一種苯駢苯丙素用於製備治療病毒性B肝藥物的用途的製作方法

2023-11-12 07:08:32 1

專利名稱：：一種苯駢苯丙素用於製備治療病毒性B肝藥物的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體而言，本發明涉及式(1)所示的兩個苯駢苯丙素或其可藥用鹽用於製備抑制B型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBVDNA複製、治療乙型病毒性肝炎藥物之用途，該二苯駢苯丙素具有確切抑制HBVDNA活性，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的複製抑制活性是α-幹擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性的1.3至2.2倍，且其中一個超過陽性對照藥物拉米呋啶同樣濃度下對HBVDNA的抑制活性，屬於極其強效的非核苷類抑制B肝病毒天然產物，以上藥效學結果表明該類苯駢苯丙素或其可藥用鹽可預期用於製備抑制HBVDNA複製、治療B型肝炎病毒感染疾病藥物的用途。
背景技術：
：B型肝炎(B肝)是由B型肝炎病毒HBV引起的傳染病。HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一員，其形狀為直徑42納米的球形顆粒。HBV是奇特的病毒，在其它動物中較少有傳染性，唯有在人體或者靈長類動物黑猩猩體內才能得以複製。該病毒通過B肝病毒攜帶者和B肝病人的血液、唾液、精液、陰道分泌物進行傳播，具有慢性攜帶狀態。B肝在我國廣泛流行，因其分為垂直傳播、水平傳播、家庭內傳播、醫源性傳播和性傳播等多種方式，對人群感染率高，在某些地區感染率達到35%以上。據有關資料，肝炎檢測陽性的患者已經達到1.89億，而應就診未就診人數(攜帶者)將近4億，是當前危害人民健康最嚴重的傳染病之一。B肝臨床表現多樣化，易發展為慢性B型肝炎(CHB)和肝硬化，少數病人可轉變為原發性肝癌。近幾年隨著肝病的研究，發展了標準化的HBVDNA的分析，大大推進了對B肝患者病情的了解。HBVDNA的定量分析能預測B肝的嚴重性及其預後，因為HBVDNA持續陽性(即持續病毒血症)容易使B肝病情進展和加重；高B肝病毒(HBVDNA)含量容易促進肝硬化的形成；HBVDNA持續存在是肝細胞癌(HCC)發生的高危因素，特別是病毒含量較高、病程較長、年齡較大或合併其它肝病者；持續高濃度的HBVDNA存在，可導致失代償性肝硬化及原發性肝重症的死亡率明顯增加。同時必須認識到，HBVDNA水平與肝臟組織學的關係極其密切文獻報導經抗病毒治療，肝臟纖維化的改善和消除明顯；近期國際肝病會議報導，強效和低耐藥性的抗病毒治療，隨著HBVDNA的降低和轉陰，而觀察到肝硬化可出現不同程度的逆轉，因此現在主張肝硬化也應進行抗病毒治療。因此，HBVDNA指標在抗病毒治療中的應用起著舉足輕重的作用HBVDNA的水平是決定慢性B型肝炎是否需要抗病毒治療的重要指標；根據HBVDNA的不同情況分別制定出HBeAg陽性或HBeAg陰性的不同治療標準和要求；在抗病毒治療中，根據HBVDNA的治療反應，判斷是否病毒學早期應答進而決定長期用藥的策略以取得持續性的病毒學應答，達到持續病毒抑制的目的；根據HBVDNA的病毒學的應答情況，創造HBeAg血清學的轉換基礎和條件，以達到其良好的中間治療目標；根據HBVDNA持續抑制情況爭取病毒持續陰性，以爭取達到抗病毒最終治療目標；根據HBVDNA持續完全受到抑制，也顯示出了cccDNA的不同程度好轉和消失；在抗病毒治療中，以HBVDNA的變化來評估和預防抗病毒藥物所引起的病毒變異及耐藥發生的風險；一旦發生病毒變異或耐藥時，HBVDNA的變化是唯一的最先的信號和診斷依據，也是治療耐藥和改變治療策略的指導和依據。綜上所述，對HBVDNA的抑制程度在B肝的進一步診斷和治療上有著新的重大意義，對療效的觀察，對評估B肝預後及耐藥危險性均有較大的指導作用。由上述因素可知抑制B肝病毒在體內增殖的一個根本環節在於抑制HBVDNA的複製。HBVDNA水平的降低或者低於檢測水平是檢驗抗病毒藥物的一把金鑰匙。所以，亞太肝臟研究學會和歐洲肝臟研究學會均將HBVDNA檢測不到作為B型肝炎病毒患者治療終點之一。我國新藥開發指南中也將受測化合物對於HBVDNA的抑制強度視為必須完成的測試項目之一。拉米呋啶之所以能夠成為首選核苷類藥物便是因為其具有強效的抑制HBVDNA複製之活性。必須說明的是目前使用的抗病毒藥物其實只是病毒複製的抑制劑，並不能直接殺滅病毒和破壞病毒體，否則就會損傷宿主細胞。這些抗病毒藥物(多為核苷類藥物)還存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥後易反跳等缺點。因此開發新型抗病毒藥物是當今藥物研發領域的當務之急，其對於治療我國大量的B肝患者和病毒攜帶者、控制傳染源等都有著極其重要的社會意義和經濟意義。所以，從民族民間長期使用的天然藥物中發現新的非核苷類B肝病毒抑制劑及此類能夠抑制HBVDNA複製的先導化合物有著很大的指導性意義，並有著遼闊的發展前景。