Vero細胞流感病毒疫苗製備方法

2023-11-11 12:55:47 3

專利名稱：Vero細胞流感病毒疫苗製備方法
技術領域：
本發明提供一種Vero細胞流感病毒疫苗製備方法，涉及多種流感病毒疫苗株在 Vero細胞上的製備方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
傳統的製備流感疫苗的方法是使用雞胚製備的，國內使用雞胚培養疫苗已經有 50多年歷史。目前使用的流感疫苗主要是雞胚製備的滅活的流感三價裂解疫苗，包括甲型 流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株以及大流感疫苗(包括H5W等)。疫苗株的來源主要是 由WHO根據每年全球流感病毒的變化規律推薦的用於下一年度流感疫苗生產用流感病毒 流行株的表面抗原來確定的，將WHO推薦的流行野毒株與雞胚高產株(A/PR/8/34 (HlNl)) 雙重感染產生重配或反遺傳學重配，得到的新的疫苗株，在雞胚上具有高產的特性，但雞胚 存在有潛在汙染可能，以及潛在的雞胚蛋白引起的變態反應，而且培養周期過長，不易於 控制產量，不利於應對大規模的流感爆發；如使用SPF級雞胚成本過高；再者流感病毒在 雞胚上傳代易引起變異，而以Vero細胞和MDCK細胞傳代的流感病毒其抗原性和HAl區氨 基酸順序幾乎沒有變化。流感病毒在雞胚內容易發生變異，可能是造成禽流感流行的一個 重要原因。為此世界衛生組織、美國政府等都鼓勵發展細胞培養技術替代目前的雞胚培養 技術來生產流感疫苗。在流感疫苗製備領域內許多廠家都進行了不屑努力，利用常規的組織培養技術， 用已經建立MCDCK和Vero細胞等流感病毒敏感細胞種子庫，進行流感疫苗的研究與生產。 非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)是世界衛生組織推薦的疫苗生產細胞，屬貼壁依賴和規定代次 以內非致瘤性，現在採用Vero細胞生產的疫苗主要有狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗、出血熱 疫苗等。Vero細胞流感疫苗研發的關鍵技術難題是疫苗病毒株在Vero細胞上快速適應，建 立能夠快速培育流感病毒Vero細胞高產適應株，解決這一關鍵技術，為Vero細胞流感疫苗 的製備打下堅實基礎。病毒純化，即應用各種物理、化學方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿 主細胞組分等非病毒雜質，提純出高純度濃縮的病毒樣品。一種好的病毒抗原純化工藝可 以有效去除病毒培養過程中的所帶來的雜蛋白、宿主細胞DNA、內毒素、及其它雜質，並且具 有很好的病毒抗原回收率及純度。傳統的病毒類疫苗純化採用蔗糖密度梯度超速離心純化工藝，該工藝需要大型離 心設備，價格高，上樣量少，花費時間長，去除宿主細胞DNA效果也不理想，不適合疫苗產業 化的要求；親和層析方法雖然分離蛋白純度高，但其對分離條件較嚴格，相對處理能力低， 特別是由於易在表層形成蛋白膠質層，阻礙後期樣品滲透，同樣不適合大規模生產需要。採 用常規的凝膠過濾層析雖然其條件溫和、重複性好、便於產業化，在疫苗純化工藝中被廣泛 採用，但去除雜蛋白和DNA效果並不明顯，所以在疫苗製備純化工藝中只能作為輔助手段。目前國內對於Vero細胞等傳代細胞的宿主細胞殘餘DNA，嚴格限制在每劑小於 lOOpg，遠遠小於WHO和歐盟藥典標準即小於IOng水平，因此應用傳統的疫苗工藝很難達到
3我們國家藥典標準，因此，需要對疫苗純化工藝進行創新研究。疫苗收穫液經連續流離心後經0. 45-1 μ m柱芯過濾，100KD-500KD膜包超濾濃縮
至適宜血凝滴度。疏水層析疏水柱層析主要是利用病毒在一定硫酸銨濃度下，充分暴露其疏水性， 從而使其能夠結合在層析柱上，而部分雜蛋白由於疏水性弱，殘餘宿主細胞DNA不具有疏 水性，不能結合，所以流穿出來，這樣就可以達到去除雜蛋白及宿主細胞DNA目的，然後用 凝膠層析或超濾除鹽，減少高鹽對病毒活性的影響
超濾及除鹽通過超濾去除硫酸銨，更換離子交換所使用緩衝液，並進行適當濃縮。離子交換柱層析利用病毒、雜蛋白和DNA的等電點不同，通過改變緩衝液濃度的 辦法，收集病毒，其操作簡單，對病毒作用溫和，可反覆上樣，上樣量大，適合疫苗產業化的 要求。超濾濃縮及滅活通過超濾濃縮，再加入β-丙內酯滅活。再次離子交換層析進一步去除宿主細胞殘餘DNA。超濾及除鹽通過超濾去除鹽類，並進行適當濃縮，即為疫苗原液。目前尚無文獻報導使用疏水層析方法純化傳統病毒性疫苗。

