預防和治療視網膜和角膜血管新生的藥物的製作方法
2023-12-07 08:01:11 2
專利名稱：預防和治療視網膜和角膜血管新生的藥物的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域。
目前臨床上尚沒有治療眼內血管新生的有效藥物和方法。臨床上採用的雷射光凝療法可造成視網膜嚴重的不可逆損傷。曾有人考慮採用地塞米松治療，但效果並不明顯，且毒副作用很大，限制了其應用。因此尋找能夠防治眼內血管新生且毒副作用小的藥物具有重大的社會和經濟意義。
新生血管的形成，包括血管內皮細胞基膜的降解、內皮細胞遷移、內皮細胞增生、新生血管的成熟等幾個步驟，這些步驟受多種生長因子的調節，如血管內皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導因子1(HIF1)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子α(TGF-α)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)等。但在這些因子中，唯有VEGF特異性地對血管內皮細胞有強有力的促分裂、遷移作用。眼內血管新生與VEGF表達在時間、空間上有著極高的相關性，已有越來越多的證據表明，VEGF在眼內血管新生中起著關鍵性作用。人類VEGF基因由8個外顯子和7個內含子組成，長約14kb。由於RNA剪切方式不同，VEGF家族至少有4個成員，分別為VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206。其中VEGF165為最主要的異構體。內皮細胞上VEGF受體包括fms樣酪氨酸蛋白激酶(FLT)和激酶插入功能域受體(KDR)，VEGF通過誘導自身受體磷酸化從而啟動細胞內系統。
4』，5，7-三羥基異黃酮(Genistein，簡寫Gen)是主要從豆類等植物中提取的一種異黃酮類化合物，近來研究發現Gen可以抑制多種腫瘤的生長和轉移，但其作用的生化位點和作用機制還不清楚，目前提出的幾種可能機制包括抑制酪氨酸激酶活性，抑制拓撲異構酶II的活性，抗氧化作用等。Gen可在腸道通過被動機制被迅速吸收，在肝臟轉化為金雀異黃素-7-氧-β葡糖苷酶(genistein-7-O-βglucuronide)結合物，經膽汁排入十二指腸，再由腸道重吸收，形成腸肝循環。Gen已有保健食品上市，尚未有作為藥物使用的報導。Gen屬於低毒物質，其對人體生理代謝有益的調節及豐富的大豆資源，為其開發利用展示了廣闊的前景。
經整體動物試驗和培養細胞試驗證實，該藥物可以明顯抑制疾病模型C57BL/6小鼠的視網膜血管新生，也可抑制多種因素所致兔和大鼠的角膜血管新生。該藥物還可以抑制物理缺氧和化學缺氧所致的兔視網膜色素上皮細胞VEGF和HIF1蛋白表達，表明該藥物通過抑制血管新生的誘導因子表達而發揮預防和治療視網膜和角膜血管新生。內容包括(一)Gen和大豆異黃酮提取物對小鼠視網膜血管新生的作用C57BL/6小鼠相對缺氧造成視網膜血管新生模型。觀察正常對照組小鼠眼切片，僅見極少量有突破內界膜的血管內皮細胞，模型處理組突破內界膜的血管內皮細胞數明顯多於正常組，Gen給藥組和給大豆異黃酮提取物組突破內界膜的血管內皮細胞數較模型處理組明顯減少，且呈劑量依賴性。模型處理組視網膜血管內皮細胞中VEGF和HIF1的表達明顯較正常組強。Gen給藥組和給大豆異黃酮提取物組與模型處理組比較，VEGF和HIF1的表達明顯減弱。表明Gen和大豆異黃酮提取物可以抑制小鼠視網膜血管新生。(二)Gen和大豆異黃酮提取物對角膜血管新生的抑制作用觀察縫線所致兔角膜血管新生進展，發現角膜縫線後第三天，角膜充血，並有新生血管伸入角膜緣內，每根縫線上端出現新生血管，長度0.6mm左右。觀察至縫線後第20天，可見給藥組新生血管的支數和總長度較對照組明顯減少，血管新生的進程也減慢。表明Gen和大豆異黃酮提取物可抑制縫線所致兔角膜血管新生。
