使用正義單鏈病毒rna載體在植物中生產抗體的製作方法
2023-11-11 05:02:12
專利名稱：使用正義單鏈病毒rna載體在植物中生產抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用正義單鏈RNA病毒栽體在植物、植物部分或植物細 胞培養物中產生異源寡聚蛋白質。本發明所述的方法和栽體為植物細^l:
供產量提高的功能性異源寡聚重組蛋白，例如全長的抗體或其異源寡聚合 成衍生物(包括與其它蛋白質或其片段的融合).
背景技術：
基於植物的分子農業是產生設計用於人類和動物健康領域的重組蛋白 的良機，由於其潛在的低生產成本以及生物製藥工業為從製造方法中消除 動物衍生蛋白質的嘗試(因為這些產品可能受到人抗原，例如牛海綿狀腦炎 (BSE)或克雅病(CJD， vCJD)汙染)而成為優選.然而，使用基於強組成型或 組織特異性啟動子的標準表達系統不能解決在植物細胞中高產量生產異源 寡聚蛋白質的問題，原因如下首先，大部分這樣的重組蛋白對植物生長 和發育具有不利的影響，因此嚴重影響產量；其次，使用組織特異性啟動 子(例如種子特異性)需要將編碼藥物蛋白質的基因穩定摻入可食用作物植 物(例如稻、玉米、小麥)的基因組，這在開放領域栽培情況下可能產生轉 基因流控制的問題.此外，如果出於產物的低產量而在封閉(溫室)環境中 使用，這些系統是不可商購的.
基於植物病毒的瞬時表達系統(見綜述Porta和Lomonossoff， 1996， Mo/.歷W"Aiw/" S， 209-221 ; Yusibov等人，1999， Cwir.r印.M,c^6iV^ /加挑m朋/" 2^. 81-94; Gleba等人2004， 0^/". 1V朋fL182-188) 能夠在植物葉組織中提供高表達水平並且在一定程度上能夠處理重組蛋白 質的毒性及其對植物發育的有害影響的問題，因為該技術能夠使生長和生
產期分離.最佳已建立的和可商購的系統是基於正義單鏈RNA病毒栽體， 優選基於菸草花葉病毒(TMV)衍生的栽體(Kumagai等人，1994, Proc. Natl. Acad. ScL USA，卯，427-430; Mallory等人，2002， Nature Biotechnol. 20， 622-625; US5316931 ; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO022卯68; US5491076)。然而，這些系統受到嚴重的局限， 限制其用於產生簡單、相對小的蛋白質。這部分是由於病毒栽體的不穩定 及其高頻率的回覆成為野生型(如果其帶有大於1 kb的異源序列)而引起。 該技術的另 一嚴重的局限是缺乏能夠表達^最有價值的重組蛋白類的復 合異源寡聚蛋白質(例如治療的單克隆抗體及其衍生物)的病毒栽體系統。
僅有一份公開提出使用植物病毒栽體在植物中表達全長的單克隆抗體 (Verch等人，1998， J. Immunol. Meth.， 220， 69- 75).該文獻描述了使用兩 個系統的基於TMV的病毒栽體在體系的葉中表達單克隆抗體的重鏈和輕 鏈，通過使用所述栽體的體外合成的轉錄本共轉染本氏菸草(N. benthamiana)植物，從不同栽體表達不同的鏈.然而，重組蛋白在所述系 統中的產量4艮低，以至於必須使用高度靈敏的測試，例如Western印跡和 ELISA確定裝配的單克隆抗體的存在.由於重組抗體的微不足道的產量， 該系統不適於實際應用並且不具有商業價值。因為兩個或多個基於TMV 的病毒栽體通常不存在於被轉染植物的相同植物組織中(見實施例1),檢測 的抗原結合活性可能歸因於在分離^Mt中來自不同細胞或組織中表達的抗 體重鏈和輕鏈的體外裝配.先前已表明功能性的抗體可以由變性和還原的 抗體組分體外裝配(Petersen和Dorrington， 1974，工及》/L 0^ i.，12i 5633-5641; Maeda等人1996， iVvtei"五"g/"從i7"g，丄95-100),然而， 在缺乏這樣裝配的適宜條件下，這樣的裝配的效率極低。
因此，對於重組的異源寡聚蛋白質，在植物中沒有其產量和效率足以 與其它大,表達系統(例如真菌或昆蟲細胞表達系統)市場竟爭的大， 表達系統。這樣的植物表達必須儘可能好地滿足下列標準
(i)高產量，包括在儘可能多的植物組織中和所述組織的儘可能多的細 胞中表達目標異源寡聚蛋白質；
(ii)為了避免重組蛋白表^j"植物生長的有害影響，蛋白質或目標產物 的表達應該為瞬時(或可轉換的)從而能夠在期望的植物發育階段開始表
達；
(m)提供在植物細胞中編碼異源寡聚蛋白質不同亞基的多蛋白的最佳 比率，從而在由所述亞基組裝的所述重組蛋白水平上支持重組蛋白的高產 量。
因此，本發明的目標是提供在植物、植物部分或植物細胞培養物中產 生異源寡聚蛋白質的有效方法。另 一 目標是提供能夠表達異源寡聚蛋白質 的高產量的植物表達系統。本發明的另一目標是提供在相同植物細胞中共 表M過一種目的多肽的有效方法。此外，本發明的目標是為在植物、植 物部分或植物細胞培養物中表達抗M供快速和高產量的方法。
發明概述
本發明提供在植物、植物組織或植物細胞中產生包括至少第一和第二 蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括通過以下方式在植物
中表達至少所述第 一和第二蛋白質亞基
(i) 向所^ti物、所i^iL物組織或所述植物細胞提供第一和笫二正義單
鏈RNA病毒栽體，所述第一病毒載體編碼至少所述第一蛋白質亞基，所 述第二病毒栽體編碼至少所述第二蛋白質亞基，其中，至少所述第一病毒 栽體和所述第二病毒栽體是非竟爭的病毒栽體；或
(ii) 向所i^HL物、所i^物組織或所i^ML物細胞提供編碼至少所述第一 和所述第二蛋白質亞基的正義單鏈RNA病毒栽體.
在一個實施方案中，所述第一病毒載體和所述第二病毒栽體由於是不 同的病毒栽體因而是非竟爭性的。在另一實施方案中，所述第一病毒栽體 和所述第二病毒栽體由於並非衍生自相同的RNA病毒因而是非竟爭性的. 在另一實施方案中，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體由於在除了編 碼所述第一和第二蛋白質亞基的序列部分之外的序列部分不同因而是非竟 爭性的.在另一實施方案中，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體由於
衍生自屬於不同病毒種的RNA病毒因而是非竟爭性的。在另一實施方案 中，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體由於衍生自屬於不同病毒屬的 RNA病毒因而是非竟爭性的。
本發明的另一實施方案是在植物、植物組織或植物細胞中產生包含至 少第 一和第二蛋白質亞基(例如抗體的重鏈和輕鏈)的抗體，所述方法包括 在植物細胞中通過以下方法表達至少所述第 一和所述第二蛋白質亞基
(i) 通過農桿菌介導的轉染向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞 提供第一正義單鏈RNA病毒栽體的DNA前體和笫二正義單鏈RNA病毒 栽體的DNA前體，所述第一病毒栽體編碼至少所述笫一蛋白質亞基，所 述第二病毒栽體編碼至少所述第二蛋白質亞基，其中，至少所述第一病毒 載體或所述第二病毒栽體缺少編碼所述第一或所述第二病毒栽體在所^L 物中系統轉移所需的功能性蛋白質的開放閱讀框；或
(ii) 通過農桿菌介導的轉染向所述植物、所iitt物組織或所述植物細 胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質亞基的正義單鏈RNA病毒栽 體的DNA前體，其中，所述病毒栽體缺少編碼系統移動所需的功能性蛋 白質的ORF.
本發明還提供在植物、植物組織或植物細胞中產生包含至少第一和笫 二蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括在植物細胞中表達 來自一個或多個正義單鏈RNA病毒栽體的至少所述第一和所述笫二蛋白 質亞基。
在權利要求和下^t本發明的另 一實施方案進行描述， 本發明的發明人已經令人驚奇的建立了使用植物病毒栽體在植物中產 生高產量的異源寡聚蛋白質的方法。在植物中有效產生異源寡聚蛋白質需 要在相同植物細胞中高產量的產生異源寡聚蛋白質的不同蛋白質亞基。這 樣，可以利用所述細胞的天然蛋白組裝能力，例如其內質網(ER)，在具有 表達的所述至少兩種蛋白質亞基的細胞中有效組裝異源寡聚蛋白質。因此 無需在體外低效率地組裝所述異源寡聚蛋白質.本發明通過以上步驟(i)或 通過以上步驟(ii)或通過以上步驟(i)和(ii)的組合，首次在相同細胞中獲得兩
個或多個蛋白質的有效共表達。
所述第一蛋白質亞M RNA病毒栽體中由第一異源(核酸)序列編碼. 所述第二蛋白質亞M RNA病毒栽體中由第二異源(核酸)序列編碼。因 此，這些異源序列是所述病毒載體的RNA序列並且通常包含或編碼表達 所述蛋白質亞基所需的調節序列。這類調節序列的實例為亞基因組啟動子、 IRES元件和3，-非翻譯序列。這裡，如果序列並非天然存在於其衍生自的 病毒中，則該序列為異源序列。
根據本發明，可生產的異源寡聚蛋白質具有至少第一和第二亞基，其 中，所述第一和所述第二亞基具有不同的多肽序列。因此，所述第一和所 述第二亞基通常必須由不同的異源核酸序列表達。寡聚蛋白質的亞基組裝 形成寡聚蛋白質的四級結構。亞基的組裝通常涉及亞基之間的非共價鍵。 此外，可以在所述蛋白質亞基之間形成共價鍵，例如二疏鍵.
