，然後使之乾燥。
本發明的肽是具有下列胺基酸序列的五肽酪氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-絲氨酸(YGSRS)。
圖1是在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取/乾燥裝置的1個實施例的示意圖，圖2是在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取/乾燥裝置的另外的實施例的示意圖，圖3是在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取裝置的外筒部分立體圖，圖4(a)、(b)以及(c)是分別表示在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取裝置的內筒容器的結構的立體圖，圖5是在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取裝置所用的空氣流控制設備的平面圖，圖6是圖5的6-6線的剖面圖，圖7是在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取系統中所用的凝結裝置的實施例的示意圖，圖8是在本發明中所述的活性成分的提取時使用的提取系統中所用的凝結裝置的示意圖，圖9是根據本發明的其他的實施例的活性成分的提取時使用的提取系統中所用的凝結裝置的凝結部的剖面圖，圖10是圖9的裝置的凝結部的上視圖。
具體實施例方式
可以用於生成含有本發明的新肽的提取物的提取系統的對象的優選的原材料是咖啡豆。
以下，參照附圖，詳細說明得到提取物的優選的方法。圖1是示出第1實施例1的製備裝置的結構的示意圖，附圖內的標號1是該製備裝置中的液體蓄留槽，優選的是具有水的箱(ハウジング)或者容器。箱1優選是不鏽鋼製的。箱1的大小沒有特別的限制，在圖示的提取實施例中，根據一般使用的原料4的量以及從原料中有效成分的期望提取率而決定。箱1包含用於加熱蓄留槽的設備H，但對該設備沒有特別的限制，例如，可以包含電加熱元件或線圈、UV或IR加熱元件、燃燒器等。加熱設備H必須是可以充分加熱到使箱1內的液體蒸發所必要的溫度。加熱器可以結合在操作者可以設定所期望液體溫度的測量儀表(沒有圖示)和啟動加熱器的開關(沒有圖示)上。加熱設備H可以配置在箱1的內部或者外部。箱1可以根據產生微細化微粒或霧的設備(沒有圖示)而任意地供給水。適合的設備具有在箱1的底部裝備有1套或者數套(根據槽的大小)具有將水微細化形成霧狀的能力的各振子的超聲波發生裝置。優選家庭用超聲波加溼器中所用的通常的超聲波發生裝置。也可以利用離心噴霧裝置。
箱1通過管P1或同等物，與從其中容納的原料中提取有效成分的提取裝置2流體連通。圖3是作為提取裝置2的主要部件的外筒的外觀立體圖，它包含第1外筒2a以及第2外筒2b，兩個圓筒製作成互相結合，但又可以脫離，優選是不鏽鋼製的。用於檢測提取操作中的溫度的溫度傳感器(沒有圖示)可以安裝在第2外筒2b的底面。為了可以簡單地進行原料的填充和取出，通過鉸鏈鎖定(蝶番ロツク)結構C1，將圓筒2a與圓筒2b結合。圖3示出了開放的沒有固定的狀態的提取裝置2。
