胎盤來源的間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法

2023-12-05 20:20:51 1

專利名稱：胎盤來源的間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種幹細胞差異膜蛋白的檢測方法，特別涉及胎盤和臍帶來源的間充 質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCSs)表面差異膜蛋白的檢測方法。
背景技術：
幹細胞(stem cells, SC)是一類具有自我複製能力的多潛能細胞，在一定條件下， 它可以分化成多種功能細胞。間充質幹細胞(MSCSs)是幹細胞家族的重要成員，最早來源 於骨髓，因其具有強大的增殖能力和多向分化潛能、造血支持和促進幹細胞植入、免疫調控 等特點使其在組織工程、細胞治療和基因治療等方面具有廣泛的臨床應用前景。近年來，隨 著人們對間充質幹細胞生物學特性及功能的深入研究，已成功地從骨髓、外周血、肌肉、脂 肪、臍血、臍帶及胎盤等組織中分離並鑑定出MSCSs。其中，胎盤來源MSC^s易分離培養，增 殖迅速，可以分化為3個胚層來源的細胞系，並有向傷處遷移的能力；同時胎盤在臨床上為 廢棄物，取材幾乎不受限制，且不涉及倫理問題；因此是很好的實驗材料和細胞治療載體。 而臍帶來源的間充質幹細胞，迄今的研究表明，它不但能夠成為骨髓間充質幹細胞的理想 替代物，而且具有更大的應用潛能，它表達多種胚胎幹細胞的特有分子標誌，具有分化潛力 大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易於工業化製備等特徵， 因此也極具具臨床應用前景。因此，本發明選擇這兩種細胞作為被檢測對象。骨髓來源的MSCS 能夠表達 CD^、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、基質細胞 抗原1 (Stro. 1)、幹細胞抗原1 1)、CXC類趨化因子受體4 (CXCR-4)和CXCR. 6等表面 標誌,但是不表達造血細胞表面標誌⑶1 lb、CD14、CD31、CD33、CD34、CD133和CD45。胎 盤來源的MSCS表達⑶四、CD44和CD105，不表達CD;34、CD45、CD19。臍帶來源的MSCS表達 CD13、CD29、CD44、CD105,不表達 CD34、CDlla、CD14、CD31、CD45。但胎盤和臍帶 MSCS 表面 標誌，不同文獻報到不盡相同。換而言之，骨髓、胎盤和臍帶MSCS都沒有明確的細胞表面標 志。臍帶作為連接胎兒和胎盤的管狀結構，其分離出的MSCS和胎盤MSCS表面表達的差異 有何不同，目前還沒有資料標明，但這種差異在發育生物學上有著重要意義，本專利就是採 用一種新的技術手段，來揭示胎盤和臍帶中分離出的MSCS表面蛋白表達差異。

發明內容
本發明要解決的問題是，克服現有技術中的不足，提供一種間充質幹細胞表面差 異膜蛋白的檢測方法，該方法可用於檢測胎盤、臍帶兩種不同來源的間充質幹細胞表面的 特殊的膜蛋白標誌。雙向凝膠電泳是蛋白質組研究中的主流技術，但該技術的重複性和敏感 性不佳，且缺乏對蛋白質點的精確定量，近年來出現的雙向螢光差異顯示凝膠技術 (two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)克月艮了傳統的雙向 疑膠 電泳技術的上述缺點，2D-DIGE在傳統雙向凝膠電泳技術的基礎上，結合多重螢光分析的方 法，在同一塊膠上分離多個由不同螢光標記的樣品，並第一次引入了內標的概念，軟體自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的，極 大地提高了結果的準確性，可靠性和重複性，避免了使用不同凝膠時在操作上的偶然性和 不平行性。因此我們我們通過雙向螢光差異凝膠電泳對不同來源的膜蛋白進行分析，來研究 胎盤和臍帶MSCS表面差異蛋白，在此基礎上一方面可製備單抗，進行MSCS的鑑定，另一方 面，揭示兩者在發育生物學上的關係。為解決技術問題，本發明是通過如下的技術方案實現的
