一株假格裡尼翁蒼白桿菌及其防治植物寄生線蟲的應用的製作方法
2023-11-11 03:59:57
本發明總的涉及微生物領域，具體涉及一株假格裡尼翁蒼白桿菌及其在防治植物寄生線蟲的應用。
背景技術：
根結線蟲(Root-knot nematode,Meloidogyne spp.)隸屬於異皮科根結線蟲屬，是一類重要的土傳性病原物。迄今為止，已記錄的根結線蟲達100餘種，中國常見種類為南方根結線蟲(M.incognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)和北方根結線蟲(M.hapla)。根結線蟲分布地區廣泛，寄主複雜多樣，涉及糧食作物、油料作物、纖維作物、菸草、茶葉、果樹、蔬菜、藥材和花卉等3000餘種植物。其通過口針吸取植物營養，對植物地下根部，地上莖、葉和果實等造成極大危害，據估計植物寄生線蟲每年對世界農業生產造成的直接經濟損失高達1000億美元。近年來隨著中國農業產業結構的不斷調整，保護地蔬菜栽培面積擴大，寄主蔬菜種植密度和重、迎茬栽培模式增加，加之人為因素的影響導致蔬菜根結線蟲病害發生成災。據報導中國大約有50％的溫室蔬菜存在不同程度的根結線蟲危害，每年造成的經濟損失高達4億美元。目前，施用化學殺線劑仍是防治根結線蟲病害的主要措施，而由此帶來的環境及食品安全問題成為發展有機農業的主要障礙。大量的研究表明，利用自然界線蟲天敵微生物進行線蟲的生物防治及生態調控是控制線蟲病害最為安全、有效的措施，也是目前國內外植物病害防控的重要發展方向。
蒼白桿菌(Ochrobactrum spp.)屬於變形菌門、根瘤菌目、布魯氏菌科，是一類革蘭氏陰性細菌，專性好氧。目前該屬共描述18個種，其主要存在於植物根際土壤、工業重汙染土壤、汙泥和動、植物組織等環境。一些優良的蒼白桿菌菌株被運用於阿維菌素(胡秀虹， 黃劍.阿維菌素降解菌AW1-12的篩選與分類鑑定.西南農業學報，2013，26(2):583-586)和噻吩磺隆(Zhao,W.S.,Xu L.,Li D.Z.et al.,Biodegradation of thifensulfuron-methy by Ochrobactrum sp.in liquid medium and soil.Biotechnology Letter,2015,37:1385-1392)等有毒殘留物質的生物降解。同時也有一些蒼白桿菌菌株作為植物根際促生菌被報導，這些菌株可以產生吲哚乙酸(IAA)和ACC脫氫酶，還具有固氮、溶膦、溶鉀或螯合土壤鐵離子等功能，有利於豆角(ImranA.,Saadalla M.J.A.,Khan S.U.et al.,Ochrobactrum sp.Pv2Z2exhibits multiple traits of plant growth promotion,biodegradation and N-acyl-homoserine-lactone quorum sensing.Annals of Microbiology,2014,64:1797-1806)和黃瓜(Xu S.,Liu Y.,Wang J.J.,et al.,Isolation and potential of Ochrobactrum sp.NW-3to increase the growth of cucumber.International Journal of Agricultural Policy and Research,2015,3(9):341-350)等植物生物量的積累。但目前國內外利用蒼白桿菌進行植物病害生物防治的研究較少，特別是對蒼白桿菌優良生防菌株的殺線蟲活性評價及生防微生物菌劑(生物農藥或微生物肥料)的研發尚處於空白狀態。
技術實現要素：
本發明提供了具有高效殺線蟲活性的假格裡尼翁蒼白桿菌及其應用，解決了化學殺線劑對環境及食品安全帶來的問題，該菌株可高效殺滅植物寄生線蟲，且以其發酵菌體為活性成分製備的生防微生物菌劑對植物生長還具有促進作用。
本發明的一個方面，提供一株假格裡尼翁蒼白桿菌(Ochrobactrum pseudogrignonense)NC1，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.12154，保藏日期：2016年3月1日，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101。該菌株是通過大量篩選殺線蟲功能菌株試驗而獲得的一株蔬菜根結線蟲優良生防菌株，具有一定工業化生產潛力。
