通過測定標誌肽的水平在中風患者中進行預後和風險評估的製作方法

2023-11-30 21:54:26

專利名稱：通過測定標誌肽的水平在中風患者中進行預後和風險評估的製作方法
技術領域：
本發明屬於臨床診斷學領域。具體來說，本發明涉及通過測定標誌肽的水平在中風患者中進行結果預後和風險評估。
背景技術：
中風被定義為由腦血管疾病引起的急性局灶性神經功能缺損。中風的兩種主要類型是缺血性和出血性中風，分別佔約85%和15% (Hickey 2003.《神經和神經外科護理臨床實踐》第五片反(The clinical practice of neurological and neurosurgical nursing) (5th ed. )，Philadelphia =Lippincott, ffilliams&ffilkins) 當發生缺血性中風時，腦的血液供應中斷，腦細胞被剝奪葡萄糖和氧。約45%的缺血性中風由小或大的動脈血栓引起，20%源於栓子，其餘的原因未知(Hickey 2003.《神經和神經外科護理臨床實踐》第五片反(The clinical practice of neurological and neurosurgical nursing) (5th ed.), Philadelphia :Lippincott，Williams&Wilkins)。短暫性缺血性發作(TIA)(也稱為「小中風」)是一種症候群，其特徵為個別神經症狀突然發作，並在M小時內完全消解。0. 5-8%的老年人群可能報告TIA(Bots等， 1997. Stroke 28(4) :768-73)。表現出TIA的患者處於隨後不利事件的高風險中。已報導，90-天中風風險超過10%，最高風險出現在前兩天內(Jonston等，2003. Neurology 60: 1429-34)。中風是最重要的血管疾病之一。中風仍然是全世界死亡的第二大主因，在歐洲是成年人殘疾和病廢的主要原因之一(Murray和Lopez，1997. Lancet 349 :1269-76 ；Murray 和Lopez 1997. Lancet349 :1498-504)。在美國，每年有超過700000人患有中風，其中 550，000人是第一次中風(Thom等，2006. 「心臟病和中風統計數據——2006年更新來自美國心臟協會統計委員會和中風統計學分委會的報告」(Heart disease and stroke statistics—2006 update :A report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation 113:85-151)。因此，它是一個重要的公共衛生問題，並且對於保健提供者和整個社區來說是一個負擔，因為在保健的計劃和提供中不得不投入大量的工作。在我們的社會中，中風的發病率隨著年齡增加而顯著增加(Modan和Wagener， 1992. Stroke 23:1230-36)。大多數缺血性中風發生在71到80歲之間，而大多數出血性中風出現在 60 到 70 歲之間(Colombo 等，1989. Rivista de Neurologia 59 :1_7)。神經放射成像法例如計算機斷層成像術(CT)或磁共振斷層成像術(MRT)被用於診斷中風。對於患有由腦溢血引起的急性中風的患者，推薦進行CT掃描。然而，這種方法在患有急性缺血性發作的患者中效率較低(靈敏度低於33%)。此外，都卜勒超聲顯像法和數字減影血管造影術(DSA)可用於確定急性循環障礙的原因。缺血性中風的治療一般集中於支持生命機能和康復性措施。療法的目的在於通過打破血凝塊或機械移除它來除去阻塞、使血凝塊的增大降到最低並阻止新血凝塊的形成。 血栓溶解(血凝塊的分解)可以通過在中風後前3個小時內施用纖溶酶原激活劑(tPA或PLAT)來誘導。因為一些疾病狀態例如低血糖、偏頭痛、腦溢血和某些腦腫瘤具有與急性缺血性中風類似的症狀，因此對於快速鑑別診斷存在著需求。療法還需要根據患者的個體情況、例如個體的預後和/或個體再次中風的風險， 進行調整。中風患者在確定時間間隔後的結果預後可以是功能的，或與個體存活相關。 對於功能結果的預後來說，使用計分系統例如「改良的評分量表(modified Ranking Scale)」 (mRS ;Bonita和Beaglehole，1988. 「評級量表的改良在中風後運動功能的恢復，，(Modification of Ranking Scale :Recovery of motor function after stroke), Stroke 19:1497-1500)或「國立衛生研究院中風量表」(National Institutes of Health Stroke Scale) (NIHSS ;Adams等，1999. 「基線NIH中風量表分值強烈預測中風後結果 急性中風治療的 Org 10172 試驗(TOAST)報告」(Baseline NIH Stroke Scale score strongly predicts outcome after stroke :A report of the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST)),Neurology 53來確定預定時間後患者的發病率，NIHSS目前是金標準。功能結果也可以根據對護理的需要或根據日常生活的活動(ADL) 來表述，例如根據巴氏(Barthel)指數和評級量表(Collin等，1988. 「巴氏ADL指數可 ilt生石if究，，(The Barthel ADL Index :areliability study), International Disability Study 10 :61-3 ；Bonita和Beaglehole，1988. 「評級量表的改良在中風後運動功能的恢復，，(Modification of Ranking Scale :Recovery of motor function after stroke), Stroke 19 :1497-1500)。已經報導，一些生物標誌物能夠指示將來的心血管事件、例如再一次中風。已報導的潛在中風生物標誌物是S-100B (血清蛋白100 β ；Stranjalis等，2007 Acta Neurochir (Wien) 149 :231-7 ;Foerch 等，2005. Arch Neurol 62 :1130-4)、NSE (神經元特異性烯醇化酶；Ananc^P Maed 2005. Cerebrovasc Dis 20 :213-9)、GFAP (神經膠質纖維酸性蛋白；Nylen 等，2007. Mroke 38 :1489-94)、CRP (C 反應蛋白；Di Napoli 等，2001. Stroke 32 :133-8 ；Di Napoli 等，2001. Mroke 32 :917-24)、IL-6 (白介素-6 ;0rion 等， 2008. Eur J Neurol 15 :323-8 ；Shenhar-Tsarfaty 等，2007. Thromb Res 122:167-73)以及血漿纖維蛋白原 CTuraj 等，2006. J Neurol Sci 246:13-9)。已經顯示，N-端proBNP (NT-proBNP)是缺血性中風後(Jensen等，2006. Cerebrovasc Dis 22 :439-44 ；Sharma ^,2006. J Stroke Cerebrovasc Dis 15 :121-7 ； Makikallio等，20^. Stroke 36 :1016-20 ；Yip 等，2006. Circ J 70 :447-52)和出血性中風後(Sharma 等，2006. J Stroke Cerebrovasc Dis 15 :121-7)個體存活預後的一個獨立變量。在患有缺血性中風的患者的樣品中已經測定了成熟ANP(EStrada等，1994. Am J Hypertens 7 :1085-9)和 ADM (Hosomi 等，2004. JHypertens 22 :1945-51)的水平。然而，沒能顯示出ANP濃度與神經狀態(Mathew改良量表)或結果的關聯性。在中風患者的血液中已經發現升高的ET-I濃度，但是沒有調查這些數據的預後價值(Ziv 等，1992 Stroke 23 :1014-6 ；Alioglu 等，2002. Angiology 53 :77-82 ； Giannopoulos等，2008. Neurol. Res. 30(7) :727-30)。已經發現，在缺血性中風後患者中的 ET-I水平升高(Estrada等，1994. Am JHypertens 7 1085-9)，但是沒有確定與存活率的關聯性。
對患有急性中風的患者的血清降鈣素原(PCT)水平的研究(Miyakis等，2004. Clin Chim Acta 350 :437-9)，沒有顯示出在入院當天與第7天時的水平有顯著差異。在該研究中沒有發現PCT水平與死亡或神經結果的關聯性。人生長激素(hGH)是由垂體中的促生長激素細胞產生的多肽。它以脈衝方式分泌 (在每M小時的周期中10到20次脈衝)，並且其分泌受到三種下丘腦肽的調控，刺激hGH 分泌的生長激素釋放激素(GHRH)和生長激素釋放肽(ghrelin)，以及通過反向調控抑制 hGH分泌的生長素抑制因子(Kato等，2002. 「人生長激素分泌的調控及其障礙」(Regulation of human growth hormone secretion and its disorders)，Internal Med 41 :7-13)0HGH是異質的，由幾種分子同工型和片段組成(Baumarm G. 1991. 「生長激素的異質性基因、同工激素、變體和結合蛋白」(Growth hormone heterogeneity :genes, isohormones, variants and binding proteins)，Endocr Rev 12 :424-449)。在人類垂體中已經鑑定到4種主要的hGH同工型，其胺基酸數量不同，並包括191個胺基酸(頻率為87. 5 % )、176個胺基酸(8. 1 % )、153個胺基酸(3.3%)和145個胺基酸(11%) (Zhan X.等，2005. 「人類垂體中生長激素同工型的蛋白質組學分析」(Porteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary), Proteomics 5:1228—41)。 191個胺基酸形式的分子量為22kDa，與缺少32到46位胺基酸殘基的176個胺基酸形式(20kDa 同工型)從垂體腺前葉共同分泌(De Palo E.等，2006. 「生長激素同工型和區段/片段: 分子結構禾口實驗室狽Ij量」(Growth hormone isoforms and segments/fragments molecular structure and laboratory measurements)，Clin Chim Acta 365 :67-76)0女性的hGH分泌比男性略高，其最高水平在青春期時觀察到。分泌隨著年齡每10 年減少約14%。此外，分泌隨著正常生理和病理生理狀況而變。hGH分泌的主要生理調節機制是神經內源節律、睡眠、壓力、運動以及營養和代謝信號在慢波睡眠期間(典型為入睡後1至2小時)hGH水平較高，並被運動、壓力、發燒、禁食和使用某些胺基酸(亮氨酸和精氨酸)所增加。HGH分泌也被胰島素誘導的低血糖、L-多巴、可樂定(α2-腎上腺素能受體激動劑)、Y -羥基丁酸和β -腎上腺素能受體阻斷劑所刺激，而口服給予葡萄糖和血清游離脂肪酸水平的增加抑制hGH的分泌。hGH分泌也在肥胖症中並隨著衰老而減少。(綜述在Kato等，2002. 