含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列的製作方法
2023-11-12 05:47:32
專利名稱：含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列國內外所有的檢測方法並沒有完全解決轉基因產品的檢測問題，新的檢測方法在不斷出現，並在繼續完善之中。首先，目前國內外常用的幾套篩選引物，不能完全檢測出目前已商品化的轉基因品種；傳統的的PCR技術較難控制汙染的產生；另外，質量不過關的檢測試劑，經常影響檢測結果的判斷和檢測出證工作。
到目前為止，最有發展前途的檢測技術為實時螢光PCR技術。實時螢光PCR技術具有很多優點使用了雜交探針，提高了檢測的準確性；螢光檢測的高靈敏度；不用對PGR產物後期處理，較好地降低了檢測過程中的汙染；邊擴增邊檢測，提高了檢測速度；可以使用國際標準品對檢測樣品進行定量。這個技術的核心環節是首先要獲得能高效、特異並靈敏地擴增目的片斷DNA的引物。
據國際農業生物技術應用諮詢服務中心(ISAAA)統計，2001年全世界轉基因作物種植面積為5260萬公頃，十多個國家已種植轉基因作物，其中99％的轉基因作物種植在美國、阿根廷、加拿大和中國，已批准商品化轉基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、菸草、西瓜、菊苣等。據估計，用這些轉基因作物生產加工的食品全世界有近萬種。
對轉基因產品的安全性，特別是轉基因食品對人和動物的健康及對生態環境的影響，自轉基因技術出現以來，就一直是世界各國及聯合國等國際組織關心的焦點問題，2000年聯合國通過了「生物安全議定書」，該議定書對除了藥物以外的所有進出境活性轉基因生物有關過境、審批、檢測、風險評估和管理、賠償責任等做出了詳細的規定，其中最重要的措施之一就是對轉基因產品要進行檢驗，以明確其種類，確定是否為已批准的或已獲得許可的轉基因產品，以防止一些具有風險的轉基因產品任意擴散，造成不可挽回的損失。2001年歐盟要求對轉基因食品進行標識管理，並提出只要不是有意汙染，食品中含有不超過1％的轉基因產品(閾值)則不用標識，這樣轉基因產品檢測不但需要定性，還需要定量檢測。不同國家閾值大小不一樣，從1-5％不等。我國於2001年5月9日公布並實施《農業轉基因生物安全管理條例》，並於2002年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法。目前全世界36個國家和地區出臺了各種轉基因產品有關的法律法規。總之，轉基因產品的研究、生產、銷售都要在政府有關部門的許可和監督下，在特定的環境和地點進行。
事實上，最近幾年已先後發現轉基因產品研究、生產及進出口過程中出現安全及監管事故，存在各種各樣的轉基因產品擴散、汙染及安全隱患，加大對轉基因產品的檢測監管是非常必要的。
2002年歐盟執行新的轉基因產品管理法規，要求對轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售進行全程的「跟蹤」、檢測，以保證轉基因產品不汙染非轉基因產品。美國提出了品種「個性保存」方案，所不同的是要求對非轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售進行全程的「跟蹤」檢測，以確保非轉基因產品不被轉基因產品汙染(事實上完全不被汙染是不可能的，但要控制在一定的許可範圍之內)。許多國家對進口非轉基因食品，要求出口商提供經檢測合格的非轉基因產品證明。
綜上所述，轉基因食品從研究、生產、貯存、運輸、銷售、進出口等環節都需要檢驗監控，不但要求檢測出是否含有轉基因，而且要檢測出轉基因產品的含量。
對轉基因產品的檢測，主要想解決如下幾個方面的問題是否為轉基因產品；如果含有轉基因產品、又是某國已批准商品化的轉基因產品，則要檢測出轉基因產品的含量是否達到允許值；如果是尚未批准的轉基因產品，原則上不允許進口或銷售。所有這些都離不開確實可靠的GMO檢測方法。
一個好的GMO檢測方法首先要有較廣泛的GMO針對性。雖然轉基因作物的獲得性狀的多種多樣，但為了使轉入的基因成功表達，均需要插入一定的外源性調控序列，例如啟動子、終止子等等。花椰菜花葉病毒(CaMV)的35s啟動子(或其人工改建序列)就是一種最常見的插入序列，大約70％的轉基因作物均含有該序列。因此，35s啟動子成為GMO檢測的一個理想的標誌性DNA序列。
發明內容
本發明的目的就是要提供針對35s啟動子序列的特異性好、靈敏度高的擴增引物，用於轉基因作物的PCR的檢測。
