用於水產養殖的可口服給藥的免疫刺激產品的製作方法

2023-12-05 09:07:36

專利名稱：用於水產養殖的可口服給藥的免疫刺激產品的製作方法
用於水產養殖的可口服給藥的免疫刺激產品
背景技術：
水產養殖似乎是滿足漁業(extractive fishing)所無法滿足的不斷增長的水產食品需求的唯一可能。在過去的50年間，全世界的水產養殖產量已由50年代早期的不足 100萬噸的產量提高到2004年的5940萬噸。該產量水平的價值為703億美元。全世界總產量的69. 6%產於中國，21. 9%產於亞洲其它地區和太平洋地區，3. 5%產於西歐地區，並且0.4%產於中東歐地區。在環境方面，2004年來自海水養殖(鹹水水產養殖)的水產產量為3020萬噸，佔總產量的50. 9%。淡水水產養殖提供2580萬噸4% )，而其餘340萬噸(5.7%)來自半鹹水(brackish)環境的產量。所有數據均來自於FisheriesTechnical Paper 2006, State of World Aquaculture(FAO)。歐洲的水產產量僅佔世界產量的3%，但在數個種類的生產方面處於領先地位，例如大西洋鮭魚、鱒魚、海鱸、金頭鯛(gilthead seabream)、大菱鮃和貽貝。2002年的產量超過130萬噸，價值32. 8億歐元。地中海國家中最重要的物種是金頭鯛、海鱸和大菱鮃。2002 年，金頭鯛和海鱸二者的產量為181000噸，主要產地為希臘、土耳其、西班牙、義大利和法國。大菱鮃在2002年的產量為5320噸，其中75%產自西班牙。所有數據均來自FA0。魚類疾病已經成為水產養殖的障礙，並且正對世界上很多國家的經濟發展造成嚴重影響。疾病在很多情況下導致高死亡率，並且是重大產量損失的原因。水產損失還導致食物供應減少、收入和就業損失以及各種相關的社會後果。影響上述物種的最常見疾病及其病原(causal agent)(細菌或病毒)為弧菌病(弧菌屬美人魚發光桿菌美人魚亞禾中(Photobacterium damselaesubsp. damselae, Vibrio spp·))、巴斯德菌
( ^Afe^T^ff(Photobacterium damselae subp. piscicida) )> ^jtff
菌病(photobacteriosis)(美人魚發光桿菌巴斯德菌亞種(Photobacterium damselae subp. pasteurella))、屈接桿菌病(flexibacteriosis)(海洋屈接桿菌(Tenacibaculum maritimum))、分枝桿菌病(myxobacteriosis)(海岸屈接桿菌(Flexibacter maritimus))、癤病(殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida))、鏈球菌病(副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis))、冬季疾病綜合症(病鯖假單胞菌(Pseudomonas anguillis印tica))、病毒性腦病禾口視網膜病(viral encephaloretinopathy)(野田村病毒(Nodavirus))、淋巴囊腫(虹膜病毒科(Iridoviridae))、腸脹氣綜合症(distendedgut syndrome)(病毒樣顆粒)、感染性胰腺壞死(IPNV)、感染性造血組織壞死(IHNV)或病毒性出血性敗血症(VHS)。所有數據均來自Cultured AquaticSpecies Information Programme (FAO)。水產養殖場中物種的養殖條件(即高密度的動物或水生環境)適合於傳染性病原 (disease agent)在個體之間的傳播。此外，養殖場中的魚類在對其處理(manipulation) 期間產生的應激可能導致免疫系統抑制，所述免疫系統的抑制促進病原體的感染。因此，已在疫苗或免疫刺激產品的研發中投入大量研究精力以預防魚類疾病。由於避免了抗生素在水產養殖中的大量使用，疾病的預防還減少了對環境的影響。現已有數種產品用於魚類的疫苗接種或免疫系統刺激。實際上，已有可用於普通細菌性魚類疾病(例如弧菌病、發光桿菌病、癤病、屈撓桿菌病、冬季疾病綜合症或鏈球菌病)以及可用於普通病毒性魚類疾病 (例如IPNV或IHNV)的疫苗(參見Toranzo等人，2005和Sommerset等人，2005的綜述)。疫苗接種有三種常見方法浸漬、注射和口服給藥。腹膜內注射是最有效的疫苗接種途徑，這是因為其允許更好的劑量控制，並且可使用產生更好免疫應答的佐劑。但是，由於對魚類的鎮靜和處理可能導致動物的應激，並且可能在疫苗給藥不謹慎時對魚類造成傷害，所以注射途徑也存在一些缺點。此外，無法通過此途徑對小魚進行疫苗接種。由於簡單快速，所以養殖場常使用浸漬法，但該方法不能進行嚴格的劑量控制，並且使魚類產生應激並具有頑固的免疫系統抑制。疫苗的口服給藥不需要對魚類進行處理，並且是適合於對所有大小的動物進行免疫接種的方法，所述動物包括開始進食的幼魚，由於這些魚更易於被病原體感染，所以這一點非常重要。口服途徑的幾個缺點在於不能進行嚴格的劑量控制，並且需要大量抗原以進行免疫。口服給藥的最大障礙是抗原常因酸性環境或蛋白酶活性而在腸中失活，並且阻止活性抗原的腸吸收。因此，有效的口服給藥需要對抗原進行保護(即包封)，以防止抗原在腸中降解(Hart等人，1988 ；Quentel和Vigneulle, 1997)。用於保護抗原免於降解的不同方法已顯示出一些具有前景的結果，例如包埋在脂質體或藻酸鹽微粒中 (Ire 等人，2005 ；Maurice 等人，2004)。現有技術描述在水產養殖中使用免疫刺激劑(immunostimulant)以提高魚類對疾病的抵抗力。 已記載了很多不同免疫刺激劑的化學性質和作用方式，所述免疫刺激劑例如細菌的結構元件(LPS)、來自細菌和絲狀真菌的各種β_1，3葡聚糖產物、來自酵母細胞壁的β_1，3/1，6 葡聚糖、來自多種生物來源的複雜碳水化合物結構(葡聚糖)、存在於某些動物的提取物中或通過魚類蛋白的酶解而製備的肽、核苷酸、合成產品(左旋咪唑)和維生素C(參見Raa， 1996的綜述)。所用的某些免疫刺激劑還增強特異性抗體反應(參見&ikai，1999的綜述)。水產養殖中的數種情形適合於免疫刺激劑的使用，例如對魚類的處理、水溫變化、較高的病原體暴露、疫苗佐劑和所有應激狀態。現已公布了關於免疫刺激劑在金頭鯛免疫系統中的作用的多項研究，所述免疫刺激劑例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞壁 (OrtUfio 等人,2002 ；Rodriguez 等人，2003)、殼多糖(Esteban 等人，2000 ；Esteban 等人， 2001 ；Cuesta 等人，2003)、維生素 C 和 E(Cuesta 等人，2002 ；Ortufio等人，2003)和左旋咪唑(Mulero等人，1998 ;CueSta等人，2002)。在已知對魚類有效的免疫刺激劑中，葡聚糖、 殼多糖和左旋咪唑增強吞噬活性，而酵母葡聚糖和維生素C還激活補體活性。現已公開了將B-I，3/1，6葡聚糖作為免疫刺激劑應用的數項研究，並且在涉及提高大比目魚幼體在其發育關鍵期的存活率(0ttesen，Lunde和Engstad，1999)、增強對細菌性疾病的抵抗力(Raa 等人，1990 ；Robertsen 等人，1990)以及增強疫苗功效(Raa 等人，1990 ；Rorstad, Aasjord 和Robertsen，1993)的方面取得良好結果。由於細胞因子調控重要生物過程(例如細胞生長、細胞活化、炎症、免疫力、組織修復、纖維化和形態發生)的量，所以細胞因子是屬於廣義概念的「免疫調節劑」的蛋白質。 細胞因子是共享數種性質的不同種類的蛋白質，並且對於先天性及適應性免疫應答的介導效應期(mediate effectors phases)的發育和機能都至關重要。近幾年已克隆了大量細胞因子，並在多個魚類物種中進行測序(參見Bird等人，2002的綜述)。可按照細胞因子的功能將其分成四類