「人類生長激素分泌的調控及其障礙」(Regulation of human growth hormone secretion and its disorders)，Internal Med 41 :7-13)。C-反應蛋白(CRP)是一種血漿蛋白，其最初由Tillett和Francis在1930年作為患有急性炎症的患者血清中與肺炎球菌的C多糖反應的物質而發現。已經顯示，CRP基礎水平升高的患者具有糖尿病、高血壓和心血管疾病的增加的風險(Pradhan等，2001. JAMA 286 :327-334 ；Dehghan. 2007，Diabetes 56 872)。肌鈣蛋白是三種調節蛋白的複合物，其在骨骼肌和心肌而不是平滑肌中是肌肉收縮所必需的。肌鈣蛋白具有三個亞基TnC、TnI和TnT。每種亞基起到不同作用肌鈣蛋白 C(TnC)與鈣離子結合，在TnI中產生構象變化。肌鈣蛋白T與原肌球蛋白結合，使它們連鎖以形成肌鈣蛋白-原肌球蛋白複合物。肌鈣蛋白I與細肌絲中的肌動蛋白結合，將肌鈣蛋白-原肌球蛋白複合物保持在位。肌鈣蛋白的某些亞型(心臟肌鈣蛋白I和Τ)是心臟肌肉(心肌)損傷的非常靈敏和特異的指示物。它們在血液樣品中的水平可用於在患有胸痛的患者中辨別不穩定心絞痛和心肌梗塞(心臟病發作)(Antman等，1996. N Engl J Med；335 :1342-9)。發明概述本發明的主題是提供對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的改進方法，所述方法包括測定所述患者的樣品中至少一種標誌肽的水平。本發明涉及對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的方法，所述方法包括下列步驟a.提供來自所述患者的樣品，b.測定所述樣品中至少一種標誌肽的水平，所述標誌肽選自ANP、AVP、ADM、ET_1、 降鈣素、肌鈣蛋白、CRP和hGH或其片段或其前體或所述前體的片段，c.將所述至少一種標誌肽或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與所述患者的結果預後或風險評估相關聯。本發明還涉及本發明的方法的應用，用於對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估。發明詳述本發明涉及對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的方法，所述方法包括下列步驟a.提供來自所述患者的樣品，b.測定所述樣品中至少一種標誌肽的水平，所述標誌肽選自ANP、AVP、ADM、ET_1、 降鈣素、肌鈣蛋白、CRP和hGH或其片段或其前體或所述前體的片段，c.將所述至少一種標誌肽或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與所述患者的結果預後或風險評估相關聯。本發明的優選標誌肽是ANP、BNP、AVP、ADM、ET-I、降鈣素、肌鈣蛋白、CRP (C-反應蛋白)和hGH。特別優選的標誌肽是ANP、BNP, AVP、ADM、ET-I、降鈣素和hGH。這些肽也可以根據它們的起源和/或在體內合成的位置或根據主要作用位點或根據功能性質分類成亞組ANP、BNP和肌鈣蛋白(cT)是心血管肽，ET-I和ADM是內皮肽，AVP (包括例如和肽素) 和hGH是垂體肽，而PCT和CRP是炎性肽。肌鈣蛋白和CRP(C_反應蛋白)是蛋白質或蛋白複合物，即多肽。在本發明的情形中，它們與其他所提到的肽一樣，也被稱為標誌肽。因此，在本發明的情形中，術語「標誌肽」是指本發明的心血管、炎性和/或垂體肽。在本發明的一個優選實施方案中，所述樣品在幹預前從所述患者獲取。在本發明的另一個優選實施方案中，所述樣品在幹預後從所述患者獲取。本文中的術語「幹預前」是指用於治療中風或TIA的幹預開始之前的時間。使用「幹預」是指用於改變健康結果的任何醫學幹預。該定義包括藥物施用、外科程序、使用裝置、行為治療、護理方法改變等。優選，樣品在接收患者入院時或中風或TIA的診斷被證實之前獲取。術語「幹預後」是指幹預或治療已經開始後的時間。通過本發明的方法或使用本發明的分析法獲得的標誌物的水平，可以用本技術領域的專業人員公知的眾多方式進行分析。例如，可以將獲得的每個測定結果與「正常」值或指示特定疾病或結果的值進行比較。具體的診斷/預後可以取決於每個測定結果與這種值的比較，所述值可以被稱為診斷或預後「閾值」。在某些實施方案中，用於一種或多種診斷或預後指示物的分析法，僅僅通過分析法中所述指示物的存在或不存在而與病症或疾病相關聯。例如，可以設計分析法，使得只有當高於特定目標閾值濃度時才出現陽性信號，並且低於該濃度時分析法不提供高於背景的信號。診斷和/或預後測試的靈敏度和特異性不僅取決於測試的分析「質量」，而且還取決於構成異常結果的定義。在實踐中，典型地通過將「正常」(即表觀健康的)和「患病」群體的變量值對其相對頻率進行作圖，計算出受試者工作特徵曲線(R0C曲線)。對於任何特定標誌物來說，患有或未患疾病的對象的標誌物水平分布可能交疊。在這些條件下，測試不能以100%準確性絕對辨別正常與疾病，並且交疊的區域表示測試不能辨別正常與疾病的地方。選擇一個閾值，高於它(或低於它，取決於標誌物隨著疾病如何變化)時測試被認為是異常的，低於它時測試被認為是正常的。ROC曲線下的面積是觀察到的測量值將允許正確鑑定病症的概率的度量。即使在測試結果不一定給出準確數字的情況下，ROC曲線也能使用。只要人們能夠對結果評分，人們即能產生ROC曲線。例如，在「患病」樣品上進行的測試的結果可以按照程度評分(例如1 =低，2 =正常，3 =高)。這種評分可以與「正常」群體中的結果相關聯，並產生ROC曲線。這些方法在本技術領域中是公知的。參見例如Hanley 等，1982. Radiology 143 :29_36。優選，選擇閾值以提供ROC曲線面積大於約0. 5、更優選大於約0. 7、更加優選大於約0. 8、更加優選大於約0. 85，並且最優選大於約0. 9。在這種情形中，術語「約」是指給定測量值的+/_5%。ROC曲線的水平軸表示(1-特異性)，其隨著假陽性率而增加。曲線的垂直軸表示靈敏度，其隨著真陽性率而增加。因此，對於所選的具體截止值來說，可以測定(1-特異性) 的值，並可以獲得相應的靈敏度。ROC曲線下的面積是測量到的標誌物水平將允許正確鑑定疾病或病症的概率的度量。因此，ROC曲線下的面積可用於確定測試的有效性。在某些實施方案中，不依賴於組中的一個或多個標誌物的具體閾值來確定從對象獲得的標誌物水平情況是否指示了特定診斷/預後。相反，本發明可以利用標誌物組「情況」作為統一的整體進行評估。這種標誌物組中變化的特定「指紋」模式可以有效用作特定的診斷或預後指示物。正如在本文中討論的，變化的模式可以從單一樣品或組中的一個或多個成員的時間變化(或組的響應值)獲得。這裡的組是指一組標誌物。正如在本文後面所描述的，組的響應值優選通過對在各種截止值下特定標誌物組的靈敏度(即真陽性)對組的1_(特異性)(即假陽性)進行ROC曲線作圖來確定。在這些方法中，來自對象的標誌物測量值的情況合在一起，被認為提供了診斷或預後的總體概率(表示成數字分值或風險百分率)。在這樣的實施方案中，標誌物的某些亞組的增加可能足以在一個患者中指示特定診斷/預後，而標誌物的不同亞組的增加可能足以在另一個患者中指示相同或不同的診斷/預後。也可以向組中的一個或多個標誌物施加權重因數，例如，當標誌物在鑑定特定診斷/預後中效用特別高時，可以將其權重成使得在給定水平下， 它單獨即足以傳遞陽性結果的信號。同樣，也可以提供權重因數，使得特定標誌物的任何給定水平都不足以傳遞陽性結果的信號，而只有當另一個標誌物也加入分析時才傳遞結果的信號。在某些實施方案中，選擇標誌物和/或標誌物組，以表現出至少約70%的靈敏度、 更優選至少約80%的靈敏度、更加優選至少約85%的靈敏度、更甚優選至少約90%的靈敏度以及最優選至少約95%的靈敏度，與至少約70%的特異性、更優選至少約80%的特異性、更加優選至少約85%的特異性、更甚優選至少約90%的特異性以及最優選至少約95% 的特異性的組合。在特別優選實施方案中，靈敏度和特異性兩者均為至少約75%、更優選至少約80%、更加優選至少約85%、更甚優選至少約90%以及最優選至少約95%。在這種情況下，術語「約」是指給定測量值的+/_5%。在其他實施方案中，陽性似然比、陰性似然比、機會比或風險比被用作測試的預測風險或診斷疾病的能力的度量。在陽性似然比的情況下，值為1表示在「患病」和「對照」組二者的對象中陽性結果的可能性相等；值大於1表示在患病組中陽性結果可能性更大；值小於1表示在對照組中陽性結果可能性更大。在陰性似然比的情況下，值為1表示在「患病」和「對照」組二者的對象中陰性結果的可能性相等；值大於1表示在測試組中陰性結果可能性更大；值小於1表示在對照組中陰性結果可能性更大。在某些優選實施方案中，優選選擇標誌物和/或標誌物組能夠表現出至少約1. 5以上或約0. 67以下、更優選至少約2以上或約0. 5以下、更加優選至少約5以上或約0. 2以下、更甚優選至少約10以上或約0. 1 以下，以及最優選至少約20以上或約0. 05以下的陽性或陰性似然比。在這種情況下，術語 「約」是指給定測量值的+/-5%。在機會比的情況下，值為1表示在「患病」和「對照」組二者的對象中陽性結果可能性相等；值大於1表示在患病組中陽性結果可能性更大；值小於1表示在對照組中陽性結果可能性更大。在某些優選實施方案中，優選選擇標誌物和/或標誌物組能夠表現出至少約2以上或約0. 5以下、更優選至少約3以上或約0. 33以下、更加優選至少約4以上或約0. 25以下、更甚優選至少約5以上或約0. 2以下以及最優選至少約10以上或約0. 1以下的機會比。在這種情況下，術語「約」是指給定測量值的+/_5%。在風險比的情況下，值為1表示在「患病」和「對照」組二者中終點(例如死亡) 的相對風險相等；值大於1表示在患病組中風險更高；值小於1表示在對照組中風險更高。 在某些優選實施方案中，優選選擇標誌物和/或標誌物組能夠表現出至少約1.1以上或約 0. 91以下、更優選至少約1. 25以上或約0. 8以下、更加優選至少約1. 5以上或約0. 67以下、更甚優選至少約2以上或約0. 5以下以及最優選至少約2. 5以上或約0. 4以下的風險比。在這種情況下，術語「約」是指給定測量值的+/_5%。專業技術人員將會理解，將診斷或預後指示物與診斷或與將來臨床結果的預後風險相關聯，是一種統計學分析。例如，標誌物水平大於X可以傳遞患者與水平低於或等於X 的患者相比更可能遭受不良後果的信號，正如通過統計學顯著性水平所確定的。此外，標誌物濃度從基線水平的改變可以反映患者的預後，並且標誌物水平變化的程度可能與不良事件的嚴重性相關。統計學顯著性經常通過比較兩個或多個群體並確定置信區間和/或ρ值來確定。參見例如Dowdy和Wearden，《用於研究的統計學》(Statistics for Research), John ffiley&Sons, New York，1983。本發明的優選置信區間是 90 %、95%、97. 5%、98 %、 99 %,99. 5 %,99. 9 % 和 99. 99 %,而優選的 ρ 值是 0. 1、0· 05,0. 025,0. 02,0. 01,0. 005、 0. 001 和 0. 0001。在其他實施方案中，可以進行多次診斷或預後標誌物的測定，並可以使用標誌物的時間變化確定診斷或預後。例如，可以在初始時間測定對象樣品中的標誌物濃度，並在第二個時間從第二個對象樣品再次測定。在這樣的實施方案中，標誌物從初始時間到第二個時間的增加可以指示特定的診斷或特定的預後。同樣地，標誌物從初始時間到第二個時間的減少可以指示特定的診斷或特定的預後。當在本文中使用時，術語「樣品」是指出於對目標對象例如患者進行診斷、預後或評估的目的而獲得的體液樣品。優選的測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、 痰液和胸膜腔積液。