庚型肝炎病毒基因組全長cDNA克隆及其構建方法
2023-11-11 04:52:27 3
專利名稱：庚型肝炎病毒基因組全長cDNA克隆及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是庚型肝炎病毒基因組全長cDNA的克隆及其構建方法。
1995年，美國有兩個研究小組幾乎同時分別報導了一種新型肝炎病毒，分別命名為GB病毒C(GBV-C)和庚型肝炎病毒(HGV)，簡稱為GBV-C/HGV。GBV-C/HGV可經血傳播，在商業獻血員、血透析患者、靜脈藥癮者及B型肝炎病毒(HBV)和C型肝炎病毒(HCV)感染者中都有較高的感染率，引起輸血後肝炎及其他急、慢性肝病。GBV-C/HGV屬於黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.4kb，基因組中儀有一個開放閱讀框架(ORF)，結構基因C、E1和E2位於氨基端，編碼結構蛋白；非結構基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b位於羧基端，編碼非結構蛋白；在開放閱讀框的兩側分別為5』非編碼區和3』非編碼區(圖1中方框圖所示)。雖然報導的GBV-C/HGV全序列有11株之多，但全序列的讀取是根據分段克隆的基因片段的序列，迄今沒有具有整體功能的GBV-C/HGV基因組全長cDNA單個克隆。基因片段克隆不能從整體上反映病毒的真正特性，影響了對GBV-C/HGV的深入研究。
本發明的目的是提供GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆及其構建方法。
本發明構建的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆包含了GBV-C/HGV基因組從5』非編碼區，結構基因C、E1、E2，非結構基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3』非編碼區的全長基因。
庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構建，採用重疊延伸PCR拼接基因片段和酶切、連接相結合的方法，包括如下步驟(1)合成擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；(2)擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段；(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克隆(4)GBV-C/HGV基因組全長cDNA的先隆。
構建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的基礎材料是含有GBV-C/HGV基因組不同區域基因片段的五個重組質粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3』和Iw3(詳見文獻Li Shao et al.Biochem Biophys.Res.Commun1996；228785-791)。五個同名基因片段從3』至5』端相鄰片段互相重疊，覆蓋整個基因組(見圖1)，其中Iwq2和Iwh6兩個基因片段是用長PCR方法從病人血清中擴增而來，Iw5、Iw3』和Iw3基因片段則由5』或3』RACE方法從同一病人血清中擴增而來。
本發明利用重疊延伸PCR(SOEing and PCR)方法，將Iw5和Iwq2基因片段拼接為Iw5-q2基因片段；將Iw3和Iw3基因片段拼接得到Iw3』-3基因片段後，再與Iwh6基因片段拼接獲得Iwh6-3基因片段；將Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段。拼接Iwq2-h6基因片段時，要求Iwq2-h6基因片段5』端與Iw5-q2基因片段的3』端互相重疊，且包括共同而且唯一的酶切位點；Iwq2-h6基因片段的3』端與Iwh6-3的5』端互相重疊，同樣包括共同且唯一的酶切位點。利用上述酶切位點及在擴增Iw5基因片段的上遊引物和擴增Iw3基因片段的下遊引物中加入的酶切位點，先進行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，獲得重組質粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3。待分段克隆成功後，再以此為基礎，利用限制性內切酶酶切和連接酶連接的方法構建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆pHGVqz。
本發明具有如下優點和積極效果本發明採用重疊延伸PCR(SOEing and PCR)拼接、限制性內切酶酶切和連接酶連接基因片段相結合的方法，構建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆，技術方案構思巧妙。既避免了由數個小基因片段起始、經限制性內切酶酶切、再由連接酶連接的繁雜過程，又因為採用先分段克隆再進行全長基因克隆的途徑而降低了實驗難度。GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆成功，為廣泛深入地研究該病毒提供了重要實驗材料。利用GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆，可以從細胞水平到分子水平，從細胞模型到動物模型，從局部到整體等多方位、多角度地展開對GBV-C/HGV的致病性及致病機制，複製、轉錄及翻譯機制，形態及形態發生等廣泛而深入的研究。
圖1為本發明中GBV-C/HGV基因組結構及cDNA基因片段的位置，上部的方框圖代表GBV-C/HGV基因組結構及各區基因的位置。下部的粗線圖及粗線上端的數字代表五個基因片段及其在基因組中的位置。