a)介導先天性免疫的細胞因子。在魚類中得到最佳表徵的此類細胞因子是包括 IFNa和IFN β的I型幹擾素(IFN)，包括IL-1 a、IL-1 β、IL-1受體拮抗劑和IL-18的白細胞介素(IL-I)家族，以及包括TNF a、TNF β、Lt β和Fas配體的腫瘤壞死因子(TNF)家族，其中TNFa是在免疫系統中具有調控功能的最重要成員；b)調控造血作用的細胞因子；c)調控淋巴細胞的細胞因子；和d)控制非特異性效應細胞的細胞因子。在魚類中得到最佳表徵的此類細胞因子是b)組中的白細胞介素2(IL_2)以及c) 組中的幹擾素Y (IFNy)和轉化生長因子β (TGF^)0TNFa是單核細胞/巨噬細胞在急性炎症期間產生的炎性細胞因子，並且負責細胞內不同範圍的信號轉導事件。TNFa在對抗寄生性、細菌性和病毒性感染中作為重要介質發揮作用(Czarniecki, 1993 ；Goldfeld 和 Tsai, 1996 ；Steinshamn 等人，1996)。TNFa 還具有其它重要的治療功能，包括抗腫瘤(Vilcek和Lee，1991)、睡眠調節(Krueger等人， 1998)和胚胎發育(Wride和Sanders，1995)。TNFa通過作為三聚體與細胞膜受體TNFR-I 或TNFR-2結合來發揮這些功能(Dembic等人，1990 ；Loetscher等人，1990)，這兩種受體均大量存在於大多數細胞中(Letscher等人，1991 ；Schoenfeld等人，1991)。TNFamRNA似乎在多種細胞中轉錄，並且主要以轉錄後水平受到調控(Han等人， 1990)。TNFa以膜結合形式和可溶形式這兩種形式存在，每種形式可能具有不同的生理作用(Watts等人，1997)。TNFa表達為^kDa的膜結合前體，其被解聚素金屬蛋白酶 (TACEiTNFa轉化酶)溶蛋白性裂解，以產生17kDa的C端活性形式(Black等人，1997 ； Moss 等人，1997)。已對數種哺乳動物的TNF α基因(TNF α gen)完全或部分測序，所述哺乳動物包括人(Pennica 等人，1984)、黑猩猩(Kutsi 等人，2002)、小鼠(Shirai 等人，1988)、犬(Zucker 等人，1994)或貓(McGraw等人，1990)。也已對數種魚類的TNFa基因或TNF α基因片段測序，所述魚類例如黑鯛(black seabream) (Cai等人，2003)、虹鱒(Laing等人，2001)、鯉魚(Saeij等人，200 或斑馬魚(Phelan等人，2003)或金頭鯛(Garcia-Castillo等人， 2002)。金頭鯛的TNFa基因具有4個外顯子和3個內含子，長度為1244pb。cDNA由1359pb 組成，其包括762pb的開放讀碼框(ORF)、142pb的5，-非翻譯區(UTR)和455pb的3'UTR0 推導蛋白具有253個胺基酸，估計分子量為^kDa,其(特別是在參與同受體相互作用的 C-端末端)與其它魚類的TNFa具有高序列同源性。TNFa蛋白包含在第37和第M殘基之間的跨膜區以及與TACE溶蛋白性裂解相關的Thr-Leu保守序列(Garcia-Castillo等人，2002)。因此，可以區分253個胺基酸的膜結合蛋白(proTNFa)和167個胺基酸的可溶蛋白(sbTNFa)。表達研究揭示TNFa在所檢測的所有金頭鯛組織(例如肝、腮、血液、頭腎、腹膜滲出液、腦和脾)中的組成型表達，巨噬細胞是此分子的主要來源之一。US 5871751 公開了用於治療對鮭魚腎菌(Renibacterium salmoninarum)的感染敏感的魚類的疫苗和方法。所述疫苗包括缺少完整細胞表面相關蛋白P57的滅活微生物， 並可包被腸溶衣以供口服遞送。所述腸溶衣包括聚合物包衣，其不在胃中溶解和/或降解，但在進入腸道的較高PH環境時溶解。所公開疫苗的優選實施方案是使用球形糖微球製成， 其由包含缺少完整細胞表面相關蛋白P57的滅活微生物的第一層包被，隨後由腸溶衣的第二層包被，所述第二層包含不在魚類的胃中溶解和/或降解的材料。WO 03/020040A1公開了由包封了含抗原的單細胞生物的多細胞生物組成的口服疫苗。此疫苗用於飼餵待接種疫苗的水生動物(例如魚類)。根據WO 03/020040，通過兩步飼餵將在單細胞微生物中表達的抗原遞送到水生動物中，即將單細胞微生物(包含抗原)飼餵給多細胞生物以及將多細胞生物飼餵給水生動物。根據WO 03/020040，總是需要單細胞微生物和多細胞生物二者同時存在。待表達的抗原依賴於誘導的免疫應答是否針對目標病原體。WO 03/020040描述了作為細菌抗原的假單胞菌外毒素A(PE)、作為單細胞微生物的大腸桿菌(E. coli)、作為多細胞生物的滷蟲無節幼體(Artemianauplii)。根據WO 03/020040所公開的口服給藥疫苗的製備，所選的抗原嚴格依賴於疫苗應當針對的目標病原體。ES 2189608A1公開了用於生產重組金頭鯛(Sparus aurata L. ) IL-1 β的方法及其在經濟魚類中作為疫苗佐劑和免疫刺激劑的用途。根據ES2189608，通過將其克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)表達載體中來生產重組IL_1 β。將由此獲得的重組蛋白純化，並用作漁業養殖中的免疫刺激劑和疫苗佐劑。本發明的目的是提供適合於口服給藥的免疫刺激產品，其不發生水解和/或降解，並可被所給藥的生物完全吸收。

發明內容
本發明的一目的是提供能夠向目標個體直接給藥的免疫刺激產品。本發明的另一目的是提供能夠被生物吸收的免疫刺激產品，所述免疫刺激產品以大量的初始給藥量向所述生物給藥。本發明的又一目的是提供免疫刺激產品，其並非特異性地針對一個選定的病原體或一組選定的病原體。本發明的目的還在於提供製備可口服給藥的免疫刺激產品的方法，以及免疫刺激產品用於在魚類水產養殖中激活免疫應答的用途。因此，本發明提供至少包含微囊化的重組魚類細胞因子(特別是腫瘤壞死因子 α (TNFa))的可口服給藥的免疫刺激產品、製備包含微囊化重組魚類細胞因子的可口服給藥的免疫刺激產品的方法、及其用於在魚類水產養殖中激活免疫應答的用途。本發明的一方面體現在充當免疫刺激劑的活性分子(即細胞因子，特別是腫瘤壞死因子a (TNFa))是屬於期望激活其免疫應答的相同魚類物種的細胞因子的事實。由於這樣能夠增強已屬於某物種的一系列免疫刺激劑(immimostimulator)，從而激活該物種的免疫反應，因此這一方面非常重要。這意味著不通過任何方式向所述物種給藥外源因子、化合物或產品，從而使所得結果具有極大的優勢，並且獲得較為安全的途徑。如上所述，根據本發明，充當免疫刺激劑的活性分子是從魚類本身獲得的細胞因子，即腫瘤壞死因子a (TNFa)0因此，在提供免疫刺激產品時不會在動物中引入外源物質 (strange substance)，並避免了副反應的可能性。