此外，本技術領域的專業人員將會認識到，某些測試樣品在分級或純化程序、例如將全血分離成血清或血漿組分後，將更容易分析。因此，在本發明的優選實施方案中，樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿液樣品，或上面提到的任何樣品的提取物。優選，樣品是血液樣品，最優選為血清樣品或血漿樣品。本文中使用的術語「患者」是指由於疾病而接受醫療護理或應接受醫療護理的活的人類或非人類生物體。這包括正對其病徵進行研究的患有未確定疾病的人。因此，本文描述的方法和分析法適用於人類和獸醫疾病兩者。當在本文中在涉及診斷和預後標記物的用途中使用時，術語「相關聯」是指將患者中標記物的存在或量，與其在已知患有給定病症或已知具有給定病症風險的人、或已知沒有給定病症的人中的存在或量進行比較。正如上面討論的，可以將患者樣品中的標誌物水平與已知與特定診斷相關的水平進行比較。樣品的標誌物水平被說成已經與診斷相關聯； 也就是說，專業技術人員可以使用標誌物水平確定患者是否具有特定類型的診斷，並做出相應反應。供選地，樣品的標誌物水平可以與已知與良好結果(例如不存在疾病等)相關的標誌物水平進行比較。在優選實施方案中，將一組標誌物的水平與總體概率或特定結果相關聯。優選，所述結果或所述風險是指存活和/或功能結果和/或再次中風或再次短暫性缺血性發作。本發明還涉及用於將患者分層到風險組中的方法，所述患者已患過中風或短暫性缺血性發作，並且所述方法包含上面描述的步驟。在本發明的情形中，ANP是指心房利尿鈉肽或其片段或其前體或所述前體的片段。ANP前體的優選片段是中段proANP (MR-proANP)。中段proANP (MR-proANP)被定義為proANP或其任何包含proANP的至少53-90位胺基酸殘基的片段。在本發明的情形中， MR-proANP53_9(1是特別優選的標誌肽。在本發明的情形中，AVP是指精氨酸血管加壓素(=血管加壓素)或其片段或其前體或所述前體的片段。AVP前體的優選片段是C-端proAVP (CT-proAVP或和肽素)。在本發明的情形中，CT-proAVP1(17_145 (或CT-pre-proAVP126_164)是特別優選的標誌肽。在本發明的情形中，ADM是指腎上腺髓質素或其片段、或其前體或所述前體的片段。ADM前體的優選片段是中段proADM (MR-proADM)。在本發明的情形中，MR-proADM24_71 (或 MR-pr印roADM45_92)是特別優選的標誌肽。在本發明的情形中，ET-I是指內皮素1或其片段或其前體或所述前體的片段。ET-I前體的優選片段是C-端-proETl (CT-proETl)。在本發明的情形中， CT-proET-l151_195 (或 CT-pr印roET-l168_212)是特別優選的標誌肽。在本發明的情形中，降鈣素也涉及其片段或其前體或所述前體的片段。降鈣素的優選前體是降鈣素原(PCT)。在本發明的情形中，PCT是指包含1-116、2-116或3-116位胺基酸的降鈣素原或其片段。降鈣素原可以包含翻譯後修飾例如糖基化、脂基化 (Iiposidation)或衍生化。在本發明的情形中，hGH是指人生長激素或其片段或其前體或所述前體的片段。在本發明的情形中，hGH是特別優選的垂體肽。標誌肽的「片段」是指長度為至少12個胺基酸、優選長度為至少6個胺基酸殘基的片段。此外，本發明涉及對被懷疑患有中風或短暫性缺血性發作或顯示出至少與中風或短暫性缺血性發作相似的症狀的患者進行診斷的方法，所述方法包含a.提供來自所述患者的樣品，b.測定所述樣品中至少一種標誌肽的水平，所述標誌肽選自ANP、AVP、ADM、ET_1、 降鈣素和hGH或其片段或其前體或所述前體的片段，c.根據所述至少一種標誌肽的水平，確定所述患者是否患有中風或短暫性缺血性發作。中風或類似中風的症狀可以包含例如偏癱、面部肌肉無力、麻木和感官或震動感覺減低。在大多數情況下，症狀只影響身體的一側(單側)。取決於中風的病因，症狀還可能包括下列一種或多種症狀嗅覺、味覺、聽覺或視覺改變(完全或部分)，眼瞼下垂(下垂症)和眼肌無力，反射(例如嘔吐、吞咽、瞳孔對光反應)降低，感覺減低和面部肌肉無力， 平衡問題和眼球震顫，呼吸和心率變化，胸鎖乳突肌無力伴有不能將頭轉向一側，舌無力 (不能伸出和/或從一側移動到另一側)，失語症(不能說話或理解涉及布羅卡(Broca' s) 區或韋尼克氏(Wernicke' s)區的語言)，失用症(隨意運動改變)，視野缺損，記憶缺失 (涉及顳葉)，偏側忽視(涉及頂葉)，思維瓦解，混亂，過度穢言(hypersexual gestures) (涉及前葉)，疾病失認症(堅持否認通常與中風相關的缺陷的存在)，行走困難，運動協調改變，眩暈和或不平衡。優選，所述至少一種標誌肽的水平歸因於缺血性中風或出血性中風或短暫性缺血性發作。在本發明的情形中，術語「水平」是指從患者獲取的樣品中標誌肽的濃度(優選表示成重量/體積；w/v)。正如上面所概述的，本發明的標誌肽還涉及其片段或其前體肽或所述前體的片段。標誌肽還包括激素原或前激素原或其片段，特別是激素原及其片段。在本發明的情形中，優選，ANP是proANP、最優選為MR-proANP。優選，AVP是proAVP、更優選為CT-proAVP、 最優選為CT-proAVP1(17_145及其片段。優選，ADM是proADM、更優選為MR-proADM、最優選為MR-proADM24_71及其片段。優選，ET-I是proET_l、更優選為CT-proET-Ι、最優選為 CT-proET-l151_195及其片段。優選，降鈣素是PCIV116及其片段。在本發明的一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP、AVP、ADM、ET_1和降鈣素。在本發明的另一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP、AVP、ADM、ET_1和hGH。在本發明的另一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP、AVP、ADM和ET-1。在本發明的另一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP、AVP和ADM。在本發明的又一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP和ADM。在本發明的又一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP、ADM、ET_1、降鈣素和hGH。在本發明的又一個優選實施方案中，標誌肽選自ANP、ADM和ET-I。
在本發明的特別優選實施方案中，標誌肽選自MR-proANP、C-端proAVP(和肽素)、 MR-proADM、CT-proET-1、PCT 和 hGH。在另一個特別優選實施方案中，標誌肽選自MR-proANP、MR-proADM和 CT-proET-1ο在本發明的另一個優選實施方案中，標誌肽選自MR-proANP、C-端proAVP (和肽素)、MR-proADM 和 CT-proET-1。在本發明的又一個優選實施方案中，標誌肽選自MR-proANP、MR-proADM、PCT和 hGH。在本發明的又一個優選實施方案中，標誌肽選自MR-proANP、C-端proAVP(和肽素)、MR-proADM、CT-proET-1 和 hGH。 在本發明的又一個優選實施方案中，標誌肽選自MR-proANP、MR-proADM、 CT-proET-1、PCT 和 hGH。在本發明方法的優選實施方案中，標誌肽是proANP。優選，標誌肽的水平通過檢測中段proANP來測定。在本發明方法的優選實施方案中，標誌肽是proAVP。優選，標誌肽的水平通過檢測 C-端proAVP來測定。在本發明方法的優選實施方案中，標誌肽是proADM。優選，標誌肽的水平通過檢測中段proADM來測定。在本發明方法的優選實施方案中，標誌肽是proET-Ι。優選，標誌肽的水平通過檢測C-端proET-Ι來測定。在本發明方法的優選實施方案中，標誌肽是PCT。優選，標誌肽的水平通過檢測 PCT來測定。在本發明方法的優選實施方案中，標誌肽是hGH。優選，標誌肽的水平通過檢測 hGH來測定。在本發明的優選實施方案中，使用兩種或多種心血管標誌物的組合。在本文中，優選第二中或其他心血管標誌物選自ANP、BNP, AVP、ADM、ET-I、降鈣素和hGH。任選地，附加地測定BNP或其片段或其前體或所述前體的片段的水平。在本發明的情形中，BNP是指腦利尿鈉肽或其片段或其前體或所述前體的片段。 BNP前體的優選片段是N-端proBNP (NT-proBNP)。在本發明的情形中，NT-proBNP是特別優選的標誌肽。在本發明的優選實施方案中，測定一種以上心血管標誌物的水平，並對每種單獨標誌物的結果進行不同加權，用於對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估。特別優選測定一組兩種或以上標誌肽的水平，最優選測定一組兩種標誌肽的水平。樣品中一種以上標誌肽水平的測定，與單一標誌物相比，提供了對患者進行結果預後或風險評估的更高可能性。本發明的特定實施方案涉及本發明的用於對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的方法，其中測定了至少兩種標誌肽的水平，並且其中每種標誌肽選自不同的肽亞組，所述亞組選自心臟肽、內皮肽、垂體肽和炎性肽，其中心臟肽選自ANP、BNP和肌鈣蛋白(cT)，內皮肽選自ET-I和ADM，垂體肽選自AVP和hGH，炎性肽選自 PCT 禾口 CRP0在另一個優選實施方案中，測定樣品中2、3、4、5、6、7、8或9種標誌肽的水平。最優選測定一組至少兩種標誌肽的水平，並且所述至少兩種標誌肽的組選自下列心血管肽的組合ANP與AVP，ANP與ADM，ANP與ET_1，ANP與降鈣素，ANP與hGH，ADM與 ET-I，ADM與降鈣素，ADM與hGH，ET-I與降鈣素，ET-I與hGH以及降鈣素與hGH。然而，在本發明的某些實施方案中，除了該兩種心血管肽的組之外，可以測定第三種或更多標誌肽的水平。在一個優選實施方案中，測定ANP和ADM的水平。優選，測定MR-proANP和 MR-proADM 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ANP和ET-I的水平。優選，測定MR-proANP和 CT-proET-Ι 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ANP和降鈣素的水平。優選，測定MR-proANP和 PCT的水平。在另一個優選實施方案中，測定ANP和hGH的水平。優選，測定MR-proANP和hGH 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ANP和BNP的水平。優選，測定MR-proANP和 NT-proBNP 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ADM和ET-I的水平。優選，測定MR-proADM和 CT-proET-Ι 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ADM和降鈣素的水平。優選，測定MR-proADM和 PCT的水平。在另一個優選實施方案中，測定ADM和hGH的水平。優選，測定MR-proADM和hGH 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ADM和BNP的水平。優選，測定MR-proADM和 NT-proBNP 的水平。在另一個優選實施方案中，測定ET-I和降鈣素的水平。