Gibc基因及其編碼的蛋白和應用的製作方法

2023-12-01 08:57:26

專利名稱：Gibc基因及其編碼的蛋白和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及GIBC基因(G-patch protein Implicated in BreastCarcinogenesis)，該基因編碼的蛋白，含有該基因的表達載體及其在腫瘤治療中的應用。
背景技術：
腫瘤細胞的生長和增殖與許多蛋白有關，找出編碼這些蛋白的基因，抑制基因表達這些蛋白，可有效阻止腫瘤細胞的生長和增殖，從而達到治療腫瘤的效果。

發明內容
本發明發現了一種與乳腺癌等的癌細胞的生長和增殖有關的蛋白，克隆了編碼該蛋白的基因，構建了含有該基因的表達載體和含有該表達載體的宿主細胞，並且發現該蛋白可促進乳腺癌、子宮癌、肝癌等腫瘤細胞的生長和增殖，基於以上發現，完成了本發明。
因此，在一個方面，本發明提供了可促進腫瘤細胞的生長和增殖的蛋白，尤其重組蛋白，該蛋白具有序列表中序列2所示的胺基酸序列，或者通過所述胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的缺失，取代或增加而得到的胺基酸序列。
在另一個方面，本發明提供了編碼上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的鹼基序列的DNA或者與所述DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
在另一個方面，本發明提供了含有上述基因或者編碼上述蛋白的基因的表達載體。
在又一個方面，本發明提供了由上述表達載體轉化的宿主細胞。
在另一個方面，本發明提供了生產本發明的重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養上述轉化的宿主細胞，使轉化細胞產生本發明的重組蛋白；和從培養物中分離出重組蛋白。
在另一個方面，本發明提供了針對上述蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產生的特異性抗體。它可以是單克隆或多克隆抗體。
在另一個方面，本發明提供了檢測所述蛋白的試劑盒，它含有上述特異性抗體，可以進行抗原-抗體反應，用於檢測具有序列2所示的蛋白。
此外，本發明提供了用於檢測序列1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
本發明還提供了用於PCR擴增的引物，該引物為P1gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag
P2gcg cgg atc cct aga act cag tca tc。
本發明還提供了上述基因、蛋白或抗體在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
附圖簡述

圖1是本發明蛋白的結構示意圖。
圖2是GIBC的原核表達圖。
圖3是GIBC對腫瘤細胞生長增值的影響，在每組方柱中，左側為載體，右側為GIBC。
以下是本發明的詳細描述。
基因獲取方式根據基因晶片檢測所獲EST序列，再通過生物信息學分析數據，設計了上下遊引物，以乳腺cDNA文庫作為模板進行PCR擴增，獲取了該基因的ORF。引物設計如下P1gat agc ggc cgc atg gac gag gag agP2gcg cgg atc cct aga act cag tca tc此基因被命名為GIBC(G-patch protein Implicated in BreastCarcinogenesis)。
真核表達載體的構建以下列序列為引物，經過PCR擴增，克隆到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)載體中，經轉化DH5α(Invitrogen)菌株，得到GIBC的真核表達載體。
ups 5』-GGAATTCGCCACCATGGACGAGGAGAGC-3』(EcoRI)downs 5』-CGGGATCCACGAACTCAGTCATCTTC-3』(BamHI)原核表達載體的構建以下列序列為引物，經過PCR擴增，克隆到pGEX-4T-3(Amersham)載體中，經轉化BL21(Invitrogen)菌株，得到GIBC的原核表達載體。
ups 5』-GGAATTCCATGGACGAGGAGAGC-3』downs5』-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTAGAACTCAGTCATCTTC-3』此基因定位與染色體20q13.3，全長為1882bp。表達蛋白約55kD。ORF序列(1536bp)。編碼蛋白其開放閱讀框架編碼一個511個胺基酸的蛋白質。根據生物信息學預測，這個蛋白質含有三個主要的結構域，第一個是從第180至第198個胺基酸的C3H1型鋅指結構，第二個是從第313至第359個胺基酸的G-patch結構域，第三個是從第119個至第128個胺基酸的多聚穀氨酸結構域。圖1是該蛋白的示意圖。
同源序列
H.sapiens KIAA1847 KIAA1847M.musculus BC021513 cDNA sequence BC021513R.norvegicu LOC296478 similar to cDNA sequences BC021513D.melanogas CG4709Drosophila melanogaster CG4709ter geneA.gambiae 1281359 Anopheles gambiae str.PESTENSANGG0000001...
