體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法、試劑盒以及腫瘤疫苗與流程

2023-11-11 20:32:52 1

本發明涉及分子免疫學和細胞免疫學領域，更具體地說，涉及一種體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法、試劑盒，以及腫瘤疫苗。

背景技術：

T細胞通過T細胞表面免疫受體特異性識別腫瘤細胞的主要組織相容性分子(Major histocompatibility complex，MHC)遞呈的抗原肽段(即抗原表位)來殺死或者殺傷癌細胞。CD8+細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)能特異性識別靶細胞分泌重要的細胞因子幹擾素γ(Interferonγ,IFNγ)，並直接殺傷癌細胞。CD4+輔助T細胞識別腫瘤抗原表位後能分泌多種細胞因子包括IFNγ、IL2、IL4和TNFα，激活CD8+CTL識別並殺傷腫瘤細胞。目前找尋合適的腫瘤細胞特有靶點，即腫瘤抗原，以及擴增特異性識別腫瘤抗原的免疫細胞是腫瘤免疫治療技術的關鍵技術。目前大部分細胞免疫治療選擇的靶點是腫瘤細胞過表達抗原，即在腫瘤細胞中的表達遠遠高於正常細胞。腫瘤新生抗原是區分腫瘤細胞和正常細胞的特異性靶點，是腫瘤免疫細胞治療的最佳靶點。

檢測特異性識別腫瘤新生抗原的T細胞可以使用MHC-肽多聚體染色(比如ProImmune的五聚體，Beckman coulter的四聚體以及Immundex公司的dextramer)。外周血中新生抗原特異性的T細胞能結合MHC-腫瘤新生抗原肽的多聚體，偶聯在多聚體上的螢光分子在雷射激活下會發出螢光，所以結合了MHC-肽多聚體的腫瘤新生抗原肽多聚體的特異性T細胞可以被細胞流式儀檢測到，用來分析病人外周血中識別腫瘤新生抗原肽的T細胞數量和比率。

然而，使用MHC-肽多聚體流式細胞分析方法檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞識別主要有以下幾個缺點：

1)不確定性高：腫瘤新生抗原的長度以及遞呈它對應的MHC分子都具有不確定性，因此可能無法產生穩定的MHC-新生肽的多聚體；

2)敏感度低：MHC-肽多聚體流式細胞分析方法能有效檢測的特異性T細胞比率是0.001％，當低於這個數值時，將無法被檢測；

3)功能缺失：MHC-肽多聚體流式細胞分析方法只能展現特異性T細胞能特異性地結合MHC-肽複合體，但不能檢測到T細胞識別抗原肽後是否能有效被刺激，分泌功能性細胞因子或者殺傷腫瘤細胞；

4)費用高：每一個抗原肽需要由特定的MHC分子遞呈而被T細胞識別，因此檢測費用高。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題在於，針對現有技術的上述缺陷，提供一種確定性強、敏感度高、功能全面且費用低廉的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法和試劑盒，以及可以用於擴增腫瘤新生抗原特異性T細胞的腫瘤疫苗。

本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：構造一種體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法，包括：

S1、在外周血單個核細胞的細胞培養液中加入腫瘤新生抗原刺激並進行培養孵育；

S2、採用IFNγ酶聯免疫斑點法檢測識別所述腫瘤新生抗原的腫瘤新生抗原特異性T細胞。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述步驟S1包括：

S11、採用抗原預測軟體netMHC4設計所述腫瘤新生抗原；

S12、在懸浮所述外周血單個核細胞的細胞培養液中加入所述腫瘤新生抗原進行預刺激並進行培養。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述步驟S11包括：

S111、取離體腫瘤組織做基因分析，以找出非同義的基因突變位點；

S112、採用抗原預測軟體netMHC4基於包含所述非同義基因突變位點的抗原與相應的主要組織相容性分子的結合能力選擇結合能力最好的抗原肽序列；

S113、採用抗原預測軟體netMHC4從所述抗原肽序列中選擇出其與相應的主要組織相容性分子的結合能力明顯高於其對應的非基因突變位點與相應的主要組織相容性分子的結合能力的抗原肽序列作為所述腫瘤新生抗原。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述腫瘤新生抗原包括序列為LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列為KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述步驟S12包括：

S121、將所述外周血單個核細胞在無血清細胞培養液中懸浮，並加入所述腫瘤新生抗原進行預刺激；

S122、在常溫含CO2的培養箱中進行培養。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述步驟S2包括