圖4是安裝在圖3外筒2內的內筒的示意圖。圖4(a)中所示的內筒2c，是適合安裝在前述外筒2內的形狀以及尺寸，在其底部，包含用於保持細小破碎的原料的網部分。用於插入圖4(b)中所示的內筒2c內的導向板(案內板)2d，如圖4(c)所示，是在內筒2c的內側將咖啡粉等原料的破碎片S劃區而構成的。由於該導向板2d的存在，如以下所述那樣，可以使從箱1蒸發的液體容易並且順利地通過原料的破碎片S內。本領域技術人員應當理解螺旋狀等其他形狀也可用於導向板2d。
提取裝置2通過管P2與凝結裝置3流體連通。閥V1可以配置在管P2之中，但與管P3內的閥V2(在下面說明)一起控制流向凝結裝置3的空氣流以及該裝置內的減壓。提取物在凝結裝置3內，可以通過包括如作為參考而引入的美國專利5,572,923號以及5,170,697號中公開的那樣的空氣冷卻或液體冷卻等各種方法進行冷卻。
凝結裝置3的實施例之一，包含2個同心圓筒，其外筒4內容納有冷卻內筒5的內容物的冷卻材料。在例舉的實施例中，內以及外筒的大小不同，據此，可以將由冷卻工序產生的凝結液體收集在內筒下部分5a。然而，本領域技術人員應當認識到，如果利用用於在其他地方收集凝結物而裝配的適當的設備(在一端與內筒5，在其他端與輔助容器連接的管等)，可以使內以及外筒5的大小相同。同樣，為了使外筒4內含有的冷卻材料不僅包圍內筒5的側部，而且也包圍底部，也可以使內筒5比外筒4短。在後者的實施例中，裝備了用於在其他地方收集凝結物的適當的設備。
外筒4中含有的冷卻材料6優選如水那樣的液體。然而，冷卻材料6是氣體也好，是冰那樣的固體也好，只要能維持長時間低溫，也可以是其他的材料。也可以使冷卻材料6在外筒4內循環來促進冷卻，或者在運轉中頻繁或者連續地進行補充。
內筒5優選含有1個或者多個空氣流控制裝置36，但如例舉的那樣，2個是最合適的。如圖5以及6所示，空氣流控制裝置36含有多個傾斜板(プレ一ト)37，在相鄰的傾斜板37之間形成間隙「g」。通過調整傾斜板37的傾斜角，可以調整控制對象的空氣流的量。空氣流入內筒5中時，空氣流控制裝置36進行垂直軸的旋轉，由此，空氣流強制性地向圓筒5的壁方向流動，該壁被外筒4內的冷卻材料6冷卻。或者，用發動機等驅動空氣流控制裝置36，可以促進空氣流中的水分的去除。得到的凝結物從排放口7排出，回收。
圖7示出了空氣流的控制是以使用三重結構的容器等來實施的凝結裝置3的其他實施例。外容器4」與前述的實施例同樣，在其環狀結構內具有冷卻材料6。中間容器M是將來自提取裝置的空氣流通過適當的配管94而吸入，通過配管93排出到裝置外(根據情況，使其在箱1中再循環)。中心容器5」是將中間容器M的內容物引到外容器4」側以輔助促進冷卻而配製的。容器的形狀優選筒狀，但不必一定是筒狀，只要是以可以對外容器4」吹入中間容器M內的空氣這樣的方法來促進冷卻，也可以是其他的形狀。冷卻壁的表面積也是重要的，因此，為了擴大表面積，也可以為之字形，或者也可以從冷卻壁上延伸凸起，擴大其表面積。
圖8示出了凝結裝置的另一實施例。該實施例中，除了中心容器5」中充滿冷卻流體這一點外，與圖7所示的相同，但是，該冷卻流體既可以是與外容器4」內含有的冷卻流體相同，也可以是其他種類。當流體是同一種類時，可以將連接設備95設置在中心容器5」與外容器4」之間，在兩容器之間循環冷卻流體。如圖7的實施例所示，中心容器5」優選筒狀，但不必一定是筒狀，也可以使用擴大冷卻面的表面積促進冷卻，將被冷卻介質壓迫在冷卻面上使冷卻容易的其他形狀。中心容器5」也可以如使被冷卻介質遍布在容器底部那樣做成短的。