基於此目的，發明人以前曾完成多項抗B肝病毒天然產物及其結構改造衍生物的專利和文章，發現了多種抑制B肝病毒表面抗原HBsAg或B肝病毒e抗原HBeAg活性、或抑制HBVDNA複製的化合物，從而說明從天然產物及其合成衍生物中篩選出能夠抑制HBVDNA複製、防治B肝病毒感染的創新性藥物是可行的[參見「一類對映桉烷醇類倍半萜抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、劉光明、於榮敏、李海波等；ZL200610053827.4)；「2β-羥基冬青酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(李校堃、趙昱、黃可新、李海波等；ZL200610053749.8)；「2α，3β-二羥基-5，11(13)-二烯桉烷_12_酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、張禮和、孫漢董、李海波等；ZL200610053601.4)；「艾裡莫芬烷內酯抑制B肝病毒的用途及其藥物組合物」(趙昱、李海波、楊雷香、周長新等；ZL03153691.3)；「一種艾裡莫芬內酯酸天然產物及其應用」(趙昱、周長新、施樹雲、王曉雨等；ZL200610053575.5)；「一種桉烷型倍半萜酸及其用途」(趙昱、劉光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579.3)；「六稜菊屬植物提取物抑制單純皰疹病毒及B肝病毒的用途」(趙昱、周長新、於榮敏、白驊；CN1989989Α)；「1β_氧代_5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、李校堃、黃可新、李海波等；CN1927197Α)；「1β-羥基冬青酸抑制B肝病毒的醫藥用途」(趙昱、李校堃、黃可新、巫秀美等；CN1935131Α)；「對映艾裡莫芬烷酸及其抑制B肝表面抗原的醫藥用途」(黃可新、李校堃、王曉雨、趙昱等；CN101239054)；「1_氧-取代苯甲醯奎尼酸化合物及其抑制B肝病毒用途」(李校堃、胡利紅、巫秀美、趙昱等；CN101293836)；發明人已發表之抑制HBsAg/HBeAg和HBVDNA等活性文章參見「InVitroAntiviralActivityofThreeEnantiomericSesquiterpeneLactonesfromSenecioSpeciesAgainstHepatitisBVirus，，，HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周長新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(趙昱)等,AntiviralChemistry&Chemotherapy，2005，16，277—282;「EvaluaitionofAntiviralActivityofCompoundsIsolatedfromRanunculussieboldiiMiq.andRanunculussceleratusL",HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周長新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(趙昱)等，PlantaMedica，2005，71(12)，1128-1133；"Applicationofhigh-speedcounter-currentchromatographyfortheisolationofantiviraleremophiIenolidesfromLigulariaatroviolacea，，，Shi,Shu-Yun(施樹雲)，Hai-Bo(李海波)，Zhao，Yu(趙昱)等，BiomedicalChromatography,2008,22(9),985-991；"PurificationandidentificationofantiviralcomponentsfromLaggerapterodontabyhigh-speedcounter-currentchromatography",ShuyunShi(施樹雲)，YuZhao(MS)等，JournalofChromatographyB，2007，859，119-124]。毋庸置疑，繼續從天然產物及其結構改造衍生物中尋找能夠抑制HBVDNA複製的先導化合物是非常有必要性和緊迫性的，也因此被國家科技部列為新藥研製重大專項之一。我們設計了一種分子內含有芳香醛基和苯丙素類的駢合體，該分子既有一定的共軛度，大小又合適；既屬於酚類化合物，又屬於松柏醇衍生物，分子內既有氫鍵給體，又有氫鍵供體。所以我們推測式(1)所示化合物之三維構象與HBsAg或或HBeAg乃至HBVDNA之3D空間結構相結合之配體_受體結合複合物形態和結合方式都可能產生較大的差別，其結合位點和結合模式、其結合自由能等均會產生較大的改變，因而可能在清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA複製方面有著意想不到的效果。左國營等(左國營，劉樹玲，徐貴麗，世界華人消化雜誌，2006年14卷13期，1241-1246頁)綜述了近20年來藥用植物成分體外抗HBV活性的研究進展，文中論及多種天然產物，其中並沒有報導任何苯駢苯丙素類化合物具有抗HBV活性的相關記錄，尤其是具有式(1)所示結構的含芳香醛基的苯駢苯丙素及其衍生物，國內幾乎無人涉及。因此，我們對其進行了前人未加注意的結構改造和抗HBV活性研究。我們的目的之一是希望發現能抑制HBVDNA複製的苯駢苯丙素先導化合物，從而將其進一步開發成具有能抑制HBVDNA複製、治療CHB的創新性藥物，據此完成本發明。