圖2為重組質粒pUC-5-q2的構建流程圖。
圖3為重組質粒pUC-q2-h6的構建流程圖。
圖4為重組質粒pGEM-h6-3的構建流程圖。
圖5為重組質粒pHGVqz的構建流程圖。
圖2～5中的圓圖代表環狀質粒，粗線代表基因片段，Yx(x為1-12)代表引物。粗線兩端所標數字代表該基因片段在GBV-C/HGV基因組中的位置。
圖6 GBV-C/HGV基因組全長cDNA序列GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的具體構建方法見如下實施例一、合成擴增和拼接基因片段的引物(見表1)，引物的設計及合成參照5個基因片段的大小，同時要儘量滿足引物設計的一般條件。
表1.擴增及拼接GBV-C/HGV基因片段的引物引物序列(5』-3』)引物在基因組中的位置極性Y1GCG AAT TCG CGG CCG CCC CCC CCC1-26 +CGG CAC TGG GTG CAA GCY2AGA GAG ACA TTG AAG GGC GAC321-341 -Y3GAC AGG GTT GGT AGG TCG TAA ATCC 109-133 +Y4CCG TCC TTG ATG ATG GAA CTG TC 4399-4421-Y5TAT GGG CAT GGC ATA CCC CT 4261-4280+Y6GAG GGC CAC GAT GAT GTT AG 8696-8715-Y7TTC TGC TCC ACT TGG CTC GCT GAGT 8416-8440+Y8CTG GAT GCC ACA ACA GGC CCC T 8881-8902-Y9AGG GGC CTG TTG TGG CAT CCAG 8881-8902+Y10 GCT CTA GAC TCG AGA ATA AAA CCCGGC CTT TGG GCC G 9353-9375-Y11 TTG TTC GAT CAT ATG GGG TCC TTC TCG C 2977-3004+Y12 GAC CGG AGT CCC TTC AAG TAT CTC CTG G 7737-7764-二、以質粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3』和Iw3為模板，經PCR反應分別擴增5個同名基因片段，PCR反應條件按常規根據預擴增基因片段的長度和所用引物的Tm(解鏈溫度)值進行調整。PCR擴增和拼接反應均應用ExpandTMLong Template PCR系統。
1、Iw5基因片段的擴增(圖2)(1)Iw5質粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP 1.75ulY1(30uM)0.5ulY2(30uM)0.5ul滅菌重蒸水21.25ul------------------------------------(2)10X緩衝液15ul
DNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃30秒.65℃30秒、68℃1分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
2、Iwq2基因片段的擴增(圖2，圖3)(1)Iwq2質粒(50ng/ul)1ul10mM dNTP 1.75ulY3(30uM) 0.5ulY4(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩衝液I 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃ 30秒、65℃ 30秒、68℃ 6分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
3、Iwh6基因片段的擴增(圖3，圖4)(1)Iwh6質粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP1.75ulY5(30uM) 0.5ulY6(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩衝液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃ 2分鐘預變性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 6分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃ 10分鐘。
4、Iw3』基因片段的擴增(圖4)(1)Iw3』質粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP1.75ulY7(30uM) 0.5ulY8(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩衝液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃30秒、60℃ 30秒、68℃1分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
5、Iw3基因段的擴增(圖4)(1)Iw3質粒(50ng/ul)1ul10mM dNTP1.75ulY9(30uM) 0.5ulY10(30uM) 0.5ul
滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩衝液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃ 2分鐘預變性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃1分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃ 10分鐘。