此外，在被冷卻介質從凝結裝置中排出之前，可以配置被冷卻介質的入口以及出口以使其可以環繞中心容器5」的外周。如圖9所示，中心容器5」也可以比外容器4」以及中間容器M長，並且其中包含用於引入冷卻流體的入口96。為了提高介質的溫度從介質中除去水分，凝結裝置可以與加熱器組合。將多個裝置串聯配置可以促進凝結，但考慮到某種程度估計的設置空間，可以在垂直方向或者水平方向串聯配置。本裝置與在空氣流控制方面使用旋轉裝置的圖2的實施例相比，其製備更簡單而且迅速。
圖9以及10中示出了凝結裝置3的其他實施例。該凝結裝置3包含箱，但該箱也可以是塑料制的，其內部中適合的是如示例那樣的散熱片(フイン)形狀的1個或者多個冷卻面4a～4n以留出間隔來配置。冷卻面4a～4n可以是以任何熱傳導材料做成的，但優選金屬制的，鋁製的最適合。冷卻面4a-4n優選廣泛地遍及箱3的大部分，由此，如以下詳細說明的那樣，擴展流入物質在箱內接觸的面積。留出間隔來配置的冷卻面4a～4n的數目不是固定的，依賴於凝結裝置3的箱的尺寸以及所期望的最適合凝結率。如示例那樣，冷卻面4a～4n優選隨著向其自由端越來越細。在優選的實施例中，冷卻面4a～4n包含將凝結措施的箱分成2個分離室或者區域的同樣大小的隔板5，1個室是流入材料的入口，另1個是用於凝結裝置3中沒有凝結的材料進行回流。更優選，來自管P2的流入物質向下方流動(圖2中所示裝置的方向)，進入第1室，在那裡物質與在其中配置的冷卻面4a～4n接觸。沒有凝結的物質然後穿過該第1室，進入到凝結室30內的第2室中，2個室在凝結室內連通，在這裡物質經過第2室內流向上方向(這種情況也是裝置處於圖2所示的方向的情況)，此時，與在室內配置的冷卻面4a～4n接觸。在第2室內沒有凝結的物質從管P3流出，由風扇(フアン)8再循環到容器1中。
在冷卻面4a～4n的冷卻中，使用本領域中一般的1個或多個熱電冷卻器20。簡單地說，熱電冷卻器是固體狀熱泵，由此，流過冷卻器的DC電流帶來熱傳導，產生冷的面和熱的面。熱電冷卻器20由於冷卻面4a～4n和熱傳導潤滑脂(グリ一ス)等的使用等而存在熱傳導關係。冷卻器20配置成其低溫面對冷卻面4a～4n進行冷卻。根據所要求的冷卻，也可以利用含有多個電熱冷卻器20的組件設計。
此外，為了散熱，也可以將散熱片21設置成與熱電冷卻器20成熱傳導關係。風扇22也可以配置在散熱器21的附近，促進熱的消散。
本發明人發現，由裝備有熱電冷卻器20的凝結裝置3生成的凝結物的量，在冷卻面4a～4n的溫度在3℃至60℃之間時，效率最好。作為優選的溫度區域，還包括10～60℃以及30～55℃。在該溫度區域的下端溫度時，由於多個電熱冷卻器成為必要，所以提供更大型的散熱片，更大的風扇的風量，以及為了冷卻器和風扇運轉而提供更大的電力供給就成為必要了。
在凝結裝置3中因冷卻而生成的凝結物，流入到配置在凝結裝置3的下端部、冷卻面4a～4n終止點之下的凝結室30內。凝結物從凝結室30流入到排液管31中，導入到收集凝結物的提取物貯留槽內。沒有凝結的蒸汽，為了再進行處理，被管P3以及風扇8再循環到容器1中。
至少1個或多個(示例中是2個)空氣循環設備或驅動設備，優選是以風扇或鼓風機8的形式配備。風扇8對於系統全體進行減壓以及運送空氣來說，有足夠的大小是必要的。減壓必須是在大約5-500mm H2O的範圍內。已確認通常的家庭用吸塵器的風扇是有效的。
