檢測生物樣品中的輔酶a分子的方法
2023-11-11 00:15:57 2
專利名稱：檢測生物樣品中的輔酶a分子的方法
技術領域：
本發明涉及一種定量檢測生物樣品中的輔酶A分子(在下文中記載為「CoA」)的方法。
背景技術：
CoA分子是保持生命功能必不可少的一類化合物，其涉及生物合成途徑、脂肪酸的降解和轉化、激素合成和調控、TCA循環等。用於精確測量生物樣品中的CoA分子的濃度的方法一直是研究的目標，其重點在於這種濃度作為CoA分子在脂質代謝中的功能分析研究的標誌的作用。
CoA分子之一，丙二醯CoA，是涉及線粒體和脂質合成中的脂肪酸氧化步驟中的脂質代謝機制的組成成分，因此在調控脂質代謝方面扮演了重要的角色；其在調控心臟和骨骼肌肉的脂質能量代謝和腦內下丘腦中的神經肽Y表達，以及在調控飲食攝入和能量消耗方面獲得了較多關注。
在過去，已提出了用於測定CoA分子的各種方法，包括酶學方法和HPLC。酶學測定方法的例子包括Guynn等人(Guynn，R.W.，Methods Enzymol.，1975，35，312)的方法和McGrry等人(McGarry，J.D.，J.Biol.Chem.，1978，253，22，8291)的方法。例如，當測定的對象為丙二醯CoA時，則測定放射性標記的乙醯CoA或其類似物的丙二醯CoA依賴性吸收。但是，由於其測定目標為一特定的CoA，且在測量過程中由於其他CoA分子的共同存在，從而在某些情況下導致了不精確的測量值，因而必須進行校正，並且該過程也十分複雜，因此該方法具有應用局限性。
已經出版了大量的有關採用UV-HPLC測定CoA分子的報導(參見，例如，Hosokawa，Y.，Anal.Biochem.，1978，91，1，370，Demoz，A.，J.Chromatogr.，BBiomed.Appl.，1995，667，1，148)。肌肉、心臟和肝臟生物樣品中的CoA濃度通過該方法來測量。但是，由於UV-HPLC具有較低的靈敏度，其對於高度汙染的樣品，比如那些來源於器官的樣品具有較差的再現性，並且腦部濃度特別難於測定，因此需要一種能提供更高靈敏度和再現性的方法。
LC-MS作為一種用於獲得更高靈敏度的可選擇的方法(參見Buchholz，A.，Anal.Biochem.，2001，295，129)被開發出來。該方法通過三維離子阱質譜來實現細胞中的乙醯CoA濃度的測定。雖然採用該方法可成功地對作為檢測對象的特定CoA進行檢測和峰值分離，但由於該方法為一種絕對校正曲線方法並且不採用內標物，因此其精確度和再現性仍然不足。還有，所述的測定對象為具有低極性且容易通過HPLC分離的乙醯CoA。其另外的測量優勢在於細胞樣品含有較少量的能干擾測量的汙染物中，且樣品中乙醯CoA的濃度很高。但是，對於在通過HPLC分離相對較難的高極性形式的情況下，和在樣品例如具有很高量的可幹擾測量的汙染物的動物器官的情況下，和在樣品中存在較低濃度的情況下(例如動物器官中的丙二醯CoA)測定CoA分子來說，該方法不能充分地得到應用。
本發明通過提供一種具有相當好靈敏度和再現性的用於生物樣品中CoA分子濃度測定的方法來解決上述問題。
本發明的公開作為對上述主題深入研究的結果，本發明人發現了如下方法。特別地，本發明提供了一種用於測定生物樣品中輔酶A分子濃度的方法，所述方法的特徵在於包括採用強酸性溶液從生物樣品中提取的步驟、固相提取的步驟、加入內標物的步驟、和通過LC-MS檢測的步驟。
本發明進一步提供了用於測定輔酶A分子的前述的方法，其特徵在於所述的從生物樣品中提取輔酶A分子的步驟為一個其中在一種高氯酸溶液中震蕩經過冷凍粉碎的生物樣品且通過離心分離上清液的步驟。
