一種表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒及其應用的製作方法

2023-12-05 20:59:26 3

本發明涉及突變或遺傳工程技術領域，具體是一種表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒及其應用。

技術背景

幹擾素(Interferon，IFN)是由病毒或者其他種類的幹擾素誘導劑，刺激網狀內皮系統、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調節、抗病毒和誘導分化作用。根據特異性受體和序列同源性將幹擾素分成I型和II型幹擾素。IFN-γ是唯一的II型幹擾素，也稱為免疫幹擾素。Young(1996)和Frucht(2001)提出，主要由CD4+Th1、CD8+細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞分泌，有些B細胞、NKT細胞和APC細胞也可分泌IFN-γ。Cantin(1999)提出，雖然I型和II型幹擾素在對病毒早期細胞應答都很重要，但是IFN-γ在免疫應答後期起關鍵作用並且建立了抗病毒的長效控制機制。綜合來看，I型幹擾素起到的抗病毒活性作用要優於它的免疫調節作用，II型幹擾素-IFN-γ則被認為免疫調節作用要強於抗病毒作用。同時Chin(1996)提出，IFN-γ抗腫瘤活性要比I型幹擾素強很多，通過刺激巨噬細胞、NK細胞、NKT細胞等先天免疫應答來發揮抗腫瘤作用，同時還可抑制腫瘤細胞的有絲分裂和增殖的作用。IFN-γ在抗病毒，抗腫瘤及免疫調節等方面發揮著重要作用，在臨床有一定的應用價值。相對於人IFN-γ而言，動物IFN-γ的研究相對比較落後，基本停留在實驗室的基因誘導與構建重組等階段。儘管如此，鄭仲金等(2007)研究表明IFN-γ作為疫苗佐劑或者治療製劑表現出一定的效果。如對雛雞急性新城疫、仔豬黃白痢、雞傳染性法氏囊等畜禽病毒性疾病效果明顯；曹瑞兵等(2004)提出，豬重組IFN-γ能夠對VSV起到有效 的抗病毒作用；許金俊(2004)提出，重組奶牛IFN-γ對試驗性大腸埃希菌引起的乳房炎具有較好的預防和控制效果；Schijns(2002)提出，重組貓IFN-γ能增強貓疫苗抗體的產生；龍小海等(1999)提出，重組雞IFN-γ能明顯抵抗球蟲的作用；龍小海等(1999)提出，重組的犬IFN-γ能作為佐劑輔助性治療病毒性腸炎、B肝、病毒性感冒等。各研究都表明IFN-γ對動物體疾病的預防和控制具有良好的應用前景。而且畜禽感染致病菌後主要依賴疫苗和抗生素。但抗生素的殘留及引起細菌的耐藥性等因素影響人類和動物的健康，而疫苗只是針對特定病原產生長期保護。所以湯一葦(1996)提出，幹擾素製劑不僅能提高抗體對抗原的免疫應答水平，而且能誘導機體選擇性的調節免疫系統，因此被稱為免疫激素的細胞因子正逐漸作為佐劑用於研製。

隨著幹擾素類藥物的廣泛應用，其缺點不斷暴露，半衰期短、穩定性差很大程度上限制幹擾素的藥用價值。長效幹擾素的開發中採用了多種不同的方式，包括物理方法、化學方法和生物學方法。目前研究最為廣泛的為生物學修飾法，其優勢在於工業汙染小、投入低、能夠批量生產，並且有很大的優化改進空間。血清白蛋白融合技術是長效幹擾素開發中最成熟的技術之一，Oborn(2002)首次採用人血清白蛋白製備融合幹擾素蛋白，並以猴為試驗動物，對其藥效以及穩定性進行研究。目前該項技術已經在美國等國家被批准用於治療C型肝炎等慢性傳染病。