本發明的另一個方面，提供了所述的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1在防治植物寄生線蟲方面的應用。
本發明的再一個方面，提供了一種用於防治植物寄生線蟲且以假格裡尼翁蒼白桿菌NC1為活性成分的生防微生物菌劑(微生物肥料或生物農藥)。
以上所述的用於防治植物寄生線蟲的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1生防微生物菌劑的製備方法，包括如下步驟：
(A)將所述假格裡尼翁蒼白桿菌NC1進行發酵培養，再將培養物離心獲得濃縮發酵液；
(B)向所述濃縮發酵液中添加0.5-1％的海藻酸鈉(W/V)和0.5-1％(W/V)的殼聚糖；
(C)將菌液與草炭土和膨潤土的混合載體充分混勻，獲得固形物；所述菌液與所述草炭土和膨潤土的混合載體的重量比為1:2.5；
(D)將所述固形物風乾至含水量為15-25％時，進行造粒。
以上所述的製備方法，所述假格裡尼翁蒼白桿菌NC1的培養基成分及質量百分含量為：葡萄糖0.2-0.4％，胰蛋白腖1-1.5％、酵母粉0.3-0.6％、氯化鈉0.8-1.2％，餘量為水；
優選的，所述培養基的成分及質量百分含量為：葡萄糖0.35％，胰蛋白腖1％、酵母粉0.45％、氯化鈉1％，餘量為水。
以上所述的製備方法，所述培養基的pH為7.0，培養條件為28-30℃，搖床轉速180-200rpm/min，培養時間為36-48h。
以上所述的製備方法，所述離心的轉速為5000rpm/min，離心時間20min。
以上所述的製備方法，所述草炭土和膨潤土的質量比為9-9.5：0.5-1。
以上所述的生防微生物菌劑包含的有效菌數為2.3×108CFU/g。
以上所述的生防微生物菌劑在防治植物寄生線蟲和蔬菜促生方面的應用。
本發明提供了一株具有高效殺線蟲活性的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1及其生防微生物菌劑。基於12孔組培板生測試驗，對假格裡尼 翁蒼白桿菌NC1發酵液對南方根結線蟲的殺線活性進行綜合評價，試驗結果表明NC1菌株可能通過產生一些具有揮發性的殺線蟲活性物質抑制卵粒孵化和影響二齡幼蟲活性；以假格裡尼翁蒼白桿菌NC1發酵菌體為活性成分，草炭土和膨潤土混合物為載體，經載體吸附、風乾、造粒等工序製備出用於防治植物寄生線蟲的生防微生物菌劑，盆栽試驗結果表明，施用該微生物菌劑對南方根結線蟲的生防效果達62.5％，同時對番茄植株具有一定促生作用，且效果穩定。本發明製備的微生物菌劑可與其它殺線劑配合施用，具有一定增效作用，但需保證殺線劑對假格裡尼翁蒼白桿菌NC1無抑制作用。本發明具有殺線效果顯著、安全無害的特點，將在蔬菜根結線蟲的生物防治中發揮重要作用，具有良好的應用開發前景。
附圖說明
圖1為以假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)NC1發酵菌體為活性成分，草炭土和膨潤土為載體的生防微生物菌劑形態圖。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解本發明的方案以及其各個方面的優點。然而，以下描述的具體實施方式和實施例僅是說明的目的，而不是對本發明的限制。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。所有百分比濃度如無特別說明均為質量百分比濃度。
實施例一、假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)NC1的分離、純化、鑑定及保藏
本發明所述假格裡尼翁蒼白桿菌NC1分離自山東省沂南縣銅井鎮紅峪莊某菜田中健康番茄植株的根際土壤。新鮮的番茄根系放入車載冰箱臨時保存，帶回實驗室後用無菌水衝洗3-5min，以去除根系土壤，然後將根系剪成1cm大小根段，並轉移至均質機中，同時加 入100mL無菌水，破碎處理2min，根系破碎液經梯度稀釋後均勻塗布到NA培養基(牛肉浸膏3.0g，蛋白腖5.0g，葡萄糖2.5g，瓊脂18.0g，無菌水定容至1L，pH 7.0)，於28℃倒置培養48h，待長出單菌落後，用無菌牙籤挑至新鮮NA培養基上，進行分離、純化培養，將篩選得到的菌株命名為NC1。