發明內容
本發明的目的之一是流感病毒疫苗株利用Vero細胞生產流感疫苗，通過一系列 純化，製備成季節性三價流感疫苗和大流感儲備疫苗。本發明利用流感病毒疫苗株感染Vero細胞生產流感疫苗。本發明所述的Vero細胞流感病毒疫苗，其特徵是所述病毒抗原為季節性流感疫 苗病毒，含有甲1、甲3、乙型流感病毒的當年流行株三價抗原，或H5W型病毒流行株抗原。本發明所述流感疫苗的生產方法，包括下面步驟
1)(Vero)細胞為培養的單層細胞，規定代次以內無致瘤性，所述培養液為含小牛血清 的普通細胞培養基；
2)疫苗病毒液的製備
用非洲綠猴腎Vero單層細胞經洗液衝洗後，加入0. 005-1. O複合感染量的MOI病毒稀 釋液，(或35-37°C吸附1-4小時)，棄吸附液，補加維持液置32-36°C培養，所述維持液為普 通細胞培養基或含生長因子的無血清培養基，添加1_6μ g/ml胰酶；所述洗液或含1-6 μ g/ ml胰酶，不超過96小時收穫病毒上清懸液；
3)疫苗病毒液的純化
a)採用杯式或連續流離心(離心力5000-18000g)，0.45-2. 5 μ m柱芯過濾，100-500KD
膜包超濾濃縮；
b)採用PhenylSepharose 6 Fast Flow (Low Sub)進行疏水柱層析超濾濃縮液 加入至終濃度為10-40%硫酸銨後，用10-40%硫酸銨，0. 01-0. 05MPB緩衝液平衡層析柱 1-4個柱體積後上樣，上樣體積以流穿峰達到一定高度時結束，然後用10-40%硫酸銨， 0. 01-0. 05MPB緩衝液衝洗至基線，用0. 01-0. 05MPB緩衝液洗脫收集洗脫峰；
c)用超濾除鹽後進行及陰離子交換層析，在一定鹽濃度(0.2-1. OM NaCL)下，並經該鹽濃度緩衝液平衡後上樣，收集流穿峰，用高鹽(1-4M NaCL)和高濃度Na0H(0. 1-1M)處理再 生；
d)100-500KD膜包超濾濃縮後β -丙內酯滅活Μ-48小時，37°C水解2小時(或2_8°C 滅活及水解7-14天)；
e)陰離子交換層析，在(0.2-1. OM NaCL)濃度下緩衝液平衡後，調樣品鹽濃度(終濃度 0. 2-1. 0 M NaCL)，進行離子交換層析，收集流穿峰；
f)100-500KD膜包超濾濃縮，經0. 22-0. SOym濾膜澄清過濾即為疫苗原液，或超濾後 裂解，並經分子篩及IOKD超濾去除裂解劑後即為疫苗原液。本發明的積極效果在於對疫苗純化工藝進行改進，採用疏水層析和離子交換相 結合的方法，再輔以其它純化方法，可以製備成質量合格的病毒性疫苗。


圖1為甲1型流感病毒疫苗宿主細胞殘餘DNA含量圖譜； 圖2為甲3型流感病毒疫苗宿主細胞殘餘DNA含量圖譜；
圖3為乙型流感病毒疫苗宿主細胞殘餘DNA含量圖譜； 圖4為流感病毒裂解疫苗(Vero細胞)宿主細胞殘餘DNA含量圖譜； 圖5為H5N1型禽流感全病毒疫苗(Vero細胞)宿主殘餘DNA含量圖譜。
具體實施例方式
實施例1
甲1型毒種，Who批准的，所羅門株，A/Solomon/3/06 (HlNl)-，IVR-145,來源於英國 NIBSC，批號Ivr-145，06/234，代次E7 (雞胚代次用E和數字表示，細胞用C和數字表示) Vero單層細胞，140-145代。將A/Solomon/3/06 (HlNl) E7C0來源於NIBSC毒種感染Vero細胞和雞胚
進行傳代，雞胚傳代後毒種代次為E8Ctl,血凝滴度為640，而Vero細胞傳代代次為E7C1，血凝 滴度為20-40。將雞胚傳代的E8Ctl代毒種感染Vero細胞繼續傳代，細胞病變達+++-++++時 收穫，並建立主代種子批(血凝滴度320)和工作種子批(血凝滴度480)，並用於單價疫苗的 製備。225瓶單層Vero細胞3立升轉瓶，細胞代次145，5日齡，用洗液衝洗細胞三 遍，加 0. 005-0. IMOI，A/Solomon/3/06 (HlNl)E8C3 工作種子批毒種 37°C吸附 1_4 小時，棄 吸附液，加含1-6微克/ml的普通培養基的維持液，33-36°C繼續孵育，不超過96小時收穫。 收穫病毒液量約90立升。1)澄清濃縮
病毒收穫液經5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，並 經0. 02MPBS洗濾後體積為16立升，即為待純化的甲1型流感病毒抗原。2)疏水層析