在一個實施方案中，所述異源寡聚蛋白質為異源二聚體蛋白質，即具 有兩個不同蛋白質亞基的蛋白質。在另一實施方案中，所述異源寡聚蛋白 質可能具有超過兩個不同亞基，例如3或4個不同亞基(分別為異源三聚體 或異源四聚體蛋白質)。在另一實施方案中，所述異源寡聚蛋白質可以具有 兩個不同的亞基，其中，在所述異源寡聚蛋白質中所述亞基的一個或兩個 可以存在超過一次，所述異源寡聚蛋白質的亞基組成的實例是AaBb、 AJBbCc和AaBbCcDd，其中A代表第一蛋白質亞基，B代表第二蛋白質亞 基，C和D代表其它的蛋白質亞基。每個大寫字母A、 B、 C和D代表與 其它蛋白質亞基不同的蛋白質亞基，且小寫字母代表至少為1的整數，其 表示在所述異源寡聚蛋白質中各個蛋白質亞基的拷貝數. 一個實例是IgG 抗體，其具有亞基組成A2B2，其中A代表第一蛋白質亞基(例如重鏈)且B 代表第二蛋白質亞基(例如輕鏈)，優選地，根據本發明產生的異源寡聚蛋 白質具有兩個或三個不同的蛋白質亞基，更優選具有兩個不同的蛋白質亞 基。
在本發明的方法中，通過所述步驟(i)或/和所述步驟(ii)在所述植物、所 述植物組織或所述植物細胞的細胞中表達至少所述第一和所述第二蛋白質
亞基。每種所述步驟(i)和(ii)使能夠在相同細胞中表達至少所述第一和所述 第二蛋白質亞基，從而可以在所述細胞中有效產生所述異源寡聚蛋白質。 步驟(i)和(ii)可以相似，特別是對於產生具有三個、四個或更多個不同蛋白
質亞基的異源寡聚蛋白質(見實施例7)。
本發明的所述正義單鏈RNA病毒載體在這裡也被簡稱為"病毒載體"。 通常所述正義單鏈RNA病毒栽體衍生自正義單鏈植物RNA病毒。
在步驟(ii)中，向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞提供編碼至 少所述第一和所述第二蛋白質亞基的正義單鏈RNA病毒栽體。編碼至少 所述第一和所述第二蛋白質亞基的所述病毒栽體含有作為插入片段的編碼 所述第一蛋白質亞基的第一異源序列，該蛋白質亞基的表達可能在第一亞 基因組啟動子的控制之下。此外，所述病毒栽體含有作為插入片段的編碼 所述第二蛋白質亞基的第二異源序列，該蛋白質亞基的表達可能在第二亞 基因組啟動子的控制之下。如果所述第 一和所述第二蛋白質亞基都在亞基 因組啟動子的控制下表達，這些亞基因組啟動子優選在序列上不同，以避 免在所述病毒栽體中的自身同源(self-homology)，其將在植物細胞中導致 不期望的重組事件。可以^物病毒的不同菌林或種採集這樣的不同亞基 因組啟動子，例如一個亞基因組啟動子可以是(或可以衍生自)菸草花葉病 毒(TMV) Ul的包被蛋白(CP)亞基因組啟動子和其它的亞基因組啟動子可 以是(或可以衍生自)菸草花葉病毒(TMV) U5的CP亞基因組啟動子或來自 感染十字花科植物的菸草花葉病毒(cr-TMV),
代替所述第一或所述第二亞基因組啟動子，可以在1RES(內部核糖體 ii/v位點)元件控制下翻譯所述第一或所述第二蛋白質亞基。儘管所述第一 或所述第二蛋白質亞基兩者的翻譯可以在IRES元件控制下進行，優選使 用亞基因組啟動子表達所述蛋白質亞基的至少一種.在本發明中使用的 IRES元件可以從例如cr-TMV植物病毒或其它植物病毒獲得(Proc Natl Acad Sci USA 2002， 99， 5301-6; Virology 1999， 263， 139-54; WO03020927; WO0229068)。
步驟(ii)的所述病毒載體優選不能在所述植物或所述植物組織中系統
移動。這可以例如通過省略病毒顆粒組裝的功能起點而獲得。例如在菸草
花葉病毒中，病毒顆粒組裝的起點位於MP ORF。因此可以通過從所述病 毒載體缺失全部或部分的MP ORF省略病毒顆粒組裝的起點。因此所述病 毒栽體優選缺少功能性移動蛋白(MP) ORF。更優選地，所述病毒載體缺 少系統移動所述病毒栽體所需的功能性蛋白質。在這一實施方案中，所述 病毒載體可以缺少功能性包被蛋白質ORF,且大部分優選的所述病毒載體 同時缺少功能性移動蛋白ORF和功能性包被蛋白質ORF。從病毒栽體省 略MP ORF和/或CP ORF為在所述病毒載體中編碼至少所述笫一和所述 第二蛋白質亞基而不損害病毒栽體的穩定性提供了更多的空間。在這一實
施方案中，優選向所述植物或所述植物組織的多數細胞提供所述病毒栽體 以獲得大量細胞的感染。這可以使用農桿菌通過將所述RNA病毒栽體的 DNA前體作為T-DNA ^供而獲得(見以下)。
步驟(ii)的所述病毒栽體可以衍生自任何正義單鏈植物RNA病毒，例 如在"發明詳述"部分所列。優選的病毒組為菸草花葉病毒、馬鈴薯X病 毒(potexvirus)和馬鈴薯Y病毒(potyvirus)。最優選的病毒是TMV和PVX。 所述病毒栽體至少含有來自病毒的ORF，其衍生自所述病毒栽體複製所需 蛋白質的編碼序列。所述病毒栽體通常還包含病毒複製的調節元件和至少 一個亞基因組啟動子.
在步驟(i)中，向所述植物、所逸汰物組織或所述植物細胞提供第一和 第二正義單鏈RNA病毒栽體。所述第一病毒栽體編碼至少所述第一蛋白 質亞基，所述第二病毒栽體編碼至少所述第二蛋白質亞基，
步驟(i)使能夠產生具有兩個不同的蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質。步 驟(i)還使能夠產生具有超過兩個不同亞基的異源寡聚蛋白質，例如三個或 四個不同的蛋白質亞基。在這種情況下，可以向所述植物、植物組織或植 物細胞提供第一、笫二和第三病毒載體(且任選地提供更多的病毒載體)， 每個栽體編碼所述不同蛋白質亞基之一 。如果在步驟(i)必須表達三個或四 個不同的蛋白質亞基，優選該三個或四個病毒載體彼此分別都是非竟爭性 病毒栽體。在三個病毒載體的情況，第一病毒栽體可以衍生自菸草花葉病
毒，第二病毒載體可以衍生自馬鈴薯Y病毒，第三病毒載體可以衍生自馬 鈴薯X病毒。
如果兩個病毒栽體能夠在相同的植物細胞中有^達其編碼的蛋白質
亞基(共表達)，則這兩個病毒載體是非竟爭性的。共表達需要至少兩個不 同的病毒載體在大量表達其編碼的異源序列之前的複製期間不彼此戰勝.
在所述至少兩個病毒栽體的RNA水平上序列差異越高，其在相同植物細 胞中越為非竟爭性.由於所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體是不同的 病毒栽體，所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體是非竟爭性病毒載體。
為了是非竟爭性的病毒載體，在一個通常的實施方案中，所述第一和 所述第二病毒載體(所述兩個非竟爭性病毒載體)除了在編碼所述蛋白質亞
基的所述異源序列上不同，還至少在序列部分有差異。優選地，除了所述 異源序列，序列部分中的這類差異衍生自植物RNA病毒，例如涉及病毒 功能的序列部分，例如病毒在植物細胞中的複製(例如編碼複製酶的序列)、 病毒蛋白質的翻譯(例如亞基因組啟動子)或病毒的細胞-至—細胞或長距 離的運動。
為了是非竟爭性的病毒栽體，在另一個通常的實施方案中，所述第一 和所述第二病毒栽體(所述兩個非竟爭性病毒栽體)來自不同的植物病毒。
在這一實施方案的一個實例中，所迷至少兩個非竟爭性病毒栽體並非衍生 自相同病毒菌林的病毒。在另一實例中，所迷至少兩個非竟爭性病毒栽體 並非衍生自相同病毒種的病毒.在更多的實例中，所述至少兩個非竟爭性 病毒栽體並非衍生自相同病毒屬的病毒.因此，所述第一病毒栽體和所述 第二病毒載體優選衍生自不同菌林的病毒，更優選來自不同種的病毒，最 優選來自不同屬的病毒。
所述笫一病毒栽體可以衍生自屬於馬鈴薯X病毒屬的病毒，且所述第 二病毒載體可以衍生自屬於馬鈴薯Y病毒屬的病毒.具體的，所述第一病 毒載體可以衍生自馬鈴薯病毒X，且所述第二病毒栽體可以衍生自馬鈴薯 病毒Y.
在馬鈴薯Y病毒載體(potyviral vector)的情況下，所述蛋白質亞基能
夠作為與病毒多蛋白的融合而表達，其中，可以通過馬鈴薯Y病毒蛋白酶 識別位點從所述多蛋白分離本發明的蛋白質亞基。
在另一實施方案中，所述第一病毒栽體可以衍生自屬於馬鈴薯X病毒 屬的病毒，且所述第二病毒載體可以衍生自屬於菸草花葉病毒屬的病毒. 具體的，所述第一病毒載體可以衍生自馬鈴薯病毒X，且所述第二病毒栽 體可以衍生自菸草花葉病毒。
"從病*生"意指病毒栽體含有其衍生自的病毒的遺傳元件或序列 部分。在一個實施方案中，所述病毒栽體含有從RNA病毒獲得的複製酶 ORF (開放閱讀框).在另一實施方案中，病毒栽體含有來自RNA病毒的 運動蛋白ORF以及任選的還有複製酶ORF。如果需要，可以突變從RNA 病毒獲得的病毒遺傳元件,例如從而引入病毒載體克隆所需要的限制位點。
其中所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體都是基於菸草花葉病毒載 體TMV 30 B的一個實施方案被排除在本發明方法的步驟(i)之外，因為在 這種情況下所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體並非不同的病毒栽體而 是相同的病毒載體(參見Verch等人，J. Immunological Methods 220 (1998) 69-75)。
所述第一和所述第二病毒載體(所述非竟爭性病毒栽體)優選具有至多 90%，更優選至多80%，甚至更優選至多70%和最優選至多60。/。的RNA 水平上的序列同源性.更具體的，所述第一病毒栽體的任何序列段的100 個威基與所述第二病毒栽體的任何序列段的100個M具有至多90% ,優 選至多80 % ，更優選至多70 %和最優選至多60 %的序列同源性。
在一個實施方案中，所述第一病毒栽體的複製酶ORF(或者，如果該 複製酶由超過一個ORF編碼，則為多個ORF)和所述第二病毒栽體的複製 酶ORF(或者，如果該複製酶由超過一個ORF編碼，則為多個ORF)具有 至多卯％,更優選至多80%，甚至更優選至多70%和最優選至多60%的 序列同源性。在另一實施方案中，所述第一病毒栽體的複製酶ORF和所 述第二病毒載體的複製酶ORF具有至多85%，更優選至多75%，甚至更 優選至多65 %和最優選至多55%的同 一性。
在步驟(i)中，所述第一病毒載體優選含有編碼所述第一蛋白質亞基的
第一異源序列，該蛋白質亞基的表達可能在笫一亞基因組啟動子的控制下。 所述第二病毒載體優選含有編碼所述第二蛋白質亞基的第二異源序列，該
蛋白質亞基的表達可能在第二亞基因組啟動子的控制下。可以以IRES元
件代替所述亞基因組啟動子的一個或兩個。對於步驟(ii)與上述相似，如果
所述第一和所述第二蛋白質亞基都在亞基因組啟動子的控制下表達，這些
亞基因組啟動子優選在序列上不同以避免在所述第 一和所述第二病毒載體
(以及任何更多的病毒栽體)之間的同源性，該同源性將在植物細胞中導致
不希望的重組事件。可以從不同的菌林或植物病毒種獲得這類不同的亞基
因組啟動子，例如一個亞基因組啟動子可以是菸草花葉病毒(TMV) Ul的
包被蛋白(CP)亞基因組啟動子，和另一亞基因組啟動子可以是TMVU5或
十字花科感染的菸草花葉病毒(cr-TMV)的CP亞基因組啟動子。
由於在構建本發明的病毒栽體時可以省略細胞-至-細胞或"1U巨離移 動所需要的植物病毒的ORF，可以通過比較所述病毒栽體的複製酶ORF 確定所述非竟爭性病毒栽體的相關性.
可以將分別編碼所述第 一和所述第二蛋白質亞基的所述第 一和所述第 二異源序列作為附加序列加入所述病毒栽體。優選加入所述異源序列使能 夠獲得高水平的表達。為此目的，將所述異源序列加在病毒的3，末端，因 為在許多病毒中，3， ORF通常是表達水平最高的ORF.然而，優選用所 述異源序列代替所述病毒的天然序列，例如所述病毒的天然3， ORF，其在 許多病毒例如菸草花葉病毒中為CPORF.因此，所述第一和/或所述第二 病毒載體優選缺少所述病毒栽體系統移動的ORF。所述病毒栽體還可以缺 少細胞-至-細胞移動的ORF,例如在菸草花葉病毒中的MPORF.