A.thaliana At2g24830 Arabidopsis thaliana At2g24830gene對其進行生物信息學分析，發現其廣譜表達。
cDNA sourcesNEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED；PLACENTACOT 25-NORMALIZED；成人腦；腎；淋巴；漿液乳頭狀癌，高級，2種合併腫瘤；子宮；合併的軟骨肉瘤腫瘤細胞；pnet；denis_drash；宮頸；絨毛膜癌；黑素瘤；胃；退行發育術的寡枝神經膠質細胞瘤；肺，細胞系；CNCAP(3)T-225細胞系；小細胞癌；腺癌；用EGFR放大的惡性膠質瘤；結腸腫瘤，RER+；淋巴瘤細胞系；epid_tumor；骨肉瘤，細胞系；正常胎盤；肺腫瘤；大細胞癌；中等分化腺癌；乳房；轉移細胞乳頭狀瘤，細胞系；腺癌細胞系；正常色素視網膜上皮；下丘腦；海馬；神經腫瘤；正常神經；混合的肺和脾；混合的腦，肺，睪丸；混合的胰腺和脾；腦；白血球；導管癌，細胞系；成神經細胞瘤，細胞系；平滑肌肉瘤；卵巢(pool of 3)；脾；睪丸；胎兒眼睛，晶狀體，眼睛前段，視神經，視網膜，視網膜凹區和斑，RPE和脈絡膜；晶狀體；腹水；心臟；胃；天然殺傷細胞，細胞系；肝臟；結腸；肺；原發性肺囊性纖維化上皮細胞；郎格罕氏島；bocio_tumor；testis_normal；鱗狀細胞癌，細胞系；腺癌，細胞系；坐骨神經；細胞系淚腺；前列腺；肝臟；視神經；；Aveolar巨噬細胞；人肺上皮細胞；肝臟和脾上皮(細胞系)。
通過使用本發明的蛋白或者免疫學上等效的多肽，可以獲得其抗體，抗體用於所述蛋白的檢測和純化。可以利用本發明的蛋白或其部分胺基酸序列作為免疫原來產生抗體。可以通過將抗體接種給宿主動物並回收血清的常規方法產生多克隆抗體。還可以通過常規雜交瘤方法產生單克隆抗體。
利用MTT法檢測不同濃度的GIBC對MCF-7和T47-D(乳腺癌細胞)、ECC-1和Ishikawa(子宮癌細胞)、HepG2(肝癌細胞)細胞等腫瘤細胞增殖的影響，結果發現，GIBC有促進腫瘤細胞增殖的作用。
通過抑制所述蛋白表達，或通過利用針對所述蛋白的抗體，可以抑制腫瘤細胞的生長和增殖，從而可以達到治療腫瘤的目的。
實施例實施例1用PCR方法從人乳腺癌文庫克隆編碼GIBC蛋白的基因用乳腺癌文庫(Clontech公司)為模板，用下列引物進行PCR擴增
Primer15』-gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag-3』Primer25』-gcg cgg atc cct aga act cag tca tc-3』擴增反應條件在50μl的反應體系中含有50mmol/L KCL，10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTP，20pmol引物，1U的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司產品)。在PTC-100型PCR儀(MJR公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；56℃ 1min；72℃ 2min。擴增產物用QIAGEN公司的PCR純化試劑盒純化，用DNA限制性內切酶NotI和BamHI(NEB公司)進行切割(37℃ 12Hours)。由博亞公司進行測序得到一1536bp序列。
實施例2GIBC在原核細胞中的表達及純化pGEX-4T-3-GIBC可以在大腸桿菌BL21菌株中30℃誘導表達GST-GIBC的融合蛋白，首先製備BL21的感受態細胞挑取單克隆到適量培養基中，37℃ 250rpm培養至A6000.4-0.5，2500g離心15分鐘，備用。將1-50ng pGEX-4T-3-GIBC轉化到上述製備的感受態細胞中，用Glutathione Sepharose 4B進行純化，純化的步驟如下(1)取單克隆到2-3mL 2YTA培養基中培養4-5小時。轉接到100mL的錐形瓶中生長過夜。
(2)轉接到500mL的錐形瓶中培養3-5小時。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培養3-6小時。
(4)3000rpm 10分鐘離心收集細胞。
(5)用25mL PBS重懸細胞。超聲10分鐘。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混勻1小時。
(7)1000rpm 10分鐘離心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室溫30分鐘。
(8)1000rpm 5分鐘離心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脫Buffer洗脫，短暫離心後收集上清。
電泳結果如圖2所示。
實施例3MTT法檢測不同濃度的GIBC對腫瘤細胞增殖的影響MTT(四甲基偶氮唑蘭)可被細胞攝取，並被活細胞內線粒體脫氫酶還原成一種不溶於水的藍紫色產物甲瓚，並沉澱於細胞中，而死細胞沒有這種功能。甲瓚可溶於二甲基亞碸(DMSO)，溶液在570nm處有最大吸收。故該波段處吸收值越大代表存活細胞量越多。MTT法廣泛應用於細胞毒性實驗、細胞生長測定等。本實驗利用MTT法觀察SIP對MCF-7生長的影響。具體操作方法如下將培養到對數生長期的MCF-7和T47-D(乳腺癌細胞)、ECC-1和Ishikawa(子宮癌細胞)、HepG2(肝癌細胞)細胞接種於96孔板中，每孔接種細胞數為1×104個。次日按照濃度梯度加入SIP(25、50、100ng)，每濃度作用6孔細胞，37℃，5％CO2進行培養。分別培養1d、2d、3d、4d後，在每個細胞培養孔內加入50μlL 1mg/mL的MTT溶液，同樣培養條件下作用4小時後取出，小心吸出每孔內液體，每孔加入二甲基亞碸150μL，輕微振蕩10分鐘，使藍紫色結晶充分溶解在二甲基亞碸中。用自動酶標儀測量96孔板中每孔在570nm處的吸光值。結果如圖3所示，說明本發明的蛋白具有促進腫瘤細胞增殖的作用。
GIBC序~1SEQUENCE LISTING110北京大學120GIBC基因其編碼的蛋白和應用130
1602170PatentIn version 3.121012111536212DNA213人220
221CDS222(1)..(1533)223