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質，按與水比例為 4 1混勻，充分攪拌後裝填於層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速衝洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存 2- 小時，用注射用水衝洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝液平衡層析柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨並最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達到一定高度時結束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝 液平衡層析柱1-4個體積，上樣後繼續用平衡液衝洗至基線，然後用PB緩衝液洗脫收集疫 苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6500ml，收集樣品經100-500KD超濾除鹽後(收集體 積為3000ml)進行離子交換層析。將超濾純化樣品進行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為3700ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為2000ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內酯4°C滅 活，48小時後37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監測。將樣品鹽濃度調 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 2500ml，用 0. 5-4M NaCL 和 0. I-IM NaOH 處理再生。6)採用100-500KD膜包適當超濾濃縮及除鹽，用0. 06-0. 2%Triton-101裂解病毒， 並經分子篩kpharose 4 Fast Flow去除裂解劑後即為疫苗原液。收集分子篩第一峰即為病毒峰，並經IOKD膜包超濾適當濃縮後體積為500ml，並 經0. 22-0. 45微米濾膜澄清後即為單價的疫苗原液。7)進行血凝素含量、內毒素、蛋白質含量、宿主殘餘DNA含量測定。血凝素含量測定
採用單向免疫擴散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時後，乾燥、染色、脫色。 準確測量抗原參考品和供試品形成的沉澱環直徑，以抗原參考品形成的沉澱環直徑對其相 應抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉澱環直徑，即可得到樣品的血凝
素含量。宿主細胞殘餘DNA測定採用地高辛標記檢測法，利用與標準參考DNA比較確定殘 餘DNA含量。蛋白含量測定採用Lowrry法，進行測定。實驗結果
甲1型抗原回收率72.6%
蛋白去除率98.5%
內毒素含量原倍合格
血凝素含量92. 5μδ/πι1
宿主細胞殘餘DNA含量小於100pg/ml 宿主細胞殘餘DNA含量圖譜見圖1。結論經此工藝純化後，甲1型抗原回收率在70%以上，宿主細胞殘餘DNA含量在 IOOpg以下。實施例2甲 3 型毒種，A/wisconsin/67/2005 (H3N2)-，NYMC-161,來源於 NIBSC，批號06/112， 代次E9
SPF種蛋北京梅裡亞維通實驗動物技術有限公司 37°C生化培養箱中孵育，10日齡。Vero 單層細胞，140-145 代；
將A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E9C0來源於NIBSC毒種感染雞胚進行傳代，雞 胚傳代後毒種代次為EltlCtl,血凝滴度為480，此毒種感染Vero細胞繼續傳代，細胞病變達 +++-++++時收穫，並建立主代種子批(血凝滴度M0)和工作種子批(血凝滴度480)，並用於 單價疫苗的製備。225瓶單層Vero細胞3立升轉瓶，細胞代次145，5日齡，用洗液衝洗細胞三 遍，加 0. 01-0. IMOI, A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E10C3 工作種子批毒種 37°C吸附 1-4 小 時，棄吸附液，加含1-6微克/ml的普通培養基的維持液，33-36°C繼續孵育，不超過96小時 收穫。收穫病毒液量約90立升。3)澄清濃縮