所述的固相提取步驟的特徵在於，它是這樣的一個步驟其中通過把用強酸溶液提取輔酶A而獲得的上清液中和，並且隨後加樣於採用含有十八甲矽烷基團或辛基甲矽烷基團的矽膠填充的反相柱上，採用水溶液洗滌，再用有機溶劑洗脫。特別地，所述上清是在採用乙腈和1M醋酸銨來再生所述反相柱後加樣的，並且洗脫是採用乙腈和醋酸銨的混合物來進行的。
本發明仍進一步提供了用於測定輔酶A分子的前述的方法，其特徵在於所述輔酶A分子為一種脂肪酸輔酶A的酯，並且所述內標物為所述輔酶A分子的結構類似物。
本發明仍然進一步提供了一種用於測定輔酶A分於的前述方法，其特徵在於所述脂肪酸輔酶A的酯為一種在主碳鏈中含有2-8個碳原子的的短鏈脂肪酸的輔酶A的酯，所述的結構類似物具有與輔酶A分子相比不多於3個碳原子的差異，且至少3個主鏈上的氫原子被氘原子所替代，或被13C所替代；且更特別的在於，所述輔酶A分子為丙二醯CoA，且結構類似物為乙醯CoA-d3、甲基丙二醯CoA-d3、甲基丙二醯CoA-d4、丙醯CoA-d3、丙醯CoA-d5或丙二醯CoA-13C3。
附圖簡述
圖1為採用來源於Wistar大鼠的肌肉樣品檢測的色譜圖。
圖2為採用來源於Wistar大鼠的肝臟樣品檢測的色譜圖。
圖3為採用來源於Wistar大鼠的腦部樣品檢測的色譜圖。
實施本發明的最佳方式本發明涉及一種檢測CoA分子的方法，其包括採用強酸性溶液從生物樣品中提取，隨後如果需要的話，進行濃縮，添加內標物，製備HPLC加樣樣品，通過HPLC分離CoA分子和內標物，採用質譜儀檢測CoA分子和內標物，和通過測得的待檢測的CoA和內標物的面積比率進行定量分析。
採用強酸性溶液從生物樣品中提取CoA分子的步驟可在含有CoA分子的任何生物樣品上進行，並且如特定實施例中所提到的，可以是人和動物器官，人、動物和植物的組織或細胞，微生物，及其類似物。測定器官，如肌肉、肝臟和大腦中的CoA分子是特別有用的。
作為待檢測的CoA分子，可提到具有醯化的巰基基團的醯基CoA分子，具有氧化性鍵合的巰基基團的氧化的CoA分子，和具有醯化的伯胺的N-醯基CoA分子。雖然在此處提到的一些CoA分子沒有在生物樣品中發現，但是其可用於研究的目的，如用於功能性分析，因此對於藥物開發中的療效評價十分重要。
作為醯基CoA分子的特定實施例，可提到乙醯乙醯基CoA、丙二醯CoA、琥珀醯CoA、3-羥基-3-甲基戊二醯CoA、戊二醯CoA、CoA、乙醯CoA、苯甲醯CoA、苯乙醯CoA、異丁醯CoA、異戊醯CoA、丁醯CoA、β-甲基巴豆醯CoA、甲基巴豆醯CoA、3-羥基丙醯CoA、巴豆醯CoA、已醯CoA、甲基丙二醯CoA、丙醯CoA、丙烯醯CoA、花生四烯醯CoA、癸醯CoA、反油醯CoA、油醯CoA、棕櫚油醯CoA、棕櫚醯CoA、亞麻醯CoA、月桂醯CoA、肉豆蔻腦醯CoA、神經醯CoA、硬脂醯CoA、辛醯CoA、肉豆蔻醯CoA、花生四烯醯CoA、十七醯CoA、十九醯CoA、二十六醯CoA、十五醯CoA、β-羥丁醯CoA、庚醯CoA、戊醯CoA、2-丁烯醯CoA和硬脂醯CoA。
作為N-醯基CoA分子的特定實施例，可提到N-丁醯CoA、N-癸醯CoA和N-已醯CoA。
作為具有氧化性鍵合的巰基基團的氧化的CoA分子的特定實施例，可提到氧化的CoA和CoA穀胱甘肽二硫化物。
在這些中，優選乙醯CoA、CoA、琥珀醯CoA、乙醯乙醯基CoA、3-羥基-3-甲基戊二醯CoA、丙醯CoA、甲基丙二醯CoA、丙二醯CoA、3-羥基丙醯CoA、丙烯醯CoA、油醯CoA、硬脂醯CoA、亞麻醯CoA、花生四烯醯CoA、棕櫚醯CoA、硬脂醯CoA、異丁醯CoA、氧化的CoA和CoA穀胱甘肽二硫化物、具有短鏈的(≤C8)脂肪酸CoA酯和硫代酸酯、例如乙醯CoA、CoA、琥珀醯CoA、乙醯乙醯基CoA、3-羥基-3-甲基戊二醯CoA、丙醯CoA、甲基丙二醯CoA、丙二醯CoA、異丁醯CoA和特別適合檢測的CoA穀胱甘肽二硫化物。