凝結裝置3通過管P3與箱1連通。將閥V2配置在管P3內，可以與閥V1一起控制空氣流及減壓。例如，如果一邊將閥V1部分地關閉，一邊開放閥2，凝結裝置3就成為減壓狀態。如果一邊將閥2部分地關閉，一邊開放閥1，凝結裝置3內的壓力就上升。閥的調節可以手動實施也可以自動實施。
以下基於上述結構說明裝置的運轉。
首先，將材料用適當的方法破碎成大約米粒大小，然後填充到圖5(a)所示的內筒20內。填充完了後，為了維持材料在內筒2c中穩定，使材料蓋上網。
然後將內筒2c裝入到圖3所示的外筒內。用能有蒸汽發生的足夠量的水或者其他液體填滿箱1。水可以採用持續維持同一水平的方式，或者可以分批加入。將溫度表設定為所期望的溫度，啟動加熱器，將水加熱到提取裝置2內的溫度不破壞原料的有效成分的水平(一般不到100℃)的適當的溫度。例如，咖啡豆的場合，為了使水到達提取裝置時的水溫約在60-70℃範圍內，優選約65℃，期望將水溫加熱至85℃。
箱1內的水溫達到所期望的水平時，啟動鼓風機8，系統內的流動開始循環。通過鼓風機8，空氣流在由箱1、提取裝置2、凝結裝置3以及分別連接這些裝置的管所形成的閉合循環流路內循環。這樣，在箱1內產生的水蒸氣，與空氣流一起流過管P內，到達提取裝置2。提取裝置2內的溫度可以通過溫度傳感器測定，可以確認其內部是否到達了適合的溫度。箱1內的溫度可以根據提取裝置2內的溫度來控制。
如上所述，鼓風機啟動時，空氣流在各裝置間循環，但提取裝置2用粉碎的原料粒子S填滿了，該原料形成對空氣流的阻抗，由此在提取裝置2內產生減壓空間。
達到減壓狀態時，原料內的成分被提取到原料碎片S的表面上，然後被從其中通過的水蒸氣捕獲。提取裝置內的溫度更具體地是由於內筒2c內的溫度被維持在所期望的範圍內，原料內所含的成分被提取到水中而不被熱破壞。
含有得到的原料有效成分的液體(例如水)，然後與來自鼓風機8的空氣流一起通過連接管P2被送到凝結裝置3中。凝結裝置3的外筒4被對於內筒5內的水凝結是足夠溫度的冷卻材料填滿，優選被水填滿。凝結裝置內的空氣流以及減壓可以通過調節閥V1以及V2進行控制。液化或者凝結了的材料如示例那樣，可以從排放口7排出，最終通過閥3進行收集。
凝集裝置3內沒有液化的粒子，與空氣流一起通過連接管P3被吸入到箱1中再循環。再循環部分可以根據情況進行通過整流板(プレ一ト)預熱，或者形成螺旋狀而不降低槽1內的水溫。
凝集裝置3內的冷卻材料可以定期更換。或者也可以通過冷卻液的連續流將內筒5冷卻。
原料可以粉碎成大約米粒大小。然而，最終生成物中含有的有效成分的濃度可以通過改變原料的大小來控制。例如，將原料粉碎成微小片時，可以得到有效成分濃度高的的最終生成物。然而在這種情況下，最終生成物的生成速度變慢。原料的大小越大，最終生成物內的有效成分濃度越低，生成速度越塊。同樣，通過利用導向板2d，單位時間的最終生成物的收率提高了大約20％，但最終生成物內的有效成分濃度下降。
如果利用前述各實施例的裝置，使含有水分的空氣在凝結裝置內循環，減少或除去該水分，不受外部氣體的影響，得到取得平衡的乾燥狀態。其結果是，乾燥時間以及伴隨乾燥所必要的能量大幅減少。
生成物是無色、透明的澄清液體。然後提取物被固化。
在實施例1中，固化步驟如下。
使用作為吸收材料的非營養性材料。作為優選的材料，可以舉出，ミリポア公司的以商標名Duraporeフイルタ市售的各種修飾的聚偏氟乙烯膜、玻璃纖維膜、綿、尼龍、纖維素或者可以用於袋裝茶葉的紙材料。材料的形狀沒有特別的限制，也包括片狀(シ一ト)和圓盤狀(デイスク)。以特定的使用目的而選擇的材料的具體性質，某種程度上依賴於在對最終生成物的成分進行鑑定的分析工序等後續工序中所使用的溶劑的性質。