4001atg gac gag gag agc ctg gag tcg gcc ttg cag acc tac cgt gcg cag 48Met Asp Glu Glu Ser Leu Glu Ser Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Ala Gln1 5 10 15ctg cag cag gtg gag ctg gcc ttg ggc gcc ggc ctg gat tcg tct gag 96Leu Gln Gln Val Glu Leu Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asp Ser Ser Glu20 25 30cag gct gac ctg cgc cag ctg cag ggg gac ctg aag gag ctc atc gag144Gln Ala Asp Leu Arg Gln Leu Gln Gly Asp Leu Lys Glu Leu Ile Glu35 40 45ctc acc gag gcc agc ctg gtg tct gtc agg aag agc agg ttg ttg gcc192Leu Thr Glu Ala Ser Leu Val Ser Val Arg Lys Ser Arg Leu Leu Ala50 55 60gcg ctg gac gaa gag cgc ccg ggc cgc cag gaa gat gct gag tac cag240Ala Leu Asp Glu Glu Arg Pro Gly Arg Gln Glu Asp Ala Glu Tyr Gln65 70 75 80gct ttc cgg gag gcc atc act gag gcg gtg gag gca cca gca gcg gcc288Ala Phe Arg Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Ala Pro Ala Ala Ala85 90 95cgt ggg tcc gga tca gag acc gtt cct aaa gca gag gcg ggg cca gaa336Arg Gly Ser Gly Ser Glu Thr Val Pro Lys Ala Glu Ala Gly Pro Glu100 105 110tct gcg gca ggt ggg cag gag gag gaa gag gga gag gac gag gaa gag384Ser Ala Ala Gly Gly Gln Glu Glu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Glu Glu115 120 125ctg agt ggg aca aag gtg agc gcg ccc tac tac agc tcc tgg ggc act432
GIBC序~1Leu Ser Gly Thr Lys Val Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Ser Trp Gly Thr130 135 140ctg gag tat cac aac gcc atg gtg gtg gga acg gaa gag gcg gag gat 480Leu Glu Tyr His Asn Ala Met Val Val Gly Thr Glu Glu Ala Glu Asp145 150 155 160ggc tcg gcg ggt gtc cgt gtg ctt tac ctg tac ccc act cac aag tct 528Gly Ser Ala Gly Val Arg Val Leu Tyr Leu Tyr Pro Thr His Lys Ser165 170 175ctg aag ccg tgc ccg ttc ttc ctg gag gga aag tgc cgc ttt aag gag 576Leu Lys Pro Cys Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Cys Arg Phe Lys Glu180 185 190aac tgc agg ttc tcc cat ggg cag gtg gtc tct ctg gat gag ctg cgc 624Asn Cys Arg Phe Ser His Gly Gln Val Val Ser Leu Asp Glu Leu Arg195 200 205ccc ttc cag gac cca gac ctg agc tcc ctg cag gcc ggc tct gcg tgt 672Pro Phe Gln Asp Pro Asp Leu Ser Ser Leu Gln Ala Gly Ser Ala Cys210 215 220ctg gcc aag cac cag gat ggc ctc tgg cac gca gca cgc atc acc gat 720Leu Ala Lys His Gln Asp Gly Leu Trp His Ala Ala Arg Ile Thr Asp225 230 235 240gtg gac aac ggc tac tac aca gtc aag ttt gac tcg ctg ctg ctg agg 768Val Asp Asn Gly Tyr Tyr Thr Val Lys Phe Asp Ser Leu Leu Leu Arg245 250 255gag gcc gtg gtg gag ggg gac ggc atc ctg ccc cca ctg cgc aca gag 816Glu Ala Val Val Glu Gly Asp Gly Ile Leu Pro Pro Leu Arg Thr Glu260 265 270gcc aca gag tcc gac tca gac agc gac ggt acg ggt gac tcc agc tat 864Ala Thr Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Gly Thr Gly Asp Ser Ser Tyr275 280 285gcc aga gtg gtg ggg tca gat gct gtg gac tct ggg acc tgc agc tct 912Ala Arg Val Val Gly Ser Asp Ala Val Asp Ser Gly Thr