用於從生物樣品中提取CoA分子的強酸性溶液通常為一種能使生物樣品蛋白變性並且能提取待檢測的化合物的溶液，並且作為優選實施例，可提及三氯乙酸溶液和高氯酸溶液。對於所採用的特定提取方法沒有特別的限定，其可根據待檢測的樣品和檢測對象來合適地選擇。例如，在利用液氮冷凍生物組織，如肌肉或大腦，並將其粉碎後，可加入一種強酸性溶液至其預定的濃度，並充分混合攪拌和離心分離，並且隨後將所述的上清液用作生物樣品提取物。
要添加的內標物的優選實例包括前述的CoA分子或其等價物。基於內標方法的本性，待檢測的CoA和內標物優選地具有一定的關係，例如其物理和化學特性類似，並且二者在方法過程中均顯示出相同的行為，但可以在檢測中分開，不相互幹擾。為了滿足這種關係，優選地選擇符合如下所述的內標物的選擇標準的CoA類似物或CoA等價物。
CoA類似物與待檢測的CoA相比具有不多於3個碳原子的差異，並且當待檢測的CoA的主碳鏈具有官能團例如乙醇、胺、羧酸或其類似物時，其內標物也優選地具有相同的官能團。CoA同位素待檢測的CoA的醯基基團主鏈上至少有3個氫原子被氘原子所取代，或被13C所取代，並且其優選地符合CoA類似物的前述標準。
由於一些CoA分子實質上是生物來源的，所採用的內標物優選地為人工合成的，例如上述的氘或13C形式，或N-醯基CoA或其類似物。例如，為了檢測鼠肝臟中的丙二醯CoA，乙醯CoA不能被用作內標物，因為內源的乙醯CoA濃度高，從而乙醯CoA-d3、乙醯乙醯基CoA-d5、甲基丙二醯CoA-d3、甲基丙二醯CoA-d4、丙醯CoA-d3、丙醯CoA-d5、異丁醯CoA-d7或甲基丙二醯CoA-13C3為優選的。
內標物的添加既可以被添加於通過用強酸性溶液從生物樣品中CoA提取獲得的上清液中，也可最初添加於強酸性溶液中。如果所述內標物在處理過程中的行為特別不同，則其可在通過HPLC製備樣品的過程中添加，或其僅作為一校正角色用於質譜儀的電離作用中。
由於提取的上清液將是一種強酸性溶液，其可在加樣於HPLC中之前，通過中和作用、溶劑交換或其類似方法，將pH值調節至中性範圍內。將HPLC的注射樣品調節至pH3-10。從靈敏度、再現性和穩定性的角度來說，該測定最優選地在中性pH範圍3-8下進行。在pH2的酸性端值和其以下值時，會由於CoA的磷酸基團的存在而發生色譜峰的拖尾現象，或者對柱的吸附現象將十分明顯。在pH10的鹼性端值或其以上值時，CoA的分解現象將十分明顯。用於調節pH值的的試劑可以是具有緩衝效果的pH調節劑，例如乙酸銨或磷酸鉀。
為了使用具有低CoA濃度的生物樣品，例如大腦或其類似物，進行檢測或為了進行高靈敏度的分析，需要對樣品進行濃縮。作為濃縮的優選方法，可提及冷凍乾燥、減壓下濃縮、液-液萃取、固相提取、在線濃縮及其類似的方法，其中固相提取法為優選的。
採用商業化購得的反相柱、正相柱或離子交換柱可實現固相提取，不過由於反相柱具有良好的再現性，因此最適合用於CoA分子的檢測。由於CoAs的高極性，正相系統不太適合；當對於離子交換系統，採用強酸溶液進行提取時，鹽濃度將過高從而在載體上的保留將十分困難。
固相提取過程首先涉及採用有機溶劑、水溶劑或其類似物來再生固相柱，以及將通過採用強酸溶液提取CoA而獲得的上清液中和，並將其加樣至固相柱用於將CoA吸附至固相柱，並隨後採用水性溶劑衝洗柱子，並隨後洗脫所吸附的CoA。
再生採用有機溶劑和高濃度的鹽溶液來進行。當採用反相柱時，採用乙腈和1M乙酸銨來進行再生。特別地，將100％的乙腈注射加樣至固相柱中，並且隨後為了避免鹽沉澱，採用50％的乙腈水溶液來降低柱中的乙腈濃度，隨後，加入1M乙酸銨水溶液用於再生柱子。