根據本發明，從魚類組織中分離編碼所選細胞因子的基因，並將其克隆到用於在適合的宿主微生物中表達細胞因子的表達載體中。在生物反應器中使用適合的培養基培養宿主細胞，以獲得最佳的細胞因子表達和高生物質產量。根據本發明的一優選實施方案，所述宿主微生物是酵母，優選巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和釀酒酵母，最優選巴斯德畢赤酵母。選擇酵母作為宿主微生物不是偶然的，而是因為酵母是能夠取決於所選的表達載體而在細胞外或細胞內表達所選細胞因子的真核微生物。這一方面使得能夠決定如何表達重組蛋白，從而在發酵過程中以及在所得產品的純化中提供多個優點。隨後對所述重組蛋白(單獨獲得或在宿主微生物內獲得)進行微囊化過程，由此在任選的純化步驟後獲得即可給藥的微囊化蛋白。所述「微囊化過程」是指適合於為重組細胞因子提供至少部分包被的任何過程，所述包被適合於保護所述細胞因子免於腸降解。實際上，在口服給藥免疫刺激物質的情況下，必須有有效的保護方法以避免所述物質的腸降解，並允許幾乎完全的腸吸收。微囊化是使用聚合材料的連續薄膜環繞或包被液體或固體材料的極小液滴或顆粒，從而獲得微粒的技術過程。微囊化技術廣泛應用於多種生物和化學體系，並可生產大量的產品。根據本發明，用於對所關注及所選的細胞因子 (特別是TNFa )成功實現微囊化的主要技術是通過噴霧乾燥進行霧化。在通過噴霧乾燥進行霧化的技術中，將活性分子溶解或懸浮在熔體或聚合物溶液中，並留在乾燥顆粒中。根據本發明，用於保護重組蛋白微粒免受存在於腸中酸性PH影響的最有用的聚合物選自例如 醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯、羧甲基纖維素、甲基丙烯酸共聚物 (即甲基丙烯酸共聚物LS，例如Eudragit L-30和Kollicoat)。其它可用的聚合物選自例如麥芽糊精、殼聚糖、明膠、澱粉或阿拉伯膠。在本發明中已使用TNFa作為在微生物中表達的細胞因子的實例，隨後將其與多種聚合物混合以保護蛋白免受腸的酸性環境和蛋白酶活性的影響。當宿主微生物允許重組蛋白(即TNF α)在細胞外過度表達時，可以將其直接使用。另一優點在於，當所述蛋白在宿主微生物內過度表達時，對相同的微生物進行微囊化過程，從而獲得能夠直接使用並體現所有上述優點的微囊化微生物。通過噴霧乾燥將所得的過度表達蛋白乾燥，並添加到對健康魚類具有有益效果的魚食中。本發明開發的產品對水產市場具有重大意義，其預防感染所致的魚類疾病、保護某些應激環境下的魚類，並作為疫苗佐劑。根據本發明，由於微囊化過程而獲得的優點，當所述免疫刺激產品用於成魚的處理時，均可將其直接給藥。反之，當所述免疫刺激產品用於小魚或幼魚的處理時，可將其飼餵給多細胞生物(例如滷蟲無節幼體)，隨後將易於被小魚群食用的所述多細胞生物飼餵給小魚。在上述兩種情況下，所述免疫刺激產品的微囊化均使得能夠安全地保持所述產品的主要特徵和活性，從而產生巨大的優勢。例如，現已將金頭鯛的重組SbTNFa進行純化，並在體內和體外測定其生物活性。 重組蛋白在N-端末端包含六個組氨酸標記以用於親和色譜純化以及免疫印跡中的抗-多組氨酸mAb檢測。腹膜內注射導致a)引發腹膜滲出液和頭腎(HK)白細胞的呼吸爆發；b) 向注射位點快速募集吞噬粒細胞；以及c)在HK中誘導粒細胞生成。sbTNFa能夠在體外誘導HK細胞的強烈增殖。本發明的另一優點體現在表達TNF α細胞因子的宿主微生物本身能夠充當免疫刺激物質的額外來源的事實。實際上，細菌的某些結構元件(來自酵母細胞壁的葡聚糖或者來自多種生物來源的複雜碳水化合物結構(葡聚糖))可用作免疫刺激劑。現在通過以下實施例說明本發明，所述實施例是使用在水產養殖中具有重要意義的數個魚類物種的TNFa進行的。然而，在實施本發明時，也可使用其它魚類物種的TNFa 以及其它細胞因子。然而，本發明也適用於提取的或通過合成獲得的細胞因子。附圖簡述現在參考所附的以下非限制性實施例和附圖更為詳細地進一步公開本發明，其中

圖1 顯示用於基因構建體的引物。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖2 包含金頭鯛sbTNFa及推導蛋白序列的DNA片段。以斜體字顯示BamHI限制位點。圖3 包含金頭鯛Hise-sbTNFa及用於在巴斯德畢赤酵母中表達的推導蛋白序列的DNA片段。下劃線標記6個CAT/C密碼子和組氨酸。加重標記用於在巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的共有序列中的ATG。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖4 包含海鱸Hise-sbTNFa及用於在巴斯德畢赤酵母中表達的推導蛋白序列的 DNA片段。下劃線標記6個CAT/C密碼子和組氨酸。加重標記用於在巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的共有序列中的ATG。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖5 包含大菱鮃Hise-sbTNFa及用於在巴斯德畢赤酵母中表達的推導蛋白序列的DNA片段。下劃線標記6個CAT/C密碼子和組氨酸。加重標記用於在巴斯德畢赤酵母中表達蛋白的共有序列中的ATG。以斜體字顯示EcoRI和BamHI限制位點。圖6 顯示SDS-PAGE和使用抗多組氨酸mAb的蛋白質印跡法(分別為A和B)。箭頭表示在1)大腸桿菌；2)釀酒酵母和幻巴斯德畢赤酵母中表達的金頭鯛的His6-sbTNFa。圖7 在飼餵染色的重組酵母60分鐘後，對滷蟲無節幼體的顯微觀察。A)滷蟲無節幼體和B)消化道內的用DTAF螢光染色的酵母。圖8 通過依賴魯米諾化學發光顯示由頭腎白細胞產生的呼吸爆發活性。圖9 頭腎和腸中的數個炎性基因的mRNA水平。優選實施方案描述實施例1 金頭鯛TNF α在大腸桿菌中的表達將sbTNF α 克隆至Ij pET15b 中使用LPS刺激的頭腎cDNA作為PCR中的模板，以使用引物FE4和RE5 (圖1)擴增sbTNF a。這兩個引物都包含BamHI限制位點，用於隨後在質粒pETMb (Novagen)的相同位點中克隆PCR產物。在包含cDNA模板、每種dNTP各50μΜ、0. 2mM引物、含MgCl2 的IX緩衝液PLUS和1單位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在 EppendorfMastercycler Gradient中進行循環反應，包括95°C 2分鐘的1個循環，95°C 45 秒、60°C 45秒和72°C 30秒的25個循環，以及隨後72°C 10分鐘的1個循環。使用QIAquick PCR Purification Kit ^liagen)純化PCR產物，並在室溫下使用1單位的T4DNA連接酶 (New England BioLabs,Inc.)以插入片段(insert)質粒=3 1 的比例與質粒 pGEM-T Easy(Promega)連接(Iigate) 16小時。使用連接混合物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，並塗布在包含氨苄西林和X-Gal (Sigma)的LB平板上。