使吸收材料與提取物接觸。期望吸收材料的表面全部用提取物潤溼。當吸收劑材料是濾器時，使用叫做壓力或真空(例如使用真空泵)的驅動力，以按押提取物或者抽吸提取物通過濾器的方式，可以使材料完全被提取物潤溼。根據情況，也可以在用提取物潤溼吸收劑材料之前或者之中進行加熱，擴大孔，使容易潤溼。替代這樣的方式，或者在這樣的基礎之上，還可以將提取物單獨、或者與吸收劑材料一起加熱。
將吸收劑材料用提取物充分潤溼之後，優選將提取物通過乾燥附著於濾器。乾燥可以通過冷凍乾燥、加熱或空氣乾燥來實現，但冷凍乾燥是尤其優選的。乾燥的材料，不會使提取物惡化，可以長時間保存。乾燥材料可以用水或適當的溶劑溶解，由此，提取物的有效成分在水或溶劑中溶解析出。根據需要，可以利用高壓促進該溶解。乾燥材料可以用於分析、尤其是針對醫藥研究的分析，此外，也可以用於最初溶解之後得到的溶液的分析。在使用的吸收劑材料是紙的情況下，也可以將乾燥材料溶解在水中作為健康飲料而飲用。
在利用冷凍乾燥的情況下，期望冷凍乾燥工序是在約-10℃至約-70℃的範圍的溫度、和排氣量約5.3cfm至約23cfm的真空下進行。本領域技術人員應當認識到，前述溫度以及真空有時會根據材料的特性以及材料的大小以及實際使用的冷凍乾燥機而變動。將材料冷凍乾燥所用的時間，可以由本領域技術人員容易地決定，部分地依賴於材料的濃度。
得到的生成物不會對生成物的品質或風味帶來有害作用，可以以日為單位至以月為單位進行長時間保存。而且，用水或者其他液體載體恢復到原來的情況時，得到生成物的風味比原來的原料好。輸送以及保管容易，更經濟。用其他方法時，提取物中的有效成分會被加熱破壞，但通過使用上述提取工序而可以保存。冷凍乾燥生成物與液體提取物比較，具有更長的保存時間，對化學鑑定以及實驗有利。
冷凍乾燥生成物只要在生成物中加入液體載體、優選水，就能容易地復原。添加的液體載體的量沒有特別的限制，依賴於期望的最終飲用液體內的提取物濃度。前述生成物可以直接(即不還原)作為其他食品添加劑或配料，例如沙拉配料使用，或者作為乾燥湯的成分，或者與其他食品成分混合使用。加熱冷凍乾燥生成物，也可以在室內充滿芳香蒸汽。
以前述的方法，從咖啡豆提取的本發明的肽具有以下序列酪氨酸(Thr)-甘氨酸(Gly)-絲氨酸(Ser)-精氨酸(Arg)-絲氨酸(Ser)。
含有有效量的該肽的藥物組合物作為人用以及動物用的藥物，對於例如包括癌症以及抗炎症症狀的各種各樣的疾病以及病症的治療和/或預防有用。對於患者的治療有效的量是指，在給藥於以該量為必要的患者時，抑制癌的惡化，縮小或去除腫瘤的體積或者大小，殺死惡性細胞，和/或減輕或去除炎症的化合物的量。作為肽有效的各種疾病，可以舉出各種類型的癌。作為肽有效的各種類型的炎症，可以舉出，腦炎、髓膜炎、瞼緣炎、結膜炎、角膜炎、虹膜炎、視網膜炎、口炎、唇炎、舌炎、扁桃體炎、內耳炎、外耳炎、中耳炎、胃炎、十二指腸炎、肺炎、胸膜炎、支氣管炎、鼻炎、結腸炎、小腸炎症、腎炎、腎盂腎炎、胰腺炎、膽囊炎、肝炎、甲狀腺炎、前列腺炎、膀胱炎、肌肉炎、骨膜炎、骨髓炎、睪丸炎、子宮內膜炎、陰道炎、卵巢炎、皮膚炎、關節炎、肛周炎、淋巴結炎、糖尿病(胰島的炎症)、感冒(扁桃體炎、支氣管炎、鼻炎、黏膜炎)、蕁麻