發明內容本發明的目的是提供式(1)所示結構的苯駢苯丙素或其可藥用鹽用於製備治療乙型病毒性肝炎藥物以及用於製備抑制HBVDNA複製藥物之用途；819(^V0十、w\0HOCH3R=OCH3或OH⑴式(1)化合物選自(士)-2，3-tranS-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2_羥甲基-2，3_二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛或(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛。本發明還提供了兩種製備式(1)所示的苯駢苯丙素類化合物的方法，第一種製備方法特徵是取代苯甲醛在銀鹽催化下，與3，4-二甲氧基肉桂醇進行偶合反應而得；formulaseeoriginaldocumentpage6其中，銀鹽可以是碳酸銀或硝酸銀等，本發明中報告了使用碳酸銀的例子；無水溶劑可以使無水苯、無水丙酮、無水四氫呋喃等無水非質子溶劑或它們的混合物，本發明中報告了無水苯、無水丙酮的混合溶劑。第二種製備方法是咖啡酸乙酯與3，4_二甲氧基肉桂醇在銀鹽存在下直接氧化偶合成新木脂素，該新木脂素再於臭氧與二硫甲醚共同作用下生成化合物(1)。formulaseeoriginaldocumentpage6本發明的另一個目的是提供了一種用於抑制HBVDNA複製、治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其特徵為含有由治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以採用現代製藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米製劑。本發明的式(1)化合物是一種分子內含有芳香醛基和苯丙素類的駢合體，該分子既有一定的共軛度，大小又合適；既屬於酚類化合物，又屬於松柏醇衍生物；分子內既有氫鍵給體，又有氫鍵供體。因而可能在抗B肝病毒方面有著意想不到的效果。我們測試了該化合物對H印G2.2.15細胞的生長抑制作用，同時測試了其對H印G2.2.15細胞分泌的HBVDNA複製的抑制活性。試驗結果發現式(1)所示之苯駢苯丙素化合物對B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的複製具有比較強的抑制作用，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的複製抑制活性是α-幹擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性的1.3至2.2倍，因此該化合物屬於具有顯著效果的非核苷類抑制B肝病毒天然產物。以上均說明式(1)化合物有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預期其可以作為抑制HBVDNA複製、治療乙型病毒性肝炎之活性先導化合物繼續開發。經本發明人詳細的文獻查閱，到目前為止，尚無有關該化合物治療B肝病毒感染性疾病和製備抗B肝病毒藥物的報導。苯駢苯丙素式(1)化合物對於HBVDNA強效抑制均屬於意想不到的發現，有著確切的原創性。綜上所述，我們製備的該苯駢苯丙素既有結構上的獨特性，又有抗病毒作用方面研究的新穎性，並在抗B肝病毒活性測試中發現了不尋常的抑制HBVDNA的活性，有望成為抑制HBVDNA複製及治療CHB之先導化合物。本發明有益之處在於首次發現式(1)所示之苯駢苯丙素具有抑制HBVDNA複製的功效，並在防治B肝病毒方面的成藥潛力；為開發成為治療B肝病毒創新藥物，開發抑制HBVDNA複製之創新藥物提供了新的物質基礎。具有潛在巨大的社會效益和經濟效益。本發明再一特點為本發明之合成起始物來源方便，合成方便。其製備方法簡單易行，原料來源方便易得，成本低，汙染小，利於節能減排條件下的大規模生產。產業化前景十分明確。具體實施例方式本發明人通過多步簡單合成，並通過層析手段得到該能有效抑制HBVDNA複製活性的一個苯駢苯丙素類活性化合物，又經質譜和核磁共振波譜等綜合解析推導出其化學結構。本發明人發現，式(1)化合物對H印G2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，而對H印G2.2.15細胞分泌的HBVDNA之複製具有顯著的抑制作用，提示該化合物具有用藥安全、抑制HBVDNA複製高效的特點。