將平板在37°C下溫育，並選擇數個所得白色菌落以檢測插入片段的存在，所述檢測是通過用QIApr印SpinMiniprep Kit(Qiagen) 分離質粒，並用BamHI消化來進行的。將包含插入片段(具有BamHI末端的sbTNF α ；圖 2)的所選質粒命名為PVP81。使用10單位的BamHI消化此質粒和500ng的pETMb，從而釋放PVP81的sbTNFa，並將pET 1 線性化。在低熔點瓊脂糖(agarose low meelting) (Pronadisa)凝膠中電泳分離，然後使用QIAquick Gel Extraction Kit ^jiagen)純化插入片段和線性質粒二者，並在室溫下使用1單位的T4DNA連接酶(New EnglandBioLabs, Inc.) 連接16小時。使用連接混合物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，並塗布在包含氨苄西林的LB平板上。將平板在37°C下溫育，並分離數個所得菌落的質粒，用BamHI消化以檢測插入片段的存在，並用PvuII消化以檢測插入片段的方向。使用ABI Prism 377基因分析儀 (CIB, CSIC)對所選質粒進行測序。大腸桿菌的轉化和表達試驗使用包含sbTNF α的質粒pETMb轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，並將混合物塗布在包含氨苄西林的LB平板上。將數個所得菌落在LB-氨苄西林培養基中培養過夜。將培養物稀釋到新鮮LB-氨苄西林中，然後在37°C下培養至0D_ = 0. 8，並在25°C或 37°C下使用ImM異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG ；Applichem)誘導0. 25_4小時。通過離心 0. Iml誘導培養物(HOOOrpm)來檢查全細胞提取物中的蛋白表達，並在SDS上樣緩衝液中煮沸以溶解細胞團塊(cell pellet)，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb(Sigma)的蛋白質印跡法。實施例2 金頭鯛sbTNF α在釀酒酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 p424_GPD 中使用包含sbTNF α的質粒pET 1釙作為PCR中的模板，以使用引物TNF-EC0F和 TNF-ECOR(圖1)擴增包括613pb的Hi%-sbTNF α的片段。這兩個引物都包含EcoRI限制位點，用於在質粒p4M-GPD(ATCC 87357)的相同位點中克隆PCR產物。在包含5ng模板、2. 5mM MgCl2、每種 dNTP 各 50 μ M、0. 2mM 引物、IX High Speec 添加劑、IX 緩衝液 PLUS 和 2 單位 Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler II(Cepheid)中進行循環反應，包括95°C 5分鐘的1個循環，95°C 30秒、62°C 45秒和72°C 2分鐘的30個循環，以及隨後720C 10分鐘的1個循環。通過在包含0. 5 μ g/ml溴乙啶的0. 8%瓊脂糖(Pronadisa) 凝膠中進行電泳來分離PCR產物，並使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)進行純化。在37°C下使用10單位的EcoRI O^ermentas)消化純化片段和250ng p4M_GPD，隨後在 22°C下使用5單位的T4DNA連接酶O^rmentas)進行連接。將連接反應轉入大腸桿菌DH5 α 感受態細胞中，並在含100 μ g/ml氨苄西林的LB平板上選擇包含質粒的菌落。使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物PRO-GPD和TER-GPD (圖1)，通過菌落PCR鑑定重組體。使用 QIApr印 SpinMiniprep Kit ^jiagen)純化包含 His6_sbTNF α 的所得質粒 p424_GPD，並在使用EcoRI消化後檢測插入片段的釋放，並通過SmaI和NcoI消化檢測插入片段的方向。 還使用ABI Prism 3130基因分析儀(University of Murcia)對質粒進行測序。釀酒酵母的轉化和表達試驗用於轉化的釀酒酵母菌株為EGY48 (Invitrogen)。為了製備用於轉化的EGY48，將在YPD培養基蛋白腖、酵母提取物、2%葡萄糖)中生長的OD6tltl = 0.5的IOOml培養物的細胞在4°C下以2500rpm離心5分鐘。在用無菌水清洗(waste)的步驟後，將細胞重新懸浮於 IX LiAc-TE(0. IM醋酸鋰、IOmM Tris pH 7. 5、lmM EDTA pH 8.0)中。為了進行轉化，將10 μ 1 0. 3 μ g/ μ 1的DNA與50 μ 1細胞和50 μ gDNA載體(預先煮沸的鮭魚DNA)混合。隨後將其加入到混合物(mix) IX LiAc-TE-PEG(如上文所述的LiAc-TE和PEG 40%)，並在30°C下溫育30分鐘，隨後添加DMSO至10%，並在42°C下溫育10分鐘。將細胞塗布到 MMSS+SDC-Trp (包含2%葡萄糖、0. 17%酵母氮源、0. 25%硫酸銨、IM山梨醇和SDC-Trp的基本培養基)平板上，在30°C下溫育數天，直至出現菌落。SDC(合成葡萄糖補充劑(synthetic dextrosecomplete))包括20mg/l腺嘌呤、精氨酸、組氨酸、色氨酸和尿嘧啶，30mg/l亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸和異亮氨酸，50mg/l苯丙氨酸，200mg/l蘇氨酸，150mg/l纈氨酸。為了檢測Hk6-SbTNFa的表達，將數個菌落在YPD培養基或MM+SDCIrp (包含 2%葡萄糖、0.17%酵母氮源、0.25%硫酸銨和SDC-Trp的基本培養基)中培養數小時。為了檢查蛋白表達，將全細胞提取物在Branson超聲波儀150中以10個30秒的脈衝超聲破碎，或者將其在珠磨式組織研磨器(bead beater)中以8個1分鐘的脈衝用玻璃珠破碎。在處理後，通過離心收集細胞剩餘物，並通過在SDS上樣緩衝液中煮沸來對上清液進行 HiS6-SbTNF α檢測，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的蛋白質印跡法。實施例3 金頭鯛sbTNF在巴斯德畢赤酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 pPICZA 中使用包含sbTNF α的質粒pET 1釙作為PCR中的模板，以使用引物TNF-EC0PP和 TNF-ECOR (圖1)擴增包括618pb的Hi%-sbTNFa的片段。這兩個引物都包含EcoRI限制位點，用於在質粒pPICZA (Invitrogen)的相同位點中克隆PCR產物。在包含5ng模板、2. 5mM MgCl2、每種 dNTP 各 50 μ m、0. 