犬類作為伴侶動物在人類生活中扮演的角色越來越重要，寵物醫療保健水平的也不斷提高，病毒性疾病嚴重影響犬類健康。而幹擾素蛋白與血清白蛋白融合表達的研究主要集中於人醫臨床，目前國內外尚未見到針對犬IFN-γ的相關研究。我們通過基因融合技術，將犬IFN-γ基因與犬血清白蛋白基因相融合，利用昆蟲細胞杆狀病毒表達系統，成功表達了CSA-IFNγ蛋白，並對其生物活性 性進行研究，為其在犬病毒性疾病的預防、免疫治療及疫苗佐劑方面的應用奠定基礎。

現有技術存在以下技術問題：

1.通過血清白蛋白與幹擾素相融合來延長幹擾素半衰期在人類醫學研究較為深入，但獸醫臨床關於融合蛋白幹擾素的研究及應用均比較少。目前臨床上常用的犬免疫增強用幹擾素為常規幹擾素，多次反覆注射會導致動物機體產生免疫耐受和其他不良反應，影響其治療效果。

2.獸用幹擾素製品大都採用原核表達方式，產物多為包涵體形式，製備方法複雜。純化過程中需要變性、復性等過程，產物生物活性較差，藥物療效一般。

3.獸用幹擾素製品在結構和功能上與天然蛋白差異大。

4.獸用幹擾素製品的高水平表達蛋白質佔細胞總蛋白量低。

5.獸用幹擾素製品提純困難。

技術實現要素：

本發明的目的是：

1)提供一種表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒的基因片段，與現有技術不同的是，可翻譯為如SEQ ID NO.1所示胺基酸序列，用於擴增其序列的上下遊引物包含上遊酶切位點EcoR I、上遊酶切位點Hind III，具有如SEQ ID NO.2所示的犬血清白蛋白核苷酸序列、柔性linker序列和犬IFNγ成熟蛋白核苷酸序列；

2)提供一種利用所述的基因片段在構建表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒的應用，與現有技術不同的是，本發明採用的載體質粒是pFastBacTM I，重組質粒是pF-CSA-IFNγ；

3)提供一種表達犬用血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒及其應用，與現有技術不同的是，採用杆狀病毒表達系統，表達出修飾合理、活性優、穩定性佳的犬血清白蛋白融合幹擾素，為開發半衰期長、成本低、功效高的犬用血清白蛋白融合幹擾素奠定基礎；

4)提供了一種表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒，與現有技術不同的是，可表達具有如SEQ ID NO.1所示胺基酸序列，以及所述的表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒在製備增強免疫力藥物中的應用，所述的免疫治療藥物為犬類免疫力增強的藥物；

5)提供了一種含有表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒的增強免疫力藥物和一種含有表達犬血清白蛋白融合幹擾素γ的重組杆狀病毒的犬類免疫力增強的藥物。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1.本發明使用搭橋PCR技術，使基因的融合快捷方便，又可以避免酶切位點的引入幹擾後續試驗這個缺點；

2.本發明採用杆狀病毒表達系統，該系統與細菌、酵母和哺乳動物細胞表達體系相比具有如下優點：

(1)重組蛋白具有完整的生物學功能，表達產物在結構及功能上更接近天然蛋白；

(2)能夠進行翻譯後加工修飾，使表達產物在結構上最大限度接近於天然蛋白；

(3)能夠高水平表達蛋白質，可高水平獲得重組蛋白，最高可達細胞總蛋白量的50％；

(4)能夠使表達產物通過分泌形式進行表達，進一步簡化了分離純化工作。

與傳統方法表達的犬幹擾素相比較，本發明通過採用基因融合技術實現了犬血清白蛋白與犬γ幹擾素的融合表達，且蛋白表達量高，活性好，為犬血清白蛋白融合幹擾素的產品化創造了先決條件。犬γ幹擾素具有抑制病毒複製、抗腫瘤、抗寄生蟲及免疫調節等作用，作為一種重要的免疫增強劑，其在犬類病毒性疾病預防、免疫治療及免疫佐劑方面應用前景廣闊。