因此，根據本發明人的研究，發明人所設計併合成的式(1)所示之苯駢苯丙素化合物可以用於製備治療B肝病毒感染性疾病的藥物和用於治療B肝病毒感染性疾病。為了更好地理解本發明的實質，下面分別用式(1)化合物的製備及其對H印G2.2.15細胞生長抑制作用以及對H印G2.2.15細胞分泌的HBVDNA複製之抑制作用試驗的結果，說明其在製藥領域中的新用途。實施例給出了式(1)化合物的部分合成、結構鑑定、和活性數據。必須說明，本發明的實施例是用於說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。實施例1化合物(士)-2，3-仕￡11^-3-(3，4-二甲氧基苯基-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛的製備儀器與試劑紫外光譜用ShimadzuUV-240紫外分光光度計測定；核磁共振氫譜1H-NMR由INOVA型超導核磁共振波譜儀(VARIANIN0VA-400MHz)測定(四甲基矽醚TMS為內標)；電噴霧質譜ESI-MS由BrukerEsquire3000+質譜儀測定，柱層析用矽膠(100-200，200-300和300-400目)以及薄層層析用矽膠GF254(10-40目)均由青島海洋化工廠生產；所用試劑均為分析純，薄層製備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔矽膠板；柱色譜用葡聚糖凝膠SephadexLH-20採用瑞典AmershamPharmaciaBiotechAB公司產品；反相矽膠RP-18採用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex產品；MCI為日本三菱化工公司產品，薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鉬酸溶液。1.1製備方法1(銀鹽催化下直接氧化偶合法)在乾燥500毫升三口瓶中，加入0.38克3，4_二羥基苯甲醛和0.62克3，4_二甲氧基肉桂醇，氬氣保護下加入80毫升無水苯和20毫升無水丙酮。於60°C攪拌20分鐘，再加入0.765克碳酸銀劇烈攪拌7小時。混合物過濾，濾液減壓濃縮，加矽膠拌樣後，用16克200-300目矽膠柱層析，石油醚醋酸乙酯(31)反覆洗脫，得到黃色固體0.354克。Rf(氯仿/甲醇=251):0.35;核磁共振氫譜(400MHz，氘代丙酮)δ:3.58(單峰，3Η，OMe)，3.65(單峰，3Η,OMe)，3.88(多重峰，1Η,H_9a)，4.08(多重峰，1H,H_9b)，4.41(多重峰，1Η，Η-2)，5.35(雙峰，J=11.2Ηζ，1Η，Η-3)，6.777.13(多重峰，3H，H-2'，5'，6')，7.15(雙峰，J=8.4Ηζ,1Η，Η-8)，7·38(雙峰，J=1.2Ηζ,1Η，Η_5)，7·47(雙雙峰，J=8.4，1.2Hz,1Η,Η-7)；電噴霧質譜ESI-MS329[Μ-Η]+。1.2製備方法2:向乾燥的反應瓶中投入碳酸銀667毫克，478毫克咖啡酸乙酯和480克3，4_二甲氧基肉桂醇，氬氣保護下加入16毫升無水苯和8毫升無水丙酮，在45°C時保溫反應12小時。冷至室溫後靜置，濾去不溶物，母液減壓濃縮，得黃色油狀物，經20克200-300目矽膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯(31)洗脫，得到343毫克中間體化合物。Rf(氯仿/甲醇/甲酸=2510.5):0.40；電噴霧質譜ESI-MS:m/z399[Μ-Η]+0直接用於下一步反應。中間體酯300毫克溶於15毫升甲醇中，向三口瓶中通臭氧，後降溫至_70°C，再通入臭氧1小時，薄層檢測反應畢，停止反應。通入氬氣5分鐘後，加入1毫升二甲硫醚，於-30°C下攪拌一小時。減壓蒸除溶劑，醋酸乙酯萃取有機相，蒸除醋酸乙酯後得790毫克油狀物。以200-300目矽膠12克柱層析，石油醚/醋酸乙酯(21)反覆純化，最終得到186毫克(士)-2，3-^^仙-3-(3，4-二甲氧基苯基)2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][1,4]二氧六環-6-基-甲醛。Rf(氯仿/甲醇=251):0.35;核磁共振氫譜(400MHz，氘代丙酮)δ3.58(單峰，3Η,OMe)，3.65(單峰，3Η,OMe)，3.88(多重峰，1Η,H_9a)，4.08(多重峰，1H,H-9b),4.41(多重峰，1H,H-2)，5.35(雙峰，J=11.2Hz,1H,Η_3)，6·777.13(多重峰，3Η,Η-2『，5'，6')，7·15(雙峰，J=8.4Hz，1Η，Η-8)，7·38(雙峰，J=1.2Hz，1Η，Η-5)，7.47(雙雙峰，J=8.4，1.2Ηζ，1Η，Η-7)；電噴霧質譜ESI-MS:m/z329[M-H]+。