病毒收穫液經5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，並 經0. 02MPBS洗濾後體積為16立升，即為待純化的甲3型流感病毒抗原。4)疏水層析
採用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質，按與水比例 為4 :1混勻，充分攪拌後裝填於層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速衝洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存 2- 小時，用注射用水衝洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝液平衡層析 柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨並最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達到一定高度時結束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝 液平衡層析柱1-4個體積，上樣後繼續用平衡液衝洗至基線，然後用PB緩衝液洗脫收集疫 苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6300ml，收集樣品經100-500KD超濾除鹽後(收集體 積為3500ml)進行離子交換層析。將超濾純化樣品進行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為4300ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為1900ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內酯4°C滅 活，48小時後37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監測。將樣品鹽濃度調 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 2400ml，用 0. 5-4M NaCL 和 0. I-IM NaOH 處理再生。6)採用100-500KD膜包適當超濾濃縮及除鹽，用0. 06-0. 2%TritonN-101裂解病 毒，並經分子4 Fast Flow或IOKD超濾去除裂解劑後即為疫苗原液。收集分子篩第一峰即為病毒峰，並經10KD超濾適當濃縮後體積為500ml，並經 0. 22-0. 45微米濾膜澄清後即為單價的疫苗原液。
7)進行血凝素含量、內毒素、蛋白質含量、宿主殘餘DNA含量測定。血凝素含量測定採用單向免疫擴散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時後，乾燥、染色、脫色。 準確測量抗原參考品和供試品形成的沉澱環直徑，以抗原參考品形成的沉澱環直徑對其相 應抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉澱環直徑，即可得到樣品的血凝 素含量。宿主細胞殘餘DNA測定採用地高辛標記檢測法，利用與標準參考DNA比較確定殘 餘DNA含量。蛋白含量測定採用Lowrry法，進行測定。實驗結果
甲3型抗原回收率73.2%
蛋白去除率96.5%
內毒素含量原倍合格
血凝素含量93. 2μδ/πι1
宿主細胞殘餘DNA含量 小於100pg/ml 甲3型流感疫苗宿主細胞殘餘DNA含量圖譜見圖2。結論經此工藝純化後，甲3型抗原回收率在70%以上，宿主細胞殘餘DNA含量在 IOOpg以下。實施例3
乙型毒種，B/Malaysia/2506/2004,來源於英國NIBSC，批號06/104，代次& SPF種蛋北京梅裡亞維通實驗動物技術有限公司 37°C生化培養箱中孵育，10日齡。Vero 單層細胞，140-145 代；