三、PCR的5個基因片段經瓊脂糖凝膠電泳純化後，分別用DNA聚合酶I大片段(Klenow)處理37℃1小時，去除基因片段3』端存在的「A」(腺嘌呤核苷)。
例Iw5基因片段的Klenow酶處理(圖2)Iw5基因片段(0.1ug/ul) 50ul10X Klenow緩衝液 10ulKlenow酶(10單位/ul)1ul滅菌重蒸水39ul混勻後置37℃1小時，然後酚/氯仿抽提，無水乙醇沉澱。Iwq2、Iwh6、Iw3』和Iw3基因片段的Klenow酶處理依照此例進行(圖2，圖3，圖4)。
四、重疊延伸PCR拼接Iw5-q2、Iwq2-h6、Iw3』-3和Iwh6-3基因片段，PCR反應條件根據預拼接基因片段的長度和所用引物的Tm值進行調整。
1、Iw5-q2基因片段的拼接(圖2)(1)經Klenow酶處理後的Iw5基因片段(0.1ug/ul)2ul經Klenow酶處理後的Iw q2基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP1.75ulY1(30uM) 0.5ulY4(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水1 8.25ul--------------------------------(2) 10X緩衝液1 5ul聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃30秒、60℃1分鐘、68℃6分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
2、Iw3』-3基因片段的拼接(圖4)(1)經Klenow酶處理的Iw3』基因片段(0.1ug/ul)2ul經Klenow酶處理的Iw3基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP 1.75ulY7(30uM)0.5ulY10(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水18.25ul(2) 10X緩衝液15ul聚合酶混合液(3.5單位/ul)0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃30秒、60℃30秒、68℃2分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
3、Iwh6-3基因片段的拼接(圖4)(1)經Klenow酶處理的Iw3』-3基因片段(0.1ug/ul)2ul經Klenow酶處理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP 1.75ulY5(30uM) 0.5ulY10(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 18.25ul---------------------------------(2) 10X緩衝液15ul聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃30秒、65℃30秒、68℃6分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
4、Iwq2-h6基因片段的拼接(圖3)(1)經Klcnow酶處理的Iwq2基因片段(0.1ug/ul) 2ul經Klenow酶處理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP1.75ulY11(30uM)0.25ulY12(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 18.25ul--------------------------(2) 10X緩衝液1 5ul聚合酶混合液(3.5單位/ul)0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然後再將(1)(2)混合，按下述條件進行PCR反應94℃2分鐘預變性，94℃30秒、65℃45秒、68℃6分鐘進行35個循環，反應結束前延伸68℃10分鐘。
五、將Iw5-q2基因片段經EcoRI+BamHI酶切，回收約3301bp的基因片段，與經EcoRI+BamHI酶切的pUC18載體連接，轉化大腸桿菌JM109，酶切鑑定轉化子得到重組質粒pUC-5-q2(圖2)。Iwq2-h6基因片段經BamHI+SalI酶切，回收約3298bp的基因片段與經BamHI+SalI酶切的pUC18載體連接，轉化大腸桿菌JM109，酶切鑑定轉化子得到重組質粒pUC-q2-h6(圖3)。Iwh6-3基因片段經SalI+XbaI酶切，回收約2806bp的基因片段，與經SalI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體連接，轉化大腸桿菌JM109，酶切鑑定轉化子得到重組質粒pGEM-h6-3(圖4)。
六、將重組質粒pUC-5-q2用EcoRI+BamHI酶切，回收約3301bp的基因片段；pUC-q2-h6用BamHI+SalI酶切，回收約3298bp的基因片段pGEM-h6-3用SalI+XbaI酶切，回收約2806bp的基因片段。將回收的三個基因片段與經EcoRI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體相連接，轉化大腸桿菌JMI09，挑取轉化子進行酶切鑑定，初步確定克隆GBV-C/HGV基因組全長cDNA的重組質粒pHGVqz(圖5)。