2mM 引物、IX High Speec 添加劑、IX 緩衝液 PLUS 和 2 單位 Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler II(Cepheid)中進行循環反應，包括95°C 5分鐘的1個循環，95°C 30秒、55°C 45秒和72°C 2分鐘的30個循環，以及隨後720C 10分鐘的1個循環。通過在包含0. 5 μ g/ml溴乙啶的0. 8%瓊脂糖(Pronadisa) 凝膠中進行電泳來分離PCR產物，並使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)進行純化。在37°C下使用10單位的EcoRI O^ermentas)消化純化片段和200ng p4M_GPD，隨後在 22°C下使用5單位的T4DNA連接酶O^rmentas)進行連接。將連接反應物轉入大腸桿菌 T0P10F'感受態細胞中，並在含25 μ g/ml博萊黴素(zeocin) (Invitrogen)的低鹽LB平板上選擇包含質粒的菌落。使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物PIC5和PIC3，通過菌落PCR鑑定重組體。使用QIApr印Spin Miniprep Kit(Qiagen)純化包含Hi -sbTNF α 的所得質粒pPICZA，並通過用EcoRI消化檢測插入片段的釋放，並通過用BioI消化檢測插入片段的方向。還使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，Universityof Murcia)對質粒進行測序。在重組質粒中，sbTNFa的起始密碼子(star codon)ATG位於用於在酵母中進行外源基因表達的酵母共有序列AAAAMSTCT (圖幻中(Romanos等人，199 。此共有序列包含在引物TNF-EC0PP中。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗在將巴斯德畢赤酵母電穿孔之前，通過在37°C下用McI或RiieI消化來將包含 HiS6-SbTNFa的質粒pPICZA線性化，以供隨後在巴斯德畢赤酵母的基因組DNA中的重組及整合。使用MiniElute Reaction Cleanup Kit ^liagen)純化總量為5 μ g的線性質粒，並洗脫到10μ 1無菌水中。用於電穿孔的巴斯德畢赤酵母菌株為Χ-33。為了製備用於電穿孔的 Χ-33，將OD6tltl = 1. 5的IOOml培養物的細胞在4°C下以1500Xg離心5分鐘。在用無菌水清洗的2個步驟後，將細胞重新懸浮於IM山梨醇中，如前所述進行離心，並最後重新懸浮於 ImllM山梨醇中。為了電穿孔，將10 μ 1 DNA與80 μ 1細胞混合，並轉移到冰冷的0. 2cm電穿孔管(electroporation cuvette,BioRad)中。溫育 5 分鐘，然後將細胞在 MicroPulser 電穿孔儀(BioRad)中在25 4 6、1.51^和400 0的條件下施以脈衝。隨即向管中添加Iml冰冷的IM山梨醇，並將所得混合物在30°C下溫育1小時。將細胞塗布到包含100 μ g/ml博萊黴素(Invitrogen)的YPDS平板上，在30°C下溫育數天，直至出現菌落。使用引物PIC5和 PIC3的PCR和2X PCR Master Mix (i^ermentas)分析數個轉化體是否存在插入片段，並測定 HiS6-SbTNFa 的表達。在所選的菌落中，使用 Genomic DNA Purification Kit(Fermentas) 分離基因組DNA，並使用EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)擴增包含Hk6-SbTNF α的DNA 片段，以使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。在30°C和250rpm下，將帶有Hi%-sbTNFa的重組巴斯德畢赤酵母菌株在包含甘油的25ml基本培養基中培養以產生生物質，隨後進行甲醇誘導直至培養物達到OD6tltl約為 6。通過在3000 X g下離心5分鐘來收集細胞，並將團塊重新懸浮於包含0. 5%甲醇的200ml 基本培養基中直至OD6tltl約為1，以誘導表達。如前所述溫育培養物，每M小時添加0.5% 甲醇以維持誘導。在數個時間點收集樣品以分析蛋白表達。為了檢查蛋白表達，將全細胞提取物在Branson超聲波儀150中以10個30秒的脈衝超聲破碎，或者將其在珠磨式組織研磨器中以8個1分鐘的脈衝用玻璃珠破碎。在處理後，通過離心收集細胞剩餘物，並通過在SDS上樣緩衝液中煮沸來對上清液進行Hk6-SbTNF α檢測，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的蛋白質印跡法。實施例4 海鱸SbTNF α在大腸桿菌中的表達將sbTNF α 克隆到 pETMb 中使用得自肝的海鱸cDNA作為PCR中的模板，以使用引物FE4和RE5擴增sbTNF α。 這兩個引物都包含BamHI限制位點，用於隨後在質粒pETMb (Novagen)的相同位點中克隆 PCR產物。在包含cDNA模板、每種dNTP各50μΜ、0. 2mM引物、含MgCl2的IX緩衝液PLUS和 1 單位 Eco Taq PLUSDNA 聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在 Smart Cycler (Cepheid) 中進行循環反應，包括95°C 5分鐘的1個循環，95°C 45秒、55°C 45秒和72°C 90秒的30 個循環，以及隨後72°C 10分鐘的1個循環。在0. 8%瓊脂糖凝膠(Pronadisa)中電泳分離，然後使用 QIAquick Gel Extraction Kit ^jiagen)純化 PCR 產物。在 37°C下使用 10 單位BamHI將純化片段和質粒pETMb消化2小時，並在22°C下使用1單位T4DNA連接酶 (Fermentas)將此前使用PCRPurification Kit純化的DNA連接過夜。使用連接混合物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，並塗布在包含氨苄西林的LB平板上。將平板在37°C下溫育，並使用2X PCR Master Mix(Fermentas)和引物T7F和T7R(圖1)，通過菌落PCR鑑定重組體。使用QIApr印Spin Miniprep Kit ^jiagen)分離數個所得菌落的質粒，用BamHI消化檢測插入片段的釋放，並用PvuII消化檢測插入片段的方向。使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)對重組質粒進行測序。大腸桿菌的轉化和表達試驗如實施例1所述進行大腸桿菌的轉化和海鱸Hk6-SbTNF α的表達試驗。實施例5 海鱸sbTNF在巴斯德畢赤酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 pPICZA 中如實施例3所述，將海鱸His6-sbTNF α克隆到pPICZA中。使用ABIPrism 3130 基因分析儀(SACE，University of Murcia)對包含海鱸Hk6-SbTNF α的所得質粒pPICZA進行測序。與實施例3—樣，sbTNFa的起始密碼子ATG位於用於在酵母中進行外源基因表達的酵母共有序列AAAAMSTCT (圖4)中(Romanos等人，199 。