將B/Malaysia/^SOe/^OCMEAQ來源於NIBSC毒種感染雞胚和Vero細胞，血凝 滴度，達對0，傳代後病毒代次為^Ctl,而Vero細胞傳代後代次為^C1，血凝滴度達10。將B/ Malaysia/2506/2004E4C1毒種回傳雞胚，血凝滴度可達480，再繼續在Vero細胞上傳代建立 主代種子批(血凝滴度160)和工作種子批(血凝滴度240)，並用於單價疫苗製備。225瓶單層Vero細胞3立升轉瓶，細胞代次145，5日齡，用洗液衝洗細胞三 遍，加0. 1-1. OMOI, B/Malaysia/2506/2004E5C3工作種子批毒種37°C吸附1-4小時，棄吸附 液，加含1-6微克/ml的普通培養基的維持液，33-36°C繼續孵育，不超過96小時收穫。收 獲病毒液量約110立升。5)澄清濃縮
病毒收穫液經5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，並 經0. 02MPBS洗濾後體積為16立升，即為待純化的乙型流感病毒抗原。6)疏水層析
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質，按與水比例為 4 1混勻，充分攪拌後裝填於層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速衝洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存2- 小時，用注射用水衝洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝液平衡層析 柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨並最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達到一定高度時結束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝 液平衡層析柱1-4個體積，上樣後繼續用平衡液衝洗至基線，然後用PB緩衝液洗脫收集疫 苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6600ml，收集樣品經100-500KD超濾除鹽後(收集體 積為3500ml)進行離子交換層析。將超濾純化樣品進行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為4200ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為2000ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內酯4°C滅 活，48
小時後37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監測。將樣品鹽濃度調 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 ^OOml,用 0. 5-4M NaCL 和 0. I-IM NaOH 處理再生。6)採用100-500KD膜包適當超濾濃縮及除鹽，用0. 06-0. 2%Triton N-101裂解病 毒，並經分子4 Fast Flow或IOKD超濾去除裂解劑後即為疫苗原液。收集分子篩第一峰即為病毒峰，並經10KD適當濃縮體積為400ml，並經 0. 22-0. 45微米濾膜澄清後即為單價的疫苗原液。7)進行血凝素含量、內毒素、蛋白質含量、宿主殘餘DNA含量測定。血凝素含量測定採用單向免疫擴散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時後，乾燥、染色、脫色。 準確測量抗原參考品和供試品形成的沉澱環直徑，以抗原參考品形成的沉澱環直徑對其相 應抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉澱環直徑，即可得到樣品的血凝 素含量。宿主細胞殘餘DNA測定採用地高辛標記檢測法，利用與標準參考DNA比較確定殘 餘DNA含量。蛋白含量測定採用Lowrry法，進行測定。實驗結果
乙型抗原回收率70.4%
蛋白去除率96.
內毒素含量原倍合格
血凝素含量90. 6μδ/πι1
宿主殘餘DNA含量小於100pg/ml
乙型流感疫苗宿主殘餘DNA含量圖譜見圖3。結論經此工藝純化後，乙型抗原回收率在70%以上，宿主殘餘DNA含量在IOOpg 以下。