觀察鹼燒傷所致大鼠角膜血管新生進展，1周時周邊有新生血管浸入，給藥組新生血管支數較對照組明顯減少，2周後血管閉塞呈線狀，直至消失。對照組2周後出現血管閉塞，約5周後血管消失。表明Gen和大豆異黃酮提取物可明顯抑制鹼燒傷所致的角膜血管新生。(三)Gen對化學缺氧和物理缺氧所致兔RPE細胞VEGF表達的影響採用免疫螢光組織化學技術和雷射共聚焦顯微鏡，以螢光比值來表示VEGF的表達，半定量分析氯化鈷和物理缺氧處理不同時間對體外培養的視網膜色素上皮(RPE)細胞VEGF蛋白表達的誘導作用，以及Gen對氯化鈷和物理缺氧誘導的VEGF表達的影響。發現對照組有低水平VEGF蛋白的表達，隨著氯化鈷和物理缺氧處理時間的延長，螢光比值的變化表現為時間依賴性，在6h點達到高峰。Gen(50、100、200μmol/L組)與DMSO對照組相比，均可明顯抑制氯化鈷和物理缺氧誘導的VEGF的表達，且此種抑制作用呈濃度依賴性。以上結果顯示Gen可抑制氯化鈷和物理缺氧誘導的RPE細胞VEGF表達，表明該藥物通過抑制血管新生的誘導因子VEGF表達而發揮預防和治療視網膜和角膜血管新生。
四、具體實施方案(一)Gen和大豆異黃酮提取物對小鼠視網膜血管新生的作用1.材料和方法1.1 材料和主要儀器Gen，98％，購自Sigma公司，溶於1％羧甲基纖維素鈉(CMCC)；大豆異黃酮提取物(Gen含量70％)，本室提取，溶於1％CMCC；VEGF蛋白單克隆抗體購自NEOMARK公司；HIF-1蛋白單克隆抗體購自NOVUS公司；山羊抗小鼠IgG-FITC、羊抗小鼠IgG-CY3購自Sigma公司；測氧儀購自上海嘉定學聯儀表廠；LSM510型雷射共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司。1.2 動物模型的製作選未生育過的成年C57BL/6母鼠(上海中科院動物中心提供)，2隻一組分別與1隻公鼠同籠飼養，隨機分為給氧組，三個給氧給Gen組(Gen 50、100、200mg/kg)，三個給氧給大豆異黃酮提取物組(70mg/kg、140mg/Kg、280mg/Kg)和對照組。每組平均出生10隻新生C57BL/6小鼠。將給氧組、給氧給Gen組和給氧給大豆異黃酮提取物組各10隻小鼠於生後7d與同籠母鼠一起放入密閉的乾燥瓶中。乾燥瓶中接入100％溼潤的氧氣，維持氧箱內氧的體積分數為75±5％，每3-6小時調節一次，用測氧儀監測。每日一次打開氧箱加食，換水。對照組10隻小鼠生活在正常氧環境中。1.3 視網膜切片計數視網膜血管的增生每組小鼠均於生後21d處死，眼球摘除並標記方向。摘除的眼球浸泡在4％中性甲醛溶液中24小時，常規脫水，石蠟包埋。矢狀面平行視神經連續6μm切片，每隻眼隨機抽取5個切面(有視神經斷面的切面不記入在內)，雪夫高碘酸—蘇木素(PAS)染色，顯微鏡下計數突破內界膜的血管內皮細胞核數目。1.4 免疫螢光法檢測視網膜中VEGF、HIF1的表達從給氧組、給氧給藥組、給大豆異黃酮提取物組及對照組中隨機抽取10張未經染色的視網膜切片，常規脫蠟後，枸櫞酸緩衝液中100℃抗原修復15分鐘，分別予VEGF，HIF1單抗4℃孵育過夜。PBS洗3次，每次5分鐘。而後予以FITC或CY3標記的二抗孵育1小時，PBS洗3次，每次5分鐘。在雷射共聚焦顯微鏡下觀察，成像。1.5 統計學分析採用非配對t檢驗法分別比較給氧組與對照組，給氧組與給氧給藥組突破視網膜內界膜的細胞核數目。P＜0.05，表示有顯著性差異。