鐵皮石斛試管苗的特徵dna序列及其應用的製作方法

2023-11-11 20:38:32 1

專利名稱：：鐵皮石斛試管苗的特徵dna序列及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學領域，進一步的本發明涉及鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列及其應用。技術背景鐵皮石斛(De"(ira6/臓0，/"a/eKimuraetMigo),隸屬於蘭禾鬥(Oc/i油ce"e)石斛屬(Z^"AoW"附Sw.)，為多年生附生草本，是我國傳統名貴中藥之一，列為上品，具有潤喉消毒、生津益胃、清熱養陰等功效。現代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力，擴張血管及抗血小板凝集等作用。鐵皮石斛生長環境特殊，加之長期的採挖，已成為稀有、瀕危的藥用植物。為拯救這一珍貴藥源，近年來通過無性繁殖試管苗以及試管苗栽培的成功，實現了鐵皮石斛資源的可持續開發和利用。石斛屬(De"craWwMSw.)全世界約有1000種，我國有74種2變種，其中可做藥用的種類繁多，中國藥典(2000年以前版本)收載石斛為蘭科(C^W由ce"e)石斛屬(De"Ao6/wwSw.)鐵皮石角鬥Z)em/ro6/謂ojf"'朋/e、金釵石角鬥Z)."oMe、黃草石角鬥Z).c/^拜W/m/w、環草石斛A/o^^gew7、馬鞭石斛Z).y/^n'aft^的新鮮或乾燥莖。因鐵皮石斛的珍貴、稀有、來源有限等，其混淆品也就屢見不鮮；另外，通過無性繁殖培植的試管苗，因植株較小，在外形上無法判斷其來源的種類；還有，試管苗在繁殖和栽培的過程中，由於生態環境的改變和人們生產活動的影響，是否會發生變異等，這些現象如果依靠傳統的方法進行鑑定非常困難。隨著分子生物技術的迅速發展，DNA分子標記技術在中藥鑑定方面的應用已取得了許多進展(曹暉等，DNA分子指紋圖譜與測序技術在中藥品質研究中的現狀與展望，中國中藥雜誌，1998，23(11);姜玉新，石思信，張志娥等.人參、西洋參的基因組DNA的RAPD分析.特產石開究，1998，(1):5;KitanakaS，KunishiM，TairaT，etal.Ginsenosideproduction,tissuecultureandinductionofregenerationofinterspecifichybridginseng(PanaxginsengxP.quinquefoli咖).NaturalMed,1997，51'.1;NganFN，WangJ,ButPPH，etal.Applicationofarbitrarilyprimedpolymerasechainreaction(AP-PCR)incommercialginsengproducts.5thInternationalCongressofPlantMolecularBiology,Singapore,1997)。本實驗通過隨機擴增多態性DNA(randommplifiedpolymorphicDNA，RAPD)方法，對鐵皮石斛試管苗及石斛屬中其它一些種類進行了研究，獲得了RAPD圖譜，從中篩選出鐵皮石斛試管苗特異性條帶，通過克隆、測序等，設計了特異性探針，應用於組培鐵皮石斛及野生鐵皮石斛鑑定，得到了滿意的結果，為鐵皮石斛的鑑定和可持續開發及利用等提供了分子生物學方面的依據。
發明內容本發明的目的是公開鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列及其應用。本發明一方面公開了一種鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列，它是SEQIDN0:1的DNA序列或其互補序列。本發明另一方面公開了上述鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列在鐵皮石斛試管苗鑑定中的應用。較佳的，利用針對上述鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的特異性探針鑑定鐵皮石斛試管苗或鐵皮石斛。本發明第三方面公開了一種檢測樣品中是否含有鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的方法，包括下列步驟(1)使用針對鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的特異性探針對樣品的基因進行擴增；(2)檢測是否獲得相應的擴增產物。