優選，測定CT-proET-Ι和 PCT的水平。在另一個優選實施方案中，測定ET-I和hGH的水平。優選，測定CT-proET-Ι和 hGH的水平。在另一個優選實施方案中，測定ET-I和BNP的水平。優選，測定CT-proET-l和 NT-proBNP 的水平。在另一個優選實施方案中，測定PCT和hGH的水平。優選，測定PCT和hGH的水平。在另一個優選實施方案中，測定PCT和BNP的水平。優選，測定PCT和NT-proBNP 的水平。在另一個優選實施方案中，測定hGH和BNP的水平。優選，測定hGH和NT-proBNP 的水平。在一個特定實施方案中，在入院第一天(0日)和入院後第1日、2日、3日、4日、5 日、6日、7日、8日、9日或10日測定至少一種標誌肽的水平。優選，在入院後第0日、第1日、第3日和第5日測定至少一種標誌肽的水平。更優選，在入院後第0日和第5日測定至少一種標誌肽的水平。在另一個優選實施方案中，在幹預前和幹預後測定至少一種標誌肽的水平。更優選，在幹預前和第5日測定至少一種標誌肽的水平。無論何時測定一種或多種標誌肽的水平，樣品都從患者獲取。在本發明的特定實施方案中，在第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10日從所述患者獲取樣品，測量所述樣品中至少一種標誌肽的水平，並將其用於對所述患者進行結果預後或風險評估，或用於確定所述患者是否患有中風或短暫性缺血性發作。在本發明的情形中特別優選，沒有測定樣品中選自NOGO受體、RNA結合蛋白調節亞基、遍在蛋白融合物降解蛋白1同系物、β -嵌合素、核苷二磷酸激酶A和硝基酪氨酸的標誌物或一種或多種與其相關的標誌物的存在或量。在這種情形中，術語「相關標誌物」是指特定標誌物的可以作為標誌物本身的替代被檢測的一種或多種片段。這些相關標誌物可以是例如標誌物的「前體」、「原」或「原的前體」形式，或被移除以形成成熟標誌物的「前體」、 「原」或「前體原」片段。根據優選實施方案，測定使用多變量分析進行，所述多變量分析還考慮到了選自 NIHSS、巴氏指數和mRS的另外一種或多種協變量。本文中的術語「結果」是指例如患者在規定時間例如5天、4周、3個月、1年後的存活、或再次中風或功能結果。最優選，預測中風或TIA後3個月的結果。在本發明的情形中，術語「功能結果」涉及患者在規定時間例如5天、4周、3個月或1年後疾病的嚴重性程度，即健康狀況，優選是在中風或中風樣症狀方面。最優選，預測中風或TIA後3個月的功能結果。在本發明的情形中，優選功能結果被確定為結果的嚴重性評分或程度。功能結果也可以根據對護理的需要或根據日常生活活動(ADL)、例如根據巴氏指數、NIHSS和改良的評分量表來表述。此外，本發明還涉及用於對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的試劑盒，所述試劑盒包含針對選自ANP、AVP、ADM、ET-1、降鈣素、肌鈣蛋白、CRP 和hGH的標誌肽或其片段或其前體或所述前體的片段的一種或多種捕獲探針(優選為抗體或其功能性片段)。試劑盒可以任選包含針對BNP的捕獲探針(優選為抗體或其功能性片段)。試劑盒可以另外包含檢測所需的試劑例如緩衝液。此外，試劑盒還可以包含一種或多種標準樣品，即一種或多種標誌肽的具有確定濃度的一種或多種樣品。優選，試劑盒包含針對標誌肽或其片段或其前體或所述前體的片段的至少兩種捕獲探針的組合，所述組合選自MR-proANP與MR-proADM、MR-proANP與CT-proET-1、 MR-proADM 與 CT-proET-1、MR-proANP 與 hGH、hGH 與 MR-proADM、hGH 與 CT-proET-1、 MR-proANP 與 PCT、MR-proADM 與 PCT、CT-proAVP 與 PCT、CT-proET-1 與 PCT 和 hGH 與 PCT。本發明還涉及本發明的方法或本發明的試劑盒的應用，用於已患過中風或短暫性缺血性發作的患者中進行結果預後或風險評估。本發明還涉及本發明方法的應用，用於在已患過中風或短暫性缺血性發作的患者中監測治療。本發明還涉及本發明方法的應用，用於在所述對象中鑑別診斷缺血性中風、出血性中風和/或短暫性缺血性發作，優選在中風或TIA的第一次症狀後M小時內。特別優選，所述方法和試劑盒用於鑑別缺血性中風與出血性中風，或用於鑑別缺血性和/或出血性中風與短暫性缺血性發作。在這種情形中，優選的單一標誌物是ANP特別是MR-proANP、 AVP特別是和肽素、ADM特別是MR-proADM、ET-l特別是CT-proET_l、PCT和hGH。在這種情形下，也可以使用本發明的兩種或多種標誌肽的組合。特別優選的組合包含MR-proANP與 MR-proADM、MR-proANP 與 CT-proET_l、MR-proADM 與 CT-proET_l、MR-proANP 與 hGH、hGH 與 MR-proADM、hGH 與 CT-proET-1、MR-proANP 與 PCT、MR-proADM 與 PCT、CT-proAVP 與 PCT、 CT-proET-1 與 PCT、hGH 與 PCT。本文中標誌肽的水平的測定(或測量或檢測)使用下面解釋的檢測方法和/或診斷分析法來進行。當在本文中提到時，「分析法」或「診斷分析法」可以是在診斷學領域中應用的任何類型的分析法。這樣的分析法可以基於待檢測分析物與具有一定親和性的一種或多種捕獲探針的結合。對於捕獲分子與靶分子或目標分子之間的相互作用來說，親和常數優選大於 IO8M^10在本發明的情形中，「捕獲分子」是可用於結合來自樣品的靶分子或目標分子、即分析物(即在本發明的情況下是心血管肽)的分子。因此，捕獲分子必須在空間上和表面特徵例如表面電荷、疏水性、親水性、存在或不存在路易斯供體和/或受體方面適當塑造， 以特異性結合靶分子或目標分子。因此，結合可以由例如捕獲分子與靶分子或目標分子之間的離子、範德華、n-n、S-Ji、疏水或氫鍵相互作用或兩種以上上面提到的相互作用的組合來介導。在本發明的情形中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、糖類分子、RNA分子、蛋白質、抗體、肽或糖蛋白。優選，捕獲分子是抗體，包括其與靶或目標分子具有足夠親和性的片段，並包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體或其源自於變體鏈的長度為至少12 個胺基酸的片段的化學和/或生物化學修飾的衍生物。優選的檢測方法包括各種格式的免疫分析法，例如放射免疫分析(RIA)、化學發光-和螢光-免疫分析、酶聯免疫分析(ELISA)、基於Luminex的珠子陣列、蛋白質微陣列分析，以及快速檢測格式例如免疫層析試紙試驗。分析法可以是均相或非均相分析、競爭和非競爭性夾心分析。在特別優選的實施方案中，分析法是夾心分析形式，其是非競爭性免疫分析，其中待檢測和/或定量的分子與第一抗體並與第二抗體結合。第一抗體可以結合到固相例如珠子上、孔或其他容器的表面上、晶片或試紙上，並且第二抗體是例如用染料、放射性同位素或者反應性或催化活性部分標記的抗體。然後通過適合的方法測量與分析物結合的標記抗體的量。「夾心分析」所涉及的通用組合物和程序是已確立的，並為專業技術人員所公知。(《免疫分析手冊》(The Immunoassay Handbook) ,David Wild Elsevier LTD，Oxford ；第三片反(2005 年 5 月)， ISBN-13 :978-0080445267 ；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb ；10(1) :4-10. PMID :16376134)，在此引為參考。在特別優選的實施方案中，分析法包含兩種捕獲分子，優選為都作為分散體存在於液體反應混合物中的抗體，其中第一種標記組分附著在第一種捕獲分子上，其中所述第一種標記組分是基於螢光-或化學發光-淬滅或擴增的標記系統的一部分，並且所述標記系統的第二種標記組分附著於第二種捕獲分子上，使得當兩種捕獲分子與分析物結合後產生可測量信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心複合物。
更加優選，所述標記系統包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與螢光染料或化學發光染料、特別是花青類型的染料的組合。在本發明的情形中，基於螢光的分析法包含使用染料，所述染料可以例如選自 FAM(5-或6-羧基螢光素)、VIC、NED、螢光素、螢光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、 花青染料例如CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7、佔噸、6-羧基-2』，4』，7』，4，7-六氯螢光素 (HEX)、TET、6-羧基-4，，5，- 二氯-2，，7，- 二甲氧基螢光素(JOE)、N，N，N' , N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5_羧基羅丹明-6G (R6G5)、6_羧基羅丹明_6G(RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯並亞胺類例如Hoechst 33258 ；菲啶類例如德克薩斯紅、 雅吉瓦黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶類染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、嚇啉染料、聚甲炔染料等。在本發明的情形中，基於化學發光的分析法包含使用基於對化學發光材料描述的物理原理的染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化學技術百科全書》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J. I. Kroschwitz 執行主編，Μ· Howe-Grant 編輯，John ffiley&Sons, 1993,vol. 15,p. 518-562中，在此引為參考，包括在551-562頁中的引用文獻。 優選的化學發光染料是吖啶酯。將患者樣品中的一種或多種標誌肽(或其片段或其前體或所述前體的片段)的水平、即濃度，與患者的結果預後或風險評估相關聯。例如，標誌肽的濃度高於某個閾值表明患者的不良結果或升高的風險。這樣的閾值對於MR-proANP來說優選在約100至300pmol/l 的範圍內，更優選為250pmol/l、最優選為188pmol/l ；對於和肽素來說，在約10至40pmol/ 1的範圍內，更優選為15pmol/l、最優選為20. 3pmol/l ；對於MR-proADM來說，在約0. 4至 1. Onmo 1/1的範圍內，更優選為0. 5nmol/l、最優選為0. 67nmol/l ；對於CT-pro-ET_l來說， 在約50至120pmol/l的範圍內，更優選為75pmol/l、最優選為98. 3pmol/l ；對於PCT來說，在約0. 01至0. 06ng/ml的範圍內，更優選為0. 015ng/ml、最優選為0. 026ng/ml ；對於 hGH來說，在約0. 25至1. 0ng/ml範圍內，更優選為0. 5ng/ml、最優選為0. 34ng/ml ；對於 NT-proBNP來說，在約250至500pg/ml的範圍內，更優選為450pg/ml、最優選為370pg/ml。在本文中，優選使用靈敏的PCT分析法(例如PCT靈敏分析法，B. R. Α. H. M. S AG, Hermigsdorf，德國)。在本文中，優選PCT分析法具有0. 05ng/ml以下的功能性靈敏度。這意味著在本發明方法的一個實施方案中，以高靈敏度(即靈敏度為0. 05ng/ml, 優選為0. 02ng/ml)測量患者樣品中的PCT水平。在這種情形中，優選將PCT水平與患者的存活預後相關聯。在本發明的另一個實施方案中，通過將患者個體的標誌肽水平與健康群體的某個百分位數(例如97. 5百分位數)相關聯，來確定患者的風險和/或結果。用於中風(出血性和/或缺血性)與TIA的鑑別診斷的優選閾值，對於MR-proANP 來說在約90至約140pmol/l的範圍內，對於和肽素來說在約9. 5至約11. 5pmol/l的範圍內，對於MR-proADM來說在約0. 5至約0. 8nmol/l的範圍內，對於CT-pro-ET_l來說在約65 至約90pmol/l的範圍內，對於PCT來說在約0. 0230至約0. 0260ng/ml的範圍內，對於hGH 來說在約0. 10至約0. 3ng/ml的範圍內，其中低於閾值的值表明TIA，高於閾值的值表明中風。用於鑑別診斷的實例性閾值提供在實施例11的表25中。