在本發明中，可以將步驟(i)和步驟(ii)組合，特別是對於表達具有三個 或更多不同亞基的異源寡聚蛋白質.如果要生產的異源寡聚蛋白質具有四 個不同蛋白質亞基，可以根據步驟(i)表達兩個蛋白質亞基，根據步驟(ii)在 植物或植物組織的細胞中生產另外的兩個蛋白質亞基。然而，優選的，可 以從第一病毒栽體表達兩個蛋白質亞基，從對第一病毒載體非竟爭性的第
二病毒栽體表達兩個蛋白質亞基。如果要生產具有三個不同蛋白質亞基的
異源寡聚蛋白質，可以根據步驟(i)通過從笫一病毒載體表達兩個蛋白質(與 步驟(ii)所述相似)，並且從非竟爭性病毒栽體表達第三個蛋白質亞基來表 達所述三個蛋白質亞基。
通常在DNA水平^it本發明的病毒栽體。如果將所述病毒栽體作為 RNA病毒栽體提供給植物細胞或植物組織細胞，可以例如使用噬菌體聚合 酶，例如T7聚合酶以及合適的啟動子將所述DNA體外轉錄為所述RNA 病毒栽體。優選將兩個不同的病毒栽體作為混合物用於所述植物以保證向 所述植物細胞同時提供兩個病毒載體。然而，優選使用所述RNA病毒載
細胞提供本發明的病毒栽體。所述DNA前體在所述植物的細胞中具有轉 錄啟動子活性，通過所述DNA前體的轉錄形成所述病毒栽體。最優選的 所述DNA前體是農桿菌Ti質粒中的T-DNA。接著通過用兩個或多個農 桿菌菌林的混合物(如懸液)處理所述植物，向所述植物或所述植物組織提 供兩個或多個病毒栽體，其中，每個菌抹含有編碼特定病毒栽體的T-DNA。 使用這樣的農桿菌懸液處理植物的主要部分可以代替天然植物病毒的系統 移動功能和/或細胞-至-細胞移動功能。
在本發明中最優選通it^桿菌使用所述病毒栽體的DNA前體瞬時轉 染所述植物、植物組織或植物細胞.然而，可以將所述病毒栽體的所述DNA 前體穩定摻入植物染色體DNA。可以通過可誘導的啟動子控制所述病毒栽 體從染色體DNA的釋放.
如果通過DNA前體向所述植物提供所述病毒栽體，優選採取措施以 提高所述病毒栽體從細J!^亥(栽體在其中被轉錄)至細胞質(所述病毒栽體在 其中複製)的轉移效率.這可以通過在所述DNA前體中包含內含子而實現， 特別是如在國際專利申請PCT/EP05/000492，公布為WO2005〃10卯中詳 細描述的病毒載體的複製酶ORF中，其在這裡被引入作為參考。
可以將本發明的方法用於其中存在或在今後可以作出植物病毒表達系 統的任何植物。所述植物可以是單子葉或雙子葉。在雙子葉中，優選茄科、
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十字花科、藜科和豆科。在茄科中，優選菸草屬，如普通菸草(N. tabacum) 或本氏菸草。其它優選的植物是紫苜蓿(# //0^^她^)和甜菜種，如甜菜 (Beta vulgaris),
使用本發明的方法在植物系統中產生異源寡聚蛋白質。優選的異源寡 聚蛋白質是免疫球蛋白，如以下類型的免疫球蛋白免疫球蛋白G、免疫 球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白E。這些免疫球蛋 白可以包含至少抗原結合的結構域部分。如情況所需，如果根據本發明產 生的這些免疫球蛋白包含至少兩個不同的蛋白質亞基，其可以相對於天然 動物的免疫球蛋白被修飾。該免疫球蛋白可以包含與免疫球蛋白重^目連 的保護蛋白質，其中該保護蛋白質包含多聚免疫球蛋白受體部分。另一優 選的異源寡聚蛋白質是胰島素。
按照情況需要，可以以多種不同的方式，相對於天然蛋白質#^本發 明的異源寡聚蛋白質。在異源寡聚蛋白質中，可以用植物特異性的信號肽 代替天然異源寡聚蛋白質的一個或多個蛋白質亞基的形成分泌信號的前導 序列.所述植物特異性信號肽可以衍生自菸草鈣網蛋白和/或稻ct澱粉酶。 所述異源寡聚蛋白質的至少一個或至少兩個或多個亞基可以含有內質網滯 留信號KDEL以提高植物細胞中所述異源寡聚蛋白質從所述亞基的組裝。 此外，可以突變編碼所述蛋白質亞基的所述異源序列以從所述異源寡聚蛋 白質中部分或全部地除去糖基化位點。而且，可以例如通過^tit植物糖基 化機制的組分，例如一個或多個糖基轉移酶，改變要表達的異源寡聚蛋白 質的糖JMt方式。
可以在表達之後根據/^的操作^物、植物組織或植物細胞分離本 發明的異源寡聚蛋白質。接著可以純化所述異源寡聚蛋白質至基本同質， 該狀態可以被定義為，所述異源寡聚蛋白質在考馬斯染色的SDS-PAGE上 的條帶佔據由常規凝膠讀取器測定的染色條帶的至少70%，優選至少80 %和最優選至少90%。
圖l(A)顯示在浸潤的本氏菸草葉中來自兩個不同的基於TMV的載體 GFP和DsRed的表達分布。左圖左側上部的亮點是用plCH17272浸潤 區域的GFP螢光。下面的弱的亮點是用載體plCH18505浸潤區域的紅色 螢光。在左圖右側底部的亮點是用plCH17272 + plCH18505浸潤的區域。 右側圖顯示從葉區域分離的原生質體，用兩個不同的載體共浸潤(上部在 GFP螢光檢測^^下的原生質體；下欄在DsRed螢光檢測4Hf下的相 同原生質體)。(B)plCH17272和pICH18505的T-DNA區的示意圖。P-轉錄啟動子；T —轉錄終止區；RdRP —病毒RNA依賴的RNA聚合酶； MP-病毒移動蛋白；3，NTR-病毒3，非翻譯區；Cr-sgp-crTMV菌林的 CP亞基因組啟動子區；GOI-目的基因。(C)是plCH17272和plCH18505 的T-DNA區限制圖鐠的示意圖。
圖2描述了病毒載體T-DNA區的示意圖，該病毒栽體設計由不同的 亞基因組啟動子共表達兩個不同的轉基因(GOI-l和GOI-2)。 P 一轉錄啟動 子；T-轉錄終止區；RdRP-病毒RNA依賴的RNA聚合酶；MP-病毒 移動蛋白；3，NTR -病毒3，非翻譯區；Cr-sgp - crTMV菌林的CP亞基因 組啟動子區；3PK _三重假結區；U5sgp - TMV-U5菌抹的CP亞基因組啟 動子；GOI-目的基因。
圖3 (A)描述了 plCH17388、 plCH17123、 plCH15933、 plCH7410、 plCH10580、 plCH10881和plCH10745構建體的T-DNA區的示意圖。RS -由PhiC31整合酶識別的重組位點。灰色豎條表示內含子。(B)描述了 plCH 17388、 plCH17123、 plCH 15933的T-DNA區的限制圖語。(C)描述 了 pICH7410、 plCH10580、 plCH10881和plCH10745的T-DNA區的限 製圖鐠。
圖4在(A)中顯示在對DNA前體plCH17388和plCH15933與重組酶 來源一起進行農桿菌傳遞之後6天，本氏菸草葉區域的螢光顯微照相。RS -由PWC31整合酶識別的重組位點，
圖5描述了不同栽體系統的T-DNA區示意圖，該栽體系統用於表達 抗體的重鏈和輕鏈。RS -由PhiC31整合酶識別的重組位點。
圖6顯示使用病毒前栽體系統(provector system)在本氏菸草葉中IgG 表達的Western印跡。
在非還原a下的12。/。^上進行TSP的電泳分離。使用來自兔的 綴合HRP (Sigma)的抗人IgG片段(稀釋6xl03倍)檢測表達的蛋白質。
1道-未感染的葉組織；2道-細胞質中表達的IgG重鏈(plCH17388); 3道-IgG重鏈和輕鏈，用35S啟動子構建體(plC0123+pICH19846)共表達； 4道-與3遵^目同的IgG重鏈和輕鏈，用P19 (plCH6692)表達；5道-用 35S啟動子構建體和P19 (plCH5290+plCH6692)表達的GFP; 6道-IgG 重鏈和輕鏈，用雙順反子構建體plCH19860共表達；7道-IgG重鏈和輕 鏈，用XMS反子構建體plCH19860 (MP缺陷的5'前載體plCH17123， ^ MPplCH 10745)共表達；8道-在細胞質中共表達GFP和dsRED，提 供A式MP (pICH17123 + plCH19919 + plCH10745)。
圖7描述了編碼非竟爭性病毒栽體的T-DNA區示意圖，該栽體設計 用於在相同植物細胞中共表達不同的目的蛋白質亞基。P-轉錄啟動子；T -轉錄終止區；TMV RdRP _菸草花葉病毒的依賴病毒RNA的RNA聚合 酶；PVXRdRP-馬鈴薯病毒X的依賴病毒RNA的RNA聚合酶；MP-病毒移動蛋白；3，NTR-病毒3，非翻譯區；Cr-sgp - crTMV菌林的CP亞 基因組啟動子區；GOI-編碼目的蛋白質亞基的目的基因。
圖8描述了雙元栽體plC0130的T-DNA區示意圖.
圖9顯示使用TMV (plCH17388+plCH10580)和基於PVX (plC0130) 栽體在植物細胞中對GFP和dsRED的共表達M桿菌接種的本氏菸草 葉中分離的原生質體的GFP和dsRED觀測。
圖10 (A)描述了雙元栽體plCH17620、 plCH20431、 plCH21240、 plCH20421和plCH21370的T-DNA區示意圖.