2.結果2.1計數視網膜血管的新生觀察正常對照組小鼠眼切片，僅見極少量有突破內界膜的血管內皮細胞，模型處理組突破內界膜的血管內皮細胞數明顯多於正常組，Gen給藥組和給大豆異黃酮提取物組突破內界膜的血管內皮細胞數較模型處理組明顯減少，且呈劑量依賴性。2.2視網膜中VEGF、HIF1的表達缺氧處理組視網膜血管內皮細胞中VEGF、HIF1的表達明顯較正常組強。Gen給藥組和給大豆異黃酮提取物組與缺氧處理組比較，螢光強度弱，且呈劑量依賴性。(二)Gen和大豆異黃酮提取物對角膜血管新生的抑制作用1.材料與方法1.1 材料和主要儀器Gen，98％，溶於1％CMCC或0.05％DMSO，大豆異黃酮提取物(Gen含量70％)，本室提取，溶於1％CMCC或0.05％DMSO。1.2 大耳白兔，重2.0～2.2kg。兩眼進行角膜縫線，在丁卡因表面麻醉下，以1-0號絲線在角膜上方縫3針。將兔隨機分為7組，每組5隻。對照組灌胃0.5％CMCC，給藥組分別灌胃Gen 15、30、60mg/kg和灌胃大豆異黃酮提取物25、50、100mg/kg。1.3Wistar大鼠，重300～350g，全麻後對角膜中央區實施鹼性燒傷，用直徑為5mm的圓形濾紙，浸於1.0M氫氧化鈉溶液10μl，置於大鼠角膜中央，10秒後取下，立即用無菌生理鹽水衝洗1分鐘。對照組滴眼0.05％DMSO，每日3次，每次0.1ml，給藥組分別滴眼Gen 0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml，大豆異黃酮提取物0.03、0.06、0.12mg/ml，每日3次，每次0.1ml。2.結果2.1 Gen和大豆異黃酮提取物對縫線所致兔角膜血管新生的影響用手術放大鏡觀察兔角膜血管新生，測量新生血管的支數和總長度。發現角膜縫線後第三天，角膜充血，並有新生血管伸入角膜緣內，每根縫線上端出現3～7支新生血管，長度0.6mm左右。觀察至縫線後第20天，可見給藥組新生血管的支數和總長度較對照組明顯減少，血管新生的進程也減慢。表明Gen和大豆異黃酮提取物可抑制縫線所致兔角膜血管新生。2.2 Gen和大豆異黃酮提取物對鹼燒傷所致大鼠角膜血管新生的影響以裂隙燈觀察角膜新生血管進展，1周時周邊有新生血管浸入，給藥組新生血管支數較對照組明顯減少，2周後血管閉塞呈線狀，直至消失。對照組2周後出現血管閉塞，約5周後血管消失。表明Gen可明顯抑制鹼燒傷所致的角膜血管新生。(三)Gen對化學缺氧和物理缺氧所致兔RPE細胞VEGF表達的影響1.材料和方法1.1材料和儀器；Dulbecco`s modified eagle medium(DMEM)培養基，胰蛋白酶購自GIBCO公司；胎生牛血清購自上海浦東高橋獸醫站；Dimethyl sulfoxide(DMSO)購自AMRESCO公司；VEGF蛋白單克隆抗體購自NEOMARK公司；山羊抗小鼠IgG-FITC購自Sigma公司；多聚賴氨酸購自上海生物工程技術有限公司；Gen購自Sigma公司，以DMSO助溶(DMSO終濃度＜0.05％)；TY80B型脫色搖床購自南京大學生物技術開發公司；6孔培養板購自丹麥NUNC公司；LSM510型雷射共聚焦顯微鏡為德國Zeiss公司產品。1.2兔RPE細胞的培養空氣針處死灰兔2～3隻後，即刻取下兔眼，浸泡於0.1M PBS(NaCl 8.00g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，K2HPO40.2g溶於1000ml蒸餾水，pH7.4)中，4℃冰箱1h。無菌條件下剪開眼球，棄去眼前節及玻璃體，完整吸除視網膜神經層。