附圖說明：

圖1為犬血清白蛋白基因和犬γ基因PCR擴增圖；

圖2為犬血清白蛋白基因與犬IFNγ基因PCR融合圖；

圖3為pF-CSA-IFNγ重組質粒雙酶切鑑定圖；

圖4為攜帶Bacmid-CSA-IFNγ重組杆狀病毒質粒菌株的篩選；

圖5為攜帶Bacmid-CSA-IFNγ重組杆狀病毒質粒菌株的純化；

圖6為CSA-IFNγ融合蛋白表達情況監測；

圖7為CSA-IFNγ融合蛋白純化。

具體實施方式

下面結合附圖，通過實施例對本發明內容作進一步詳細說明，但不是對本發明的限制。

實施例

(一)犬CSA-IFNγ融合基因的製備：

根據犬血清白蛋白基因序列(GenBank登陸號為AB090854.1)；以犬IFNγ基因序列(GenBank登陸號：EF095772.1)為原始序列，依據昆蟲細胞表達系統密碼子的偏嗜性，優化合成新的犬γ幹擾素成熟肽核苷酸序列(該序列經南京金斯瑞生物科技有限公司優化合成)，設計合成引物，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列表

步驟一，犬血清白蛋白基因的擴增方法：

取0.5cm3的犬肝臟樣品，十字研磨器冰浴研磨，將研磨液收集於1.5mL離心管，-20℃凍融3次後，12,000×g離心5min，收集上清液提取總RNA，操作步驟按照AxyPrep DNA/RNA提取製備試劑盒說明書進行。進行RT-PCR反應擴增犬血清白蛋白全基因序列：

1)取200μl犬肝臟研磨液，轉入1.5mL離心管中；

2)加入200μl BufferV-L，漩渦振蕩混合均勻，室溫靜置5min；

3)加入75μl BufferV-N，漩渦振蕩混合均勻，12,000×g離心5min；

4)將上清轉移到新的2mL離心管中，加250μl異丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均勻；

5)將製備管置於2mL離心管中，取步驟4中的混合液移入製備管中，6,000×g離心1min；

6)棄掉濾液，將製備管置回2mL離心管中，加500μl Buffer W1A，室溫靜置1min，12,000×g離心1min；

7)棄掉濾液，將製備管置回2mL離心管中，加800μl Buffer W2，12,000×g離心1min；

8)將製備管置回2mL離心管中，12,000×g離心1min；

9)將製備管置於潔淨的1.5mL離心管中，在製備管中央加40-60μl Buffer TE(DNase&RNase-free)，室溫靜置1min，12,000×g離心1min洗脫RNA。

反應體系見表2，反應條件如下：50℃ 30min；94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 2min，30cycles；72℃ 10min；4℃保存。

表2犬血清白蛋白(CSA)全基因序列RT-PCR反應體系

經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得大小為1827bp的目的片段，結果如圖1所示。將目的片段切膠回收，具體方法參照DNA凝膠回收試劑盒(Omega)說明書進行。將目的片段連接至pMD18-T載體(方法按照Takara pMD18-T載體說明書進行)連接體系見表3。

表3犬血清白蛋白基因與pMD18-T載體連接體系

充分混勻後，16℃連接過夜。取30μl DH5α感受態細胞，冰浴融化，加入10μl連接產物，溫和混勻，置於冰上30min，42℃熱休克90s，冰浴2min，加入1ml無抗LB培養液，37℃ 220rpm/min培養50min，5000rpm/min室溫離心5min收集菌體，將菌體塗布於LB氨苄抗性瓊脂平板，37℃培養12h，挑取單菌落接種於LB氨苄抗性培養液37℃ 220rpm/min培養12h後，進行菌液PCR鑑定，篩選陽性菌株送北京睿博興科生物技術有限公司測序鑑定。鑑定正確後採用AxyPrep質粒小量提取試劑盒製備重組質粒pMD-CSA。

步驟二，犬血清白蛋白基因(linker序列)與犬IFNγ成熟蛋白基因的融合：

分別利用自行設計的融合引物擴增CSA基因與IFNγ成熟蛋白基因，在PCR過程中成功引入上遊酶切位點EcoR I、下遊酶切位點Hind III、柔性linker序列(用於連接CSA基因與IFNγ成熟蛋白基因)，並在基因序列末端加入6個組氨酸標籤用於蛋白純化，反應體系如表4和表5所示。