S21、將預刺激後的所述外周血單個核細胞轉移到包被有IFNγ抗體的容器內，加入所述腫瘤新生抗原進行孵育，從而使得受到所述腫瘤新生抗原刺激後的腫瘤新生抗原特異性T細胞分泌IFNγ；

S22、所述IFNγ抗體捕獲所述IFNγ，且通過酶聯反應產生新生肉眼可見的免疫斑點；

S23、統計所述免疫斑點的數量，以基於所述免疫斑點的數量檢測所述腫瘤新生抗原特異性T細胞的數量。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述步驟S21進一步包括：

S211、採用乙醇水溶液在常溫下潤溼Elispot板，隨後採用PBS清洗所述Elispot板；

S212、加IFNγ抗體以包被所述Elispot板，然後加板蓋低溫孵育過夜，隨後用PBS清洗後加封閉液封閉所述IFNγ抗體未結合的位置，加板蓋常溫孵育；

S213、調整所述無血清細胞培養液中的預刺激後的所述外周血單個核細胞的濃度後，隨後加入相應的所述腫瘤新生抗原形成混合無血清細胞培養液；

S214、將所述混合無血清細胞培養液加入到包被好的所述Elispot板的板孔中，加蓋板在常溫含CO2的培養箱中進行培養。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法中，所述步驟S22進一步包括：

S221、棄除所述無血清細胞培養液，然後採用PBS進行清洗，隨後採用清洗液進行清洗；

S222、隨後加入生物素偶聯的IFNγ識別抗體，常溫孵育；

S223、採用清洗液進行清洗，然後加入偶聯鏈酶親和素的辣根過氧化物酶，加板蓋進行常溫孵育；

S224、採用清洗液進行清洗，然後加入辣根過氧化物酶的底物，室溫避光，然後採用清洗液充分清洗，晾乾。

本發明解決其技術問題所採用的另一技術方案是：構造一種體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的試劑盒，包括：腫瘤新生抗原、包被有IFNγ抗體的Elispot板、以及酶聯反應試劑；所述腫瘤新生抗原包括序列為LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列為KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽，所述酶聯反應試劑包括生物素偶聯的IFNγ識別抗體、偶聯鏈酶親和素的辣根過氧化物酶、辣根過氧化物酶的底物，以及助劑。

在本發明所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的試劑盒中，所述助劑包括清洗液、PBS、封閉液、無血清細胞培養液。

本發明還涉及一種腫瘤疫苗，包括用於擴增腫瘤新生抗原特異性T細胞的腫瘤新生抗原，所述腫瘤新生抗原包括序列為LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列為KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。

實施本發明的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法和試劑盒，通過IFNγ酶聯免疫斑點法可以高精度地檢測出腫瘤新生抗原特異性T細胞，且檢測方法簡單、結果明確、成本低廉。實施本發明的腫瘤疫苗，可以有效擴增腫瘤新生抗原特異性T細胞，進而有效用於腫瘤免疫治療藥物的製作。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：

圖1是根據本發明的第一實施例的所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法的流程圖；

圖2是根據本發明的第二實施例的所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法的流程圖；

圖3是腫瘤新生抗原特異性T細胞的免疫反應的Elispot圖；

圖4是腫瘤新生抗原特異性T細胞的免疫斑點示意圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。

本領域技術人員知悉，在下述實施例中，除特別說明之外，各個試劑、儀器均為市面上可以購得的常規產品。在下述實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。對於下述實施例中的試劑濃度、處理溫度以及處理時間，均可以由本領域技術人員根據實際情況加以調節或變化。

圖1是根據本發明的第一實施例的所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法的流程圖。如圖1所示，在步驟S1中，在外周血單個核細胞的細胞培養液中加入腫瘤新生抗原刺激並進行培養孵育。在本發明的一個實施例中，可以採用抗原預測軟體netMHC4設計所述腫瘤新生抗原。在本發明的另一個實施例中，可以採用現有技術中已知的任何可被腫瘤新生抗原特異性T細胞識別的腫瘤新生抗原。在本發明的一個優選實施例中，所述腫瘤新生抗原具有非同義基因突變的長肽或整個抗原蛋白。在本發明中，可以採用本領域中已知的任何技術和方法獲取所述外周血單個核細胞，並採用腫瘤新生抗原刺激並進行培養孵育。