疹、各種溼疹(皮膚炎)、腎病(腎炎)、齦膿腫(牙周炎、牙根炎、牙髓炎)、氣喘(支氣管炎)、神經痛(神經炎)、肺結核(肺炎、支氣管炎、黏膜炎)、感染症(細菌以及病毒誘導的炎症)、過敏(抗原-抗體反應誘導的炎症)、麻風病(病毒性皮膚炎以及肌肉炎)、癌(炎症以及纖維樣硬化或其他原因)、潰瘍(炎症的惡化)、纖維樣硬化(炎症以及潰瘍的惡化)、能量下降(腺炎)、角化上皮症、膠原病、癔病、神經病、肝硬化、高血壓、血栓症、心絞痛(アンギナ)、風溼病、痛風、僵直、阿爾茨海默病、ライム病、狂牛症以及寄生蟲所致的炎症。
在疾病的治療或預防中的本發明的提取物的治療或預防用量的大小，部分地依賴於治療對象狀態的種類、嚴重程度以及性質等。此外藥劑的給藥量以及給藥次數，根據各個患者的年齡、體重以及反應而變化。一般地，本發明的肽的總日用量是至少1日1次，優選1日2次至3次，大約1至10mcg/kg體重的範圍。嚴重程度很高的情況下的給藥量至少是1日1次，約10至約100mcg/kg體重的範圍。在必要或者期望的情況下給藥次數是1日約3次至4次。
本發明的肽的有效用量可以採用本領域公知的任何適合的給藥途徑給藥，可以列舉出經口、靜脈內、肌肉內、皮內以及皮下，優選經口給藥，以液體形式給藥是最優選的。
本發明的藥物組合物也可以與稱為鎮痛藥的其他治療藥組合。
本發明的藥物組合物可給藥於包括犬、貓、魚以及人的動物。本發明的化合物中，可以含有包括下述的藥學上可接受的載體以及其他通常的添加物以水為基質的載體、乙醇、丙二醇以及甘油等的普通溶劑、增量劑、潤滑劑、溼潤劑、芳香劑、著色劑、乳化劑、懸浮化或者分散劑、懸浮劑、甜味劑等。提取物優選單純地用水稀釋，無載體或者添加物經口給藥。
實施例實施例1本發明的肽按照以下來分離、鑑定。
以咖啡豆為原料使用上面詳述的提取方法。用得到的提取物溼潤玻璃纖維膜(96.4g)。將膜用300ml醋酸乙酯提取3次。使用旋轉蒸發器，通過抽真空使醋酸乙酯形成幾乎乾燥的狀態。溶劑層的溫度不超過40℃。殘留物是明亮的茶色液體(20.6ml)。然後將該提取物用150ml乙醚提取。取出乙醚層，用無水硫酸鈉乾燥。除去硫酸鈉，將乙醚層在旋轉蒸發器內真空乾燥。得到白色短針狀化合物。將其溶解在乙醇中後，蒸發乙醇，進行重結晶化。然後將化合物用於化學分析，得到以下參數吸收光譜 348mu薄層色譜法メルク公司矽膠3.8ミクロケルダ一ル 12.4％(通過Kjeldahl法測定的肽的分析量)熔點 172℃胺基酸序列酪氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-絲氨酸實施例2方案設計採用以使用大鼠而開發的佐劑(アジユバント)誘導關節炎模型，顯示可以篩選對人慢性關節風溼症的治療有效的化合物。佐劑誘導關節炎反應在甾體和非甾體兩方面。炎症的程度通過測定足的重量和/或足的體積的差別來評價。
試驗生物體重150～200g的大鼠從位於華盛頓(ワシントン)州ケント的AnimalTechnologies Ltd.購入。大鼠是雄性的Sprague-Dawley大鼠。大鼠在不鏽鋼製的籠子中單個飼養，自由攝取水以及餌(Harlan Tekla Rodent Diet)。明暗周期為維持明12小時暗12小時。溫度保持在22℃±3℃，相對溼度為40％至70％。
給藥將試驗物質以10mcg/kg或1mcg/kg體重的用量用去離子水溶解或懸浮。試驗化合物以及氫化可的松以胃管飼法給藥。