表4 CSA基因的擴增

CSA基因的擴增反應條件如下：94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 2min，15個循環。

表5 IFNγ成熟蛋白基因的擴增

CSA基因的擴增反應條件如下：94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 30s，15個循環。

將上述兩個反應體系的反應體系的產物混合進行融合PCR，反應條件如下94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 3min，5個循環。取出後加入一定量的酶和引物，進行最終目的基因的擴增，體系如表6所示，反應條件如下94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 3min，15個循環；4℃保存。

表6 CSA-IFNγ基因的擴增

經1％凝膠電泳分析融合效果，電泳結果顯示獲得2316bp左右的目的片段，結果如圖2所示。利用DNA凝膠回收試劑盒(Omega)回收目的片段，採用Mighty TA-cloning Kit試劑盒進行加A尾反應，反應體系如表7所示。

表7 CSA-IFNγ序列加「A」反應體系

65℃反應10min，反應液直接用於連接反應。取1μl加「A」後PCR產物至新的的1.5ml EP管中，加入1μl pMD20-T vector和3μl滅菌蒸餾水混勻，加入5μl Ligation Mighty Mix，輕輕混勻，16℃保溫30min，加入50μl Competent Cells中進行轉化，將菌體塗布於LB氨苄抗性瓊脂平板，37℃培養12h，挑取單菌落接種於LB氨苄抗性培養液37℃ 220rpm/min培養12h後，進行菌液PCR鑑定，篩選陽性菌株送北京睿博興科生物技術有限公司測序鑑定。鑑定正確後採用AxyPrep質粒小量提取試劑盒製備重組質粒pMD-CSA-IFNγ。

(二)表達CSA-IFNγ蛋白重組杆狀病毒的構建：

步驟一，pF-CSA-IFNγ重組質粒的構建：

利用EcoR I和Hind III同時對pMD-CSA-IFNγ重組質粒和pFastBacTM I載體質粒進行處理，酶切體系如表8所示。

表8雙酶切體系

酶切產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示分別獲得4700bp左右的pFastBacTMI載體骨架和2300bp左右的CSA-IFNγ融合基因靶片段，結果如圖3所示。採用DNA凝膠回收試劑盒(Omega)回收目的片段。利用T4 DNA連接酶將純化回收的載體骨架與融合基因靶片段進行融合，連接體系見表9。

表9 CSA-IFNγ與pFastBacTMI連接

充分混勻後，16℃連接過夜。取30μl DH5α感受態細胞，冰浴融化，加入10μl連接產物，溫和混勻，置於冰上30min，42℃熱休克90s，冰浴2min，加入1ml無抗LB培養液，37℃ 220rpm/min培養50min，5000rpm/min室溫離心5min收集菌體，將菌體塗布於LB氨苄抗性瓊脂平板，37℃培養12h，挑取單菌落接種於LB氨苄抗性培養液37℃ 220rpm/min培養12h後，進行菌液PCR鑑定，篩選陽性菌株送北京睿博興科生物技術有限公司測序鑑定。鑑定正確後採用AxyPrep質粒小量提取試劑盒製備重組質粒pF-CSA-IFNγ。

步驟二，表達CSA-IFNγ重組杆狀病毒的構建：

將pF-CSA-IFNγ重組質粒轉化至E.coli DH10Bac感受態細胞中，塗布於LB瓊脂糖平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml Bluo-gal，40μg/ml IPTG)進行DH10BacTM轉化株的篩選。37℃培養 48h，進行藍白斑篩選，結果如圖4所示。挑取10個白色的單菌落，重新劃線於新鮮LB瓊脂糖平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml Bluo-gal，40μg/ml IPTG)，37℃過夜培養，結果如圖5所示。挑取白色單菌落接種於LB液體培養基(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素)，37℃220rpm/min培養24h，PCR鑑定出陽性菌株後，採用AxyPrep去內毒素質粒大量提取試劑盒製備Bacmid-CSA-IFNγ重組杆狀病毒質粒。並將其轉染至生長狀態良好的SF9細胞中，轉染步驟按照Invitrogen Cellfectin轉染試劑盒說明書進行。