通過顯微鏡和肉眼觀察NC1的菌落形態、最適生長溫度及色素產生情況等生物學特性；採用革蘭氏染色法對NC1菌株進行革蘭氏染色；對NC1菌株的接觸酶、氧化酶和吲哚乙酸等生化特性進行測定(東秀珠，蔡妙英等編著.常見細菌系統鑑定手冊.北京：科學出版社，2001)；利用Biolog GENⅢ微孔板測定NC1對不同類型碳源的利用情況和對部分抗生素的耐受性；提取細菌總DNA，採用細菌的通用保守引物(27F 5』-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』和1492R5』-GGCTACCTTGTTACGACTT-3』)擴增16S r DNA序列，將測序得到的16S r DNA序列(如序列表SEQ ID NO：1所示)遞交NCBI的GenBank資料庫進行比對，確定NC1菌株分類地位；NC1菌株用含NA培養基的試管斜面進行短期保藏，用30％甘油低溫凍存法長期保藏。
結果表明，NC1菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈球狀至短杆狀，長1-1.5μm，以周生鞭毛運動。專性好氧，最適生長溫度為26-30℃。在營養瓊脂上培養48h，直徑達1-2mm，菌落微隆起，表面光滑，無色，易挑起，不產色素。接觸酶、氧化酶陽性，吲哚乙酸陰性。可以利用α-D-葡萄糖、D-果糖和D-巖藻糖作為糖類碳源。D-絲氨酸和L-天門冬氨酸陽性，甘氨酸-L-脯氨酸和L-精氨酸陰性。D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸內酯、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛醯胺、α-酮戊二酸、L-蘋果酸和乙酸等羧酸類碳源陽性，L-乳酸和乙醯乙酸為陰性。對乳酸鈉、醋竹桃黴素、利福黴素、鹽酸胍、萬古黴素、氯化鋰、亞碲酸鉀、丁酸鈉和溴酸鈉等具有一定耐受性。NC1菌株16S rDNA序列與假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)(Accession No.KT005456)的同源性達100％。
基於以上形態和分子序列特徵，將NC1菌株鑑定為假格裡尼翁 蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)，GenBank序列登陸號為KC454031，並於2016年3月1日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12154。
實施例二、假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)NC1殺線蟲活性評價
1、平板菌種的培養
將上述實施例1篩選得到的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1從試管斜面中轉接至NA培養基，於28℃培養48h，獲得平板菌種。
2、液體發酵培養
液體發酵培養基成分及質量百分含量為：葡萄糖0.35％，胰蛋白腖1％、酵母粉0.45％、氯化鈉優選1％，用水定容至1L，所述百分含量均為質量百分含量，pH優選7.0。
將上述步驟1獲得的平板菌種接種到裝有30mL液體培養基的250mL三角瓶中，於28℃180rpm/min條件下培養12h獲得種子液。然後按2％的接種量將種子液接入200mL培養基中，培養48h獲得發酵液，分別用無菌水稀釋5倍和10倍獲得稀釋發酵液備用；將發酵液按10000rpm/min離心10min去菌體，收集上清液並用0.22μm微孔濾膜過濾獲得發酵濾液，分別用無菌水稀釋5倍和10倍獲得稀釋發酵濾液備用；將部分稀釋發酵濾液分別用60℃和100℃水浴處理30min備用；NC1菌體用無菌水衝洗一次，獲得菌體懸液並用血球計數板計數，然後將菌體懸液用無菌水調成濃度分別為1010CFU/mL、109CFU/mL和108CFU/mL的菌體懸液備用。
3、假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)NC1對南方根結線蟲(M.incognita)殺線活性評價