實施例2化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2_羥甲基-2，3_二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛的製備儀器與試劑同實施例1。2.1製備方法1(銀鹽催化下直接氧化偶合法)在乾燥500毫升三口瓶中，加入0.38克3，4-二羥基苯甲醛和0.52克松柏醇，氬氣保護下加入80毫升無水苯和20毫升無水丙酮。於60°C攪拌20分鐘，再加入0.765克碳酸銀劇烈攪拌7小時。混合物過濾，濾液減壓濃縮，加矽膠拌樣後，用16克200-300目矽膠柱層析，石油醚醋酸乙酯(31)反覆洗脫，得到黃色固體0.328克，產率38%。Rf(氯仿/甲醇=251):0.32；核磁共振氫譜(400MHz，氘代丙酮)3.58(單峰，3H，OMe)，3.89(多重峰，1H,H-9a)，4.08(多重峰，1H,H_9b)，4.40(多重峰，1H,H-2)，5.32(雙峰，J=11.2Hz,1Η，Η-3)，5·59(單峰，1H，4'-OH)，6·787·13(多重峰，3H，H_2『，5'，6')，7.15(雙峰，J=8.4Hz,1H,Η-8)，7.39(雙峰，J=L2Hz,1Η,Η-5)，7.47(雙雙峰，J=8.4，1.2Hz,1Η,Η-7)；電噴霧質譜ESI-MS:m/z315[M_H]+。2.2製備方法2向乾燥的反應瓶中投入碳酸銀667毫克，478毫克咖啡酸乙酯和420克松柏醇，氬氣保護下加入16毫升無水苯和8毫升無水丙酮，在45°C時保溫反應12小時。冷至室溫後靜置，濾去不溶物，母液減壓濃縮，得黃色油狀物，經20克200300目矽膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯(31)洗脫，得到322毫克中間體化合物。Rf(氯仿/甲醇/甲酸=2510.5):0.38；電噴霧質譜ESI-MS:385[M-H]+。直接用於下一步反應。中間體酯300毫克溶於15毫升甲醇中，向三口瓶中通臭氧，後降溫至_70°C，再通入臭氧1小時，薄層檢測反應畢，停止反應。通入氬氣5分鐘後，加入1毫升二甲硫醚，於-30°C下攪拌一小時。減壓蒸除溶劑，醋酸乙酯萃取有機相，整除醋酸乙酯後的780毫克油狀物。以200-300目矽膠12克過柱，石油醚/醋酸乙酯=21反覆純化，最終得到180毫克(士)-2，3-廿皿8-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛。Rf(氯仿/甲醇=251):0.32;核磁共振氫譜(400MHz，氘代丙酮)3·58(單峰，3H,OMe),3.89(多重峰，1H,H-9a),4.08(多重峰，1H,H-9b)，4.40(多重峰，1Η，Η-2)，5·32(雙峰，J=11.2Hz，1Η，Η-3)，5.59(單峰，1H，4'-OH),6.787.13(多重峰，3Η，Η-2'，5'，6')，7·15(雙峰，J=8.4Hz，1Η，Η-8)，7·39(雙峰，J=1.2Hz，1Η，Η-5)，7.47(雙雙峰，J=8.4，1.2Hz，1Η，Η-7)；電噴霧質譜ESI-MS:m/z315[M-H]+。實施例3(士)-2,3-trans~3-(3,4-二甲氧基苯基)2_羥甲基_2,3_二氫苯並[b][1,4]二氧六環-6-基-甲醛對H印G2.2.15細胞分泌的B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)複製的抑制作用3.1細胞培養將H印G2.2.15細胞培養於含10%滅活胎牛血清，100U/毫升青黴素和100U/毫升鏈黴素，100微克/毫升G418的DMEM培養基中，置37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養。3.2採用MTT法測定化合物(士)_2，3-tranS-3-(3，4_二甲氧基苯基)2_羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環6-基-甲醛對H印G2.2.15細胞生長的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的化合物(士)_2，3-trans-3-(3,4-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-2，3_二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛(樣品編號化合物(Ι-a))，濃度分別為1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養，培養72小時後，每孔加入MTT試劑10微升，繼續培養4小時，棄去培養基，每孔加入DMSO200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標儀測定OD值。以只加培養基的培養孔為對照孔。抑制率(％)=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值X100%。實驗重複三次。