為達到上述目的，本發明採用以下技術方案含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述的引物序列包括由上遊引物35s7248，其序列為CGACAGTGGTCCCAAAGAT和下遊引物35s2R，其序列為AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基得到35s7238，後延10個鹼基得到35s7258，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基得到35s7290，後延10個鹼基得到35s7310，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述引物序列包括由上遊引物35s7201其序列為TGCCATCATTGCGATAAAG和下遊引物35s7345R其序列為CCCTTACGTCAGTGGAGAT組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述引物序列包括由上遊引物35s7190其序列為GCTCCTACAAATGCCATCA下遊引物35s7165序列為GATAGTGGGATTGTGCGTCA組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述引物序列包括由上遊引物35s7240其序列為GCCTCTGCCGACAGTGGT和下遊引物35s7306R其序列為TTGAAGACGTGGTTGGAAC組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
最優引物序列如下35s7240GCCTCTGCCGACAGTGGT35s7306rTTGAAGACGTGGTTGGAAC
35s7201TGCCATCATTGCGATAAAG35s7345RCCCTTACGTCAGTGGAGAT35s7190GCTCCTACAAATGCCATCA35s7365rGATAGTGCGATTGTGCGTCA35s7248CGACAGTGGTCCCAAAGAT35s2rAAGACGTGGTTGGAACGTCTTC(基因組全序列見附錄一)
表1.PCR反應體系
PCR條件的選擇依據本公司以往的經驗，PCR條件的選擇如下93℃3min；
40個循環(60℃末收集螢光)。
在同樣的模板量、同樣的反應條件下，以35s啟動子序列的特異螢光探針信號所獲得的Ct值和Rn值為指標(這兩者能反映擴增片斷的量和質)，比較不同引物對組合的擴增情況；同時再將同一PCR產物進行瓊脂糖電泳。選擇擴增條帶單一者而且Ct值和Rn值高者，做為待選的DNA/PCR檢測的引物對。見下
圖1圖1中，26為35s7240/7370引物對，Ct為28.43，27為35s7201/7345引物對，Ct為24.96，28為35s7240/7306引物對，Ct為23.98，29為35s7190/7282引物對，Ct為32.67，30為35s7201/7305引物對，Ct為28.80，31為35s7190/7365引物對，Ct為26.34，32為35s7248/2R引物對，Ct為23.85。
圖1中可以看出有四對引物的擴增線Ct值比較小，其螢光強度Rn也有一定高度，初步選定其做為待用的DNA/PCR檢測的引物對。這四條擴增線的引物對分別是35s7248/35s2R、35s7240/35s7306、35s7201/35s7345和35s7190/35s7365，具體見表2表2四對擴增35s啟動子的引物擴增效率比較
由圖1、表2可見，35s7248/35s2R、35s7240/35s7306、35s7201/35s7345和35s7190/35s7365四對引物均有較好的擴增，其中尤以35s7248/35s2R最好。
最初篩選出能擴增35s啟動子的最佳引物對為上遊35s7248和下遊35s2R；其Ct值為23.85。為考察此區域附近其它的引物位置是否具有同樣擴增效果，遂又在此引物對位置(35s7248)的基礎上，將上遊引物前延10個鹼基得到35s7238、後延10個鹼基得到35s7258；同理改變下遊引物位置(35s2R)得到35s7290、35s7310。經過與前述同樣條件做螢光PCR篩選，引物對35s7238/35s7290的Ct值為25.12；引物對35s7258/35s7310的Ct值為25.43。這些結果提示，在初篩最佳引物對的上下遊各延伸10個鹼基的區域範圍內，仍能選好很好的35s啟動子的擴增引物。前、後延伸的兩個上遊引物35s7238ATGCCTCTGCCGACAGTG35s7258CCCAAAGATGGACCCCCAC前、後延伸後的兩個下遊引物35s7290AACGTCTTCTTTTTCCACG35s7290TTGCTTTGAAGACGTGGTTG用選出的最佳上下遊引物對進行PCR反應體系的優化a.引物濃度的優化實驗中將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增。對引物不同濃度的配比進行了比較。最佳引物終濃度結果如下
b.鎂離子濃度的優化實驗中將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增。