南方根結線蟲採自本實驗室溫室中被南方根結線蟲侵染的番茄病根，洗淨根表土後切取帶有大量根結的根部，用解剖鑷子從病根上挑取新鮮、飽滿、成熟的卵塊。將卵塊放於1％次氯酸鈉溶液中處理1min，然後過500目網篩，並以無菌水反覆衝洗，將一部分卵粒用無菌水調成200卵/50μl的卵懸液備用；其餘卵粒放於含少量無菌水 的線蟲孵化器上，置於25℃條件下孵化一周，每天收集南方根結線蟲的二齡幼蟲，並用無菌水調至200條二齡幼蟲/50μl的二齡幼蟲懸液備用。
1)假格裡尼翁蒼白桿菌NC1對南方根結線蟲卵粒孵化的影響
試驗共設置12個處理：發酵液處理(原液、5×和10×稀釋共3個濃度)、發酵濾液處理(原液、5×和10×稀釋共3個濃度)、發酵濾液水浴處理(60℃水浴30min和100℃水浴30min共2個處理)、菌體懸液處理(1010、109和108CFU/mL共3個濃度處理)和無菌水對照，每處理設置3次重複。
將1mL各處理液體分別加入12孔組培板(共四列，本實施例分別命名為A、B、C、D列，每列三孔)A列的3個孔內，同時向B列的3個孔內加入1mL ddH2O，以檢測本發明所述假格裡尼翁蒼白桿菌NC1發酵液是否可以通過產生揮發性殺線活性物質的方式影響B列中南方根結線蟲卵粒的活性。向12孔組培板的A列和B列每孔接種50μl上述製備的南方根結線蟲卵懸液(200卵/50μl)，12孔組培板放於25℃培養箱中，10d後觀察並記錄各處理中南方根結線蟲卵的孵化數量，分別計算卵孵化率和卵校正死亡率，結果如表1所示。
卵孵化率(％)＝孵化二齡幼蟲數量/卵粒總接種數量×100％
卵校正死亡率(％)＝(處理組未孵化卵數量-對照組未孵化卵數量)/(1-對照組未孵化卵數量)×100％
表1本發明假格裡尼翁蒼白桿菌NC1對南方根結線蟲卵孵化的影響
採用統計學軟體SPSS 19.0對不同處理中卵孵化率進行單因素方差分析，a-e表示P＝0.05水平下各處理間的差異顯著性，a-e從大到小排列，處理間差異不顯著的先以a表示，直至某一個處理與之達到顯著性差異則標b，以此類推；a表示在P＝0.001水平下，12孔組培板列A中各處理的卵孵化率與列B中各處理的卵孵化率間相關性分析。
結果表明，本發明所述假格裡尼翁蒼白桿菌NC1發酵液和發酵濾液的原液和5倍稀釋液處理的南方根結線蟲卵孵化率均顯著低於對照組，同時可以影響12孔組培板列B中南方根結線蟲的卵粒孵化率；而各濃度的NC1菌體懸液對南方根結線蟲卵孵化率和對照組間無顯著性差異；發酵濾液經60℃和100℃處理30min後，並沒有失去對南方根結線蟲卵孵化的抑制效果；相關性分析結果表明，12孔組培板列A和列B間各處理的卵孵化率呈極顯著相關，說明列A中各處理對列B各處理中的卵粒孵化有極顯著影響；綜合以上現象說明，本發明所述的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1菌體本身對南方根結線蟲卵粒孵化沒有影響，而更可能是通過其發酵液中一些具有揮發性的殺線蟲活性物質抑制卵粒孵化。
2)假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)NC1對南方根結線蟲(M.incognita)二齡幼蟲活性的影響
試驗處理與上述步驟3中1)相同，將1mL各處理液體分別加入12孔組培板A列的3個孔內，同時向B列加入1mL ddH2O。向每孔接種50μl上述製備的南方根結線蟲二齡幼蟲懸液(200條二齡幼蟲/50μl)，12孔組培板放於25℃培養箱中，48h後觀察並記錄各處理中南方根結線蟲二齡幼蟲活性，計算二齡幼蟲死亡率和校正死亡率，結果如表2所示。
線蟲死亡率(％)＝死亡二齡幼蟲數量/二齡幼蟲總接數量×100％
二齡幼蟲校正死亡率(％)＝(處理組線蟲死亡數量-對照組線蟲死亡數量)/(1-對照組線蟲死亡數量)×100％
表2本發明假格裡尼翁蒼白桿菌NC1對南方根結線蟲二齡幼蟲死亡率的影響
採用統計學軟體SPSS 19.0對不同處理中二齡幼蟲死亡率進行單因素方差分析，a-d表示P＝0.05水平下各處理間差異顯著性，a-d從大到小排列，處理間差異不顯著的先以a表示，直至某一個處理與之達到顯著性差異則標b，以此類推；a表示在P＝0.001水平下，12孔組培板列A中各處理的二齡幼蟲致死率與列B中各處理的二齡幼蟲致死率間相關性分析。