3.3測定化合物(士)-2，3-tranS-3-(3，4-二甲氧基苯基)2_羥甲基-2，3_二氫苯並[b][1,4]二氧六環-6-基-甲醛對HBVDNA複製的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的化合物(士)_2，3-trans-3-(3,4-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-2，3_二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛(樣品編號化合物(Ι-a))，濃度分別為100、20和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養，每4天換含相同濃度樣品的培養基，將同一樣品同一濃度的換出的培養基等體積混勻，作為待測樣品。第8天時用HBVDNA定量PCR試劑盒測定培養基中HBVDNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1(測試濃度為100、20和4微克/毫升)，以α-幹擾素為陽性對照2(測試濃度為10000、5000和1000單位/毫升)。3.4實驗結果實驗結果如表1所示，化合物(士)-2，3_廿￡11^-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛具有強效的抑制B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)複製的作用。表1樣品第8天時對H印G2.2.15細胞的HBVDNA複製的抑制率tableseeoriginaldocumentpage10該實施例結果說明化合物(士)-2，3-tranS-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2_羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛對B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的複製具有比較強的抑制作用，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的複製抑制活性是α-幹擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性的2.2倍，且超過同樣濃度下陽性對照藥物拉米呋啶對HBVDNA的抑制活性(見表1)，屬於極其強效的非核苷類抑制B肝病毒天然產物，值得進一步關注和深入研究，並可預期進一步優化發展為抑制HBVDNA複製的藥物。實施例4化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2_羥甲基-2，3_二氫苯並[b][1,4]二氧六環-6-基-甲醛對H印G2.2.15細胞分泌的B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)複製的抑制作用4.1細胞培養同實施例3。4.2採用MTT法測定化合物(士)_2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)_2_羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛對H印G2.2.15細胞生長的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的化合物(士)-2，3-trans-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛(樣品編號化合物(1-b))，濃度分別為1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C,5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養，培養72小時後，每孔加入MTT試劑10微升，繼續培養4小時，棄去培養基，每孔加入DMSO200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標儀測定OD值。以只加培養基的培養孔為對照孔。抑制率(％)=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值X100%。實驗重複三次。4.3測定化合物(士)_2，3-trans-3-(3_甲氧基_4_羥基苯基)_2_羥甲基_2，3_二氫苯並[b][1,4]二氧六環-6-基-甲醛對B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)複製的抑制作用取對數生長期的H印G2.2.15細胞，用培養基將細胞稀釋成IXIO5個/毫升，接種於96孔細胞培養板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對溼度的培養箱中培養24小時後加入用培養基稀釋的化合物(士)-2，3-trans-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛(樣品編號化合物(1-b))，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設三個復孔，置於37°C，5%C02，100%相對溼度的培養箱中培養，每4天換含相同濃度樣品的培養基，將同一樣品同一濃度的換出的培養基等體積混勻，作為待測樣品。