轉染步驟按照Invitrogen Cellfectin轉染試劑盒說明書進行，操作步驟如下：

1)將生長良好的SF9細胞接種於6孔細胞培養板中，27℃至少培養1h；

2)將1μg純化的Bacmid-CSA-IFNγ重組杆狀病毒質粒DNA加至100μl Grace培養基中，溫和混勻；

3)完全混勻Cellfectin試劑，翻轉混合5-10次，吸取6μl Cellfectin試劑加至100μl Grace培養基中，溫和混勻；

4)將2)和3)中的液體溫和混勻，室溫孵育45min，在孵育過程中除去細胞中原有培養基並用Grace培養基清洗3次；

5)向孵育液中加入0.8ml Grace培養基，溫和混勻後加至細胞培養板中，27℃培養5h。

6)棄去，向細胞中加入2ml SF900 II液(含雙抗)；

7)27℃潮溼條件培養72h或者直至能夠看到病毒感染的現象，提取P1病毒株；

8)P1代病毒液中病毒粒子含量較低，需要將其接種於生長良好的SF9細胞進行P2代病毒擴增培養；

9)獲得表達CSA-IFNγ重組蛋白的杆狀病毒，命名為Baculovirus-C-γ

(三)CSA-IFNγ重組蛋白表達情況檢測及蛋白純化：

將重組病毒Baculovirus-C-γ接種於生長良好的SF9細胞，在感染後24h、48h、72h和96h收集細胞液，500×g離心5min去除細胞和較大的碎片，加入1/4體積5×SDS上樣緩衝液，沸水浴煮沸10min，冰上放置5min，置於-20℃保存。對樣品進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示重組杆狀病毒接種SF9細胞後24h目的蛋白開始表達，48h表達水平較高，72h開始出現較多的雜蛋白，結果如圖6所示。結果表明重組蛋白可在杆狀病毒系統中穩定的分泌表達，表達量較高，接毒後48h培養液中雜蛋白含量較少，故於接毒後48h收穫表達產物更有利於CSA-IFNγ重組蛋白的純化。

將SF9細胞懸浮培養於75cm2細胞培養瓶中並同時接種Baculovirus-C-γ，於接毒後48h收穫細胞液，500×g4℃離心15min去除細胞和較大的碎片，採用BeyoGoldTM His-tag Purification Resin蛋白純化試劑盒進行純化，具體步驟按照產品說明書進行，結果如圖7所示。

(四)重組幹擾素蛋白的生物活性測定：

參考Wish-VSV法評價CSA-IFNγ的體外生物活性，但需要將Wish細胞替換為犬腎細胞MDCK。具體方法如下：將生長狀態良好MDCK細胞培養於96孔細胞板中，37℃ 5％CO2恆溫培養箱培養4～6h，直至細胞貼壁生長良好；將待測樣品、標準品、對照分別培養基做4倍倍比稀釋12個梯度，分別接種於培養在96孔板的細胞中，每孔100μl，37℃ 5％CO2恆溫培養箱培養18～24h；棄掉96孔板中的上清液，用攻毒培養基稀釋VSV病毒，攻毒劑量為100TCID50，每孔100μl，37℃ 5％CO2恆溫培養箱培養24h後，倒置顯微鏡下觀察病變情況。結果見表10。

表10幹擾素體外活性測定結果

根據公式計算：IFN效價(IU/m1)＝Pr×(其中Pr為標準品效價；Ds為待測樣品的預稀釋倍數；ES為待測樣品相當於標準品半效價的稀釋倍數；Dr為標準品預稀釋倍數；Er為標準品半數稀釋倍數)計算幹擾素融合蛋白體外生物活性，結果為2.68IU/ml。