結果表明，本發明所述的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1發酵液和發酵濾液對南方根結線蟲二齡幼蟲的致死率均顯著高於對照組，同時可以影響12孔板列B中南方根結線蟲二齡幼蟲的活性；而各濃度的NC1菌體懸液對南方根結線蟲二齡幼蟲的活性與對照組無顯著性差異；發酵濾液經60℃和100℃處理30min後，發酵濾液對南方根結線蟲二齡幼蟲的致死率仍顯著性高於對照組；相關性分析結果表明，12孔組培板列A和列B間二齡幼蟲的致死率呈極顯著相關，說明12孔組培板列A各處理對列B各處理中的二齡幼蟲活性有極顯著影響；綜合以上現象說明，本發明所述的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1菌體本身對南方根結線蟲二齡幼蟲的活性沒有影響，而更可能是通過其發酵液中產生一些具有揮發性的殺線蟲活性物質影響二齡幼蟲活性。
實施例三、假格裡尼翁蒼白桿菌(O.pseudogrignonense)NC1生防微生物菌劑對南方根結線蟲(M.incognita)的防效評價
1、本實施例中所用的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1生防微生物菌劑的製備
(A)將假格裡尼翁蒼白桿菌NC1進行發酵培養，培養基配方及發酵條件同實施例二中步驟2。
將培養物離心獲得濃縮發酵液，離心的轉速為5000rpm/min，離心時間20min。
(B)向所述濃縮發酵液中添加0.5-1％的海藻酸鈉(W/V)和 0.5-1％(W/V)的殼聚糖；
(C)將菌液與草炭土和膨潤土的混合載體充分混勻，草炭土和膨潤土的質量比為9-9.5:0.5-1，獲得固形物；菌液與所述草炭土和膨潤土的混合載體的重量比為1:2.5；
(D)當固形物風乾至含水量為15-25％時，進行造粒，獲得生防微生物菌劑。
2、本實施例製備的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1微生物菌劑對番茄根結線蟲的防治
盆栽試驗用土採自北京市密雲縣季莊村某溫室(土壤全氮含量2.84g/kg，有效磷含量459mg/kg，速效鉀含量199mg/kg，有機質含量39.1g/kg，pH 7.2)，土壤過10目(2mm)網篩，水分調至15％左右，121℃滅菌1h後備用。盆栽防效試驗共設置四個處理：處理一：假格裡尼翁蒼白桿菌NC1生防微生物菌劑(2.3×108CFU/g)，施用量為3g/500g土壤；2)處理二：含芽孢桿菌(Bacillus sp.)和放線菌(Streptomyces sp.)共5.0×108CFU/g的防線蟲菌劑(微生物菌劑對照)，施用量為1g/500g土壤(推薦用量4kg/畝)；3)處理三：10％噻唑膦(日本石原產業株式會社，殺線劑對照)，施用量為0.25g/500g土壤(推薦用量2kg/畝)；4)處理四：未處理對照，每處理設置四個重複。將各處理菌(藥)劑按施用量與土壤充分混勻後，裝入直徑12cm的塑料花盆中(500g/盆)，將培育40d的「中雜106」番茄苗(番茄種子購於中國農業科學院蔬菜花卉研究所)移栽入花盆中，一周後向各處理的番茄苗根際接種南方根結線蟲卵懸液(5000卵/盆)，接種後60d，調查各處理番茄地上部鮮重，同時計算病情指數和防控效果。
番茄根結級數分為10級(Bridge J and Page S L J.Estimation of root-knot nematode infestation levels on root using a rating chart.Tropical pest management,1980,26:296-298)，根據各處理番茄根結級數計算病情指數和防控效果。
實施例試驗結果如表3所示，施用本發明所述的假格裡尼翁蒼白桿菌NC1生防微生物菌劑可以顯著增加番茄地上部鮮重，同時對南 方根結線蟲的防效達62.5％，與殺線劑10％噻唑膦效果相當，防效優於殺線微生物菌劑對照。
表3本發明假格裡尼翁蒼白桿菌NC1微生物菌劑對番茄根結線蟲的防治效果
採用統計學軟體SPSS 19.0對不同處理中番茄地上部鮮重進行單因素方差分析，a-b表示P＝0.05水平下各處理間差異顯著性，a-b從大到小排列，處理間差異不顯著的先以a表示，直至某一個處理與之達到顯著性差異則標b，以此類推。
最後應說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之中。