在步驟S2中，採用IFNγ酶聯免疫斑點法檢測識別所述腫瘤新生抗原的腫瘤新生抗原特異性T細胞。在受到所述腫瘤新生抗原刺激之後，所述腫瘤新生抗原特異性T細胞分泌的IFNγ可以被細胞周圍的IFNγ抗體捕獲，通過酶聯反應產生新生肉眼可見的免疫斑點，通過統計免疫斑點的數量就可以檢測所述腫瘤新生抗原特異性T細胞的數量。

因此首先，本發明中的所述腫瘤新生抗原的肽段在於外周血單個核細胞的共孵育過程中，被外周血單個核細胞中的抗原遞呈細胞比如樹突細胞和B細胞自然切割成與自身主要組織相容性分子相符的抗原片段，遞呈給所述腫瘤新生抗原特異性T細胞。因此，所檢測到的所述腫瘤新生抗原特異性T細胞識別的所述腫瘤新生抗原的肽段是自然呈現的，並且包括了通過生物信息方法無法預測到的抗原表位，這樣能確保所述腫瘤新生抗原特異性T細胞識別的抗原表位的天然性以及全面性。

其次，採用IFNγ酶聯免疫斑點法可以檢測到3x105PBMC中的一個特異性T細胞，因此其敏感性極高，有利於檢測到低比例的腫瘤新生抗原特異性T細胞。並且IFNγ酶聯免疫斑點法檢測的是識別腫瘤抗原後並能分泌功能細胞因子IFNγ的腫瘤新生抗原特異性T細胞，即是功能性檢測，直接反應腫瘤新生抗原特異性T細胞的免疫反應。

此外，免疫原性好的腫瘤新生抗原是病人癌症細胞區別於正常細胞特有的靶點，可以作為腫瘤疫苗或者用於擴增腫瘤特異性T細胞應用於腫瘤免疫治療中。

圖2是根據本發明的第二實施例的所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法的流程圖。如圖2所示，在步驟S1中，採用抗原預測軟體netMHC4設計腫瘤新生抗原。在本發明的一個優選實施例中，可以取腫瘤病人的離體腫瘤組織做基因分析，找出非同義的基因突變位點(包括由於核酸的點突變，插入或者缺失而形成的新胺基酸序列)，使用抗原預測軟體netMHC4預測包含基因突變位點的全部候選腫瘤新生抗原。隨後採用抗原預測軟體netMHC4基於其與主要組織相容性分子的結合能力設計併合成包含15-30胺基酸長度的長肽作為腫瘤新生抗原。在設計出腫瘤新生抗原之後，本領域技術人員可以採用現有技術中的任何已知技術和方法合成純度>95％的相關腫瘤新生抗原。

在步驟S2中，在懸浮所述外周血單個核細胞的細胞培養液中加入所述腫瘤新生抗原進行預刺激並進行培養。在本發明的一個實施例中，從外周血分離出外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)用無血清細胞培養液懸浮，加入腫瘤新生抗原肽(包含突變位點的15-30胺基酸長肽)預刺激，在37℃，5％CO2培養箱共培養2天。在本實施例中，刺激培養時間可以根據實際情況進行調整。

在步驟S3中，將預刺激後的所述外周血單個核細胞轉移到包被有IFNγ抗體的容器內，加入所述腫瘤新生抗原進行孵育1天，從而使得受到所述腫瘤新生抗原刺激後的腫瘤新生抗原特異性T細胞分泌IFNγ。孵育時間可以根據實際情況進行調整。

在步驟S4中，所述腫瘤特異性T細胞分泌的IFNγ被細胞周圍的IFNγ抗體捕獲，通過酶聯反應產生肉眼可見的免疫斑點。

在步驟S5中，統計所述免疫斑點的數量，以基於所述免疫斑點的數量檢測所述腫瘤新生抗原特異性T細胞的數量。所述腫瘤新生抗原特異性T細胞的數量反映病人外周血對新生腫瘤的免疫反應強弱。

因此首先，本發明中的所述腫瘤新生抗原的肽段在於外周血單個核細胞的共孵育過程中，被外周血單個核細胞中的抗原遞呈細胞比如樹突細胞和B細胞自然切割成與自身主要組織相容性分子相符的抗原片段，遞呈給所述腫瘤新生抗原特異性T細胞。因此，所檢測到的所述腫瘤新生抗原特異性T細胞識別的所述腫瘤新生抗原的肽段是自然呈現的，並且包括了通過生物信息方法無法預測到的抗原表位，這樣能確保所述腫瘤新生抗原特異性T細胞識別的抗原表位的天然性以及全面性。