從多次重複實驗中選定2.5mmol/L MgCl2為試劑盒反應體系鎂離子濃度。
c.Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優化Taq酶用量(以單位U計)的優化實驗結果，選定2U Taq酶作為試劑盒中使用Taq酶量。
d.dNTPs濃度的優化dNTPs濃度的優化實驗中選定0.2mmol/L作為試劑盒dNTPs的終濃度。
e.綜合以上反應體系優化實驗結果，優化後的PCR反應體系見表3。
表3優化後的PCR反應體系
4.發明的效果經過反覆篩選，得到35s7248/35s2R、357240/35s7306、35s7201/35s7345和35s7190/35s7365四對最佳引物對。其用途包括用於常規PCR(瓊脂糖電泳)、PCR/ELISA檢測或螢光PCR檢測。將其用於做螢光PCR檢測時，以符合國際標準的Fluka大豆標準品0.1％轉基因大豆提取的DNA做模板，得到的Ct值在31.0-32.0之間，這是目前不同螢光測定儀器的可靠檢測下限；而0.1％的檢測靈敏度已經達到了目前國際同類產品的檢測標準。
圖2中，11為轉基因大豆，12為轉基因油菜，15為轉基因蕃茄，16為轉基因土豆。
用35s7240/35s2R引物做螢光PCR檢測，具體為20ul反應體系中，加入植物基因組DNA 2ul，進行螢光PCR檢測，具體反應條件同前。經檢測，上述轉基因作物均呈陽性擴增，其Ct值分別為轉基因大豆22.36；轉基因油菜18.71；轉基因番茄28.55；轉基因土豆23.81，其檢測靈敏度均可達到0.1％；而非轉基因的農產品如普通玉米、白玉米等均無擴增信號，提示該引物對具有良好的靈敏度和特異性。實施例2定量檢測取符合國際標準的Fluka大豆標準品，基因組DNA提取方法同前，用35s7240/35s2R引物做螢光PCR定量檢測，螢光PCR儀採用RocheLight-Cycler。其結果如表4表4用35s7240/35s2R引物做螢光PCR定量檢測標準品及樣品ct值
從上述數據得到的回歸曲線是y＝-0.346x+7.9383；相關性r2＝0.99；再用1.0％和2.0％的標準品當做被測樣品，測得的GMO含量分別為0.94％和2.26％，定量偏差為5％-15％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示所用引物的檢測效率已達到核酸擴增檢測領域裡的該項目的國際水平。
圖3中1)0.0％轉基因大豆標準品2)0.1％轉基因大豆標準品3)0.5％轉基因大豆標準品4)2.0％轉基因大豆標準品M)2000ladder本發明的優點本發明提供的引物對做螢光PCR檢測，其檢測靈敏度可達0.1％，而非轉基因的農產品大豆、玉米等均無擴增信號，說明這些引物具有良好的靈敏度和特異性。該引物對做PCR定量檢測時，其定量誤差為5-15％，其檢測效率可達到核酸擴增領域裡該項目的國際水平。附錄一35S基因全序列35S PROMOTER880bpCCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTG GA35s719035s7201AAGGCCATCGTTGAAG GGACCCCCACCCACGAGGAGCATC35s724035s7248GTGGAAAAA AGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTA35s2r35s7306r35s7345RAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTG35s7365rGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAGGATCCATAGATCTGATAACAAAGATGAG
序列表110深圳市匹基生物工程股份有限公司國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所120含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列1301608170PatentIn version 3.1210121118212DNA213人工序列4001gcctctgccg acagtggt18210221119212DNA213人工序列4002ttgaagacgt ggttggaac 19210321119212DNA213人工序列4003tgccatcatt gcgataaag 19210421119212DNA213人工序列4004cccttacgtc agtggagat 19210521119212DNA213人工序列4005gctcctacaa atgccatca 19210621120212DNA213人工序列4006gatagtggga ttgtgcgtca 20210721119212DNA213人工序列4007cgacagtggt cccaaagat 19210821122212DNA213人工序列4008aagacgtggt tggaacgtct tc 2權利要求