存活分析(Cox回歸和風險比)和Kaplan-Meier估計可用於評估或預測例如肽水平高於或低於截止值的患者的結果或風險(例如發病率)。在例如中風或TIA後3、4或12 個月的發病率可以通過風險比進行評估，所述風險比描述了肽水平高於某個截止值的患者的風險的增加。在中風或TIA後的觀察期內出現的再次中風或再次TIA的風險的增加，可以分別通過例如機會比和交叉表來確定。從入院之日與入院後某個時間、例如入院後第5日時的一種或多種標誌肽的相應水平的比較，可以使用Kaplan-Meier估計和風險比為例如肽水平高於或低於截止值的患者預測結果/風險，例如3、4、12個月後的存活概率。一般來說，一種以上標誌肽水平的測定值，可以通過對高於相應截止值的肽水平值的數量進行計數，用於評估患者的結果和風險。超過截止值的肽水平越多，患者的風險越高。Kaplan-Meier估計可用於預測死亡率，機會比可用於描述風險增加，用於再次中風或再次TIA的預測。正如在上文中提到的，根據本發明，標誌肽的測定水平可以按照功能結果進行表述，例如按照巴氏指數、NIHSS或改良的評分量表進行表述。例如，利用箱線圖(肽水平對結果)、受試者工作特徵曲線(ROC)分析和機會比，可以使用肽水平預測將來的功能結果。本發明的方法和試劑盒也可用於根據所述至少一種心血管肽的水平，確定所述患者是否患有中風或短暫性缺血性發作。在這種情況下，優選在幹預前獲取樣品。序列腎上腺髓質素的前體肽(前腎上腺髓質素原)的胺基酸序列提供在SEQ ID NO=I 中。腎上腺髓質素原是指前腎上腺髓質素原序列的22至185位胺基酸殘基。腎上腺髓質素原(pro-ADM)的胺基酸序列提供在SEQ ID NO. 2中。pro-ADM N-端20肽(PAMP)是指 pre-proADM的22-41位胺基酸殘基。PAMP的胺基酸序列提供在SEQ ID NO 3中。MR-pro-腎上腺髓質素(MR-pro-ADM)是指pre-pro_ADM的45-92位胺基酸殘基。MR-pro_ADM的胺基酸序列提供在SEQ ID N0:4中。成熟的腎上腺髓質素(ADM)的胺基酸序列提供在SEQ ID NO :5 中。ANP的胺基酸序列提供在SEQ ID NO :8中。153個胺基酸的pre-pro_ANP的序列顯示在SEQ ID N0:6中。在切掉N-端信號肽(25個胺基酸)和兩個C-端胺基酸(127/128) 後，釋放出proANP(SEQ ID NO :7)。ANP包含來自前體激素原pro-ΑΝΡ的C-端的99-1 位殘基。該激素原被切割成成熟的觀個胺基酸的肽ANP，也稱為ANP (1-28)或α-ANP，以及氨基端片段 ANP (1-98) (NT-proANP，SEQ ID NO :9)。中段 proANP (MR-proANP)被定義為NT-proANP或其包含proANP的至少53-90位胺基酸殘基(SEQ ID N0:10)的任何片段。 C-端兩個精氨酸殘基(SEQ ID NO 6的pre-pro_ANP中152和153位)在pre-pro_ANP的編碼基因的另一個等位基因中不存在，因此pre-pro-ANP可以只包含1到151位殘基。對於pre-pro-ANP的相應片段來說當然也是如此，特別是pro-ANP與和肽素可以包含或可以不包含這兩個C-端精氨酸。164個胺基酸的血管加壓素前體肽(前血管加壓素原)的序列提供在SEQ ID NO 11中。血管加壓素原是指前血管加壓素原序列的四至164位胺基酸殘基。血管加壓素原的胺基酸序列提供在SEQ ID NO :12中。血管加壓素原被切割成成熟的血管加壓素、後葉激素運載蛋白II和C-端血管加壓素原(CT-proAVP或和肽素)。血管加壓素是指前血管加壓素原的20至觀位胺基酸殘基。血管加壓素的胺基酸序列顯示在SEQ ID N0:13中。和肽素是指前血管加壓素原的126至164位胺基酸殘基。和肽素的胺基酸序列提供在SEQ ID N0:14中。後葉激素運載蛋白II包含前血管加壓素原的32至IM位胺基酸殘基，其序列顯示在SEQ ID NO 15中。212個胺基酸的內皮素-1前體肽(前內皮素原-1)的序列提供在SEQ ID NO 16中。Pro-ET-I是指pre-pro-ET-l序列的18至212位胺基酸殘基。pro-ΕΤ-Ι的胺基酸序列提供在SEQ ID NO: 17中。Pro-ΕΤ-Ι被切割成成熟ET-1、big-ΕΤ-Ι和C-端 proET-1 (CT-proET-1)。ET-I 是指 pre-pro-ET-l 的 53 至 73 位胺基酸殘基。ET-I 的胺基酸序列顯示在SEQ ID NO 18中。CT-proET-Ι是指pre-pro-ET-l的168至212位胺基酸殘基。CT-proET-Ι的胺基酸序列提供在SEQ ID N0:19中。Big-ET-I包含pre-pro-ET-l 的53至90位胺基酸殘基，其序列顯示在SEQ ID NO 20中。141個胺基酸的降鈣素前體肽(前降鈣素原)序列提供在SEQ ID NO 21中。降鈣素原(PCT)是指前降鈣素原序列的沈至141位胺基酸殘基。PCT的胺基酸序列顯示在SEQ ID NO :22中。降鈣素原被切割成N-端PCT、降鈣素和鈣抑肽(katacalcin)。N-端PCT包含沈至82位胺基酸，其序列顯示在SEQ ID N0:23中。降鈣素是指8至116位胺基酸，其序列提供在SEQ ID N0J4中。包含121-141位胺基酸殘基的鈣抑肽的序列提供在SEQ ID NO 25 中。134個胺基酸的腦利尿鈉肽的前體肽(pre-pro-BNP)的序列提供在SEQ ID NO 26 中。Pro-BNP是指pre-pro-BNP的27至1；34位胺基酸殘基。pro-BNP的序列顯示在SEQ ID NO 27 中。Pro-BNP 被切割成 N-端 pro-BNP (NT-pro-BNP)和成熟 BNP。NT-pro-BNP 包含 27 至102位胺基酸殘基，其序列顯示在SEQ ID NO 28中。SEQ ID NO 29顯示了 BNP的序列， 其包含pre-pro-BNP肽的103至134位胺基酸殘基。
0149]SEQID NO 1 (pre-pro-ADM 的胺基酸序列)0150]1MKLVSVALMY LGSLAFLGAD TARLDVASEFRKKffNKffALSRGKRELRMSS0151]51SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMN0152]101NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRR0153]151RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGSAPHFL0154]SEQID NO :2(pro-ADM的胺基酸序列)0155]1ARLDVASEFR KKffNKffALSR GKRELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQ0156]51DMKGASRSPE DSSPDAARIR VKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLA0157]101HQIYQFTDKD KDNVAPRSKI SPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAH0158]151GAPAPPSGSA PHFL0159]SEQID NO :3(pro-ADM N20的胺基酸序列)0160]1ARLDVASEFR KKffNKffALSR0161]SEQID NO :4(MR-pro-ADM 的胺基酸序列)0162]1ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMKGASRSPEDSS0163]SEQID NO :5(ADM的胺基酸序列)0164]1YRQSMNNFQG LRSFGCRFGT CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQ0165]51GY0166]SEQID NO :6(pre-pro-ANP 的胺基酸序列)0167]1MSSFSTTTVS FLLLLAFQLL GQTRANPMYN AVSNADLMDFKNLLDHLEEK0168]51MPLEDEVVPP QVLSEPNEEA GAALSPLPEV PPffTGEVSPAQRDGGALGRG0169]101PffDSSDRSAL LKSKLRALLT APRSLRRSSC FGGRMDRIGAQSGLGCNSFR0170]151YRR0171]SEQID NO :7(pro-ANP的胺基酸序列)0172]1NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSEPNEEAGAALS0173]51PLPEVPPffTG EVSPAQRDGG ALGRGPffDSS DRSALLKSKLRALLTAPRSL0174]101RRSSCFGGRM DRIGAQSGLG CNSFRY0175]SEQID NO :8(ANP的胺基酸序列)0176]1SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY0177]SEQID NO 9 (NT-proANP的胺基酸序列)0178]1NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSEPNEEAGAALS0179]51PLPEVPPffTG EVSPAQRDGG ALGRGPffDSS DRSALLKSKLRALLTAPR0180]SEQID NO :10(proANP的53-90位胺基酸的胺基酸序列)0181]1PEVPPffTGEV SPAORDGGAL GRGPffDSSDR SALLKSKL0182]SEQID NO :11 (pre-pro-AVP 的胺基酸序列)0183]1MPDTMLPACF LGLLAFSSAC YFQNCPRGGK RAMSDLELRQCLPCGPGGKG0184]51RCFGPSICCA DELGCFVGTA EALRCQEENY LPSPCQSGQKACGSGGRCAA0185]101FGVCCNDESC VTEPECREGF HRRARASDRS NATQLDGPAGALLLRLVQLA0186]151GAPEPFEPAQ PDAY0187]SEQID NO :12(pro-AVP的胺基酸序列)0188]1CYFQNCPRGG KRAMSDLELR QCLPCGPGGK GRCFGPSICCADELGCFVGT0189]51AEALRCQEEN YLPSPCQSGQ KACGSGGRCA AFGVCCNDESCVTEPECREG0190]101FHRRARASDR SNATQLDGPA GALLLRLVQL AGAPEPFEPAQPDAY0191]SEQID NO 13 (AVP的胺基酸序列)0192]1CYFQNCPRG0193]SEQID NO :14(CT-pre-proAVP或和肽素的胺基酸序列)0194]1ASDRSNATQL DGPAGALLLR LVQLAGAPEP FEPAQPDAY0195]SEQID NO :15(後葉激素運載蛋白II的胺基酸序列)0196]1AMSDLELRQC LPCGPGGKGR CFGPSICCAD ELGCFVGTAEALRCQEENYL0197]51PSPCQSGQKA CGSGGRCAAF GVCCNDESCV TEPECREGFHRRA0198]SEQID NO :16(pre-pro-ET-l 的胺基酸序列)0199]1MDYLLMIFSL LFVACQGAPE TAVLGAELSA VGENGGEKPT PSPPWRLRRS