Cys Ser Ser290 295 300gcc ttt gct ggc tgg gag gtg cac acg cga ggt ata ggc tcc aga ctc 960Ala Phe Ala Gly Trp Glu Val His Thr Arg Gly Ile Gly Ser Arg Leu305 310 315 320ctc acc aag atg ggc tat gag ttt ggc aag ggt ttg ggc cga cac gcg1008Leu Thr Lys Met Gly Tyr Glu Phe Gly Lys Gly Leu Gly Arg His Ala325 330 335gaa ggc cgg gtg gag ccc atc cat gct gtg gtg ttg cct cga ggg aag1056Glu Gly Arg Val Glu Pro Ile His Ala Val Val Leu Pro Arg Gly Lys340 345 350tcg ctg gac cag tgt gtg gag acc ctg cag aag cag acc agg gtt ggc1104
GIBC序~1Ser Leu Asp Gln Cys Val Glu Thr Leu Gln Lys Gln Thr Arg Val Gly355 360 365aag gct ggc acc aac aag ccc ccc agg tgc cgg gga aga ggg gcc agg1152Lys Ala Gly Thr Asn Lys Pro Pro Arg Cys Arg Gly Arg Gly Ala Arg370 375 380cct ggg ggc cgc cca gct cct cgg aat gtg ttt gac ttc ctc aat gaa1200Pro Gly Gly Arg Pro Ala Pro Arg Asn Val Phe Asp Phe Leu Asn Glu385 390 395 400aag ctg caa ggt cag gct cct ggg gcc cta gaa gcc ggg gcg gcc cca1248Lys Leu Gln Gly Gln Ala Pro Gly Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ala Pro405 410 415gcg ggg agg agg agc aag gac atg tac cat gcc agc aag agt gcc aag1296Ala Gly Arg Arg Ser Lys Asp Met Tyr His Ala Ser Lys Ser Ala Lys420 425 430cgg gcc ctg agc ctg cgg ctc ttc cag act gag gag aag atc gag cga1344Arg Ala Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gln Thr Glu Glu Lys Ile Glu Arg435 440 445acc cag cgg gac atc agg agc atc cag gag gct ctc gcc cgc aac gct1392Thr Gln Arg Asp Ile Arg Ser Ile Gln Glu Ala Leu Ala Arg Asn Ala450 455 460ggc cgg cat agc gtg gcg tca gcc cag ctg cag gag aag ctg gca gga1440Gly Arg His Ser Val Ala Ser Ala Gln Leu Gln Glu Lys Leu Ala Gly465 470 475 480gcc cag cgc cag ctg ggg cag ctc cgg gct cag gaa gcc ggc ctg cag1488Ala Gln Arg Gln Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Glu Ala Gly Leu Gln485 490 495cag gag cag agg aag gca gac acc cac aag aag atg act gag ttc tag1536Gln Glu Gln Arg Lys Ala Asp Thr His Lys Lys Met Thr Glu Phe500 505 5102102211511212PRT213人4002Met Asp Glu Glu Ser Leu Glu Ser Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Ala Gln1 5 10 15Leu Gln Gln Val Glu Leu Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asp Ser Ser Glu20 25 30Gln Ala Asp Leu Arg Gln Leu Gln Gly Asp Leu Lys Glu Leu Ile Glu
GIBC序~135 40 45Leu Thr Glu Ala Ser Leu Val Ser Val Arg Lys Ser Arg Leu Leu Ala50 55 60Ala Leu Asp Glu Glu Arg Pro Gly Arg Gln Glu Asp Ala Glu Tyr Gln65 70 75 80Ala Phe Arg Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Ala Pro Ala Ala Ala85 90 95Arg Gly Ser Gly Ser Glu Thr Val Pro Lys Ala Glu Ala Gly Pro Glu100 105 110Ser Ala Ala Gly Gly Gln Glu Glu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Glu Glu115 120 125Leu Ser Gly Thr Lys Val Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Ser Trp Gly Thr130 135 140Leu Glu Tyr His Asn Ala Met Val