實驗計劃對雄性的Sprague-Dawley大鼠(150～200g)注射弗氏完全佐劑(滅活結核菌的0.5％懸浮液(礦物油中的H37RA，Difco)，致敏。對各大鼠的右後足腳掌皮下給藥0.1ml的等分試樣。
各處理組，每組5隻，10天，1天1次經口給藥(以胃管飼法)試驗物質。試驗物質的給藥從致敏日開始。
恰好在致敏前以及在第10天，進行左後足的測定。與沒有致敏的大鼠組比較，判定腳掌浮腫抑制率以及體重增加率。
對各組中每個組的腳掌重量進行平均。抗炎症活性以下式計算抗炎症反應％＝(對照組的平均腳掌重量-試驗組的平均腳掌重量)/(試驗組的平均平均重量)，比較平均重量來判定。
使用氫化可的松作陽性對照。氫化可的松是以10mg/kg體重的用量對慢性關節風溼症患者給藥的一般抗炎症藥。肽以10mcg/kg以及1mcg/kg體重給藥。
表1 大鼠佐劑誘導關節炎中的分離肽的比較
表2 大鼠的體重增加的比較
結果顯示10mcg/kg體重的肽100％抑制誘導炎症。1mcg/kg體重時，肽顯示85.3％抑制。因此，肽是不會引起體重降低的強力炎症抑制劑。
實施例3試驗生物種小鼠系統Swiss-Webster供給來源Animal Technologies Ltd.，Kent，WA性別雌性體重26～30使用數60隻管理研究設施USDA註冊號91-R-043。NIH公眾衛生證書號A3932-01動物室明暗周期＝明12小時、暗12小時。溫度/相對溼度儘量努力維持溫度22℃±3℃以及相對溼度40～70％下進行。
飼養小鼠每5隻一組，在標準籠子內，按照美國學術研究會議、實驗資料研究所的《關於實驗動物的飼養以及利用的指南(Guide for the Care andUse of Laboratory Animals)》進行飼養。
衛生排洩物每2周除去。籠子以及給餌器每2周消毒。
餌Marlan Teklad Rodent Diet#8604適量餌分析不存在可以合理預想在食物材料中含有的已知有妨礙調查目的或實施的可能性的汙染物。
水是不含可生物利用的發熱物質的去離子水。
水分析系統由Continental Water System Company每6個月定期維護(活性炭槽、去離子有孔玻璃珠(ビ一ズ)以及管道式過濾器的更換)。UF膜的更換是每2年，UV燈的更換是每年。
試驗品來自咖啡豆的分離物給藥方法試驗品採用胃管飼法，連續11天，以分離物的水溶液給藥。
試驗品給藥量以胃管飼法給藥0.2ml。
處理時間11天。第12天處死。
測定方法保存腫瘤株是肉瘤180，是在美國模式培養物保藏所(American TypeCulture Collection)的研究所內得到。該保存培養株，以1周間隔，以未處理的Swiss-Webster小鼠腹水的形式傳代。
此次的調查全部使用從位於華盛頓州ケント的Animal Technologies Ltd.得到的Swiss-Webster小鼠來進行。為了調整接種材料，將7～12天的小鼠的腹水使用無菌技術來吸引。使用臺盼藍染色法檢查腫瘤細胞的生存率。確定了細胞數後，將腫瘤細胞用通常的生理鹽水或者磷酸緩衝生理鹽水稀釋，調成最終濃度1～2×106細胞/mm3。之後將該稀釋液作為腫瘤懸浮液注射到小鼠中。將最終稀釋液在胰腖豆腖瓊脂培養基上接種培養，判定是否有汙染。