較優的，上述鐵皮石斛試管苗的特異性探針序列選自下組中的一組或多組(1)5'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3'(SEQIDNO:8)禾口5'TCGGTCGTCCCGTCGTAT3'(SEQIDNO:9);(2)5'AAGTGCCAAATGTTGAGTC3'(SEQIDNO:IO)和5'CCTGGAATCTGTCGTGCT3'(SEQIDNO:11)(3)5'CGAGACACCGTCCATTCA3'(SEQIDNO:12)和5'TTCCGACATTGGGCTTTA3'(SEQIDNO:13)(4)5'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3'(SEQIDNO:14)和5'GTCGTGGTGACGGGGACCTA3'(SEQIDNO:15)優選的，上述鐵皮石斛試管苗的特異性探針序列為5'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3鄰5'TCGGTCGTCCCGTCGTAT3'。本發明通過隨機擴增多態性DNA(RAPD)方法，對鐵皮石斛試管苗及石斛屬中其它種類進行了研究，經大量實驗及比對工作，分離並獲得了鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列(SEQIDNO:l)，針對該特徵DNA序列，設計了4對特異性引物，並將所設計的特異性探針用於擴增檢驗鐵皮石斛試管苗及鐵皮石斛。有益效果中藥材來源的真偽鑑定一直是中藥研究的重要課題之一，因為它直接關係到治病療效和用藥安全。以往的鑑定主要採用性狀、顯微、理化等方法，對中藥材的鑑定起到十分重要的作用。然而，上述方法對分類系統中同屬但外形非常接近的不同種的鑑定等還存在著一定困難。而使用本發明提供的鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列及針對其設計的特異性探針進行鑑定，準確度高，特異性好，鑑別技術較易掌握，具有很大的實用價值。這一技術路線和方法的建立，為我國珍貴、稀有、瀕危的地道藥材的鑑定提供了一個可借鑑的鑑定平臺。而使用本發明對組織培養產生的試管苗進行鑑定，可以很好地鑑定出試管苗的真實種類來源。這為通過組織培養方式進行大規模生產珍貴、稀有、瀕危的野生藥用植物，並使這些藥用植物資源的可持續開發和利用提供了科學的保證。而本發明中對鐵皮石斛組織培養一定代數後產生的試管苗的PCR擴增研究結果，從一個側面說明，在一定代數範圍內，儘管鐵皮石斛試管苗與野生藥材相比生長環境等發生了改變，可以說其藥效和遺傳特性等方面並沒有發生本質的變化，組培鐵皮石斛在一定代數範圍可以替代野生鐵皮石斛使用。這為擴大藥源和保證用藥安全提供了一定的科學證據。圖l:引物H-20的擴增結果圖M:100bpDNALadder(北京天為時代科技有限公司)Primer:引物H-20ArA3:為不同濃度的鐵皮石斛試管苗材料；13卜132:為不同濃度的兜唇石斛材料；1、3、15、16、20—22、24、25:分別為實施例表1中相同編號對應的材料圖2:鐵皮石斛試管苗及鐵皮石斛的高特異性探針擴增圖M:100bpDNALadderPrimer:引物AS1樣品分別為實施例表1中相同編號對應的材料圖3:鐵皮石斛試管苗及鐵皮石斛的高特異性探針擴增圖M:lOObpDNALadderPrimer:引物ASl樣品分別為實施例表1中相同編號對應的材料圖4:不同代鐵皮石斛試管苗與野生鐵皮石斛AS1引物PCR擴增圖M:100bpDNALadderPrimer:引物AS11、2、4、6、8、10:分別代表鐵皮石斛組培試管苗的代數An:傳代數超過10代以上的鐵皮石斛試管苗樣品標號說明A:officinale鐵皮石斛組培試管苗B:採自雲南的野生officinale鐵皮石斛C:採自浙江的野生o迅cinale鐵皮石斛D:採自江西的野生officinale鐵皮石斛E:採自福建的野生officinale鐵皮石斛F:採自廣東的野生officinale鐵皮石斛G:採自廣西的野生officinale鐵皮石斛具體實施方式下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而非限輸本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。實施例l鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的獲得1材料與方法1.1材料實驗材料的名稱和來源具體見表1，其中野生鐵皮石斛分別採自雲南、廣西等產區，鐵皮石斛試管苗由上海市中藥研究所提供。表l、材料名稱和來源tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7注鐵皮石斛A為組培試管苗；B、C、D、E、F、G分別採自雲南、浙江、江西、福建、廣東、廣西，1.2方法1.2.1DNA抽提選擇表1樣品(1-26)適宜葉片和莖O.lg左右，剪碎後液氮研磨，加入800ylCTAB-free[100mmol/LTris/HCl(pH=7.5),5mmol/LEDTA，0.35mmol/L山梨醇，1%PVP]，12000r離心6分鐘。