實施例4
經上述3個實施例製備的實驗性裂解疫苗單價原液試驗結果如下 甲 1 型 A/Solomon/3/06 (HlNl)血凝素含量 92. 5μδ/πι1 原液體積為 500ml 甲 3 型 A/wisconsin/67/2005 (H3N2)血凝素含量 93. 2μδ/πι1 原液體積為 500ml 乙型B/Malaysia/2506/2004血凝素含量90. 6μδ/πι1原液體積為400ml
為了製備季節性流感病毒裂解三價疫苗，需將三型裂解病毒液按1 1 1配比合併，各 取三型病毒裂解原液300ml，配製成三價的流感裂解疫苗半成品，並進行全面檢測。實驗結果如下
內毒素含量小於30EU/0. 5ml
血凝素含量 甲 1 型 30. 84μδ/πι1，甲 3 型 30. 60μδ/πι1，乙型 30. 02μδ/πι1
宿主細胞殘餘DNA含量小於100pg/0. 5ml
流感裂解疫苗(Vero細胞)宿主細胞殘餘DNA含量圖譜見圖4。結論經此工藝製備的流感裂解疫苗(Vero細胞)經實驗室檢測血凝素含量合格， 宿主細胞殘餘DNA含量符合《中華人民共和國藥典》2010版三部標準。實施例5
H5N1 型毒種，A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-14)來源於英國 NIBSC，批號09/184，代次
E3
SPF種蛋北京梅裡亞維通實驗動物技術有限公司 37°C生化培養箱中孵育，11日齡。Vero 單層細胞，140-146 代。將 A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-14)來源於 NIBSC 毒種感染雞胚，一代雞 胚血凝滴度，達320，傳代後病毒代次為^Cci,再傳Vero細胞後代次為^C1，血凝滴度達160。 再繼續在Vero細胞上傳代建立主代種子批(血凝滴度M0)和工作種子批(血凝滴度320)， 並用於人用禽流感疫苗製備。225瓶單層Vero細胞3立升轉瓶，細胞代次145，5日齡，用洗液衝洗細胞三 遍，加 0. 01-0. IMOI, A/Vietnam/1194/2004 (NIBRG-14)工作種子批毒種 37°C吸附 1-4 小 時，棄吸附液，加含1-6 μ g/ml的普通培養基的維持液，33-36°C繼續孵育，不超過96小時收 獲。收穫病毒液量約90立升。7)澄清濃縮
病毒收穫液經5000-18000g離心；0. 4511111柱芯澄清過濾、100-5001 1膜包超濾濃縮，並 經0. 02MPBS洗濾後體積約為16立升，即為待純化的H5W型流感病毒抗原。8)疏水層析
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Low Sub)疏水層析介質，按與水比例為 4 1混勻，充分攪拌後裝填於層析柱中，柱體積為2000ml。用0. 5M NaOH溶液，以一定流速衝洗層析柱，至液體流出為PH8-14. 0為止，保存 2- 小時，用注射用水衝洗層析柱至中性為止，用10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝液平衡層析 柱1-4個體積，將疫苗加入一定濃度硫酸銨並最終含10-40%硫酸銨的濃度，與平衡液硫酸 銨濃度一致，上樣體積以流穿峰達到一定高度時結束，以含有10-40%硫酸銨，0. 02MPB緩衝 液平衡層析柱1-4個體積，上樣後繼續用平衡液衝洗至基線，然後用PB緩衝液洗脫收集疫苗抗原，共上樣兩次，收集洗脫峰合計6400ml，收集樣品經100-500KD超濾除鹽後(收集體 積為3900ml)進行離子交換層析。將超濾純化樣品進行Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監 測。樣品鹽濃度為0. 1-1. OM NaCL,層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和 洗脫，收集流穿峰體積為4600ml，用0. 5-4M NaCL和0. I-IM NaOH處理再生。4) 100-500KD膜包超濾濃縮體積為2000ml，按1 :2000-1 :4000 β -丙內酯4°C滅 活，48