將上述懸浮液的10分之一(0.1ml)接種到各小鼠的左後腳的肌肉內(大腿屈肌)。將接種的小鼠放入1個大型籠子內後，隨機分成每5隻一組。小鼠在鋪有木屑的鞋箱型籠子內飼養，自由攝取水以及固體飼料。在接種時、第7天、第12天以及處死時測定小鼠的體重。
小鼠的處理在移植後當天開始。觀察期結束時，將小鼠通過乙醚麻醉處死。去除左後腳上的皮膚露出腫瘤，在髖關節位置取出腳以及腫瘤。去除殘留的皮膚，逐個測定有腫瘤的腳部的重量。同樣準備10隻腳的正常腳(右腳)，測定重量。從有腫瘤的腳的重量中扣除正常腳的平均值，得到實際的腫瘤重量的推定值。抑制％＝[(平均腫瘤重量(試驗組))/(平均腫瘤重量(對照組))]×100結果表3 抑制百分數
表4 平均體重增加
如數據所示，肽在10mcg/kg體重時顯示100％抑制。與肽的給藥相關的體重增加與對照相匹敵，顯示無毒性。
工業實用性如上所述。本發明涉及的肽使提供新的有效的藥物組合物成為可能，該藥物組合物具有對以下各種疾病的改善、治癒特別的效力，所述疾病為各種類型的癌、各種類型的炎症、感染症(細菌以及病毒誘導的炎症)、過敏(抗原-抗體反應誘導的炎症)、麻風病(病毒性皮膚炎以及肌肉炎)、、肝硬化、高血壓、血栓症、心絞痛、風溼症、痛風、僵直、阿爾茨海默病、ライム病、狂牛症以及寄生蟲所致的炎症等各種疾病。
序列表110久保山生物株式會社(KUBOYAMA BIOKEN CO.，LTD.)120新肽及其製備方法以及含有該肽的藥物組合物1301314-PCT150U.S.A.10/747,4661512003-12-291601170Windows Me21012115212PRT213咖啡豆220
223申請人亨利·青木(Henry Aoki)4001Thr Gly Ser Arg Ser1權利要求
1.具有以下胺基酸序列的肽酪氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-絲氨酸。
2.藥物組合物，含有權利要求1中所述的肽和藥學上可接受的載體。
3.由咖啡豆的提取物製備具有酪氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-絲氨酸胺基酸序列的肽的方法，該方法具備以下工序將水加熱至所設定溫度的工序；和將前述加熱的水霧化成微粒狀的工序；和在減壓狀態下加熱前述咖啡豆，使其與霧化的前述水的微粒接觸的工序；和使產生的水粒子凝結的工序；和收集產生的冷卻水的工序；以及用以下的方法將產生的提取液固化的工序提供吸收劑的工序，和使前述吸收劑材料與前述提取物接觸的工序；和將產生的溼潤的吸收劑材料乾燥，生成前述提取物的固體物的工序；和從前述提取物中分離含有前述肽的液體的工序。
4.權利要求3中所述的製備方法，其特徵在於前述吸收劑材料是玻璃纖維。
5.權利要求4中所述的製備方法，其特徵在於乾燥是冷凍乾燥。
6.權利要求5中所述的製備方法，其特徵在於前述的冷凍乾燥是在約-10℃至約-70℃範圍的溫度下實施的。
全文摘要
具有抗癌活性以及抗炎症活性的、具有胺基酸序列酪氨酸－甘氨酸－絲氨酸－精氨酸－絲氨酸的生物活性肽，以及由該肽配製的藥物組合物，以及前述肽以及藥物組合物的製備方法。前述肽是利用有效回收來自原料的衍生物的加熱、提取以及凝結系統而得到。
文檔編號A23F5/24GK1902217SQ20048003946
公開日2007年1月24日 申請日期2004年6月22日 優先權日2003年12月29日
發明者亨利·青木 申請人:久保山生物株式會社