其次，採用IFNγ酶聯免疫斑點法可以檢測到3x105PBMC中的一個特異性T細胞，因此其敏感性極高，有利於檢測到低比例的腫瘤新生抗原特異性T細胞。並且IFNγ酶聯免疫斑點法檢測的是識別腫瘤抗原後並能分泌功能細胞因子IFNγ的腫瘤新生抗原特異性T細胞，即是功能性檢測，直接反應腫瘤新生抗原特異性T細胞的免疫反應。腫瘤新生抗原特異性T細胞的免疫反應可以通過肉眼可見的免疫斑點表示，快速簡單地定量檢測病人外周血中腫瘤新生抗原的免疫原性以及腫瘤病人外周血中針對腫瘤新生抗原的免疫反應。

此外，免疫原性好的腫瘤新生抗原是病人癌症細胞區別於正常細胞特有的靶點，可以作為腫瘤疫苗或者用於擴增腫瘤特異性T細胞應用於腫瘤免疫治療中。

並且，腫瘤新生抗原採用生物信息方法預測併合成，方法簡單。腫瘤新生抗原的切割以及遞呈在抗原遞層細胞內自然完成，不需要花費高額費用合成MHC-抗原肽的多聚體。

下面將以實施例的方式詳細對根據本發明的第三實施例的所述的體外檢測腫瘤新生抗原特異性T細胞的方法做進一步的介紹。

實施例1、腫瘤新生抗原的預測和合成

取離體腫瘤組織做基因組分析，找出非同義的基因突變位點(包括由於核酸的點突變，插入或者缺失而形成的新胺基酸序列)，使用抗原預測軟體netMHC4基於包含所述非同義基因突變位點的抗原與相應的主要組織相容性分子的結合能力選擇結合能力最好的抗原肽序列作為候選的腫瘤新生抗原肽。候選的腫瘤新生抗原肽與相應MHC的結合能力通過達到穩定MHC-抗原肽結合所需要的抗原肽最低濃度表示。濃度越低，表示抗原肽與MHC分子的結合越穩定，它的抗原原性就越強，能更好地刺激特異性T細胞的增殖。

然後採用抗原預測軟體netMHC4從所述抗原肽序列中選擇出其與相應的主要組織相容性分子的結合能力明顯高於其對應的非基因突變位點與相應的主要組織相容性分子的結合能力的抗原肽序列作為所述腫瘤新生抗原。即從候選的腫瘤新生抗原肽中篩選與相應MHC分子的結合力明顯高於對應的非突變肽(即原生肽)與MHC分子的結合力的抗原肽序列作為所述腫瘤新生抗原。確定候選的腫瘤新生抗原肽是腫瘤細胞特有的靶點，可以刺激產生腫瘤細胞靶向的特異性免疫反應，而不會識別表達原生肽的正常細胞。

附表1是採用netMHC4軟體篩選出來的兩個腫瘤新生抗原肽和它們對應原生肽的肽序列。如附表2所示，這兩個腫瘤新生抗原肽與相應MHC分子的結合力都高於對應的原生肽與MHC分子的結合力，表示這兩個突變產生了所需的腫瘤新生抗原。

表1預測的腫瘤新生抗原及其對應原生肽的胺基酸序列

註：粗體並加下畫線的胺基酸為腫瘤新生抗原的突變位點

表2預測的腫瘤新生抗原與相應MHC的結合能力(Kd，nM*)

*：潛在腫瘤新生抗原肽與相應的MHC的結合能力通過達到穩定的MHC-抗原肽結合所需要的抗原肽最低濃度表示，濃度越低，表示肽與MHC分子的結合越穩定，潛在抗原原性就越強。