Val Gly Thr Glu Glu Ala Glu Asp145 150 155 160Gly Ser Ala Gly Val Arg Val Leu Tyr Leu Tyr Pro Thr His Lys Ser165 170 175Leu Lys Pro Cys Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Cys Arg Phe Lys Glu180 185 190Asn Cys Arg Phe Ser His Gly Gln Val Val Ser Leu Asp Glu Leu Arg195 200 205Pro Phe Gln Asp Pro Asp Leu Ser Ser Leu Gln Ala Gly Ser Ala Cys210 215 220Leu Ala Lys His Gln Asp Gly Leu Trp His Ala Ala Arg Ile Thr Asp225 230 235 240Val Asp Asn Gly Tyr Tyr Thr Val Lys Phe Asp Ser Leu Leu Leu Arg245 250 255Glu Ala Val Val Glu Gly Asp Gly lle Leu Pro Pro Leu Arg Thr Glu
GIBC序~1260 265 270Ala Thr Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Gly Thr Gly Asp Ser Ser Tyr275 280 285Ala Arg Val Val Gly Ser Asp Ala Val Asp Ser Gly Thr Cys Ser Ser290 295 300Ala Phe Ala Gly Trp Glu Val His Thr Arg Gly Ile Gly Ser Arg Leu305 310 315 320Leu Thr Lys Met Gly Tyr Glu Phe Gly Lys Gly Leu Gly Arg His Ala325 330 335Glu Gly Arg Val Glu Pro Ile His Ala Val Val Leu Pro Arg Gly Lys340 345 350Ser Leu Asp Gln Cys Val Glu Thr Leu Gln Lys Gln Thr Arg Val Gly355 360 365Lys Ala Gly Thr Asn Lys Pro Pro Arg Cys Arg Gly Arg Gly Ala Arg370 375 380Pro Gly Gly Arg Pro Ala Pro Arg Asn Val Phe Asp Phe Leu Asn Glu385 390 395 400Lys Leu Gln Gly Gln Ala Pro Gly Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ala Pro405 410 415Ala Gly Arg Arg Ser Lys Asp Met Tyr His Ala Ser Lys Ser Ala Lys420 425 430Arg Ala Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gln Thr Glu Glu Lys Ile Glu Arg435 440 445Thr Gln Arg Asp Ile Arg Ser Ile Gln Glu Ala Leu Ala Arg Asn Ala450 455 460Gly Arg His Ser Val Ala Ser Ala Gln Leu Gln Glu Lys Leu Ala Gly465 470 475 480Ala Gln Arg Gln Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Glu Ala Gly Leu Gln
GIBC序~1485 490 495Gln Glu Gln Arg Lys Ala Asp Thr His Lys Lys Met Thr Glu Phe500 505 510
權利要求
1.可促進腫瘤細胞的生長和增殖的蛋白，尤其重組蛋白，該蛋白具有序列表中序列2所示的胺基酸序列，或者通過所述胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的缺失，取代或增加而得到的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1的蛋白的基因，它是具有序列1所示的鹼基序列的DNA或者與所述DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
3.含有權利要求2的基因或者編碼權利要求1的蛋白的基因的表達載體。
4.由權利要求3的表達載體轉化的宿主細胞。
5.生產權利要求1的重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養權利要求4的轉化的宿主細胞，使轉化細胞產生權利要求1的重組蛋白；和從培養物中分離出重組蛋白。
6.針對權利要求1的蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產生的特異性抗體。
7.檢測權利要求1的蛋白的試劑盒，它含有權利要求6的特異性抗體，可以進行抗原-抗體反應，用於檢測具有序列2所示的蛋白。
8.用於檢測序列1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
9.用於權利要求2的基因的PCR擴增的引物，該引物為P1gat agc ggc cgc atg gac gag gag agP2gcg cgg atc cct aga act cag tca tc。
10.權利要求1的蛋白或權利要求2的基因在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及GIBC基因，該基因編碼的蛋白，含有該基因的表達載體及其在醫學中的應用。
文檔編號G01N33/53GK1807454SQ200510011198
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月18日 優先權日2005年1月18日
發明者尚永豐, 吳歌 申請人:北京大學