小時後37°C水解2小時(或4°C滅活7天-14天)。5)Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析，全程用紫外監測。將樣品鹽濃度調 為0. 1-1. OMNaCL層析時用0. 02M PB, 0. 1-1. OMNaCL的緩衝液平衡和洗脫，收集流穿峰體積 為 1500ml，用 0. 5-4M NaCL 禾口 0. I-IM NaOH 處理再生。6)採用100-500KD膜包適當超濾濃縮及除鹽，收集膜上液體積為2100ml，並經 0. 22-0. 45微米濾膜澄清後即為疫苗原液。7)進行血凝素含量、內毒素、蛋白質含量、宿主殘餘DNA含量測定。血凝素含量測定採用單向免疫擴散試驗檢測血凝素含量
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品的1. 5%瓊脂糖凝膠板上，孔徑為 3mm，每孔為1(^L，20-25°C放置至少18小時左右。用PBS浸泡1小時後，乾燥、染色、脫色。 準確測量抗原參考品和供試品形成的沉澱環直徑，以抗原參考品形成的沉澱環直徑對其相 應抗原濃度作直線回歸，求得直線回歸方程，代入樣品的沉澱環直徑，即可得到樣品的血凝 素含量。宿主細胞殘餘DNA測定採用地高辛標記檢測法，利用與標準參考DNA比較確定殘 餘DNA含量。蛋白含量測定採用Lowrry法，進行測定。實驗結果
H5m型抗原回收率71.8%
蛋白去除率98.7%
內毒素含量原倍合格
血凝素含量26. 52μδ/πι1
宿主殘餘DNA含量小於100pg/ml
H5N1型禽流感全病毒疫苗(Vero細胞)宿主細胞殘餘DNA含量圖譜見圖5。結論經此工藝純化後，H5W型抗原回收率在70%以上，宿主細胞殘餘DNA含量小 於 IOOpg0
權利要求
1.利用流感病毒疫苗株感染Vero細胞生產的流感疫苗。
2.依據權利1要求所述的Vero細胞流感病毒疫苗，其特徵是所述病毒抗原為季節性 流感疫苗病毒，含有甲1、甲3、乙型流感病毒的當年流行株三價抗原，或H5W型病毒流行株 抗原。
3.權利要求1或2所述流感疫苗的生產方法，包括下面步驟1)Vero細胞為培養的單層細胞，規定代次以內無致瘤性，所述培養液為含小牛血清的 普通細胞培養基；2)疫苗病毒液的製備用非洲綠猴腎Vero單層細胞經洗液衝洗後，加入0. 005-1. O複合感染量的MOI病毒維 持液，或加入病毒稀釋液35-37°C吸附1-4小時，棄吸附液，補加維持液置32-36°C培養；所 述維持液為普通細胞培養基或含生長因子的無血清培養基，添加1_6μ g/ml胰酶；所述洗 液或含1-6 μ g/ml胰酶，不超過96小時收穫病毒上清懸液；3)疫苗病毒液的純化a)採用杯式或連續流離心(離心力5000-18000g)，0.45-2. 5 μ m柱芯過濾，300-500KD膜包超濾濃縮；b)採用PhenylSepharose 6 Fast Flow (Low Sub)進行疏水柱層析超濾濃縮液 加入至終濃度為10-40%硫酸銨後，用10-40%硫酸銨，0. 01-0. 05MPB緩衝液平衡層析柱 1-4個柱體積後上樣，上樣體積以流穿峰達到一定高度時結束，然後用10-40%硫酸銨， 0. 01-0. 05MPB緩衝液衝洗至基線，用0. 01-0. 05MPB緩衝液收集洗脫峰；c)用分子篩或超濾除鹽後進行陰離子交換層析，在一定鹽濃度(0.2-1. OM NaCL)下，並 經該鹽濃度緩衝液平衡後上樣，收集流穿峰，用高鹽(1-4M NaCL)和高濃度Na0H(0. 1-1M) 處理再生；d)300-500KD膜包超濾濃縮後β -丙內酯滅活Μ-48小時，37°C水解2小時(或2_8°C 滅活及水解7-14天)；e)陰離子交換層析，在(0.2-1. OM NaCL)濃度下緩衝液平衡後，調樣品鹽濃度(終濃度 0. 2-1. 0 M NaCL)，進行離子交換層析，收集流穿峰；f)100-500KD膜包超濾濃縮，經0. 22-0. SOym濾膜澄清過濾即為疫苗原液，或超濾後 裂解，並經分子篩或IOKD超濾去除裂解劑後即為疫苗原液。
全文摘要
本發明提供一種Vero細胞流感病毒疫苗製備方法，對疫苗純化工藝進行改進，採用疏水層析和離子交換相結合的方法，再輔以其它純化方法，可以製備成質量合格季節性三價流感疫苗和大流感儲備疫苗。
文檔編號A61P31/16GK102078605SQ20101060553
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者於洪濤, 周慶玲, 嶽振齊, 張瑩, 李光譜, 李淑蘭, 胡曉明, 董喚, 郭巖 申請人:吉林亞泰生物藥業股份有限公司