(B) 為雙元載體plCH11599、 plCH21910和plCH21920的T-DNA區示 意圖。
(C) 為雙元載體plCH21282、 plCH109卯、plCH22250和plCH22240 的T-DNA區示意圖。Lv和Lc-輕鏈的可變區和保守區；Hv和Hc-重鏈
的可變區和保守區。
(D)為PVX衍生的前栽體plCH21380的克隆方案示意圖。
圖11 (a)顯示使用PVX和crTMV載體確定IgG輕鏈和重鏈共表達水
平的ELISA檢測結果。左邊的組織培養板的孔數對應於柱狀圖中柱的數
目。柱狀圖顯示這些孔在405 nm的OD值。 1，2-未感染的植物組織；
3， 4， 5-在PVX中的鉤網蛋白SP-重鏈(分別為plCH21240-l、 plCH21240-5和pICH21370-14克隆)
6， 7， 8-在PVX中的鉀網蛋白SP-IgG輕鏈(LC)(分別為 plCH21370-18、 plCH21370-19、 plCH21370畫31 ，在N端缺失)；
9， 10， 11 -在PVX中的鈣網蛋白SP - IgG輕鏈(分別為plCH21370-40、 plCH21370-44、 plCH21370-45);
12 -空白對照(沒有^^I植物蛋白質提取物)；
13， 14， 15-在PVX中的鈣網蛋白SP-IgG重鏈(HC)(分別為 plCH21240-l、 plCH21240-5和plCH21240-14克隆)與crTMV中的鈞網蛋 白SP - IgG輕鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20431 )共表達；
16， n， 18 -在PVX中的鈣網蛋白-IgG的LC (分別為plCIK1370-18、 plCH21370-19、 plCH21370-31，在N端缺失)與crTMV中的釣網蛋白-HC (plCH 17620+plCH10881 +plCH20421 )共表達；
19， 20， 21 -在PVX中的鈣網蛋白-IgG的LC(分別為plCH21370-40、 plCH21370-44、 plCH21370-45)與基於crTMV的栽體中的鈞網蛋白SP-重鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20421 )共表達；
22 -用PVX表達的GFP(plC0130);
23 -用PVX表達的GFP(plCH20799);
24 -由crTMV單獨表達的鋦網蛋白SP - IgG輕鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20431);
25-由基於crTMV的栽體表達的鈣網蛋白SP - IgG重鏈(plCH 17620+plCH10881 +plCH20421 );
26- 在PTGS阻抑基因P19存在下在強35S啟動子控制下共表達的 IgG的輕鏈和重鏈；
27- 由基於crTMV的栽體共表達的IgG的輕鏈和重鏈(plCH17388 +plCH10881= plCH20241);
28- 由基於crTMV的栽體共表達的輕鏈和重鏈(plCH17388 +pICH10881= pICH20241)， MP (plCH10745)以^4'提供；
* - OD405值遠超過可測量值。
圖11 (b)顯示在本氏菸草葉中表達的抗癌抗體的電泳和Western印跡 分析.
(A) 在用TMV和PVX前栽體共轉染的本氏菸草葉中的抗癌抗體的重 鏈和輕鏈的聚積。輕鏈由PVX表達，重鏈由TMV表達。在還原條件下以 12%聚丙烯,亂歐分離蛋白質。上欄顯示考馬斯染色；中間欄顯示4吏用 HRP綴合的山羊抗人IgG (Y鏈特異性)抗體(Sigma)的Western印跡；下 欄顯示使用HRP綴合的兔^AlgG (入鏈特異性)抗體(Sigma)的Western 印跡。Uninf，未感染組織；2-11，接種後的天數；S，標準抗癌mab(單 克隆抗體)；LC，用TMV前栽體單獨表達的輕鏈(感染後6天)；HC，用 TMV前栽體單獨表達的重鏈(感染後6天)，
(B) 使用A蛋白磁珠(NEB)純化抗癌mab。在考馬斯染色凝膠上在非還 原條件下12%聚丙烯醯胺凝膠中遷移的植物衍生的(1道)和標準的(2 道)mab,
(C) 用表達HC的TMV前栽體和表達LC的PVX前栽體共感染的本 氏菸草葉中組裝的抗癌mab的積聚.在非還原條件下以10°/。聚丙烯^ MJi^分離蛋白質'用山羊抗人IgG ( Y鏈特異性)抗體進行探針的Western 印跡。Uninf，未感染組織；2-11，接種後的天數；S,標準抗癌mab; LC，用TMV前載體單獨表達的輕鏈(感染後6天)；HC，用TMV前栽體 單獨表達的重鏈(感染後6天)；H2L2:含有兩條重鏈和兩條輕鏈的IgG異 源四聚體，H2L-含有兩條重鏈和一條輕鏈的異源三聚體，112-重鏈同源 二聚體，L2 —輕鏈同源二聚體'
圖12顯示雙元載體plCH17620、 pICH-FSHA和pICH-FSHB的 T-DNA區示意圖。
圖13描述了雙元栽體plCH17388、 plCH-MLCJ和plCH-MHC的 T-DNA區示意圖。
發明詳述
本發明所述病毒栽體是其中單個栽體編碼形成所述異源寡聚蛋白質所 需4^P蛋白質亞基的病毒載體，或是至少兩個不同的非竟爭性病毒栽體， 其中，所述至少兩個病毒載體的每一個編碼形成所述異源寡聚蛋白質所需 的不同蛋白質亞基。每一個所述非竟爭性病毒栽體可以表達編碼重組異源 寡聚蛋白質的多個亞基的多條異源核酸序列.可以將所述RNA病毒栽體 瞬時傳遞iiA植物細胞，或作為DNA前體穩定#^^植物染色體DNA。
本發明提供在植物細胞中高產量生產異源寡聚蛋白質的方法.這一方 法克服了現存的基於病毒栽體表達系統的局限性(例如對要表達異源序列 大小的局限)、所述栽體的高度不穩定性以及在同一植物細胞中共表達不同 異源核酸的不穩定性.此外，由於從系統除去病毒包被蛋白，阻止感染性 病毒顆粒的形成和回復為野生型病毒，所述方法提供更好的生物安全特性。 通過本發明的操作，為目的異源寡聚蛋白質而設計的高產量表達系統對於 實際上任何植物RNA病桊時生的複製子是可能的，所述複製子適於表達 目的異源序列，通過修飾所述複製子能夠表達編碼目的異源寡聚蛋白質不 同亞基的至少兩個目的異源序列。或者，可以發現另一非竟爭性病毒栽體 能夠與所述病毒栽體在同 一植物細胞中共複製.
屬於不同分類群的正義單鏈RNA病毒(這裡也簡稱為"RNA病毒") 適用於構建本發明的正義單鏈RNA病毒栽體(這裡也稱簡為"病毒栽體")。 本文中，病毒栽體是能夠在植物細胞中複製的RNA栽體，即使用RNA病
優選的，本發明的病毒栽體含有至少一個具有RNA病毒功能的病毒序列 元件，例如複製酶、亞基因組啟動子、病毒顆粒組裝起點、包被蛋白ORF、
或移動蛋白ORF。此外，病毒載體可以有RNA病毒IRES元件。
可以，例如通過向病毒中引入限制位點，從其衍生自的病毒構建病毒 栽體，所述限制位點代表適用於引入本發明的異源序列的克隆位點。本領 域技術人員應該理解的是對RNA病毒或栽體的核酸改造通常分別使用所 述RNA病毒或栽體的DNA拷貝在DNA水平上完成。因此，更精確的說， 可以通過向RNA病毒的DNA拷貝引入限制位點，從其衍生自的RNA病 毒的DNA拷貝構建RNA病毒栽體的DNA拷貝，所述限制位點代表適於 在DNA水平引入本發明異源序列的DNA拷貝的克隆位點。這些問題對於 本領域技術人員是顯而易見的並且在本文中通常不再強調。
如果RNA病毒的DNA拷貝天然地具有適於克隆的P艮制位點，該病毒
本身可以是病毒栽體。本文中，術語"病毒栽體"指其中在所述栽體中不 存在所述異源序列的情況，或者指其中在栽體中不存在本發明的蛋白質亞 基的編碼序列的情況。通過清楚說明存在這類插入片段從而鑑定其中編碼 本發明的蛋白質亞基的所述異源序列或序列插入所述病毒栽體的情況。
本文中，在引入編碼本發明蛋白質亞基的所迷異源序列或序列之前， 如果兩個病毒栽體序列不同，則稱兩個病毒栽體為不同的.在引入編碼本 發明蛋白質亞基的所述異源序列或序列之前，如果兩個病毒栽體具有相同 的序列，則稱兩個病毒栽體為相同的。因此，當確定兩個病毒栽體是不同 或相同時，不考慮編碼本發明蛋白質亞基的所述異源序列或序列.
本文中，術語"複製子"或"病毒複製子"具有與"病毒栽體"相同 的含義.
以下列出可用於^t本發明的病毒栽體的RNA病毒表。引用的分類 名(並非斜體字體)表示該分類不具有ICTV國際認可的名稱.種名(俗名) 以常規字體給出。不具有正式指定的屬或科的病毒被指出
RNA病毒
ssRNA病毒
科雀麥花葉病毒科CB/wn0W"V/ae)，
屬苜蓿花葉病毒屬04(/iiwoWf"s)，代表種苜蓿花葉病毒，
屬等軸不穩環斑病毒屬(J/flrWnw)，代表種菸草條(斑)紋病毒， 屬雀麥鑲嵌病毒屬CBiYWwWr"s)，代表種雀麥鑲嵌病毒， 屬黃瓜花葉病毒屬(C"cM挑ov/r"s)，代;ft^種黃瓜花葉病毒；
科長線形病毒科(C7仍teiYm'i7V/"e)，
屬黃化絲狀病毒屬(C7仍tewvi'nis)，代表種甜菜黃化病毒， 屬長線狀病毒屬(CWw/v,'ms)，代表種萵苣傳染性枯黃病毒，
科St豆花葉病毒科(CVwiwviV7V/fle)， 屬虹豆花葉病毒屬(OwfitfVfV"s)，代表種tn豆花葉病毒， 屬蠶豆萎蔫病毒屬CFfl6flv!Vm)，代表種蠶豆萎蔫病毒l， 屬線蟲傳多面體病毒屬(iVe/wv,'r"s)，代表種菸草環斑病毒；
科馬鈴薯Y病毒科(/V卿iV7V/fle)，
屬馬鈴薯Y病毒屬(i^0^'r"s)，代表種馬鈴薯Y病毒、李痘病毒、 菸草蝕紋病毒、三葉草黃脈病毒、菸草脈斑駁病毒；
屬黑麥草花葉病毒屬(i^挑oviV^),代表種黑麥草鑲嵌病毒， 屬大麥黃花葉病毒屬(外加卯i'i^)，代表種大麥黃色鑲嵌病毒；
科歐防風黃點病毒科CS^"i'viWitee)，
屬伴生病毒屬CSq"i'w'f"s)，代表種歐防風黃點病毒，
屬矮化病毒屬(l^i汰aw7w)，代表種稻東格魯球狀病毒；
科番痴叢矮病毒科(7Vi/wWWrfae)，
屬香石竹斑駁病毒屬(Gw挑(m'nw)，代表種香石竹斑駁病毒， 屬香石竹環斑病毒屬(i)i'fl/f^wv!'ras)，代表種香石竹環斑病毒， 屬玉米褪綠斑駁病毒屬(MacWwiwvi'fiis),代表種玉米褪綠斑駁病
屬壞死病毒屬(iVecfYmV""s)，代表種菸草壞死病毒屬， 屬番茄叢矮病毒屬(r0w6"svZ/^)，代表種番茄叢矮病毒，
未指定屬的ssRNA病毒，
屬線形病毒屬(Cfl/;淑ov/r"s)，代表種蘋果莖溝病毒；
屬香石竹潛隱病毒屬(Ow/flWnw)，代表種香石竹潛隱病毒；
屬耳突花葉病毒屬(五/m挑卵/ras)，代表種豌豆耳突花葉病毒，
屬真菌傳杆狀病毒屬(Fiiwv/nw)，代表種土傳小麥花葉病毒，
屬大麥病毒屬(^mfe,'Wi"ws)，代表種大麥條紋花葉病毒，
屬懸鉤子病毒屬(A/fl朋Wf"s)，代表種覆盆子叢矮病毒；
屬黃症病毒屬(l"teov^"s)，代表種大麥黃矮病毒；
屬玉米細線病毒屬(M"rfl/ vi'f"s)，代表種玉米雷亞多非納病毒；
屬馬鈴薯X病毒屬(/VitocWrMs)，代表種馬鈴薯X病毒；
屬南方菜豆花葉病毒屬(5^6eimmVws)，代;^種南方菜豆花葉病毒，
屬纖細病毒屬(re"",'vi'r船)，代表種稻條紋病毒，
屬菸草花葉病毒屬(7V^a加卵i'f"s)，代表種菸草花葉病毒，
屬菸草脆裂病毒屬(7V^mW/m)，代表種菸草脆裂病毒，
屬髮狀病毒屬(7Wc^Wrws)，代表種蘋果褪綠葉斑病毒；
屬蕪普黃花葉病毒屬(r戸柳'/""s)， >^^種蕪菁黃花葉病毒；
屬幽影病毒屬(r附6mvi'ws)，代表種胡蘿蔔斑駁病毒；
負鏈ssRNA病毒目單股負鏈RNA病毒目(Afo朋"堪flWiYi/M)，科: 彈狀病毒科(及Afl6rfimi7V/fle)，屬胞質彈狀病毒屬(Q加fA"6fltovinw)，代表 種萵苣壞死黃化病毒，
屬胞核彈狀病毒屬(iViic/wfAflMw/nw)，代表種馬鈴薯黃矮病毒。
RNA病毒栽體能夠為在植物細胞中表達目的基因提供極高的異源 RNA拷貝數。然而，如果異源核酸序列的大小增加至某些限制之上，通常
在lkb以上，已知這樣的栽體會變得極不穩定。由於這樣的限制，迄今為 止，對這類載體系統的應用限制於相對簡單的小蛋白質至中型蛋白質的表 達。表達大或複雜的異源寡聚蛋白質的努力尚無成功結果。我們已驚奇地 發現可以成功地採用病毒載體高產量的表達複合異源寡聚蛋白質，這在先 前是不可能的。由於在相同細胞中共表達目的蛋白所使用的病毒載體的不
相容性，對表達全長單克隆抗體的早期努力(Verch等人，1998，/. /附挑《朋/.