在約50mM的較低乙酸銨濃度下，不可能在反相柱中完全保留CoA，從而損害了產量。
用於再生的有機溶劑可以是乙腈或其他通常採用的溶劑，比如甲醇或2-丙醇。作為使用的鹽溶液，可以提及乙酸銨或甲酸銨、碳酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀或其類似物。濃度優選地為200mM至2M。
用於衝洗的水溶液優選地為水，不過其也可以含有鹽例如乙酸銨或磷酸鈉。為了進一步增強衝洗的效果，也可以以不洗脫CoA的量將有機溶劑例如乙腈或甲醇加入其中。水在CoA衝洗溶劑中的比例至少為50％，並且不含有機溶劑的水溶液特別優選地用於短鏈脂肪酸CoA酯的檢測，因為其極性較高。
其次，洗脫溶劑用於洗脫保留在柱中的檢測對象CoA。採用的洗脫溶劑可以是通常用於固相提取的有機溶劑的混合物，例如甲醇、乙腈、2-丙醇、丙酮或四氫呋喃，與水或如上文所述的作為衝洗溶液使用的水溶液混合，並且混合比例(0-100％)可基於CoA檢測對象和內標物的洗脫動力學以及汙染物的洗脫動力學來適當地確定。
在短鏈脂肪酸CoA酯例如丙二醯CoA的情況下，可採用適當的20％有機溶劑的溶液來進行洗脫，不過考慮到隨後的溶劑的蒸去，其濃度優選為20-75％。當接近100％時，汙染物的洗脫變為一個顯著的因素。將洗脫物的溶劑蒸去並且用重新溶解溶液將殘留物重新溶解。如果沒有內標物被加入到通過強酸溶液獲得的提取物中時，則在該時間點處加入一預先設定量的內標物。
為了進行CoA和內標物的HPLC分離，可採用商業化購得的用於常規反相色譜的液相色譜分離柱，不過鍵合了十八烷基矽烷基團(C18)的二氧化矽基質填充物是優選的。也可以採用鍵合了辛基矽烷基團的二氧化矽基質填充物(C8)或基於醯胺，特別是氨基甲醯基化學鍵類型的矽膠。
柱的尺寸可以是用於分析的任何可商業化購得的尺寸，並且測定可採用一內徑為1mm至10mm，長度為50mm至250mm的柱進行。不過，對於該尺寸範圍沒有限定，並且如果檢測對象物質被適當地保留並且能顯示清晰的峰就基本上足夠了。採用的流動相可以是常規用於反相HPLC的任何溶劑，並且其優選地含有揮發物或可升華鹽例如乙酸銨。
作為通過質譜儀用於檢測CoA和內標物的合適的質譜儀的特定例子，可提及四極質譜儀、扇形質譜儀、三節四極質譜儀、離子阱質譜儀、飛行時間質譜儀、四極飛行時間混合質譜儀及其類似物。其中，四極質譜儀和三節四極質譜儀是優選的，並且最優選三節四極質譜儀。檢測條件包括設定化合物的質量單位和檢測通過分析柱分離的峰。
為了從檢測的CoA測定對象與內標物的面積比例進行定量分析，在上述檢測條件下對為校正曲線製備的樣品進行測定，並且峰面積比例和CoA測定對象和內標物的濃度被用於創建校正曲線。通過最小平方法從一級回歸線中創建出標準曲線，並且經其實的樣品測量而獲得的內標物和CoA檢測對象的峰面積比例被用於反向回歸，來計算CoA測定對象的濃度。
實施例現在將進一步解釋用於肌肉、肝臟和大腦的丙二醯CoA的檢測的本發明的CoA測定方法的實施例。
1.標準溶液的製備採用精確天平準確地稱量幾毫克的丙二醯CoA的鋰鹽，並隨後採用6％的高氯酸溶解至10mM的濃度，從而製備標準貯存液。採用6％的高氯酸逐級稀釋標準貯存液從而製備10μM、5μM、1μM、500nM、100nM、50nM和10nM的用於校正曲線的標準溶液。類似地，採用6％的高氯酸逐級稀釋標準貯存液，從而製備50μM、5μM和500nM的用於證實再現性(QC)的標準溶液。