51 KRCSCSSLMD KECVYFCHLD IIWVNTPEHV VPYGLGSPRS KRALENLLPT 101 KATDRENRCQ CASQKDKKCW NFCQAGKELR AEDIMEKDWN NHKKGKDCSK 151 LGKKCIYQQL VRGRKIRRSS EEHLRQTRSE TMRNSVKSSF HDPKLKGKPS
201 RERYVTHNRA HWSEQ ID NO :17(pro-ET_l 的胺基酸序列)1 APETAVLGAE LSAVGENGGE KPTPSPPffRL RRSKRCSCSS LMDKECVYFC
51
101
151
SEQ
1
SEQ
1
SEQ
1
SEQ
1
51
101
SEQ
1
51
101
SEQ
1
51
SEQ
1
SEQ
1
SEQ
1
51
101
SEQ
1
51
101
SEQ
1
51
SEQ
1
ALESSPADPA RSKRCGNLST RPHVSMPQNA
QDYVQMKASE FPQTAIGVGA
TLSEDEARLL CMLGTYTQDF
N
LEQEQEREGS PGKKRDMSSD
HLDIIffVNTP EHVVPYGLGS PRSKRALENL LPTKATDREN RCQCASQKDK KCffNFCQAGK ELRAEDIMEK DffNNHKKGKD CSKLGKKCIY QQLVRGRKIR RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW ID NO :18(ET-1的胺基酸序列) CSCSSLMDKE CVYFCHLDII W SEQ ID NO :19(CT-pro-ET-l 的胺基酸序列)
RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW SEQ ID NO :20(Big-ET-l 的胺基酸序列)
CSCSSLMDKE CVYFCHLDII WVNTPEHVVP YGLGSPRS ID NO :21(前降鈣素原的胺基酸序列) MGFQKFSPFL ALSILVLLQA GSLHAAPFRS LAALVQDYVQ MKASELEQEQ EREGSSLDSP NKFHTFPQTA IGVGAPGKKR DMSSDLERDH ID NO 22 (PCT的胺基酸序列) APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV SLDSPRSKRC GNLSTCMLGT YTQDFNKFHT LERDHRPHVS MPQNAN ID NO 23 (N-端PCT的胺基酸序列)
APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV QDYVQMKASE LEQEQEREGS SLDSPRS
ID NO 24(降鈣素的胺基酸序列) CGNLSTCMLG TYTQDFNKFH TFPQTAIGVG AP ID NO :25(鈣抑肽的胺基酸序列) DMSSDLERDH RPHVSMPQNA N SEQ ID NO :26(pre-pro-BNP 的胺基酸序列):
MDPQTAPSRA LLLLLFLHLA FLGGRSHPLG SPGSASDLET SGLQEQRNHL QGKLSELQVE QTSLEPLQES PRPTGVffKSR EVATEGIRGH RKMVLYTLRA PRSPKMVQGS GCFGRKMDRI SSSSGLGCKV LRRH ID NO :27(pro-BNP的胺基酸序列)
HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL GCKVLRRH
SEQ ID NO :28(NT-pro-BNP 的胺基酸序列):
HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPR ID NO 29 (BNP的胺基酸序列) SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH


圖1 幹預前測量到的MR-proANP水平高(短劃線)和低(實線)的患者的 Kaplan-Meier圖(在四個月內存活的患者的比例)。圖2 具有幹預前測量到的MR-proADM水平高(短劃線)和低(實線)的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖3 具有的幹預前測量到的CT-proET-Ι水平高(短劃線)和低(實線)的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖4:幹預前測量到的CT-proAVP水平高(短劃線)和低(實線)的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖5 幹預前測量到的PCT水平高(短劃線)和低(實線)的患者的Kaplan-Meier 圖。圖6 幹預前測量到的hGH水平高(短劃線)和低(實線)的患者的Kaplan-Meier 圖。圖7 幹預前測量到的MR-proANP和CT-proAVP (兩種標誌的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖8 幹預前測量到的MR-proANP和MR-proADM(兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖9 幹預前測量到的MR-proANP和CT-proET_l (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖10 幹預前測量到的MR-proANP和PCT(兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖11 幹預前測量到的CT-proAVP和MR-proADM(兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖12 幹預前測量到的CT-proAVP和CT-proET-1 (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖13 幹預前測量到的CT-proAVP和PCT(兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖14 幹預前測量到的MR-proADM和CT-proET_l (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖15 幹預前測量到的MR-proADM和PCT (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖16 幹預前測量到的CT-proET-Ι和PCT (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於預定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖17 幹預前測量到的hGH和MR-proANP (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖18 幹預前測量到的hGH和MR_proADM(兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖19 幹預前測量到的hGH和CT-proET-l (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖20 幹預前測量到的hGH和PCT (兩種標誌物的成對組合)水平高和低的患者的 Kaplan-Meier圖。實線兩種標誌物低(低於規定閾值)；短劃/點線兩種標誌物高(高於規定閾值)；短劃線第一種標誌物低，第二種標誌物高；點線第一種標誌物高，第二種標誌物低。圖 21 MR-proANP, MR-proADM、CT-proAVP、CT-proET-1 和 / 或 PCT 水平高的患者的Kaplan-Meier圖。從上到下的曲線0、1、2、3和4個或更多標誌物高於規定閾值。圖 22 幹預前測量到的 MR-proANP、MR-proADM、CT-proAVP、CT-proET-l 和 / 或 PCT 水平高的患者的Kaplan-Meier圖。MR-proANP和CT-proAVP被計數兩次。從上到下的曲線0、1、2、3、4、5和6個或更多標誌物高於規定閾值。圖23 幹預前測量到的MR-proANP水平高和低並且第5日的改良評分量表為5的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖M 幹預前測量到的MR-proANP水平高和低並且第5日的巴氏指數< 85%的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖25 具有幹預前測量到的PCT水平高和低並且第1日的NIHSS指數< 10的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖26 幹預前測量到的MR-proANP水平高和低並且第5日的NIHSS指數< 10的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖27 幹預前測量到的PCT水平高和低並且第1日的NIHSS指數 10)和低的NIHSS (< 10)的患者的Kaplan-Meier 圖。圖34 第5日測量到的MR-proANP水平高/低的患者的Kaplan-Meier圖。圖35 第5日具有高/低的MR-proANP水平和高/低的NIHSS的患者的 Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，NIHSS低；短劃線標誌物水平低，NIHSS高；點線 標誌物水平高，NIHSS低；短劃/點線標誌物水平高並且NIHSS高。圖36 第5日具有高/低的CT-proAVP水平的患者的Kaplan-Meier圖。圖37 第5日具有高/低的CT-proAVP水平和高/低的NIHSS的患者的 Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，NIHSS低；短劃線標誌物水平低，NIHSS高；點線 標誌物水平高，NIHSS低；短劃/點線標誌物水平高並且NIHSS高。圖38 第5日具有高/低的CT-proET-Ι水平的患者的Kaplan-Meier圖。圖39 第5日具有高/低的CT-proET-Ι水平和高/低的NIHSS的患者的 Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，NIHSS低；短劃線標誌物水平低，NIHSS高；點線 標誌物水平高，NIHSS低；短劃/點線標誌物水平高並且NIHSS高。