眼杯內用D-Hanks液(NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·H2O 0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g溶於1000ml蒸餾水，pH7.4)衝洗二遍，加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化30min，用滴管吹打使RPE細胞分離，收集細胞，離心洗滌後加入DMEM培養液(含100U/ml青黴素鈉，100μg/ml鏈黴素，20％新生牛血清，pH7.4)，接種於50ml培養瓶中，每3d換液一次。細胞長至近融合狀態時，用0.25％胰酶消化，傳代。3～4代細胞用於實驗。1.3 氯化鈷模擬缺氧將25×25mm蓋玻片洗淨常規消毒處理後，浸泡於0.1％多聚賴氨酸中2～4h，取出晾乾2～4h，放入6孔培養板中備用。將傳至第三代的RPE細胞接種於6孔培養板中的蓋玻片上，待細胞長滿玻片的50％～60％時開始實驗。傾去培養液，用D-Hanks液衝洗2～3遍後，加入含有終濃度為125μmol/L氯化鈷的DMEM培養液，分別繼續培養0，1，2，4，6h。傾去培養液，用於免疫螢光試驗。1.4 物理缺氧將傳至第三代的RPE細胞接種於6孔培養板中的蓋玻片上，待細胞長滿玻片的50％～60％時開始實驗。傾去培養液，用D-Hanks液衝洗2～3遍後，置於95％N2、5％CO2的37℃培養箱中，分別繼續培養0，1，2，4，6h。傾去培養液，用於免疫螢光試驗。1.5 免疫組織化學試驗和雷射共聚焦顯微鏡下半定量觀察分別將經缺氧和氯化鈷處理及Gen預處理的RPE細胞置於脫色搖床上用4℃PBS衝洗2次，每次5min。100％甲醇室溫固定10min。用4℃PBS衝洗細胞2次。加入小鼠抗VEGF蛋白的單克隆抗體(1∶200稀釋)50μl，4℃孵育1h。用4℃PBS衝洗細胞4次。加入山羊抗小鼠IgG-FITC(1∶200稀釋)50μl，4℃孵育1h。用4℃PBS衝洗細胞4次。每待測樣品加入200μl PBS後，分別置於聯結電腦的雷射共聚焦顯微鏡下，×40物鏡，7％濾光片，激發光波長為488nm，預掃描後選定最佳細胞掃描參數，並在實驗中保持不變。每個視野雷射掃描2次後，可紀錄全細胞中的平均螢光強度，並存儲所採集的實驗數據。本實驗以全細胞中的平均螢光強度作為判斷VEGF表達的指標。2、結果2.1 RPE細胞培養及形態觀察原代培養的兔RPE細胞多呈扁平多角形，胞漿內充滿黑色或褐色色素顆粒。當細胞進入分裂期後，細胞內色素顆粒隨多次分裂逐漸稀釋減少，細胞逐漸透明，至第三、四代，細胞內無明顯的色素顆粒，而成均一透明的單層梭形細胞。2.2 氯化鈷模擬缺氧對RPE細胞VEGF蛋白表達的影響125μmol/L氯化鈷處理後，選取0、1、2、4、6h細胞。在雷射共聚焦螢光顯微鏡下可觀察到與不加一抗組相比，缺氧0h組胞漿中有較弱的螢光，提示有低水平VEGF蛋白的表達。而後隨著缺氧時間的延長，螢光比值的增加表現為時間依賴性，氯化鈷處理4h後胞漿中螢光比值的增加趨緩，形成平臺期，在缺氧6h達到高峰。(圖1)2.3 Gen對氯化鈷模擬缺氧4h RPE細胞VEGF蛋白表達的影響以125μmol/L氯化鈷+DMSO處理RPE細胞4h為對照組，125μmol/L氯化鈷+終濃度分別為50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Gen處理RPE細胞4h後的螢光比值明顯降低，且隨濃度的增高依次遞減。平均螢光強度比值分析提示Gen可顯著抑制氯化鈷模擬缺氧4h後RPE細胞VEGF蛋白的表達，且呈濃度依賴性。(圖2)2.4 物理缺氧對RPE細胞VEGF蛋白表達的影響將接種RPE的六孔板置於95％N2、5％CO2的37℃培養箱中，分別繼續培養0，1，2，4，6h。