1.一種含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特徵在於所述的引物序列包括由上遊引物35s7248，其序列為CGACAGTGGTCCCAAAGAT和下遊引物35s2R，其序列為AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基得到35s7238，後延10個鹼基得到35s7258，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基得到35s7290，後延10個鹼基得到35s7310，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
2.根據權利要求1所述的含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特徵在於所述的引物序列上遊引物序列為CGACAGTGGTCCCAAAGGAT，下遊引物序列為AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC。
3.一種含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特徵在於所述引物序列包括由上遊引物35s7201其序列為TGCCATCATTGCGATAAAG和下遊引物35s7345R其序列為CCCTTACGTCAGTGGAGAT組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
4.根據權利要求3所述的含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特徵在於所述引物序列上遊引物序列為TGCCATCATTGCGATAAAG，下遊引物序列為CCCTTACGTCAGTGGAGA。
5.一種含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特徵在於所述引物序列包括由上遊引物35s7190其序列為GCTCCTACAAATGCCATCA下遊引物35s7165序列為GATAGTGGGATTGTGCGTCA組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
6.一種含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉基因作物核酸擴增引物序列，其特徵在於所述的引物序列上遊引物序列GCTCCTACAAATGCCATCA，下遊引物序列為GATAGTGGGATTGTGCGTCA3。
7一種含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特徵在於所述引物序列包括由上遊引物35s7240其序列為GCCTCTGCCGACAGTGGT和下遊引物35s7306R其序列為TTGAAGACGTGGTTGGAAC組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。
8.一種含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉基因作物核酸擴增引物序列，其特徵在於所述的引物序列上遊引物序列為GCCTCTGCCGACAGTGGT AT，下遊引物序列為TTGAAGACGTGGTTGGAAC。
全文摘要
本發明提供了含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉基因作物核酸擴增用引物序列，它們包含在四對最優引物序列延伸區域範圍內，所述的每對引物序列延伸區域範圍是由上遊引物和下遊引物組成的引物對，在該引物對的上遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，而引物對的下遊引物位置前延10個鹼基，後延10個鹼基，在上述引物對的上下遊延伸位置的區域範圍內，得到的引物序列。本發明提供了最優引物對做螢光PCR檢測的結果，其檢測靈敏度可達0.1％，而非轉基因的農產品大豆、玉米等均無擴增信號，說明這些引物具有良好的靈敏度和特異性。該引物對做PCR定量檢測時，其定量誤差為5－15％，其檢測效率可達到核酸擴增領域裡該項目的國際水平。
文檔編號C12Q1/68GK1470645SQ0212563
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月26日 優先權日2002年7月26日
發明者朱文斯, 黃茜華, 朱水芳 申請人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所