此共有序列包含在引物 TNF-EC0PP 中。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗如實施例3所述進行電穿孔，但使用RiieI (Fermentas)進行質粒的線性化。在所選的菌落中，使用 Genomic DNA Purification Kit (Fermentas)分離 DNA，並使用 EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)擴增包含Hi%-sbTNF α的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。同樣如實施例3所述進行表達試驗。實施例6 大菱鮃SbTNF α在大腸桿菌中的表達將sbTNF α 克隆到 pETMb 中使用得自肝的大菱鮃cDNA作為PCR中的模板，以使用引物TNFR0-BAMF和 TNFR0-BAMR(圖1)擴增sbTNFa。這兩個引物都包含BamHI限制位點，用於隨後在質粒 pET 15b (Novagen)的相同位點中克隆PCR產物。在包含cDNA模板、每種dNTP各50 μ M、0. 2mM 引物、含MgCl2W IX緩衝液PLUS和1單位Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler (Cepheid)中進行循環反應，包括95°C 5分鐘的1個循環，95°C 45 秒、55°C 45秒和72°C 90秒的30個循環，以及隨後72°C 10分鐘的一個循環。在0. 8%瓊脂糖凝膠(Pronadisa)中電泳分離，然後使用 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)純化 PCR產物。在37°C下使用10單位BamHI將純化片段和質粒pETMb消化2小時，並在22°C 下使用1單位T4DNA連接酶(Fermetas)將此前使用PCR Purification Kit純化的DNA連接過夜。使用連接混合物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，並塗布在包含氨苄西林的LB平板上。將平板在37°C下溫育，並使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物T7F和T7R，通過菌落PCR鑑定重組體。分離數個所得菌落的質粒，用BamHI消化檢測插入片段的釋放，並用PvuII消化檢測插入片段的方向。使用ABI Prism 377基因分析儀(CIB，CSIC)對所選質粒進行測序。大腸桿菌的轉化和表達試驗如實施例1所述進行大腸桿菌的轉化和大菱鮃Hk6-SbTNF α的表達試驗。實施例7 大菱鮃sbTNF在巴斯德畢赤酵母中的表達將His6-sb TNFa 克隆到 pPICZA 中如實施例3所述，將大菱鮃Hk6-SbTNF α克隆到pPICZA中。使用ABIPrism 3130 基因分析儀(SACE，University of Murcia)對包含大菱鮃Hi -sbTNF α的所得質粒pPICZA 進行測序。與實施例3—樣，sbTNFa的起始密碼子ATG位於用於在酵母中進行外源基因表達的酵母共有序列AAAAMSTCT (圖幻中(Romanos等人，199 。此共有序列包含在引物 TNF-EC0PP 中。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗如實施例3所述進行電穿孔，但使用RiieI (Fermentas)進行質粒的線性化。在所選的菌落中，使用 Genomic DNA Purification Kit (Fermentas)分離 DNA，並使用 EcoTaq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)擴增包含Hi%-sbTNF α的DNA片段，以使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。
同樣如實施例3所述進行表達試驗。實施例8 通過色譜純化sbTNF α使用AKTA Explorer FPLC(GE Healthcare)，通過親和色譜純化在大腸桿菌、釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母中表達的Hk6-SbTNF α。通過帶有Ni2+的固定化金屬離子親和層析 (IMAC)用Hisl^rap FF柱(GE Healthcare)進行純化，這是用於純化組氨酸標記蛋白的方法。通過UNICORN 5. 10測量^Onm的吸光度。以lml/min的流速，使用至少5倍柱體積的結合緩衝液OOmM磷酸鈉、0. 5M NaCl、5mM咪唑，pH 7. 4)平衡體積為Iml的柱。隨後如實施例 2所述，通過超聲處理或珠磨式組織研磨器溶解生長的培養物樣品，並進一步離心以去除團塊並獲得澄清的上清液，此後將2mL此上清液的樣品上柱。使用結合緩衝液洗柱，直到吸光度達到穩定的基線(10-15柱體積)。最後使用漸增量的20-25柱體積的線性梯度的洗脫緩衝液QOmM磷酸鈉、0. 5M NaCUO. 5M咪唑，pH 7.4)洗脫與柱結合的蛋白。使用自動流分收集器收集Iml洗脫物流分。通過SDS-PAGE和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的免疫印跡法檢測包含蛋白的流分中是否存在Hk6-SbTNF α。將所選流分混合，並通過Bradford(Sigma) 測定Hk6-SbTNF α的量。在必要時，使用凝血酶-瓊脂糖(Recom-Τ ；Sigma)去除Hk6標記。實施例9 通過SDS-PAGE和免疫印跡法檢測sbTNF α通過用12. 5%丙烯醯胺/雙丙烯醯胺的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析帶有Hk6-SbTNFa的樣品。使用0. 考馬斯(coomassie)將凝膠染色30分鐘，並區分出對應於HiS6-SbTNF α的2 IkDa帶。為了通過免疫印跡法檢測Hi S6-SbTNF α，在上述SDS-PAGE後，在TBS (20mM Tris-HCl、150mM甘氨酸(glicine)、20 %甲醇)中，在100V下將凝膠向硝酸纖維素膜 (Sigma)中轉移 1 小時。在 4°C下使用含有 5% BSA 的 TTBS(IOmM Tris-HClUOOmM NaCl, 0. 1 % Tween 20)將所述膜溫育過夜以阻斷蛋白。使用TTBS清洗所述膜，然後將其與 TTBS+5% BSA+1 1000抗多組氨酸mAb (Sigma) —起溫育2小時。隨後再次使用TTBS和 TBS清洗所述膜，隨後使用ECL (Amersham Biosciences)染色。顯示出對應於Hi -sbTNF α 的21kDa單帶(圖6)。實施例10 通過發酵培養酵母在生物反應器系統(Applicon)中進行轉化酵母的發酵培養。例如，將巴斯德畢赤酵母菌株在含有YPGly培養基的燒瓶中培養M小時直至培養物達到0D_高於30。隨後將生長的培養物接種到含有MMG (含甘油的基本培養基)的生物反應器系統中。培養條件為溫度30°C，pH5.00(通過添加朋3進行控制)，在500-1250rpm 下攪拌，以及攪拌下30%的氧級聯。