提供一種胎盤來源的間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法，包括以下步驟
(1)間充質幹細胞的分離和培養
如間充質幹細胞為胎盤來源，則取新鮮胎盤組織剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的 細胞懸液，使用Ficoll分離液進行密度梯度離心，收集白膜層，洗兩遍，收集細胞，常規培 養；
如間充質幹細胞為臍帶來源，則取新鮮臍帶組織，剝離血管，剪碎，膠原酶消化，收集 消化得到的細胞懸液，離心，收集細胞，常規培養；
所有間充質幹細胞均培養至對數生長期，用於移植；
(2)間充質幹細胞膜蛋白的提取
反覆凍融法使得細胞破碎，然後通過梯度離心得到含有膜蛋白的組分；
(3)雙向螢光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜
通過雙向螢光差異凝膠電泳法(2D-DIGE)，得到Cy2、Cy3及Cy5螢光素標記的不同種類 的膜蛋白凝膠圖譜，採用DeCyder 2D圖像分析軟體進行分析，識別兩組間差異表達的蛋白 質點；
(4)質譜分析及驗證
選取差異蛋白質點，膠內酶解後進行質譜分析，並對網上資料庫查詢，鑑定差異蛋白 質，尋找不同來源幹細胞的特殊表面標誌，然後採用Western-Blot驗證。本發明的有益效果在於
本發明首次將2D-DIGE用來對幹細胞膜表面特殊差異表面標誌的檢測，可以在同一塊 凝膠上對不同樣品中蛋白質進行定量比較分析，在每塊凝膠中加入了內標，DIA和BVA軟體 可以自動地根據每個蛋白質點的內標對其表達量進行校準，最大程度上降低了不同批次膠 與膠之間的誤差，反應了蛋白質的真實改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。
具體實施例方式下面結合具體實施例子，對本發明的技術方案詳細描述。(一)間充質幹細胞細胞的分離培養 胎盤MSCSs的分離培養
無菌條件下將胎盤用預熱的PBS充分洗滌去血漬後，剪碎，剪成儘可能小的組織塊，置 於0. 1%四型膠原酶中消化，37°C消化，30min,過濾，用PBS衝洗，收集消化液和衝洗液，1200 rpm離心10 min，收集細胞沉澱，用5mlPBS重懸，加至5ml含有Ficoll-I^aqueTM PLUS人淋 巴細胞分離液(其相對密度為1.077g/L)上，進行梯度離心(20°C，2000rpm，25min)。離心 後，吸取管中白膜層，PBS洗滌兩次，收集細胞。MSCS專用培養基重懸，接種於6孔培養板中，置於37°C、5%0)2飽和溼度培養箱中，行常規培養及傳代。臍帶MSCSs的分離培養
無菌條件下將臍帶用預熱的PBS充分洗滌去血漬後，剝離臍動靜脈血管，剪成Icm3見 方的小塊，置於0. 1%四型膠原酶中消化，37°C消化，lh，過濾，用PBS衝洗，收集消化液和衝 洗液，1200 rpm，離心10 min，棄上清，PBS洗滌細胞沉澱。MSCS專用培養基重懸，接種於6 孔培養板中，置於37°C、5%0)2飽和溼度培養箱中，行常規培養及傳代。(二)分離細胞膜蛋白的方法
1、冰上刮下細胞後將細胞溶於有蛋白酶抑制劑的緩衝液A (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT, 0. 5 μ g/ml Leup印tin, 20 μ M pmsf (PH=7. 4))中，於室溫與液 氮罐中反覆凍融2次。2、5000轉4度離心，驅除核及未裂解的細胞。3、取上清12000轉4度離心10分鐘取沉澱溶於有蛋白酶抑制劑的緩衝液 B (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT,0.5 μ g/ml Leupeptin,20 μ M PMSF (ΡΗ=7· 4))中。4、12000轉4度離心10分鐘取沉澱溶於有蛋白酶抑制劑的緩衝液C (0.5 μ g/ml Leupeptin, 20 μ M PMSF, 50mMTris-cl (ΡΗ=7. 0))中提取後測蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳，分裝 後-20度保存備用。(三)膜蛋白濃度測定