第8天時用HBVDNA定量PCR試劑盒測定培養基中HBVDNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1(測試濃度為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)，以α-幹擾素為陽性對照2(測試濃度為10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單位/毫升)。4.4實驗結果實驗結果如表2所示，化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][1，4]二氧六環-6-基-甲醛具有強效的抑制B型肝炎病毒脫氧核糖核酸複製的作用。表2樣品第8天時對H印G2.2.15細胞的HBVDNA複製的抑制率tableseeoriginaldocumentpage11該實施例結果說明黃酮木脂素化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環-6-基-甲醛對B型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的複製具有比較強的抑制作用，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的複製抑制活性是α-幹擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性的1.3倍，達到拉米呋啶抑制HBVDNA活性的60%，屬於強效的非核苷類抑制B肝病毒天然產物，值得進一步關注和深入研究，並可預期進一步優化發展為抑制HBVDNA複製的藥物。在上述說明書闡述本發明時，同時提供了實施例的目的是舉例說明本發明的實際操作過程和本發明的意義。在進入本發明權利要求和其等同物範圍內時，本發明的實際應用包括所有一般變化、配合，或改進。權利要求具有式(1)所示結構的苯駢苯丙素或其可藥用鹽用於製備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途；R＝OCH3或OH(1)其特徵為式(1)化合物選自(±)-2，3-trans-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][1，4]二氧六環-6-基-甲醛或(±)-2，3-trans-3-(3-甲氧基4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][1，4]二氧六環-6-基-甲醛。FSA00000134348800011.tif2.具有式(1)所示結構的苯駢苯丙素或其可藥用鹽用於製備抑制B型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBVDNA複製藥物之用途；formulaseeoriginaldocumentpage2其特徵為式(1)化合物選自(士)-2，3-廿皿8-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羥甲基-2，3_二氫苯並[b][1,4]二氧六環-6-基-甲醛或(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-2，3-二氫苯並[b][l，4]二氧六環6-基-甲醛。全文摘要本發明涉及一種苯駢苯丙素用於製備治療病毒性B肝藥物的用途，具體而言，本發明涉及兩個苯駢苯丙素或其可藥用鹽用於製備抑制B型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBVDNA複製、治療B型肝炎病毒感染疾病藥物的用途，該二苯駢苯丙素具有確切抑制HBVDNA活性，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的複製抑制活性是α-幹擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性的1.3至2.2倍，屬於強效的非核苷類抑制B肝病毒天然產物，以上藥效學結果表明該類苯駢苯丙素或其可藥用鹽可預期用於製備抑制HBVDNA複製、治療B型肝炎病毒感染疾病藥物的用途。文檔編號A61K31/357GK101829093SQ20101018153公開日2010年9月15日申請日期2010年5月25日優先權日2010年5月25日發明者吳俊珠,孫蓮莉,巫秀美,廖曉輝,李鳳賢,楊雷香,趙昱,郝小江申請人:大理學院