圖40 第5日巴氏指數 85 % (實線)的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖41:第5日具有高/低的MR-proANP水平並且巴氏指數85%的患者的 Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，巴氏指數> 85% ；短劃線標誌物水平低，巴氏指數 85% ；短劃/點線標誌物水平高並且巴氏指數< 85%。圖42:第5日具有高/低的CT-proAVP水平並且巴氏指數85%的患者的 Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，巴氏指數> 85% ；短劃線標誌物水平低，巴氏指數 85% ；短劃/點線標誌物水平高並且巴氏指數< 85%。 圖43 第5日具有高/低的CT-proET-Ι水平並且巴氏指數85 %的患者的 Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，巴氏指數> 85% ；短劃線標誌物水平低，巴氏指數 85% ；短劃/點線標誌物水平高並且巴氏指數< 85%。圖44:第5日改良評分量表分值為0_2(實線)和3_6(短劃線)的患者的 Kaplan-Meier 圖。圖45 第5日具有高/低的MR-proANP水平並且改良評分量表分值在0_2或3_6 之間的患者的Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，評分0_2 ；短劃線標誌物水平低，評分3-6 ；點線標誌物水平高，評分0-2 ；短劃/點線標誌物水平高並且評分3-6。圖46 第5日具有高/低的MR-proADM水平並且改良評分量表分值在0_2或3_6 之間的患者的Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，評分0_2 ；短劃線標誌物水平低，評分3-6 ；點線標誌物水平高，評分0-2 ；短劃/點線標誌物水平高並且評分3-6。圖47 第5日具有高/低的CT-proAVP水平並且改良評分量表分值在0_2或3_6 之間的患者的Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，評分0_2 ；短劃線標誌物水平低，評分3-6 ；點線標誌物水平高，評分0-2 ；短劃/點線標誌物水平高並且評分3-6。圖48 第5日具有高/低的CT-proET-Ι水平並且改良評分量表分值在0_2或3_6 之間的患者的Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，評分0_2 ；短劃線標誌物水平低，評分3-6 ；點線標誌物水平高，評分0-2 ；短劃/點線標誌物水平高並且評分3-6。圖49 第5日具有高/低的PCT水平並且改良評分量表分值在0_2或3_6之間的患者的Kaplan-Meier圖。實線標誌物水平低，評分0_2 ；短劃線標誌物水平低，評分3_6 ； 點線標誌物水平高，評分0-2 ；短劃/點線標誌物水平高並且評分3-6。圖50 三個月後測定的改良評分量表分別與幹預前測量 到的CT-proAVP(A)和 MR-proANP(B)水平之間的關聯性的箱線圖。在χ軸上從左到右評分為0至6。圖51 幹預前測量到的CT-proAVP與三個月後二分式改良評分量表(好結果= mRS 0-2 ；壞結果=mRS 3-6)的受試者工作特徵曲線(ROC)圖。曲線下面積(AUC) = 0. 723。圖52 幹預前測量到的MR-proANP與三個月後二分式改良評分量表(好結果= mRS 0-2 ；壞結果=mRS 3-6)的 ROC 圖。AUC = 0. 703。圖53 幹預前測量到的MR-proADM與三個月後二分式改良評分量表(好結果= mRS 0-2 ；壞結果=mRS 3-6)的 ROC 圖。AUC = 0. 658。
圖54 幹預前測量到的CT-proET-Ι與三個月後二分式改良評分量表(好結果= mRS 0-2 ；壞結果=mRS 3-6)的 ROC 圖。AUC = 0. 608。圖55 幹預前測量到的PCT與三個月後二分式改良評分量表(好結果=mRS 0-2 ； 壞結果=mRS 3-6)的 ROC 圖。AUC = 0. 580。圖56幹預前測量到的hGH與三個月後二分式改良評分量表(好結果=mRS 0-2 ；壞結果=mRS 3-6)的 ROC 圖。AUC = 0. 581。圖57 在患有缺血性中風、出血性中風和TIA的患者中MR-proANP水平的分布。中位數值分別為 137. 0pmol/L、124. Opmol/L 和 90. 6pmol/L。圖58 使用MR-proANP作為單一標誌物鑑別診斷缺血性中風與TIA的ROC圖。AUC =0. 65 (P < 0. 0001)。圖59 使用MR-proANP作為單一標誌物鑑別診斷出血性中風與TIA的ROC圖。AUC =0. 65 (P < 0. 001)。圖60 在患有缺血性中風、出血性中風和TIA的患者中CT-proAVP (和肽素)水平的分布。中位數值分別為11. 0pmol/L、16. 6pmol/L和4. 8pmol/L。圖61 使用和肽素作為單一標誌物鑑別診斷缺血性中風與TIA的ROC圖。AUC = 0. 71 (P < 0. 0001)。圖62 使用和肽素作為單一標誌物鑑別診斷出血性中風與TIA的ROC圖。AUC = 0. 74 (P < 0. 0001)。圖63 在患有缺血性中風、出血性中風和TIA的患者中MR-proADM水平的分布。中位數值分別為 0. 74nmol/L、0. 71nmol/L 和 0. 61nmol/L。圖64 使用MR-proADM作為單一標誌物鑑別診斷缺血性中風與TIA的ROC圖。AUC =0. 61 (P < 0. 0001)。圖65 使用MR-proADM作為單一標誌物鑑別診斷出血性中風與TIA的ROC圖。AUC =0. 59 (P = 0. 033)。圖66 在患有缺血性中風、出血性中風和TIA的患者中CT-proET_l水平的分布。 中位數值分別為 72. 0pmol/L,75. 7pmol/L 和 63. 3pmol/L。圖67 使用CT-proET-Ι作為單一標誌物鑑別診斷缺血性中風與TIA的ROC圖。 AUC = 0. 59 (P < 0. 001)。圖68 使用CT-proET-Ι作為單一標誌物鑑別診斷出血性中風與TIA的ROC圖。 AUC = 0. 68 (P < 0. 0001)。圖69 在患有缺血性中風、出血性中風和TIA的患者中PCT水平的分布。中位數值分別為 0. 018ng/ml、0. 018ng/ml 和 0. 016ng/ml。圖70 使用PCT作為單一標誌物鑑別診斷缺血性中風與TIA的ROC圖。AUC = 0. 58 (P < 0. 001)。圖71 使用PCT作為單一標誌物鑑別診斷出血性中風與TIA的ROC圖。AUC = 0. 56 (P = 0. 17)。圖72 在患有缺血性中風、出血性中風和TIA的患者中hGH水平的分布。中位數值分別為 0. 42ng/ml、0. 41ng/ml 和 0. 24ng/ml。圖73 使用hGH作為單一標誌物鑑別診斷缺血性中風與TIA的ROC圖。AUC =0. 60 (P< 0. 001)。圖74 使用PCT作為單一標誌物鑑別診斷出血性中風與TIA的ROC圖。AUC = 0. 61 (P= 0. 013)。圖 75 :SEQ ID NO 1 (pre-pro-ADM 的胺基酸序列)圖 76 :SEQ ID NO 2 (pro-ADM 的胺基酸序列)圖 77 =SEQ ID NO :3 (pro-ADM N20 的胺基酸序列)圖 78 =SEQ ID NO 4 (MR-pro-ADM 的胺基酸序列)圖 79 :SEQ ID NO 5 (ADM 的胺基酸序列)圖 80 :SEQ ID NO 6 (pre-pro-ANP 的胺基酸序列)圖 81 :SEQ ID NO :7(pro_ANP 的胺基酸序列)圖 82 :SEQ ID NO 8 (ANP 的胺基酸序列)圖 83 :SEQ ID NO 9 (NT-proANP 的胺基酸序列)圖84 =SEQ ID NO 10 (pro ANP的53-90位胺基酸的胺基酸序列)圖 85 :SEQ ID NO 11 (pre-pro-AVP 的胺基酸序列)圖 86 :SEQ ID NO :12(pro-AVP 的胺基酸序列)圖 87 :SEQ ID NO 13 (AVP 的胺基酸序列)圖88 =SEQ ID NO 14 (CT-pre-proAVP 或和肽素的胺基酸序列)圖89 =SEQ ID NO :15(後葉激素運載蛋白II的胺基酸序列)圖 90 :SEQ ID NO 16 (pre-pro-ET-1 的胺基酸序列)圖 91 :SEQ ID NO :17(pro-ET_l 的胺基酸序列)圖 92 :SEQ ID NO :18(ET_1 的胺基酸序列)圖 93 :SEQ ID NO 19 (CT-pro-ET-l 的胺基酸序列)圖 94 :SEQ ID NO :20(Big-ET_l 的胺基酸序列)圖95 =SEQ ID NO 21 (前降鈣素原的胺基酸序列)圖 96 :SEQ ID NO 22 (PCT 的胺基酸序列)圖97 =SEQ ID NO 23 (N-端 PCT 的胺基酸序列)圖98 =SEQ ID NO :24 (降鈣素的胺基酸序列)圖99 =SEQ ID NO :25 (鈣抑肽的胺基酸序列)圖 100 :SEQ ID NO 26 (pre-pro-BNP 的胺基酸序列)圖 101 :SEQ ID NO :27(pro_BNP 的胺基酸序列)圖 102 =SEQ ID NO 28 (NT-pro-BNP 的胺基酸序列)圖 103 :SEQ ID NO 29 (BNP 的胺基酸序列)
實施例實施例1 臨床研究研究設置，入選/排除標準研究在巴塞爾大學醫院(University Hospital of Basel)的急診部和神經與神經外科門診部 進行。研究入選了急診部接納的在最近3天內症狀發作的符合世界衛生組織 (World Health Organization)標準的缺血性或出血性中風或短暫性腦缺血發作(TIA)的所有連續患者。排除了沒有知情同意書的患者。基線數據收集訪問沒有入選本研究的所有合格患者的數據，對於避免選擇偏倚是重要的。因此， 在所有合格患者中收集了關於入選和排除標準的基線數據和信息，不論他們是否入選在研究中。這允許對同意參加與不同意參加的合格患者的基線數據進行比較。患者中的基線數據收集由研究者進行，並包含a)年齡b)件別c)BMId)病史項入院前的真實病史；患有短暫性缺血性發作的患者中的AB⑶分值 (Rothwell等，2005. 「鑑定在短暫性缺血性發作後處於高的早期中風風險中的個體的簡單計分方法(ABCD) 」(A simple score (ABCD) to identify individuals at high early risk of stroke after transient ischaemic attack). Lancet 366:29-36)；家方矣史；也通過charlson指數(Goldstein等，2004. 「用於缺血性中風結果研究的charlson指數並存疾病調整，，(Charlson Index comorbidity adjustment for ischemic stroke outcome studie)s. Stroke 35 1941-5)評估的相關並存疾病(即高血壓、以前的中風、以前的TIA、 缺血性心臟病、心房纖顫、糖尿病、腎和肝功能障礙、充血性心力衰竭、血脂異常)；具有低鈉血症風險的並存疾病(嚴重的甲狀腺功能減退、糖皮質激素不足、腫瘤、HIV感染)；吸菸史(每年包數)和狀態(每天包數)；正在使用的藥物；飲酒量(每天杯數和克數)；從症狀發作到入院的時間。