Me仇，2M, 69-75)並未提供滿意的結果。在實施例1中，我們在單個細胞
水平證明^目同植物RNA病毒(TMV)衍生的病毒複製子有效共表達兩個
不同基因(GFP和DsRed)是不可能的。在圖l(A-右欄)，我們不能檢測到
顯示出表達兩種報告基因DsRed和GFP的原生質體。在右下欄一些原生
質體中，DsRed的弱表達方式與強的GFP表達(右上欄)相一致，並且由於
用於DsRed檢測的過濾片漏光而呈現假陽性結果。這一漏光產生^^有高濃
度GFP的原生質體的明顯的弱DsRed螢光。因此即使當RNA複製子帶有
編碼不同重組蛋白的不同異源核酸序列時，相同或共有廣泛同源區的RNA
複製子不能在一個植物細胞中共存。這一現象的原因目前尚未知，可能的 解釋為一個病毒複製子拷貝數的指數增加導致迅速勝過另一病毒複製子.
因此在選擇的細胞中第二個開始複製的複製子不能趕上第一個，其中，這
些事件確定"第一"複製子具有統計特徵的顯著性。
在我們解決此問題的研究中，我們改造了病毒複製子使在所述複製子 中存在兩個不同的異源核酸序列，其在兩個不同的亞基因組啟動子控制下 編碼不同的蛋白質。在圖2中顯示編碼這樣的RNA複製子的T-DNA區概 圖。我們使用先前專利申請(WO02088369;又見Marillonnet等人，2004， iV< c. Wflrf. Jcad: 5W. i7&4， 1M， 6852-6857)所述的前栽體方法作為設計和 優化這樣栽體的便宜方法。該方法使能夠經由位點特異性重組在植物中從 預製的構件組裝最終的栽體，因此顯著的加速了載體設計和載體優化。在 實施例2中描述了該構建體的設計並且在圖3中顯示了示意圖。
我們驚奇的發現儘管在最終複製子中插入大的片段且由存在兩個強亞 基因組啟動子導致的載體的複雜結構，獲得的RNA複製子在植物中顯示
出高穩定性和在相同植物細胞中提供兩種不同重組蛋白(GFP和DsRed)共 表達的能力。如圖4所示，在感染區域內，共表達的頻率可以達到幾乎所 有細胞的100%。例如在這樣的構建體中用IgG的輕鏈和重鏈代替報告基 因(GFP和DsRed)(圖5)在浸潤的本氏菸草葉中進一步的表達，產生令人 驚奇的結果。如在實施例3中所述，Western印跡分析顯示了令人印象深 刻的高濃度的組裝的單克隆抗體(6和7道；圖6)。由我們的系統提供的組 裝的單克隆抗體的產量遠遠高於由現有技術系統產生的產量(圖6， 4道)。 據我們所知，這是使用基於植物病毒栽體的表達系統表達複合異源寡聚蛋 白質(例如抗體)的第一次證明.所有先前的公開局限於表達單克隆抗體的 簡單的人工衍生物，例如使用TMV病毒栽體(McCormick等人1999， /Vw iVflrf爿cfld Sd 1/5^4， 2^， 703-708; McCormick等人，2003， / /挑附《朋/: Afe狄oflb， 22§， 95-104)和基於PVX的栽體(Smolenska等人，1998， F五AS i:e汰，巡，379-382; Franconi等人，1999， /挑挑MwotecA朋/tf^;，丄189-201 ; Hendy等人，1999， / /附加""o/. Me幼o必，211， 137-146; Roggero等人，2001 ， /VtftoVi五jc/w.戶"《>:， 21， 70-74)表達單鏈抗體(scFv)。
在本發明中，我們優選不使用系統病毒栽體。代替系統病毒栽體，我
的系統移動能力.這使我們可以用要表達的異源序列代替病毒的包被蛋白. 這一方法有助於增加病毒栽體對異源序列的可能的容量。同時，該方法消 除了病毒栽體由於自發的缺失異源序列而轉化為野生型病毒的可能性，所 述轉化可能損害系統的產量，
儘管我們基於病毒複製子系統產生的單克隆抗體產量顯著優於現有技 術系統，我們檢測了通過減少病毒複製子的大小進一步增加產量的可能性。 考慮到減少表達分泌型抗體雙鏈的病毒複製子大小的有限的可能性，我們 嘗試從兩個不同的病毒複製子表達抗體的重鏈和輕鏈。考慮到基於相同病
毒的複製子不能在相同植物細胞中共表達兩條不同的異源序列(見以上實 施例1)，我們檢測了通過將DsRed和GFP基因分別克隆進入由非同源的 植物病毒菸草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯病毒X (PVX)衍生的病毒栽體從而
在相同植物細胞中共表達兩種不同基因的可能性(見實施例4)。在圖7和8 顯示了含有所述病毒栽體的cDNA的T-DNA區示意圖(僅PVX)。在實施 例4中，出於方便，我們使用基於TMV的病毒栽體，所述載體在植物中 經由位點特異性重組從栽體構件組裝。我們令人驚奇的發現從共浸潤的植 物葉區分離的原生質體顯示出幾乎100%的DsRed和GFP報告基因的共 表達頻率(圖9).
近來，由Dietrich和Maiss提出關於不同標記病毒的空間分離的研究 (2003，/. F,/vto^， M， 2871-2876)。在這一研究中，作為報告基因表達 螢光蛋白。未提到產生異源寡聚蛋白質。此外，沒有在分離的原生質體水 平上對共表達的研究。由於報告基因產物能夠經由胞間連絲擴散至相鄰細
信息。、更早的公布涉及在感染植物時野1^病毒彼此之間的協同作;，但 不涉及異源寡聚蛋白質在植物細胞中的表達(Rochow和Ross， 1955， FiVv/柳，1， 10-27; Goodman和Ross， 1974， Wiv/柳，迅16-24; Goodman 和Ross, 1974， KiiY togy，絲，314-318; Goodman和Ross， 1974， Kiwto砂，絲， 263-271)。關於病毒在共感染植物中的協同相互作用的這些早期研究 (Vance等人，1995， K/i^<^y，裡，583-590; Pruss等人1997，屍/aW Ce//， 2， 859-868)^iUl導致發現轉錄後基因沉默(PTGS)的阻抑基因.重組蛋白 表達系統的進一步JOL定向於研究這類PTGS阻抑基因以增加重組蛋白的 產量，在現有技術中對蛋白質表達沒有使用基於協同病毒的病毒表達系統 的暗示.