在雷射共聚焦螢光顯微鏡下可觀察到與不加一抗組相比，缺氧0h組胞漿中有較弱的螢光。隨著缺氧時間的延長，螢光比值的增加表現為時間依賴性。(圖3)2.5 Gen對物理缺氧4h RPE細胞VEGF蛋白表達的影響以缺氧+DMSO處理RPE細胞4h為對照組，終濃度分別為50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Gen處理RPE細胞4h後的螢光比值明顯降低，且隨濃度的增高依次遞減。(圖4)五
圖1.氯化鈷模擬缺氧對RPE細胞VEGF蛋白表達的影響。A氯化鈷模擬缺氧後0、1、2、4、6h RPE細胞雷射共聚焦螢光顯微鏡圖像。BRPE細胞VEGF蛋白表達以對照組的螢光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01vs 0h。圖2. Gen對氯化鈷模擬缺氧引起的RPE細胞VEGF蛋白表達的作用。AGen(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)處理RPE細胞後雷射共聚焦螢光顯微鏡圖像。BRPE細胞VEGF蛋白表達以對照組的螢光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01 vs 0μmol/L Gen。圖3.物理缺氧對RPE細胞VEGF蛋白表達的影響。A物理缺氧後0、1、2、4、6h RPE細胞雷射共聚焦螢光顯微鏡圖像。BRPE細胞VEGF蛋白表達以對照組的螢光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01vs 0h。圖4.Gen對物理缺氧引起的RPE細胞VEGF蛋白表達的作用。AGen(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)處理RPE細胞後雷射共聚焦螢光顯微鏡圖像。BRPE細胞VEGF蛋白表達以對照組的螢光百分比表示。n＝8，x±S.D，××P＜0.01 vs 0μmol/L Gen。
權利要求
1.一類4』，5，7-三羥基異黃酮(Genistein，簡寫Gen)的應用，其特徵在於該藥物為Gen純品，或含有Gen的豆類及相關植物的提取物，或以Gen為主要成分的複方製劑，可用於製備預防和治療視網膜和角膜血管新生的藥物。
2.一類預防和治療視網膜和角膜血管新生的藥物，其特徵在於Gen純品，或含有Gen的豆類及相關植物的提取物，或以Gen為主要成分的複方製劑，可製備成片劑、膠囊、口服液、靜脈及肌肉注射劑、脂質體、微膠囊和滴眼液等製劑形式。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域。本發明涉及預防和治療視網膜和角膜血管新生的藥物。該藥物為4』，5，7－三羥基異黃酮(Genistein，簡寫Gen)純品，或含有Gen的豆類及相關植物的粗提取物，或以Gen為主要成分的複方製劑。可製備成片劑、膠囊、口服液、靜脈及肌肉注射劑、脂質體、微膠囊和滴眼液等製劑形式。經整體動物試驗和培養細胞試驗證實，該藥物可以明顯抑制疾病模型C57BL/6小鼠的視網膜血管新生，也可抑制多種因素所致兔和大鼠的角膜血管新生。該藥物還可以抑制物理缺氧和化學缺氧所致的兔視網膜色素上皮細胞VEGF和HIF1蛋白表達，表明該藥物通過抑制血管新生的誘導因子表達而發揮預防和治療視網膜和角膜血管新生。
文檔編號A61P27/02GK1424030SQ02148598
公開日2003年6月18日 申請日期2002年12月23日 優先權日2002年12月23日
發明者王斌, 鄒穎, 肖繼皋 申請人:南京醫科大學