採用GE公司專門針對蛋白質組學研究設計的蛋白質抽提2D Quant Kit定量試劑盒。 其基本原理是將蛋白質沉澱後，去除裂解液，再用含銅離子的溶液重溶蛋白質沉澱，未與蛋 白質結合的銅離子可與顯色工作液反應而顯色，顯色的深淺與蛋白質的濃度成反比。(四)2D_DIGE
1、內標樣品製備2個樣品(N1、N2)各取50 μ g，體積10μ 1，加入到同一個印pendorf 管裡，震蕩混勻，離心。然後50 μ g每管分裝成2管。2、儲存液的製備把染料從-20°C的冰箱中取出，輕旋，室溫靜置5min，吸5μ 1 DMF至染料管中，震蕩離心，配製成lnmol/μ 1儲存液。3、工作液的製備首先取1.8μ 1 DMF到印pendorf管，然後吸取1.2μ 1儲存液到 一個印pendorf管中，震蕩離心即配成400 pmol/μ 的工作液。避光保存。4、樣品標記將每1 μ 1工作液和50 μ g蛋白的比例進行螢光標記。整個操作中避 光進行。冰上避光放置30 min，每管蛋白中加入Ιμ 賴氨酸終止標記反應
5、樣品準備將分別用Cy2、Cy3和Cy5標記的樣品加入到同一印pendorf管中，震蕩混 勻，短暫離心。避光操作。每塊膠上加入等體積的2X上樣緩衝液(7mol/L尿素，2mmol/L 硫脲，4%CHAPS，65mmol/L DTT)冰上靜止10 min，準備上樣。 表1標記成分
權利要求
1.胎盤來源的間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法，包括以下步驟(1)間充質幹細胞的分離和培養取新鮮胎盤組織剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的細胞懸液，使用Ficoll分離液進 行密度梯度離心，收集白膜層，洗兩遍，收集細胞，常規培養；取新鮮臍帶組織，剝離血管，剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的細胞懸液，離心，收集 細胞，常規培養；所有間充質幹細胞均培養至對數生長期，用於移植；(2)間充質幹細胞膜蛋白的提取反覆凍融法使得細胞破碎，然後通過梯度離心得到含有膜蛋白的組分；(3)雙向螢光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜通過雙向螢光差異凝膠電泳法，得到Cy2、Cy3及Cy5螢光素標記的不同種類的膜蛋白 凝膠圖譜，採用DeCyder 2D圖像分析軟體進行分析，識別組間差異表達的蛋白質點；(4)質譜分析及驗證選取差異蛋白質點，膠內酶解後進行質譜分析，並對MareixScience公司的Mascot 網上資料庫查詢，鑑定差異蛋白質，尋找不同來源幹細胞的特殊表面標誌，然後採用 Western-Blot 驗證。
全文摘要
本發明涉及幹細胞差異膜蛋白的檢測方法，旨在提供一種胎盤來源的間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法。該方法包括間充質幹細胞的分離和培養、間充質幹細胞膜蛋白的提取、雙向螢光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜、質譜分析及驗證。本發明首次將2D-DIGE用來對幹細胞膜表面特殊差異表面標誌的檢測，可以在同一塊凝膠上對不同樣品中蛋白質進行定量比較分析，在每塊凝膠中加入了內標，DIA和BVA軟體可以自動地根據每個蛋白質點的內標對其表達量進行校準，最大程度上降低了不同批次膠與膠之間的誤差，反應了蛋白質的真實改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。
文檔編號G01N27/64GK102095777SQ20111000189
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者俞炯, 曹紅翠, 李蘭娟 申請人:浙江大學