本發明證明非竟爭性病毒栽體為在植物細胞或植物中生產異源寡聚蛋 白質提供有效工具.如果兩個或多個病毒栽體能夠在相同植物細胞中複製 並且在所述複製和其它細胞的轉染中不彼此稀釋，所述病毒栽體是彼此非 竟爭性的.沒有稀釋意指至少10 % ，優選50 % ，更優選卯％和最優選100 %的轉染的植物細胞是共轉染的，例如含有所述兩個或多個不同的病毒栽 體。優選所述病毒載體能夠複製和表達異源核酸序列.更優選所述異源核 ,列編碼不同蛋白質.甚至更優選所述不同的蛋白質為異源寡聚蛋白質
的亞基。為了確定病毒載體究竟是竟爭性或非竟爭性的，可以測量植物細
胞的共轉染頻率。這可以通過以下方案完成用兩種不同的報告基因，例 如DsRed和GFP標記兩種病毒載體。將所述不同標記的載體共傳遞(例如 經由農桿菌浸潤)i^A植物葉組織，並且在3-6天之後對從感染區域分離
報告基因的原生質體數的比率。在實施例2和4中描述了證明這樣的測量 的實驗(也見圖1A和9)。通常，非竟爭性病毒載體可以衍生自協同的病毒， 例如能夠成功的共轉染相同植物宿主的病毒。這樣的協同的RNA病毒對 的實例包括
馬鈴薯病毒X (PVX)/菸草花葉病毒(TMV);
PVX/菸草脈斑駁病毒(TVMV);
PVX/菸草蝕紋病毒(TEV);
PVX/三葉草黃脈病毒(CIYW);
PVX/李痘病毒(PPV); PVX/馬鈴薯病毒Y (PVY),
病毒載體的竟爭或非竟爭性機制的原因未知。 一個可能的解釋是由協
(VRC) (Kawakami等人，2004，戶腦7Vfl汰爿cd Sci t/5^， 101 ， 6291-6296)，因此它們不彼此竟爭形成VRC所需的空間。如實驗所確定， 非竟爭的病毒栽體可以衍生自在其核酸序列水平上顯著不同的不同病毒 種。所述非竟爭性病毒栽體可以衍生自能夠成功共感染相同植物宿主的協 同性植物病毒，協同性病毒通常屬於不同的屬。例如PVX屬於馬鈴薯X 病毒屬，而與其協同的病毒例如TVMV、 TEV、 PPV和CIEW屬於馬鈴 薯Y病毒屬。與PVX病毒協同的其它病毒(非竟爭性)例如TMV、 TVCV 和crTMV屬於菸草花葉病毒屬。顯然，在不同屬的代表之間基因組同源 性相當低，通常在RNA水平上低於50 %同 一性。
在實施例5中描述了將單克隆抗體的重鏈和輕鏈克隆進不同病毒栽體 (例如基於PVX和TMV的病毒載體)，接著在共感染的植物組織中進一步
共表達所述鏈。在圖10中顯示了載體的示意圖。在該栽體幫助下產生的單 克隆抗體產量與其它表達系統相比較的ELISA測量表明基於兩個非竟爭 性病毒載體的所述系統的最佳執行(圖11)。現有技術中在病毒載體幫助下 在植物細胞中有^達重組異源寡聚蛋白質尚未知。
根據我們的數據，病毒栽體的病務時生的序列應該不呈現使所述病毒 與其它病毒之間的顯著需要考慮的同源性。這樣病毒的實例是病毒對TMV 和PVX以及基於其的病毒載體。這些病毒栽體並未呈現這樣的同源性。 選擇可接受的病毒對的另一要求可以是在共感染植物宿主期間原始野生型 病毒的協同性。
使用瞬時表達系統基於農桿菌介導將DNA前體傳遞i^A植物細胞來 完成以上討論的實驗。然而，本發明備選的應用是用於以所述RNA複製 子的DNA前體穩定摻入植物核染色體的轉基因植物。這使能夠克服基於 植物病毒栽體系統的許多局限，例如對病毒栽體可容忍的異源序列最;U^ 寸的限制。由於DNA前體將存在於轉基因植物的每個細胞中，RNA複製 子的系統移動或細胞至細胞的移動(複製子擴^t)不是必需的。這可以由高 效率的形成本發明的RNA複製子和轉運其^01&質而得到##.然而， 由於RNA複製子的形成並非總是發生在全部細胞中，栽體的細胞-至-細胞移動的能力可以有額外的價值。
可以使用不同方法向植物、植物組織或植物細胞提供異源DNA.可以 通過由農桿菌攜帶的Ti-質粒栽體(US 5，591，616; US 4,940,838; US 5,464,763)或顆粒或微粒轟擊(US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616Bl)將所述載體轉化進入植物細胞。還可以使用其它植物轉化方 法，例如顯微注射(WO 09209696; WO 09400583A1 ; EP 175966B1)、電穿 孔(EP00564595B1 ; EP002卯395B1 ; WO 08706614Al)或PEG介導的原生 質體轉化等。可以由要轉化的植物物種決定選擇栽體傳遞的方法.例如， 通常優選微粒轟擊用於單子葉轉化，而對於雙子葉，通常農桿菌介導的轉 化效果^^好。
在本發明的實例中，我們使用瞬時農桿菌介導的傳遞使栽體(所述異源
DNA)ii^菸草細胞。然而，可以根據適於目的植物物種的穩定轉化或瞬時 轉化的任何標準技術將所述載體穩定的導入植物。雙子葉的轉化技術是本 領域眾所周知的，且包括基於農桿菌的技術和不需要農桿菌的技術。非農 桿菌技術涉及由原生質體或細胞直接攝取外源遺傳物質。這些技術包括 PEG或電穿孔介導的攝取、顆粒轟擊介導的傳遞和顯微注射。這些技術的 實例描述在Paszkowski等人，^Afl 0/2， 2717-2722 (1984)， Potrykus等人， MoT. (7ewet !22a 169-177 (1985)， Reich等人，Biotechnology
4:1001-1004 (1986),和Klein等人iVa似w gl， 70-73 (1987).在各個情況下 使用標準技術將轉化的細胞再生為整個植物。
因為農桿菌介導的轉化技術具有高轉化效率且廣泛的適用於多種不同 物種，優選用該技術轉化雙子葉植物。可以通it^桿菌常規轉化多種作物 物種，包括菸草、番痴、向日葵、棉、油菜、馬鈴薯、大豆、苜蓿和楊樹 (EP 0 317 511 (棉)、EP 0 249 432 (番茄)、WO 87/07299 (白菜)、美國專利 4,795,855 (楊樹))。
在本發明的實例中，使用農桿菌介導的T-DNA傳遞用於目的基因的 瞬時表達。這一方法不僅對於小，至中規模的重組蛋白生產系統，而且 對於大MJI表達都是非常有用的工具。
使用可誘導的或伶阿其它受調節的(例如發育調節的)啟動子可以達到 對穩定摻入植物染色體DNA的病毒複製子前體的釋放。根據其誘導條件， 可以將可誘導的啟動子分為兩類由非生物因子(溫度、光、化學物質)誘 導的那些和由生物因子，例如病原體或害蟲侵襲誘導的那些.第一類的實 例為熱誘導(US 05187287)和冷誘導(US05847102)的啟動子、銅誘導系統 (Mett等人，1993， iVfl汰爿caw/. Sd，巡，4567- 4571)、類固醇誘導系統 (Aoyama和Chua， 1997，屍/fl"f / ， U， 605-612; McNellis等人1998， iV"W丄， 14， 247-257; US06063985)、乙醇誘導系統(Caddick等人，1997， iVfl似w J5iV tecA.，仏177-180; WO09321334)和四環素誘導系統(Wdnmami等人， 1994，屍/flW /.，五559-569)。在植物的化學誘導系統領域，最近的;SLH之一 是嵌合啟動子，其可以由糖皮質激素地賽米鬆開啟並且由四環素關閉 (Bohner等人，1999，外flW/.， 19， 87-95)。關於化學誘導系統的綜述見Zuo 和Chua， (2000， O/w".必fW"/r/K /" 11， 146-151)和Padidam， M
(2003，O/w". /，to"/醜iW.， & 169-177)。可誘導啟動子的其它實例是控制 植物中的致病相關(PR)基因表達的啟動子。可以通過用水楊酸(其為植物信 號通路中應答病原體攻擊的重要組分)或能夠引起PR基因表達的其它化合 物(1，2，3-苯並噻二唑或異煙酸)(US05942662)處理植物來誘導這些啟動子。 本發明不限於在實施例中所逸基於TMV和基於PVX的栽體，而是可 以應用於衍生自其它植物RNA病毒的複製子，使建立由所述病毒複製子 衍生的表達系統。已知對於病毒對PVX/PVY在共感染植物中的協同性研 究得最好(Rochow和Ross， 1955， FiVyi/o^, L_10-27; Goodman和Ross， 1974， 柳,58,16-24)。很可能那些病毒許多可以在相同植物細胞中共複製， Dietrich和Maiss (2003， <7ew. Fiiv/:，払2871-2876)已表明不同標記的病 毒對，例如李痘病毒(PPV)和馬鈴薯病毒X (PVX)、菸草脈斑駁病毒(TVMV) 和PVX、三葉草黃脈病毒(CIYW)和PVX可以在植物組織的相同感染區
共表達不同的報告基因.可以使用本發明所述策略itJL重組異源寡聚蛋白
質表達系統，用於能夠在相同植物細胞中共複製的幾乎任何植物正義單鏈
RNA病毒衍生的複製子對.例如，在本發明中可以使用基於苜蓿花葉病毒 屬的苜蓿花葉病毒(AMV)的病毒栽體。
可以使用本發明在植物或植物細胞中表達編碼複合(異源寡聚)蛋白的 目的基因、其片段(功能性或非功能性)及其人工衍生物和融合。使用本發 明可以產生並純化多種有商業價值的異源寡聚蛋白質類群.那些類群包括
然而，最優選免疫應答蛋白類群，特別是選自不同類免疫球蛋白(IgG、IgM、 IgA和IgD)的單克隆抗體和它們的合成衍生物(如突變體類型以及與其它 蛋白質或其部分的不同類型的融合).
具體實施例方式
提出下列實施例以說明本發明。可以做出修改和變化而不背離本發明
的精神和範圍。 實施例1
eM^f孩參i A^ 7MK辨J AL4病毒裁舉犮,
G屍屍々/)s及"付^4這
用由相同植物RNA病4^f生的但是含有兩個不同目的基因的兩個基 於TMV的RNA病毒栽體感染葉組織(圖1)。我們4吏用克隆在基於TMV 病毒栽體中的可視標記基因GFP和DsRed來測試這一方法。第一構建體， plCH17272 (見Marillonnet等人2005， 7V抓^ 718-723的圖 1)，含有GFP，並且除了在栽體的RdRP編碼序列含有9個而非14個植物 內含子之外，與plCH18711 (見國際專利申請PCT/EP03/12530，作為 WO2005049839公布；Marillonnet等人，2005， iVflt J iofecA朋/:， 23,718-723) 相似，plCH18722 (MariUonnet等人2005， iVflt歷otecA朋/:， 718-723)構 建在兩個密切相關的菌林TMV、 Cr-TMV(Dorokhov等人1994， FfAS1 ￡欲. 350,5-8)和TVCV (Lartey等人1994， J/ cA. Fi'iv/:逃287-298)的骨架上， 並且含有在植物啟動子控制之下的病毒基因組，由異源序列代替包被蛋白 序列.在RdRP和MP中存在的11個內含子增加了在農桿菌介導栽體傳 遞進入葉組織之後病毒複製的起始效率，並且因此增加了兩個栽體在相同 細胞中的共表達的概率。plCH18505與plCH17272相似，除了其GFP編 碼序列已經由使用Xhol -Notl P艮制位點的DsRed的編碼序列代替(圖1)。 在圖1C中顯示plCH18505和plCH17272的T-DNA區詳細的限制圖諳. 在農桿菌菌林GV3101中轉化plCH17272和plCH18505，並且如先前所述 (Marillonnet等人，2004， /Vvc. iVa汰5*" C/A4，巡，6852-6857)浸潤本 氏菸草葉組織。從浸潤後7天(dpi)的浸潤區製備原生質體並且在顯微鏡的 藍光或紅光下觀察.即使對於從數天之後的浸潤區製備的原生質體，很少 有原生質體同時表達GFP和DsRed (圖1A).這說明一旦細胞^於TMV 的第一病毒栽體感染，它不能故基於TMV的第二載體再次感染。
4々卓個4#復浙子^ G/T々Z)s及^/ ^兵4這
由RNA病毒栽體表達的兩個目的基因在兩個分別的亞基因組啟動子 控制下(圖2)。兩個亞基因組啟動子可以是相同的，但是為了避免在病毒復 制期間構建體中重複序列之間缺失的風險，優選使用來自相關TMV菌林 的亞基因組啟動子；在這一情況下，第二亞基因組啟動子和3，非翻譯區來 自TMGMV菌株U5 (Shivprasad等人，1999， F,Vvfegj，逛，312-323; MariHonnet等人，2004， ZVvc. Wfl汰爿cfli/. 5W. t/5^4， 1Mi 6852-6857)。而且， 為了克隆方便，在病毒前載體(如在WO02/088369所述和由Marillonnet 等人2004， 7Vfl汰Sd f/5L4， 6852-6857所述)而非完整組裝 的載體中克隆GFP和DsRed。通過在植物中前栽體構件之間的位點特異 性重組，將兩個前栽體plCH17388和plCH15933 (圖3)轉化為完整功能的 基於TMV的病毒栽體。除了在病毒序列中存在11個內含子(如在 plCH17272)， plCH17388與plCHNOP (Marillonnet等人2004，7Va汰 爿cflA <75^4， 101 , 6852-6857)相似.除了 TMGMV U5的編碼序列由 DsRed的編碼序列代替，plCH15933與plCHGFPSYS (MariHonnet等人 2004， iVY c. iVfl汰爿cflrf. 巡，6852國6857)相同，
在農桿菌菌株GV3101中轉化plCH15933並且與plCH17388和 pICH10881(圖3)—起浸潤本氏菸草葉.浸潤5天之後，所有表達GFP的 焦點也表達DsRed，顯示出兩個基因在相同植物細胞中極好的共表達(圖 4)。
實施例3
^《卓個4毒度賴子好戎沐4這
在plCH15933中，GFP和DsRed的編碼序列分別由IgG抗體的輕鏈 和重鏈代替，產生構建體plCH20241 (圖5).作為對照，將輕鏈和重鏈克 隆在基於TMV的前栽體代替plCH1740的編碼序列，產生構建體 plCH20421和plCH20431 (圖5)。將plCH20241與plCH17388和 plCH10881(圖3)—起共浸潤本氏菸草葉。
將辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人IgG兔抗體(Sigma)以1: 6000稀 釋用於對從浸潤葉提取的可溶總蛋白質執行Western印跡分析。在圖6A 中顯示該分析的結果。顯然，使用單個病毒載體獲得的抗體表達水平(6和 7道，圖6)顯著高於使用強組成型啟動子甚至在PTGS阻抑基因P19的存 在下獲得的抗體水平(3 - 4道，圖6)。
實施例4
炎^差:f 7MK和P^Y病辜我沐W( /T^Z)si ^/
共表達兩個基因的其它策略是使用構建在不同病毒上的分開的病毒載 體，所述不同病毒可以共感染相同細胞並在其中複製。作為實例，基於馬 鈴薯病毒X (PVX)的病毒載體可以與TMV在相同細胞中共存。在圖7中 顯示兩個這樣的非竟爭性病毒栽體的示意圖。
從德國微生物和細胞培養物保藏所(DSMZ)獲得作為感染的幹葉物質 的PVX接種物(菌林PV0014)，並且用於接種本氏菸草植物。使用呈現病 毒症狀的接種植物的體系葉製備總RNA.使用引物pvxpr2、 pvxpr4和 pvxpr6製備第 一鏈cDNA。使用Pfu-Taq聚合酶混合物，通過PCR從PVX cDNA擴增三個cDNA片段
使用下列引物擴增片段l:
Pvxprl : ttt ggtctc a tgaa gaaaactaaaccatacaccaccaacacaac (SEQ ID NO: 1)
Pvxpr2: ctttttccagcccggagaccatttctgtgatgg (SEQ ID NO: 2) 用Bsal消化片段l。
使用下列引物擴增片段2:
Pvxpr3: ttt cgtctc a gggctggaaaaagaggacttccctgaagg (SEQ ID NO: 3) Pvxpr4: gagtcgtctcctgcataaacttgagcag (SEQ ID NO: 4) 用Esp31消化片段2。
使用下列引物擴增片段3:
Pvx5: ttt gaagac aa tgcaggagacgactccgcactgg (SEQ ID NO: 5) Pvx6: eg gacgtc tttttt腦ttttttttttttt
atttatattattcatacaatcaaaccagaaaatac (SEQ ID NO: 6) 用BpilAatll消化片段3。
片段4含有擬南芥肌動蛋白2基因啟動子(An等人，1996， /V朋f 10, 107-121)，使用以下引物從擬南芥基因組DNA擴增
Act2prl: ttt acgcgt ttcgacaaaatttagaacgaacttaattatg (SEQ ID NO: 7) Act2pr2: ttt ggtctc a ttca ttcaaagcggagaggaaaatatatg (SEQ ID NO: 8) 用Mlul和Bsal消4t片段4。
作為擬南芥肌動蛋白2啟動子的^^選，也使用CaMV 35啟動子驅動 基於PVX的病毒栽體的轉錄(見圖10D， plCH20788; plCH21380)。使用的 製備基於PVX載體的通用策略如Baulcombe及其同事所述(1995, /VflW /離wfl/， 2:1045-1053).