2.內標準溶液的製備(IS)採用精確天平準確地稱量幾毫克的乙醯CoA-d3，並隨後採用6％的高氯酸溶解至10mM的濃度，從而製備標準貯存液。採用6％的高氯酸稀釋標準貯存液來製備5μM的用於校正曲線的標準溶液。採用CoA和乙酸酐-d6作為起始物，根據Simon的方法(Simon，E.J.，J.A.C.S.，1953，75，2520)合成乙醯CoA-d3。
3.用於檢測的樣品溶液的製備1)生物樣品提取物的製備當從Wistar大鼠中提取肌肉、肝臟或腦組織後，立即在液氮中冷凍和粉碎，隨後加入6％的高氯酸至5ml/g溼重。將混合物充分攪拌。在9000rpm下離心，其上清液作為生物樣品提取物使用。
2)樣品預處理對於肌肉和肝臟中的檢測向300μL的1M乙酸銨溶液(未調節pH)中加入200μL的校正曲線的標準溶液、生物樣品提取物，或者為了QC，來源於多個個體的混合生物樣品提取溶液、20μL的IS溶液和僅用於QC的20μL的QC標準溶液(用於QC)，來製備固相提取樣品。
對於大腦的檢測向450μL的1M乙酸銨溶液中加入400μL的校正曲線的標準溶液、生物樣品提取物，或者為了QC，加入來源於多個個體的混合生物樣品提取溶液、20μL的IS溶液和僅用於QC的，20μL的QC標準溶液(用於QC)，來製備固相提取樣品。
在採用1mL乙腈、1mL的50％乙腈水溶液和1mL的1M的乙酸銨(未調節pH)溶液來再生100mg/1mL的作為固相提取柱的BondElute C18(Varian的產品)後，加樣固相提取物樣品。隨後採用1mL水衝洗，隨後把採用1mL的乙腈/50mM乙酸銨溶液＝2/8的混合物洗脫的溶液(未調節pH)冷凍乾燥，並將溶劑蒸發除去。同時，向殘留物中加入200μL水用於溶解而形成檢測樣品的溶液，並且將其中的20μL用於LC/MS/MS系統中。
4.檢測儀器和條件1)檢測儀器下述儀器和設備被作為LC/MS/MS系統使用。
HPLC系統Agilent 1100(Agilent)自動進樣器Shimadzu SIL-HTc(Shimadzu)質量分析器API 3000(Applied Biosystems)2)HPLC條件HPLC分析條件為AQUA C18作為分析柱，AQUA C18保護柱作為保護柱，柱溫度為25℃，10mM的乙酸銨(未調節pH)水溶液(溶液A)和甲醇(溶液B)作為流動相，在如表1所示的梯度條件下，其流速為1ml/分鐘。
表1HPLC的梯度條件
3)MS條件通過電離方法來進行質量分析(渦輪離子噴霧，正離子方式)，用於檢測乙二醯CoA離子(Q1854(m/z)，Q3347(m/z))和乙醯CoA-d3離子(Q1813(m/z)，Q3306(m/z))。
4)數值計算基於通過MRM獲得的保留時間(丙二醯CoAm/z 854→347，ISm/z 831→306)和監測離子的質量數來進行峰值確定，同時通過基於丙二醯CoA和IS的峰面積比例的內標法來進行定量分析。用於QC樣品和生物樣品提取物的校正曲線公式和數值按如下方式來確定。
校正曲線公式採用丙二醯CoA峰面積比例(y)和濃度(x)間的關係，並參考IS，通過最小平方法(加權1/x)來確定。
y＝ax+bx濃度，y峰面積比例QC樣品和生物樣品提取物的濃度根據校正曲線方法通過下述公式來確定。
x＝(y-b)/ax測量的濃度5.結果1)線性根據上述分析方法檢測校正曲線樣品，並且創建校正曲線(表2)。採用1/x的加權，線性是令人滿意的，其相關係數(r)為0.9998，相對誤差(RE)為-7.5至+6.8％。
表2校正曲線數據
2)再現性作為用於證實再現性(QC)的樣品，採用空白樣品(Q0)和含有500nM、5μM和50μM的QC標準溶液(Q1、Q2、Q3，每一濃度N＝3)來檢測丙二醯CoA的濃度。QC1至QC3表示獲得的數值減去Q0，並且如表3至5所示，全部值都令人滿意，對於肌肉濃度，純度(％CV)為1.7-9.1％，精度(％RE)為-4.3至5.7％；對於肝臟濃度，純度(％CV)為3.0-8.2％，精度(％RE)為-5.6至9.1％；對於腦部濃度，純度(％CV)為2.0-7.5％，精度(％RE)為-3.6至6.9％。