棄上清，加入600yl左右65。C預熱的2XCTAB抽提緩衝液[100mmol/LTris/HCl(pH=8)，1.4mol/LNaCl，2%PVP，20mmol/LEDTA，2%CTAB(w/v)，0.34%巰基乙醇(v/v)]，65-C保溫60分鐘，不時搖晃。取出後冷卻到室溫，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1),抽提10分鐘，7000r離心10分鐘。將上清液吸入另一1.5ml離心管，加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，抽提10分鐘，lOOOOr離心10分鐘。將上清液吸入另一1.5ml離心管，加入1/10體積的NaAc，2/3體積的異丙醇(-2(TC預冷)，混勻之後放入-2(TC冰箱保存30分鐘左右，然後12000r離心10分鐘。棄上清，每0.lg材料加入200[jl76X乙醇一0.2MNaAc(ra5.2)，冰上20min。棄上清，用70%乙醇洗滌2次，37'C烘箱烘乾乙醇，加入50[jlTE溶解。4。C保存備用。1.2.2引物的篩選用表l樣品(1-26)DNA對上海生物工程有限公司(Sangon)的S序列和上海申能博採生物技術有限公司的H、A等序列的引物如S185，CCACAGCAGT3'(SEQIDNO:2)、S225，TGCCGAGCTG3'(SEQIDNO:3)、S1155，AATGGCGCAG3'(SEQIDNO:4)、H-205，GGGAGACATC3，(SEQIDNO:5)、A-025，TGCCGAGCTG3'(SEQIDNO:6)、A-065，GGTCCCTGAC3，(SEQIDNO:7)等進行篩選。1.2.3PCR擴增和電泳檢測PCR反應總體積為25ul。其中含有3mI100ng左右的DNA模板，0.4pmol/L引物(引物如1.2.2中所述)，2.5ul10Xbuffer,3.0mmol/LMgCl2，1單位Taq酶，0.2mmol/LdNTP。PCR擴增儀型號為PTC-200(MJResearch,Inc.公司產)。反應參數為94'C預變性3min，36。C復性1min，72'C延伸2min，94。C變性1min,36。C復性1min，72。C延伸2min，循環40次，最後72。C延伸10min。擴增完畢，以1.5%瓊脂糖凝膠(含EB0.5pgmr1)進行電泳，凝膠成像系統照相記錄。1.2.4鐵皮石斛試管苗特異性條帶的篩選根據不同引物PCR擴增所得的電泳圖譜，從中挑選出鐵皮石斛試管苗具有特徵性條帶的引物，重複RAPD反應，篩選出特徵性強且能穩定擴增的引物H-20(5，gggagacatc3，)(SEQIDNO:5)，分離並純化所需的特徵性片段，然後進行克隆和測序。1.2.5鐵皮石斛試管苗特異性條帶的克隆和測序以北京博大泰克生物基因技術有限責任公司生產的BType:Mini-DNARapidPurificationKit進行凝膠回收純化。PCR產物約1.3kb,純化產物以pGEM-Teasyvector連接，再轉化大腸桿菌DH5a，在含有IPTG、X-gal和AMP的培養基上進行藍白斑篩選，挑取白色菌落培養後，抽質粒，用酶切法(EcoRl)鑑定陽性菌，取陽性菌落測序。2結果與分析2.1DNA多態性圖譜分析對120多個隨機引物進行篩選，選擇擴增效果、重複性均較好的引物進行拍照。從擴增結果看，不同的種之間存在著明顯的多態性，初步證明運用RAPD方法可以區分不同種的石斛類植物。2.2鐵皮石斛試管苗特異性條帶篩選經過篩選，發現引物H-20在1300bp左右處出現的條帶可以作為鐵皮石斛試管苗特異性標記。反覆試驗，該條帶能被穩定擴增。其擴增結果如圖l所示。2.3引物H-20擴增出的特異性條帶測序結果顯示，片段長度約為1324bp，序列為SEQIDNO:l:實施例2鐵皮石斛試管苗特異性探針的獲得及鑑定1方法1.1鐵皮石斛試管苗特異性探針的設計針對實施例1獲得的鐵皮石斛試管苗特徵DNA序歹ij,用PrimerPremier5.0(PREMIERBiosoftInternational開發)軟體設計進行引物序列設計，設計了四對引物，進行合成(1)AS1組S15'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3'(SEQIDNO:8)Al5'TCGGTCGTCCCGTCGTAT3'(SEQIDNO:9)(2)AS2組S25'AAGTGCCAAATGTTGAGTC3'(SEQIDNO:IO)A25'CCTGGAATCTGTCGTGCT3'(SEQIDNO:ll)G)AS3組S35'CGAGACACCGTCCATTCA3'(SEQIDNO:12)A35'TTCCGACATTGGGCTTTA3'(SEQIDNO:13)(4)AS4組S45'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3'(SEQIDNO:14)A45'GTCGTGGTGACGGGGACCTA3'(SEQIDNO:15)經過一系列的篩選，發現AS1組引物最佳，一條引物的Tm57.9'C，另一條引物Tm59.0。