將全部四個片段一起克隆在使用Mlul和Aatll消化的雙元栽體中。在 ;Mt菌菌林GV3101中轉化產生的構建體的20個克隆，並且使用每個克隆 浸潤本氏菸草植物的一個葉片. 一周之後，由表型篩選具有病毒感染症狀 的本氏菸草，並且保留陽性的質粒克隆(plCHPVX)。
從這一完整的功能性cDNA製備克隆栽體用於在CP亞基因組啟動子 的下遊克隆目的基因.克隆GFP基因作為實例。將在CP亞基因組啟動子 區的ATG突變為AGG (在Genbank登錄號M95516位置5651),將GFP 基因克隆在Nhel位點的3，(相當於5662至5667)。 PVX的3，末端(相當於 5618至6435)克隆在GFP序列的下遊，並且接著該序列的是12至24個A 的一段序列。通it^桿菌浸潤使此構建體(plCH0130，圖8)進入本氏菸草 葉。浸潤二至三天之後在浸潤區出現GFP螢光。幾天之後出現GFP的系 統移動。
將plC0130與提供DsRed表達的栽體plCH17388、 plCH10580和 plCH10881 (圖3)—起共浸潤進入本氏菸草葉。共浸潤6天之後，從浸潤區 製備原生質體並且在顯微鏡的藍光下觀察。幾乎全部的原生質體同時表達 GFP和DsRed，表現出極佳的共表達水平(圖9)。
實施例5
7MK付戎沐4這卓義發戎^
將IgG的重鏈和輕鏈克隆在PVX栽體中，代替在plC0130中的GFP 編碼序列，產生兩個構建體，plCH21240和plCH21370，其分別含有重鏈 或輕鏈(圖10 A).還構建了含有抗體輕鏈或重鏈的TMV前栽體部分的克 隆(plCH20431和plCH20421 ，圖10A).使用於>^於PVX和TMV的栽 體表達兩個不同鏈的農桿菌混合物浸潤本氏菸草葉並且在接種10天後通 過ELISA測量抗體的表達水平。結果(圖11 )顯示在基於PVX和TMV的 栽體共表達重鏈和輕鏈的情況下組裝的功能性抗體的極高水平。其水平顯 著高於從同時表達兩個鏈的TMV栽體所獲得的(實施例3).
另夕卜，將屬於IgGl亞類的另一人肺瘤特異性單克隆抗體，抗癌mab 亞克隆在基於TMV和PVX的載體中，步驟如下將含有抗癌mab輕鏈 編碼序列的730 Ncol-Notl片段在Notl位點平端化並且連接在基於TMV 的3，構件克隆栽體plCH11599 (圖10B)(該栽體用Ncol-Xbal切開並Xi Xbal位點平端化)，連接後產生plCH21910 (圖10B).使用相同的策 M^ 1421 bp的Ncol-Notl片段與抗癌mab重鏈編碼序列亞克隆進入pICH11599 (圖IOB)產生pICIMlMO (圖IOB)構建體.在基於TMV的3，構件克隆栽體 plCH10990 (圖IOC)的基礎上產生表達GFP的基於PVX 3，構件的 plCH21282(圖IOC)。通過將GFP編碼序列插入plCH109卯(圖IOC)和接 著用PVX的3，非翻譯區代替TMV的3，非翻譯區完成幾個克隆步驟。類 似的，通過使用PVX的3，非翻譯區代替TMV的3，非翻譯區將基於TMV 的3，前栽體構件plCH21920 (圖10B)轉化i^v基於PVX的3，前栽體構件 plCH22250 (圖IOC)。將在HindlH位點平端化的plCH21282 (圖IOC)的575
bp Hindlll-Ndel片段與Sail位點平端化的plCH21920的Sall-Ndel片段連 接。將含有抗癌mab輕鏈編碼序列的723 bp Ncol-EcoRI片段亞克隆在使 用Ncol-EcoRI消化的plCH22250 (圖IOC)中，產生plCH22240 (圖IOC)。 5，前載體piCH21380 (圖IOD)按照以下方法製備使用構建體 plCH17388 (圖3B)作為模板，在引物pv5p5F (SEQ ID NO: 9) (5， cagctagcaa caaacaagaa aggtaagttt c-3')和pv5p5R (SEQ ID NO: 10) (5'醫 tctgagctctgcatgctacgcccccaactgagag-3')幫助下PCR擴增該片段，用Nhel 和Sacl限制內切酶消化，並與plCH20788的大的Nhel-Sacl片段連接， 用內含子的5，端和AttP重組位點代替PVX栽體的3，部分。在圖10D中顯 示克隆的示意圖。使用5，前栽體和3，前載體的策略在植物中經由位點特異 性重組組裝病毒栽體在先前已有描述(Marilloniiet等人2004， 7Vfl汰 爿caA Sd U5^4， 101 :6852-6857)。
訪絲與靜
使用標準電穿孔方案將所有產生的構建體在農桿菌菌林GV3101中轉 化並且進一步用於本氏菸草葉的農桿菌浸潤.將過夜生長的4Uf菌培^ (OD咖範圍從1.8至2.5)等量混合併且在6000g離心3分鐘獲得沉澱。將沉 澱重懸浮於含有10 mM MES (pH 5.5)和10 mM MgS04的溶液中，產生對 於每種單獨的培養物的10"稀釋。通過使用無針頭的注射器使溫室生長的 本氏菸草植物的6-8周齡葉受到浸潤.在使用前載體用於農桿菌浸潤的情 況下，；Mf菌混合物通常帶有5種不同的農桿菌菌抹，每種提供下列組分 之一重組酶(整合酶)來源(plCH10881); 5'PVX前栽體(plCH21380);提 供IgG鏈之一的一個3， PVX前栽體(由TMV前栽,供的互^h^決定， 或者提供重鏈的plCH22250或者揭_供輕鏈的plCH22240); 5， TMV前栽體 (plCH17388); —個3'TMV前栽體(編碼輕鏈的plCH21910或編碼重鏈的 plCH21920)
X/XS-^丙雄^t^^泳養『gsfew伊逐
將以農桿菌浸潤的100 mg本氏菸草葉樣品在液氮中研磨，使用300 p 1蛋白質提M^衝液((U M Tris、 150 mM NaCl和0.1 %吐溫20， pH 8.0)。 使用SDS-聚丙烯醯胺皿電泳的緩衝液系統將葉的粗提物在10%(非還原 IH中)或12%(還原條件)的聚丙烯醯胺:^中分離，接著通過考馬斯亮蘭染 色。對於Western印跡分析，使用印跡緩衝液(25 mM Tris、 192mM甘氨 酸、20%曱醇，pH 8.3)將來自SDS-聚丙烯醯胺凝膠的蛋白質電轉移至 Hybond P膜(Amersham Biosciences,英國)。在TBST (50 mM Tris、 100 mMNaCl、 0.05 %吐溫20， pH7.4)中用5%脫脂牛奶封閉膜，並且用山羊抗 人入輕鏈HRP綴合抗體(Sigma，英國)或山羊抗人IgG y鏈特異性HRP綴 合抗體(Sigma，英國)作為探針檢測，所述抗體在2.5%脫脂牛奶/188中以 1: 10000和1: 5000分別稀釋。使用ECL檢測試劑(Amersham Biosciences, 英國)檢測結合的抗體.在圖11B中顯示電泳分離和Western印跡分析的 結果。與標準IgG的比^明在植物組織中單克隆抗體的產量達到每克新 鮮葉生物量0.2-0.35 mg。
遂浙射"做Mg6好為、岸
使用含有100 mM磷酸鈉、150 mM NaCl和0.05 %吐溫20 (pH8.0)的 緩衝液從接種農桿菌的本氏菸草葉區提取總可溶蛋白質。根據操作說明書， 使用A蛋白^ t珠(New England Biolabs，美國)對蛋白粗提物進行一步親和 純化，小M分離抗癌mab。在圖11B (B欄)顯示了帶有純化的植物衍生 Mab的考馬斯染色皿.