GBV-C/HGV全長基因片段與載體的連接pGEM-3Zf(+)/EcoRI+XbaI(0.1ug/ul)5-q2/EcoRI+BamHI(50ng/ul)q2-h6/BamHI+SalI(25ng/ul)h6-3/SalI+XbaI (60ng/ul)10X連接酶緩衝液 1.5ul連接酶(5u/ul) 1ul滅菌重蒸水 3.5ul混勻後14℃過夜。次日取連接物的三分之一進行轉化。
七、提取pHGVqz質粒進行核苷酸序列測定。GBV-C/HGV基因組全長cDNA序列長9373bp(圖6)，與報導的GBV-C/HGV序列高度同源，但部分核苷酸發生了改變，結果表明，我們已成功地構建了GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆。
GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的成功，為深入研究該病毒提供了重要實驗材料。以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎可以進行多方面的研究，例如(一)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎在原核、真核(含昆蟲)細胞系統進行基因表達。
(二)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行基因檢測、抗原檢測和抗體檢測研究。
(三)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行有關GBV-C/HGV在體外細胞系統的複製、轉錄及翻譯機制、病毒形態及形態發生研究。
(四)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行致病性與免疫性研究。
(五)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行基因治療、反義核酸治療及生物(多肽)藥物研究。
(六)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行核酸疫苗、重組基因工程疫苗及疫苗免疫研究。
(七)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行各種動物感染模型、轉基因動物模型及基因敲除動物模型的研究。
(八)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎進行肽庫及抗體庫的構建、篩選研究。
權利要求
1.庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆，其特徵在於該克隆包含了GBV-C/HGV基因組從5』非編碼區，結構基因C、E1、E2，非結構基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3』非編碼區9373bp的全長基因。
2.一種庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構建方法，其特徵在於採用的是重疊延伸PCR拼接基因片段和酶切、連接相結合的方法，包括如下步驟(1)合成擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；(2)擴增和拼接GBV-C/HGV基因片段；(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克隆；(4)GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆。
3.按權利要求2所述的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構建方法，其特徵在於利用重疊延伸PCR方法，將Iw5和Iwq2基因片段拼接為Iw5-q2基因片段；將Iw3』和Iw3基因片段拼接得到Iw3』-3基因片段後，再與Iwh6基因片段拼接獲得Iwh6-3基因片段；將Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段；拼接Iwq2-h6基因片段時，要求Iwq2-h6基因片段5』端與Iw5-q2基因片段的3』端互相重疊，且包括共同而且唯一的酶切位點；Iwq2-h6基因片段的3』端與Iwh6-3的5』端互相重疊，同樣包括共同且唯一的酶切位點，利用上述酶切位點及在擴增Iw5基因片段的上遊引物和擴增Iw3基因片段的下遊引物中加入的酶切位點，先進行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，獲得重組質粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3；待分段克隆成功後，再以此為基礎，利用限制性內切酶酶切和連接酶連接的方法構建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆pHGVqz。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域,是庚型肝炎病毒基因組全長cDNA的克隆及其構建方法。以覆蓋GBV－C/HGV基因組全長cDNA的5個較小的基因片段為起始材料,經過重疊延伸PCR、酶切、連接和轉化等,完成GBV－C/HGV基因組全長cDNA的克隆。GBV－C/HGV基因組全長cDNA克隆的成功,為研究GBV－C/HGV的致病性及致病機制、複製及轉錄和翻譯機制、形態及形態發生、基因及血清學特異診斷、核酸及基因工程疫苗和各種動物模型的建立等提供了重要材料。
文檔編號C12N15/51GK1202524SQ9811089
公開日1998年12月23日 申請日期1998年6月15日 優先權日1998年6月15日
發明者戚中田, 朱分祿, 邵力, 何建文, 潘衛, 崔曉紅, 朱詩應, 宋燕斌 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學