C。1.2鐵皮石斛試管苗特異性探針的驗證取表1中樣品為模板，加入合成的特異性探針進行擴增，反應體系和反應參數主要參照實施例1的1.2.3,復性溫度為52'C。2結果與分析用特異性探針對組培鐵皮石斛和廣西、江西、廣東、福建、浙江、雲南野生鐵皮石斛及石斛類樣品進行擴增如圖2-3所示。從圖2-3中可以看出，鐵皮石斛試管苗和野生鐵皮石斛目的條帶全部擴出，其餘石斛無任何擴增產物，說明此特異性探針設計成功，可用於鑑定鐵皮石斛。實施例3不同代數鐵皮石斛試管苗的遺傳分析通過建立特殊的鐵皮石斛試管苗培養系，縱向比較同系中不同代數株植株的遺傳狀況。取不同代1、2、4、6、8、10、An(傳代數超過10代以上的鐵皮石斛試管苗樣品)的鐵皮石斛組培試管苗與野生鐵皮石斛，進行DNA抽提，用特異性探針進行PCR擴增，結果如圖4所示。用鐵皮石斛試管苗特異性探針擴增結果表明，各代數沒有發生變化，全部擴出相同的條帶。序列表〈110〉〈120〉〈130〉〈160〉〈170〉〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈400〉aattcactaggcgagttcaaattgcgggeicttcccccgagctaactgaeigtcatacgacgattcaacgaggcccgaacataa^gtsttxgtccgggattcgaagcacgaccttcgtcctattgatccatccagtttgagccctcgcc幼aatccgggatcgagcaateLttccaacccgagaatactgttcaaata11actaatc上海雷允上科技發展有限公司上海市中藥研究所鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列及其應用PCNZY06120915Patentlnversion3,11腦廳DendrobiumofficinaleKimuraetMigo1tgattggg解cacatcctcgtccctcacaag卿tgtg郎ctattcttcaggacgaccgacatcagacgcggttctactctcg33caatt3g3ttCC3gggccccttctagcgtggaggca^ttcsgcgg￡t￡ttetgggaaaB3￡Lgg￡Lgt￡lsggaggettgtgtcacttccattg￡lg￡LgaCtatg鄉ttggaaatggttggtgtcttgttg3C3tcctcaacattttttcctgtcctacgtgcatgctctcgcaccccattcccatatgaggctcctctgcgcttccaccttgtggccaatggg卿atcgagtagaccctttcgtcccttaca^tctctg犯gcgcaaacacaccacttg33atggctaccgtagccgtgatccgacagtccgactggg3g3gattga3tcgcttttattcacaa^ggaagatg犯ctgaacccccagaaggctctcctgcgaactgcga3aattggtcgac已gaagaacttcgagaaccggccagattcaaagtgcccatatcgactactacag犯ccaggtctttcccgccaccctggaacgatcccctcttttgt3g^g^ttgcaa3gg￡Lttcttg已aggagtattttcaacggaaltactcagaggggtcttatgcgagacaccgtccattcgcggatgaagctataaatgcggtgcagctgggatggataacctcataggtccccgtcaccaatacatcccaagcaaatgtcaccctttaaagcccaatgtggacacactactgaagcatgggatatctccgacaattcatgggC3g33tC犯C犯C3犯gtgatcacgcactttgtgtatgttgagttgagtgttactgttgccgatacaacggga卿ggtcatcacctcatcatgcattaaaggacagcaaattggccttcccacctcattttccacttcttggaggt￡lt￡LCgCtgaCtcacaggaeia^ttctttctcaatt犯tggccCgg犯3CC3gttggcagctccaag^tacaacgaccattgttgtsttagcgatgtctccc60120180240300360420■540600660720780840■9601020108011401200126013201324〈210〉2〈211〉10〈212〉DNAArtificialsequence〈220〉引物〈400>2ccacagcagt10Artificialsequence<220〉〈223〉引物〈400〉3tgccgagctg104〈211>10〈212〉腿〈213〉Artificialsequence〈220>引物4aatggcgcag105〈211〉10〈212〉DNAArtificialsequence〈220〉<223〉引物<400〉5gggag織tc10〈210〉610〈212〉DNAArtificialsequence<220〉引物6tgccgagctg10<210〉7<211〉108〈211〉22DNA〈213>Artificialsequence〈223〉引物8aggaagatgaacttgccgatac22〈210〉9〈211〉18〈212〉〈213〉Artificialsequence〈220〉〈223〉引物10〈211〉19〈212〉腿〈213〉Artificialsequence<220〉<223〉引物〈400〉10aagtgccaaatgttgagtc191118〈212>DNAartificialsequence〈223>引物<400〉11cctggaatctgtcgtgct1812〈211>18〈212>DNA〈213>artificialsequence〈223〉引物〈德12cgagacaccgtccattca18<210〉1318DNAartificialsequence<220〉引物〈400〉13ttccgacattgggcttta18〈210>14<211〉22〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈223〉引物〈400>14aggaagatgaacttgccgatac221520〈212>DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉15gtcgtggtgacggggaccta20權利要求1.一種鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列，其特徵在於，它是SEQIDNO1的DNA序列或其互補序列。2.如權利要求1所述的鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列在鐵皮石斛試管苗鑑定中的應用。3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，利用針對所述鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的特異性探針鑑定鐵皮石斛試管苗或鐵皮石斛。4.一種檢測樣品中是否含有權利要求1所述鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的方法，包括下列步驟(1)使用針對鐵皮石斛試管苗特徵DNA序列的特異性探針對樣品的基因進行擴增；(2)檢測是否獲得相應的擴增產物。5.如權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述鐵皮石斛試管苗的特異性探針序列選自下組中的一組或多組-(1)5'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3'和5'TCGGTCGTCCCGTCGTAT3';(2)5'AAGTGCCAAATGTTGAGTC3鄰5'CCTGGAATCTGTCGTGCT3';(3)5，CGAGACACCGTCCATTCA3'和5'TTCCGACATTGGGCTTTA3';(4)5'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3'和5'GTCGTGGTGACGGGGACCTA3'。6.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於，所述鐵皮石斛試管苗的特異性探針序列為5'AGGAAGATGAACTTGCCGATAC3鄰5'TCGGTCGTCCCGTCGTAT3'。全文摘要本發明涉及鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列及其應用。本發明公開了一種鐵皮石斛試管苗的特徵DNA序列，它是SEQIDNO1的DNA序列或其互補序列。本發明還公開了將鐵皮石斛試管苗的特異性探針用於鐵皮石斛試管苗的鑑定的用途及鑑定的方法。使用本發明對鐵皮石斛試管苗及鐵皮石斛進行鑑定，準確度高，特異性好，鑑別技術易掌握。文檔編號C12Q1/68GK101235377SQ20071003692公開日2008年8月6日申請日期2007年1月29日優先權日2007年1月29日發明者莊意麗,梅其春,顧慧芬申請人:上海雷允上科技發展有限公司;上海市中藥研究所