實施例6
炎^差於W戎琳4這爽伊遂潑,r^s^)
合成編碼牛FSH的a多肽(對應於GenBank登錄號No. NMj73卯l 的101-463編碼序列的核苷酸)和P多肽(對應於GenBank登錄號No. NM_174060的70-459編碼序列的核苷酸)的基因(cDNA)，所述基因側翼帶 有限制位點(對於FSH-ct和FSH- P亞基為5， Ncol- 3，EcoRl)，並將所g因代替IgG的重鏈和輕鏈編碼序列克隆在TMV前載體(由plCH11599衍 生的plCH20431，圖10B)和PVX載體(plCH21240)產生分別含有oc亞基和 P亞基編碼序列的兩個構建體，plCH-FSHA和plCH-FSHB(圖12)。製備 從基於PVX和基於TMV的載體表達兩種不同亞基的農桿菌混合物並如上 所述浸潤本氏菸草葉，接種10天之後使用可商購的FSH 二聚體特異性 (FSH 117)抗體通過ELISA測量異二聚體FSH的表達水平並且使用Tropix 化學發光系統(Tropix， Bedford, MA)檢測。
實施例7
炎l差:f rMK和PKY時戎琳4這JgM
使用編碼IgM輕鏈和J鏈的序列分別代替plCH 15933中GFP和 DsRed的編碼序列，產生plCH-MLCJ構建體(圖13)。將編碼IgM重鏈的 基因克隆在PVX栽體(plCH21240)代替IgG重鏈的編碼序列並且產生 plCH-MHC構建體(圖13)。使用從基於PVX和TMV的栽體表達IgM的 三個不同鏈的農桿菌混合物浸潤本氏菸草葉,接種10天之後使用可商購的 IgM特異性抗體通過ELISA測量異二聚體複合物的表達水平。
本發明要求其優先權的歐洲專利申請No, 05 001 819.1和美國專利申 請No. 60/593,606的內容在此被完整引入作為參考。
權利要求
1.在植物、植物組織或植物細胞中產生包含至少第一和第二蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括在植物細胞中通過以下方式表達至少所述第一和第二蛋白質亞基(i)向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞提供第一和第二正義單鏈RNA病毒載體，所述第一病毒載體編碼至少所述第一蛋白質亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質亞基，其中所述第一病毒載體和所述第二病毒載體是不同的病毒載體；或(ii)向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質亞基的正義單鏈RNA病毒載體。
2. 根據權利要求l的方法，接著從所逸法物、所M物組織或所ii^ 物細胞分離所述異源寡聚蛋白質.
3. 棉^據權利要求1或2的方法，其中編碼至少所述第一和所述第二蛋 白質亞基的所述RNA病毒栽體含有編碼所述第一蛋白質亞基的第一異源 序列和編碼所述第二蛋白質亞基的第二異源序列，其中所述第一和/或所述 第二蛋白質亞基的表ii^亞基因組啟動子的控制下.
4. 根據權利要求1或2的方法，其中編碼至少所迷第一和所述第二蛋 白質亞基的所述RNA病毒栽體含有編碼所述第一蛋白質亞基的第一異源 序列和編碼所述第二蛋白質亞基的第二異源序列，其中所述第 一和/或所述 第二蛋白質亞基的表達在IRES元件的控制下.
5. 根據權利要求1至4的任一項的方法，其中編碼至少所述第一和所 述第二蛋白質亞基的所述RNA病毒栽體缺少編碼所述病毒載體系統移動 功能性蛋白質的ORF。
6. 根據權利要求1或2的方法，其中所述第一病毒栽體含有編碼所述 第一蛋白質亞基的第一異源序列，而所述第二病毒栽體含有編碼所述第二 蛋白質亞基的第二異源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白質亞基的表 ^亞基因組啟動子的控制下。
7. 根據權利要求1或2的方法，其中所述第一病毒載體含有編碼所述 第一蛋白質亞基的第一異源序列，而所述第二病毒栽體含有編碼所述第二 蛋白質亞基的第二異源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白質亞基的表 MlRES元件的控制下。
8. 才艮據權利要求1至7的任一項的方法，其中編碼至少所述第一和所 述第二蛋白質亞基的所述病毒栽體、所述第 一病毒栽體和/或所述第二病毒 載體缺少功能性包被蛋白ORF、功能性移動蛋白ORF和/或組裝病毒顆粒 的功能性起點。
9. 根據權利要求1至8的任一項的方法，其中所述第一病毒載體衍生 自屬於馬鈴薯X病毒屬的病毒，而所述第二病毒栽體衍生自屬於馬鈴薯Y 病毒屬的病毒。
10. 根據權利要求9的方法，其中所述第一病毒栽體衍生自馬鈴薯病 毒X，而所述第二病毒栽體衍生自馬鈴著病毒Y.
11. 根據權利要求1至8的任一項的方法，其中所述第一病毒栽體衍 生自屬於馬鈴薯X病毒屬的病毒，而所述第二病毒栽體衍生自屬於菸草花 葉病毒屬的病毒.
12. 根據權利要求ll的方法，其中所述第一病毒載體衍生自馬鈴薯病 毒X，而所述第二病毒栽體衍生自菸草花葉病毒。
13. 根據權利要求1至12的任一項的方法，其中所述第一和所述第二 病毒栽體具有至多60%的序列同源性。
14. 根據權利要求1至13的任一項的方法，其中所述異源寡聚蛋白質 是抗體，
15. 根據權利要求1至14的任一項的方法，其中向所述植物、植物組 織或植物細胞瞬時提供所述病毒載體。
16. 根據權利要求15的方法，其中通it^桿菌轉染向所迷植物、植物 組織或植物細胞瞬時提供所述病毒栽體。
17. 根據權利要求1至14的任一項的方法，其中將所述RNA病毒載 體作為所述RNA病毒栽體的DNA前體穩定摻入植物染色體DNA。
18. 根據權利要求17的方法，其中通過可誘導的啟動子提供來自所述 DNA前體的所述RNA病毒載體的受控釋放。
19. 根據權利要求1至18的任一項的方法，其中至少所述第一或所述 第二蛋白質亞基具有植物特異性信號肽作為ER靶向信號。
20. 根據權利要求19的方法，其中所述植物特異性信號肽衍生自菸草 鉀網蛋白和/或稻oc澱粉酶。
21. 根據權利要求14的方法，其中所述抗體是包含至少部分的抗原結 合結構域的免疫球蛋白。
22. 根據權利要求14或21的方法，其中所述抗體包含與免疫球蛋白 重鏈締合的保護蛋白質，其中該保護蛋白質包含多IML疫球蛋白受體的部 分。
23. 根據權利要求14、 21或22的任一項的方法，其中所述抗體或其 衍生物屬於免疫球蛋白G類、免疫球蛋白A類、免疫球蛋白M類、免疫 球蛋白D類或免疫球蛋白E類。
24. 根據權利要求1至12的任一項的方法，其中所述異源寡聚蛋白質
25. 根據權利要求1至24的任一項的方法，其中所述異源寡聚蛋白質 的至少一個或至少兩個或多個亞基^^有內質網滯留信號KDEL。
26. 根據權利要求1至25的任一項的方法，其中突變所述異源核^列從而部分或全部M所述異源寡聚蛋白質除去糖基化位點。
27. 根據權利要求1至26的任一項的方法，其中改造所述植物、植物 組織或植物細胞以改變所述異源寡聚蛋白質的糖基化方式。
28. 根據權利要求1至27的任一項的方法，其中所迷植物是單子葉或 雙子葉植物。
29. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬於茄科.
30. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是菸草物種。
31. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是菸草或本氏菸草。
32. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬於十字花科。
33. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬於豆科。
34. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是紫苜蓿.
35. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物屬於藜科。
36. 根據權利要求28的方法，其中所述雙子葉植物是甜菜。
37. 在植物、植物組織或植物細胞中生產包含至少第一和第二蛋白質 亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括在植物細胞中從一個或多個 正義單鏈RNA病毒載體共表達至少所述第一和所述第二蛋白質亞基。
38. 在植物或植物組織中生產包含至少第一蛋白質亞基和第二蛋白質 亞基的抗體的方法，所述方法包括通過以下方式在植物細胞中表達至少所 迷第 一和所迷第二蛋白質亞基(i) 通過農桿菌介導的轉染向所逸法物、所述植物組織或所述植物細胞 提供第一正義單鏈RNA病毒栽體的DNA前體和第二正義單鏈RNA病毒 載體的DNA前體，所述笫一病毒栽體編碼至少所述第一蛋白質亞基，所 述第二病毒栽體編碼至少所述笫二蛋白質亞基，其中至少所述第 一病毒栽 體或所述第二病毒栽體缺少編碼所述第一或所述第二病毒栽體在所i^i物 中系統移動所需要的功能性蛋白質的開放閱讀框；或(ii) 通過農桿菌介導的轉染向所迷植物、所述植物組織或所祖物細 胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質亞基的正義單鏈RNA病毒栽 體的DNA前體，其中所述病毒栽體缺少編碼系統移動需要的功能性蛋白 質的ORF.
39. 在植物、植物組織或植物細胞中生產包含至少第一蛋白質亞基和 第二蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括通過向所述植物、所i^物組織或所述植物細胞提供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒栽 體，在植物細胞中表達至少所述第一和所述第二蛋白質亞基，所述笫一病 毒栽體編碼至少所述第 一蛋白質亞基，所述第二病毒栽體編碼至少所述第 二蛋白質亞基，其中所述第一病毒載體和所述第二病毒載體衍生自不同的 正義單鏈植物RNA病毒。
40. 在植物、植物組織或植物細胞中生產包含至少第一蛋白質亞基和 第二蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括通過向所述植物、所述植物組織或所#物細胞提供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒載 體在植物細胞中表達至少所述第一和所述第二蛋白質亞基，所述第一病毒 栽體編碼至少所述第 一蛋白質亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質亞基，其中所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體在除了編碼所述 第一和第二蛋白質亞基的序列部分之外的序列部分不同。
41. 在植物、植物組織或植物細胞中生產包含至少第一蛋白質亞基和 第二蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括通過向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞提供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒載 體在植物細胞中表達至少所述第 一和所述第二蛋白質亞基，所述第 一病毒 栽體編碼至少所述第 一蛋白質亞基，所述第二病毒栽體編碼至少所述第二 蛋白質亞基，其中所述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體衍生自屬於不同 種的正義單鏈RNA病毒。
42. 在植物、植物組織或植物細胞中生產包含至少第一和第二蛋白質 亞基的抗體的方法，所述方法包括通過向所述植物、所述植物組織或所述 植物細J!&H供至少第一和第二正義單鏈RNA病毒載體在植物細胞中表達 至少所述第一和所述第二蛋白質亞基，所述第 一病毒栽體編碼至少所述第 一蛋白質亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質亞基，其中所 述第一病毒栽體和所述第二病毒栽體是不同的病毒栽體.
全文摘要
在植物、植物組織或植物細胞中產生包含至少第一和第二蛋白質亞基的異源寡聚蛋白質的方法，所述方法包括通過以下方式在植物中表達至少所述第一和所述第二蛋白質亞基i)向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞提供編碼至少所述第一和所述第二蛋白質亞基的正義單鏈RNA病毒載體或ii)向所述植物、所述植物組織或所述植物細胞提供第一和第二正義單鏈RNA病毒載體，所述第一病毒載體編碼至少所述第一蛋白質亞基，所述第二病毒載體編碼至少所述第二蛋白質亞基，其中至少所述第一病毒載體和所述第二病毒載體是非競爭的病毒載體。
文檔編號C12N15/67GK101115842SQ200680003264
公開日2008年1月30日 申請日期2006年1月27日 優先權日2005年1月28日
發明者A·吉裡奇, S·馬裡約內, V·克利姆克, Y·格萊巴 申請人:愛康遺傳有限公司