3)生物樣品中的丙二醯CoA濃度的檢測檢測了6隻Wistar大鼠的肌肉、肝臟和腦部的丙二醯CoA的濃度。圖1和圖3中顯示了色譜圖，同時測量結果示於表6和表8中。
表6Wistar大鼠肌肉中的丙二醯CoA的濃度
表7Wistar大鼠肝臟中的丙二醯CoA的濃度
表8Wistar大鼠大腦中的丙二醯CoA的濃度
發明效果根據本發明的檢測方法，生物樣品中的CoA分子可通過LC-MS以一種精確和可再現的方式被定量地檢測。
表3使用肌肉樣品進行的可再現性驗證實驗的結果
表4使用肝臟樣品進行的可再現性驗證實驗的結果
表5使用大腦樣品進行的可再現性驗證實驗的結果
權利要求
1.一種檢測生物樣品中輔酶A分子的濃度的方法，所述方法的特徵在於包括採用強酸性溶液從生物樣品中提取的步驟、固相提取的步驟、添加內標物的步驟和通過LC-MS檢測的步驟。
2.如權利要求1所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於所述的從生物樣品中提取輔酶A分子的步驟為一個其中在高氯酸溶液中攪拌經過冷凍粉碎的生物樣品並通過離心分離上清液的步驟。
3.如權利要求1或2所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於所述的固相提取的步驟為是這樣的一個步驟其中把用強酸性溶液提取輔酶A而獲得的上清液中和，並且隨後加樣於填充了含有十八甲矽烷基團或辛基甲矽烷基團的矽膠的反相柱上，並採用水性溶劑衝洗，再採用有機溶劑洗脫。
4.如權利要求3所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於在採用乙腈和1M乙酸銨溶液再生反相柱後加樣上清液。
5.如權利要求3所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於所述的有機溶劑為乙腈和乙酸銨的混合物。
6.如權利要求1所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於所述的輔酶A分子為脂肪酸輔酶A酯，並且所述內標物為該輔酶A分子的結構類似物。
7.如權利要求6所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於所述的脂肪酸輔酶A酯為一種在主碳鏈中具有2-8個碳原子的的短鏈脂肪酸的輔酶A的酯，並且其結構類似物具有與輔酶A分子相比不超過3個碳原子的差異，並且其主鏈上至少有3個氫原子被氘原子所取代，或其主碳鏈上至少有3個碳原子被13C所取代。
8.如權利要求7所述的檢測輔酶A分子的方法，其特徵在於所述的輔酶A分子為丙二醯CoA，並且所述的結構類似物為乙醯CoA-d3、甲基丙二醯CoA-d3、甲基丙二醯CoA-d4、丙醯CoA-d3、丙醯CoA-d5或丙二醯CoA-13C3。
全文摘要
目的是提供一種檢測生物樣品中的輔酶A(CoA)的高靈敏度和高再現性的方法，其特徵在於包括採用強酸性溶液提取生物樣品的步驟、固相提取的步驟、添加內標物的步驟以及採用LC－MS檢測的步驟。
文檔編號G01N30/06GK1643375SQ03806790
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月24日 優先權日2002年3月25日
發明者酒井滿, 杉本圭則 申請人:帝人株式會社