通過BioXpert V2測量參數。以分批方式進行發酵直到培養物達到0D_為50-80。此後以分批進料方式進行發酵，並開始供給甘油，持續10小時(0D_為260-280的培養物)。最後供給甲醇，持續40小時，在OD6tltl為380-420時結束培養。通過免疫印跡法分析重組TNF HiS6-SbTNF α的表達分析(參見實施例9)。實施例11 重組酵母的微囊化在發酵達到預期的生物量和重組TNF HiS6-SbTNFa的最佳表達後，在無菌條件下收集液體培養基(broth)，並配以20%麥芽糊精(malodextrin)和10%保護聚合物Kollicoat MAE lOOP(BASF)。隨後通過噴霧乾燥器(Buchi)泵吸配置的懸浮液，將入口溫度控制在120°C，並將出口溫度控制在85 °C。通過免疫印跡法分析重組酵母的最終微囊以確定沒有細胞存活並且存在TNF HiS6-SbTNFa (參見實施例 10)。實施例12 利用微囊化的重組酵母富集滷蟲無節幼體將滷蟲無節幼體在裝有500ml無菌全濃度(full-strength)海水的燒瓶中孵化(去被膜卵)過夜，通過與魚池氣泵相連的送風管曝氣，並在往復振蕩的水浴中保持在 ^°C。孵化後M小時，將無節幼體收集到富集系統中。此系統由裝有IOOml清潔海水的燒瓶組成，其放置於相同的水域中並各自曝氣。對所有試驗，通過採集自10個0. 5ml海水的樣品來評估孵化比例和無節幼體的數量。通過用DTAF染色微囊化重組酵母來評估用該酵母富集的滷蟲無節幼體的最佳製備時間。隨後，使用染色酵母飼餵滷蟲無節幼體。在飼餵後0分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘和120分鐘殺死該滷蟲無節幼體。使用螢光顯微鏡觀察富集的滷蟲。結果(圖7)顯示在飼餵後，首先觀察到口腔區域的微囊化重組酵母量的增加，隨後整個腸道充滿微囊化重組酵母，並且不能區分細胞個體。富集滷蟲無節幼體的最佳時間為60分鐘。實施例13 金頭鯛sbTNFa在巴斯德畢赤酵母中的表達和分泌將His6-sb TNFa 克隆至Ij pPICZ a A 中使用包含sbTNFa的質粒pETMb作為PCR中的模板，以使用引物TNF-ECOF和 TNF-ECOR(圖1)擴增包括615pb的Hi%-sbTNF α的片段。這兩個引物都包含EcoRI限制位點，用於在質粒pPICZ a A(Invitrogen)的相同位點中克隆PCR產物。在包含5ng模板、2. 5mM MgCl2、每種 dNTP 各 50 μ M、0. 2mM 引物、IX High Speec 添加劑、IX 緩衝液 PLUS 和 2 單位 Eco Taq PLUS DNA聚合酶(Ecogen)的樣品中進行擴增。在Smart Cycler II(Cepheid)中進行循環反應，包括95°C 5分鐘的1個循環，95°C 30秒、55°C 45秒和72°C 2分鐘的30個循環，以及隨後720C 10分鐘的1個循環。通過在包含0. 5 μ g/ml溴乙啶的0. 8%瓊脂糖(Pronadisa) 凝膠中進行電泳來分離PCR產物，並使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)進行純化。在37°C下使用10單位的EcoRI O^ermentas)消化純化片段和200ng pPICZA，隨後在 22°C下使用5單位的T4DNA連接酶O^rmentas)進行連接。將連接反應物轉入大腸桿菌 T0P10F'感受態細胞中，並在含25 μ g/ml博萊黴素(Invitrogen)的低鹽LB平板上選擇包含質粒的菌落。使用2X PCR MasterMix(Fermentas)和引物PICa和PIC3，通過菌落PCR 鑑定重組體。使用QIApr印Spin Miniprep Kit ^liagen)純化包含Hi -sbTNF α的所得質粒pPICZ α Α,並通過用EcoRI消化檢測插入片段的釋放，並通過用NdeI消化檢測插入片段的方向。還使用ABI Prism 3130基因分析儀(SACE，Universityof Murcia)對質粒進行測序。巴斯德畢赤酵母的電穿孔和表達試驗在將巴斯德畢赤酵母電穿孔之前，通過在37°C下用McI或RiieI消化來將包含 HiS6-SbTNF α的質粒pPICZ α A線性化，以供隨後在巴斯德畢赤酵母的基因組DNA中的重組及整合。使用MiniElute Reaction Cleanup Kit ^liagen)純化總量為5 μ g的線性質粒，並洗脫到10μ1無菌水中。用於電穿孔的巴斯德畢赤酵母菌株為Χ-33。為了製備用於電穿孔的Χ-33，將OD6tltl = 1. 5的IOOml培養物的細胞在4°C下以1500Xg離心5分鐘。在用無菌水清洗的2個步驟後，將細胞重新懸浮於IM山梨醇中，如前所述進行離心，並最後重新懸浮於ImllM山梨醇中。為了電穿孔，將10 μ 1 DNA與80 μ 1細胞混合，並轉移到冰冷的0. 2cm 電穿孔管(BioRad)中。溫育5分鐘，然後將細胞在MicroPulser電穿孔儀(BioRad)中在 25μ F、l. 5kV和400 Ω的條件下施以脈衝。隨即向管中添加Iml冰冷的IM山梨醇，並將所得混合物在30°C下溫育1小時。將細胞塗布到包含ΙΟΟμ g/ml博萊黴素(Invitrogen)的 YPDS平板上，在30°C下溫育數天，直至出現菌落。使用引物PIC5和PIC3的PCR和2X PCR Master Mix (i^ermentas)分析數個轉化子是否存在插入片段，並測定Hi%-sbTNF α的表達。 在所選的菌落中，使用Genomic DNAPurification Kit(Fermentas)分離基因組DNA，並使用 EcoTaq PLUS DNA 聚合酶(Ecogen)擴增包含 Hk6-SbTNF α 的 DNA 片段，以使用 ABI Prism 3130 基因分析儀(SACE，University of Murcia)進行測序。在30°C和250rpm下，將帶有Hi%-sbTNFa的重組巴斯德畢赤酵母菌株在包含甘油的25ml基本培養基中培養以產生生物質，隨後進行甲醇誘導直至培養物達到OD6tltl約為 6。通過在3000Xg離心5分鐘來收集細胞，並將團塊重新懸浮於包含0. 5%甲醇的200ml 基本培養基中直至OD6tltl約為1，以誘導表達。如前所述溫育培養物，每M小時添加0.5% 甲醇以維持誘導。在數個時間點收集樣品以分析蛋白表達。為了檢查蛋白表達，通過在SDS 上樣緩衝液中煮沸來對樣品的上清液進行Hk6-SbTNFa檢測，以供SDS-PAGE分析和使用抗多組氨酸mAb (Sigma)的蛋白質印跡法。實施例14 微囊化重組酵母的功效將體重為 120g 的健康金頭鯛(Sparus aurata L. ) (Sparidae, Perciform, Teleostei)樣本飼養在天然溫度和光照期的2m3流動海水池(溶解氧6ppm，流速20%池體積/小時)中，並使用商品飼料顆粒(Trouvit，Burgos，Spain)飼喂，每天兩次。對實驗組飼餵其基礎食物，但每兩天補充0. 1%、1%或10%的對照酵母或過度表達成熟(活性) sbTNF α的微囊化酵母。在所有取樣時間(處理後2天、4天、6天和10天)將該樣本稱重， 並取出頭腎和腸，並將其處理以供光學顯微鏡研究和基因表達研究。