e)居住地點即獨立牛活，被定義為住在家裡或在養老院中，具有或不具有家庭圈和/或專業護理的支持(家庭圈由配偶和/或其他與患者一起生活的重要成員組成)； 不獨立生活，被定義為住在療養院長住部門、其他醫院。f)臨床項身體檢杳包括神經狀態、NIHSS(用於評估中風的嚴重性)和格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma scale) (GCS ;Adams等，1999. 「基線NIH中風量表分值強烈預測中風後結果急性中風治療的Org 10172試驗(TOAST)報告」(Baseline NIH Stroke Scale score strongly predicts outcome after stroke :A report of the Trial of Org 10172in Acute Stroke Treatment (TOAST)), Neurology 53 :126-31)、血壓、脈搏率、體重、 容量狀態(包括皮膚充盈、頸靜脈擴張、聽診、如果可獲得的話流體攝入和失去的流程表)、 體溫；在神經外科患者中的腦內壓，如果在常規臨床管理中進行的話。 g)在神經病患者中，在入院時和鈉失衡的情況下評估低鈉血症的臨床症狀。在經歷顱內手術的患者中，將每日評估臨床症狀。具體來說，監測頭痛、厭食、噁心、嘔吐、肌肉痙攣和疼痛、癲癇發作、意識不清、感覺遲鈍或昏睡發展的出現。h)常規/標準實驗室化驗常規採血包括血細胞比容、血尿素氮、碳酸氫鹽、總蛋白、白蛋白、血清尿酸和尿電解質、尿液和血清滲透壓、肌酸酐、脂類、TSH、fT4、T3和基礎皮質醇。如果可行，所有採血在攝取任何食物或吸菸之前進行。或者，對影響因素進行監測。 )成像腦顱的計算機斷層成像或MRI (T1、T2、擴散加權的成像序列，使用或不使用造影)，如果指明使用磁共振血管造影術或常規腦血管造影術的話。記錄了施加造影劑的時間點。
也在缺血性病灶的血管區域的基礎上將中風患者分類如下完全前循環症候群 (TACS)，部分前循環症候群(PACS)，腔隙性循環症候群(LACS)，後循環症候群(POCS)。 i)其他調杳對中風患者進行神經聲像圖、心回波描記術、標準的12導心電圖和 24小時心電圖檢查，然後按照急性治療中的Org 10172試驗(TOAST)中風亞型分類標準，通過中風的病因進行分類，所述分類標準用於區分大動脈粥樣硬化、心源性腦栓塞、小動脈阻塞、其他病因和未確定病因。知情同意書陳述研究得到巴塞爾倫理委員會(Ethikkommission beider Basel)的批准。重要的是指出，這是一項探索性和觀察性的研究；與研究相關的唯一幹預是要求在常規進行的採血過程中獲得7. 5ml血漿。因此，要求患者提供他們同意將其數據用於科學目的的書面知情同意書。在由於急性CNS病變(這是入選的先決條件)的後遺症而不能「知情同意」的患者中，患者的最近親屬將籤署同意書以陳述患者的假定意願。在不容易找到最近親屬的情況下，沒有參與本研究的主治醫生必須證明從他的觀點來看不反對入選到本研究中。只有在這些知情同意書程序後，患者才被入選在本研究中。在整個試驗過程中參與者的管理步驟1.急診部或神經科病房中的所有合格患者入選本研究。步驟2.收集所有基線數據。步驟3.在住院期間，通過圖表審杳評估臨床項目包括體重、血壓、脈搏率、容積狀態和體溫，直到出院。-流體治療和藥物-可能的低鈉血症症狀，即頭痛、噁心、嘔吐、肌肉痙攣和疼痛、厭食、意識受損、癲癇發作。-在常規採血時間點處取樣進行常規實驗室化驗(化學圖、血糖、血清滲透壓、尿液滲透壓、尿鈉、血細胞比容)。步驟4.在所有患者中，在入院第5日，使用NIHSS、巴氏指數和評分量表進行臨床檢查(Collin等，1988. 「巴氏ADL指數可靠性研究」(The Barthel ADL Index :a reliability study),International Disability Study 10 :61_3 ;Bonita禾口Beaglehole， 1988. 「排序量表的改良在中風後運動功能的恢復」(Modification of Ranking Scale Recovery of motor function after stroke), Stroke 19:1497-1500)。評估了未來居住地(即非獨立或獨立生活)。步驟6.在患有缺血性中風的患者中，在3個月後獲得了關於發病和死亡(通過巴氏指數和評分量表進行評估)的電話隨訪。不利結果被定義為巴氏指數<85或改良的評分量表為3到6。標誌肽濃度的管理MR-proANP水平使用檢測下限為6pmol/L的化學發光夾心免疫分析測量。在325 位健康個體中，MR-proANP的濃度範圍是9. 6-313pmol/L,中位數為45pmol/L。濃度在男性和女性之間差異不顯著，但是與對象的年齡顯著相關。MR-proADM水平使用檢測下限為0. 08nmol/L的化學發光夾心免疫分析測量。在 264位健康個體(117位男性和147位女性)中，MR-proADM值符合高斯分布(Gaussiandistribution)，平均值(SD)為 0. 33(0. 07) nmol/L，範圍為 0. 10-0. 64nmol/L。在性別之間沒有顯著差異，但是MR-proADM濃度與年齡顯著相關。CT-proET-Ι水平使用檢測下限為0. 4pmol/L的化學發光夾心免疫分析測量。在 326位健康個體(150位男性和176位女性)中，CT-proET-Ι值符合高斯分布，平均值(SD) 為44. 3(10. 6)pmol/L，範圍為10. 5-77. 4pmol/L。男性和女性中的CT-proET-Ι平均濃度沒有顯著差異，但是與年齡顯著相關。CT-proAVP (和肽素)水平使用檢測下限為1. 7pmol/L的化學發光夾心免疫分析測量。在359位健康個體(153位男性和206位女性)中，CT-proAVP中位水平為4. 2pmol/L，範圍為1. 0-13. 8pmol/L。在男性和女性之間，CT-proAVP的中位濃度差異顯著。在CT-proAVP 水平與年齡之間沒有相關性。PCT水平使用檢測下限為7pg/ml的化學發光夾心免疫分析「靈敏PCT，，(B. R. Α. H. M. S，Hennigsdorf，德國)測量。在500位健康個體中，中位值為13. 5pg/ml (範圍為 < 7至63pg/ml)。在男性與女性之間或不同年齡組之間PCT值的範圍和中位數沒有顯著差已升。人生長激素使用新開發的用於特異性檢測最豐富的22kDa hGH同工型的化學發光夾心免疫分析測量。在50位獻血者的組群中22kDahGH同工型的中位濃度為0. 19ng/ml (範圍為 0. 05-8. 82ng/ml)。在352位患有缺血性中風的患者、32位患有腦溢血的患者和102位患有TIA的患者中，測定了標誌肽 MR-proANP、MR-proADM、CT-proET-l、CT-proAVP(和肽素)、PCT 和 hGH 的血漿水平。血樣在入院當天(第0日)和入院後第1、3和5日獲取。實施例2至11實施例2至11涉及相同的患者組並基於實施例1的研究。表1和2歸納了研究的患者及其結果。血樣(EDTA處理的血漿樣品)從501位中風或TIA患者組獲取。患者組與實施例1中的相同，但是數量可能略有不同，因為不是所有天中所有患者都可獲取，並且不是所有天每個患者都有足夠的樣品體積用於測定所有標誌物。實施例2 使用第0日測量的標誌物對存活的預後(在3個月內死亡) 調查了中風或TIA患者在中風或TIA後3 (4)個月內的結果，並將其與所述患者樣品中標誌物MR-proANP、MR-proADM、CT-proAVP、CT-proETl和PCT的水平相關聯。樣品在第0日(入院當天)獲取。由該關聯性，對給定的截止值(閾值)計算了風險比(HR)。通過將從時間依賴性ROC分析所測定到的靈敏度和特異性的總和最大化，確定截止值。表3a到4歸納了不同標誌物及其組合的HR值。圖1至27顯示了不同標誌物/ 標誌物組合以及與評分/巴氏s指數/NIHSS組合的Kaplan-Meier圖(在4個月內存活的患者的比例)。表1 患者的概況
權利要求
1.一種對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的方法，所述方法包含下列步驟a.提供來自所述患者的樣品，b.測定所述樣品中至少一種心血管肽的水平，所述心血管肽選自ANP、AVP、ADM、ET-1、 降鈣素、肌鈣蛋白、CRP和hGH或其片段或其前體或所述前體的片段，c.將所述至少一種標誌肽或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與所述患者的結果預後或風險評估相關聯。
2.權利要求1的方法，其中所述樣品在幹預前獲取。
3.權利要求1的方法，其中所述結果或所述風險涉及存活和/或功能結果和/或再次中風或再次短暫性缺血性發作。
4.一種用於將患者分層到風險組中的方法，所述患者已患過中風或短暫性缺血性發作，並且所述方法包含權利要求1或2的步驟。
5.權利要求4的用於診斷患者的方法，其中將所述至少一種心血管肽的水平歸因於或是缺血性中風，或出血性中風，或是暫時性缺血性發作。
6.權利要求1到5的方法，其中測定至少兩種標誌肽的水平。
7.權利要求6的方法，其中測定一組至少兩種標誌肽的水平，並且所述至少兩種標誌肽的組選自下列心血管肽的組合ANP與AVP，ANP與ADM，ANP與ET_1，ANP與降鈣素，ANP 與hGH，ADM與ET-I，ADM與降鈣素，ADM與hGH，ET-I與降鈣素，ET-I與hGH，以及降鈣素與 hGH。
8.權利要求6的方法，其中每種心血管肽選自標誌肽的不同亞組，所述亞組選自心血管肽、內皮肽、垂體肽和炎性肽，其中心臟肽選自ANP、BNP和肌鈣蛋白(cT)，內皮肽選自 ET-I和ADM，垂體肽選自AVP和hGH，並且炎性肽選自降鈣素和CRP。
9.前述權利要求任一項的方法，其中附加地測定BNP或其片段或其前體或所述前體的片段的水平。
10.權利要求1到9的方法，其中測定使用另外考慮選自OTHSS、巴氏指數和改良的評分量表的協變量的多變量分析來進行。
11.一種用於已患過中風或短暫性缺血性發作的患者的結果預後或風險評估的試劑盒，所述試劑盒包含針對選自ANP、AVP、ADM、ET-1、降鈣素、肌鈣蛋白、CRP和hGH的標誌肽， 或其片段或其前體或所述前體的片段的一種或多種捕獲探針。
12.權利要求1到10任一項的方法或權利要求11的試劑盒的應用，用於已患過中風或短暫性缺血性發作的患者的結果預後或風險評估。
13.權利要求1到10任一項的方法或權利要求11的試劑盒的應用，用於在已患過中風或短暫性缺血性發作的患者中監測治療。
14.權利要求1到10任一項的方法或權利要求11的試劑盒的應用，用於將缺血性中風與出血性中風區分開，或用於將缺血性和/或出血性中風與短暫性缺血性發作區分開。
15.權利要求1到10任一項的方法或權利要求11的試劑盒的應用，用於根據所述至少一種心血管肽的水平確定所述患者是否正患有中風或短暫性缺血性發作。
全文摘要
本發明涉及對已患過中風或短暫性缺血性發作的患者進行結果預後或風險評估的方法，所述方法包含測定所述樣品中至少一種標誌肽的水平，所述標誌肽選自ANP、AVP、ADM、ET-1、肌鈣蛋白、CRP、降鈣素和hGH或其片段、或其前體或所述前體的片段，以及將所述至少一種標誌肽、它的前體或所述前體的片段的水平與所述患者的結果預後或風險評估相關聯。
文檔編號G01N33/50GK102257386SQ200980151226
公開日2011年11月23日 申請日期2009年10月22日 優先權日2008年10月24日
發明者安德烈亞斯·貝格曼, 尼爾斯·莫根塔勒, 比特·穆勒 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司