所描述的實驗遵循歐盟理事會(European Union Council) (86/609/EU)和西班牙穆爾西亞大學生物倫理委員會 (Bioethical Committee of the University of Murcia(Spain))有關使用實驗動物的方針。測量作為不同刺激時間後由頭腎白細胞懸液產生的依賴魯米諾化學發光的呼吸爆發活性(Sepulcre等人，2007)。所有試驗均使用五條魚進行，一式三份。相同試驗重複兩次以驗證結果。使用SPSS 13. 0. 1統計軟體包進行所有統計分析。通過方差分析(ANOVA)和 Tukey多範圍檢驗(Tukeymultiple range test)來分析數據以測定組間差異。魚的食慾、生長速率、遊動行為和外觀形態未受到處理的影響，並且在試驗期間也未觀察到死亡。此外，在飼餵包含SbTNFa的酵母達10天的魚的腸中未發現組織病理學損傷和吞噬細胞(即嗜酸性粒性白細胞和巨噬細胞)浸潤。如頭腎白細胞呼吸爆發所測定的， 單獨給藥酵母對魚的免疫狀態沒有顯著影響。與之明顯不同的是，飼餵0. 和過度表達sbTNF α的微囊化酵母的魚在處理後4天表現出劑量依賴性增加的呼吸爆發(圖8)。意外的是，給藥酵母對頭腎和腸中除TLR9之外的數個炎性基因的mRNA水平沒有顯著影響，但TLR9的表達顯著上調(圖9)。 上述結果表明，達10天的給藥所述免疫刺激劑未對魚產生任何副作用。由於呼吸爆發活性被廣泛用作魚免疫狀態的指標(Mulero等人，1998, Garcia-Castillo等人，2004 ； Chaves-Pozo等人，2005 ；Sepulcre等人，2007)，因此在飼餵包含TNF α的酵母的魚中激活此應答表明所述免疫刺激劑有效，並且會保護魚類免於非生物應激(即由對魚的處理導致的應激)和生物(病原體)應激。此外，由於TLR9受體是識別病毒和細菌病原體的關鍵成分，因此由給藥所述免疫刺激劑所導致的腸中TLR9的表達上調同樣表明魚的腸道會受到更好的抗病毒和細菌感染保護(Ishii和Akira，2006)。綜上所述，所有上述結果還表明重組sbTNF α是通過系統性激活先天免疫細胞並增加TLR9表達的優異口服疫苗佐劑。
權利要求
1.可口服給藥的免疫刺激產品，其至少包含微囊化的細胞因子和腸保護聚合物，其中所述細胞因子是魚類細胞因子、或軟體動物細胞因子或甲殼類動物細胞因子。
2.如權利要求1所述的免疫刺激產品，其中所述細胞因子是重組細胞因子。
3.如權利要求2所述的免疫刺激產品，其特徵在於所述微囊化的重組細胞因子是腫瘤壞死因子α (TNF α )。
4.如權利要求2所述的免疫刺激產品，其特徵在於所述微囊化的重組細胞因子在宿主微生物中過度表達，所述宿主微生物是酵母。
5.如權利要求4所述的免疫刺激產品，其特徵在於所述酵母是巴斯德畢赤酵母 (Pichia Pastoris)0
6.如權利要求1-5中任一項所述的免疫刺激產品，其特徵在於所述細胞因子源自適於水產養殖的海洋生物，例如金頭鯛(Sparus aurata)、狼鱸(Dicentrarchus labrax)、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)(Psetta maxima)(Dentex dentex)、$口勿 鯛(Diplodus puntazzo)、黑斑小鯛(Pagellus bogaraveo)、大西洋白姑魚(Argyrosomus regius)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla) (Octopus sp.)。
7.如前述任一項權利要求所述的免疫刺激產品，其特徵在於將所述產品飼餵給多細胞生物。
8.如權利要求7所述的免疫刺激產品，其中所述多細胞生物是滷蟲(Artemiasp.)或輪形動物(phylum Rot if era)。
9.如前述任一項權利要求所述的免疫刺激產品，其特徵在於用腸保護聚合物將所述細胞因子和/或所述包含所述重組細胞因子的宿主微生物微囊化。
10.製備如權利要求2所述的免疫刺激產品的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟-從魚類、軟體動物或甲殼類動物的組織中選擇並分離編碼所選細胞因子的cDNA，-在至少一種用於在至少一種適合的宿主微生物中表達細胞因子的表達載體中克隆所述 cDNA,-培養所述宿主微生物的宿主細胞，獲得重組細胞因子或包含所述重組細胞因子的宿主微生物培養物，-將所述重組細胞因子或所述包含所述重組細胞因子的宿主微生物微囊化，獲得微囊化的重組細胞因子或微囊化的包含所述重組細胞因子的宿主微生物。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於所述宿主微生物是選自巴斯德畢赤酵母、 酉良(Saccharomyces cerevisiae)禾口ILSI；^ 會(Kluyveromyces lactis)白勺# 母。
12.如權利要求10或11所述的方法，其特徵在於所述微囊化步驟是通過在腸保護聚合物的存在下經噴霧乾燥實施霧化來進行的。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於所述腸保護聚合物選自醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯、羧甲基纖維素、甲基丙烯酸共聚物、麥芽糊精、殼聚糖、明膠、澱粉、阿拉伯膠。
14.如權利要求1-9中任一項所述的可口服給藥的免疫刺激產品用於在水產養殖中免疫刺激魚類、軟體動物或甲殼類動物的用途。
15.如權利要求14所述的免疫刺激產品的用途，其中所述細胞因子源自所要免疫刺激的相同的魚類、軟體動物或甲殼類動物物種。
16.如權利要求14或15所述的用途，其中所述魚類、軟體動物或甲殼類動物選自金頭鯛、狼鱸、虹鱒、瘤棘鮃、細點牙鯛、尖吻重牙鯛、黑斑小鯛、大西洋白姑魚、歐洲鰻鱺、章佳.ο
17.如權利要求14-16所述的用途，其中所述免疫刺激是通過在飼餵期間將所述產品與食物共同給藥來進行的。
18.如權利要求14-16所述的用途，其特徵在於所述免疫刺激是通過以下步驟進行的 將所述免疫刺激產品向多細胞生物給藥，獲得富集的多細胞生物，並隨後向所述物種飼餵所述富集的多細胞生物。
19.如權利要求18所述的用途，其中所述多細胞生物是滷蟲或輪形動物。
20.富集有可口服給藥的免疫刺激產品的多細胞生物，所述免疫刺激產品至少包含微囊化的魚類、軟體動物或甲殼類動物的細胞因子。
21.如權利要求1-9中任一項所述的可口服給藥的免疫刺激產品作為疫苗佐劑的用途。
22.如權利要求1-9中任一項所述的免疫刺激產品，其還包含用於魚類、軟體動物或甲殼類動物的疫苗。
23.如權利要求22所述的免疫刺激產品，其中將所述疫苗與所述細胞因子微囊化。
全文摘要
本發明涉及可口服給藥的免疫刺激產品，其包含微囊化的細胞因子和用於保護所述細胞因子的腸保護聚合物，所述細胞因子是魚類、軟體動物或甲殼類動物的細胞因子，優選重組細胞因子，例如在宿主微生物中過度表達的腫瘤壞死因子α(TNFα)。
文檔編號A61K9/50GK102209530SQ200880131935
公開日2011年10月5日 申請日期2008年10月10日 優先權日2008年10月10日
發明者F·J·羅加索萊爾, J·A·洛佩斯馬斯, J·P·索拉岡薩雷斯, J·加林多比列加斯, M·佩尼亞爾韋爾梅利亞多, P·馬丁內斯奧爾蒂斯, S·A·施特賴滕貝爾格, V·穆萊羅門德斯, Y·佩德雷尼奧洛佩斯 申請人:普羅貝爾特醫藥公司