在預測包含突變位點的腫瘤新生抗原，設計如表1所示的包含腫瘤新生抗原肽的15-30胺基酸長度的長肽，送交肽合成的生物公司合成純度〉95％的腫瘤新生抗原肽備用。

實施例2腫瘤新生抗原肽預刺激

同一例腫瘤病人在知情告知情況下，用肝素鈉抗凝管抽取病人外周靜脈血10mL。用淋巴細胞分離液(Fresenius Kabi Norge AS，LymphoprepTM)通過密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞PBMC後，用新鮮的無血清培養液(Life Technology公司的AIM-V)懸浮，細胞密度在1-3x106/mL。在無血清培養液中，加入上述腫瘤新生抗原肽或者對應的原生肽(1-10μg/mL)，在37℃，5％CO2培養箱中培養36-48h。檢測病人PBMC對原生肽的免疫反應是為了檢驗是否對腫瘤新生抗原的免疫反應是靶向突變序列，以確定腫瘤新生抗原特異性T細胞只特異性靶向識別突變細胞即癌細胞而不殺傷正常細胞。另外加入一個無相關肽(比如HIV病毒的包膜蛋白的一個肽段)作為陰性對照，不加肽作為空白對照，用來評估PBMC中免疫反應的背景水平。

實施例3採用IFNγ酶聯免疫斑點法檢測識別所述腫瘤新生抗原的腫瘤新生抗原特異性T細胞(U-CyTech BV，CT230-PR5)

操作流程參考試劑盒使用手冊。具體實驗流程如下：

用70％乙醇水溶液在常溫潤溼Elispot板1小時，隨後採用PBS清洗2遍後，加IFNγ包被抗體包被Elispot板，加板蓋4℃孵育過夜，用PBS清洗3遍，加封閉液封閉所述IFNγ抗體未結合的位置，加板蓋37℃孵育1小時；

調整預刺激過的PBMC濃度為1-3x106/ml，分別加入相應的1-10ug/mL腫瘤新生抗原(表1中的新生肽1、新生肽2)、腫瘤原生抗原(表1中的原生肽1和原生肽2)、對照肽段(比如HIV病毒的包膜蛋白的一個肽段)的無血清細胞培養液以及空白的無血清細胞培養液；每孔加100ul無血清細胞培養液到包被好的Elispot板上(即每孔1-3x105細胞、每一條抗原肽做2-3個平行孔)，加板蓋37℃，5％CO2培養16-24h；

棄除所述無血清細胞培養液，先用PBS清洗2遍，再用清洗液洗5遍，加入生物素偶聯的IFNγ識別抗體，在37℃孵育1小時；

用清洗液洗5遍，加入偶聯鏈酶親和素的辣根過氧化物酶，加蓋37℃孵育1小時；

用清洗液洗5遍，加入辣根過氧化物酶的底物，室溫避光25-50分鐘，用清水充分清洗板的正反面，晾乾。

用Elispot板分析器統計孔內免疫斑點數(如附圖3所示)，結合每孔中PBMC的細胞總數，計算出一定數目PBMC中特異性識別腫瘤新生抗原並分泌功能細胞因子IFNγ的腫瘤新生抗原特異性T細胞的數目，即識別腫瘤新生抗原特異性T細胞的比例，比例越高說明外周血中針對腫瘤新生抗原的免疫反應越強，腫瘤新生抗原的免疫原性也越強。

如附圖3-4所示，本案例中的腫瘤病人外周血中能識別非突變的兩個原生腫瘤肽並分泌IFNγ的免疫細胞數目跟陰性對照沒有明顯差異，所以原生肽沒有有效刺激腫瘤特異性T細胞的能力，即沒有免疫原性。而能識別兩個腫瘤新生抗原肽並分泌功能細胞因子IFNγ的免疫細胞數目明顯高於針對它們對應的非突變原生肽或者陰性對照，特別是針對新生肽1的免疫斑點非常明顯(附圖3)，表明這兩個潛在腫瘤新生抗原具有免疫原性，能刺激病人外周血中特異性的T細胞，可用於製備腫瘤特異性T細胞或者腫瘤疫苗應用於腫瘤免疫治療。

綜上所述，本發明公開了使用IFNγ酶聯免疫斑點技術檢測腫瘤病人外周血中腫瘤新生抗原特異性T細胞反應，確定腫瘤新生抗原的免疫原性，為病人的腫瘤免疫治療找尋有效的靶點，應用於臨床免疫治療藥物的製作。

本發明進一步公開候選的腫瘤新生抗原採用生物信息方法預測併合成，方法簡單。新生抗原的切割以及遞呈在抗原遞層細胞內自然完成，不需要花費高額費用合成MHC-抗原肽的多聚體。新生抗原特異性T細胞的免疫反應可以通過肉眼可見的免疫斑點表示，很直觀地反映腫瘤新生抗原的免疫原性以及腫瘤病人外周血中針對腫瘤新生抗原的免疫反應。免疫原性好的腫瘤新生抗原是病人癌症細胞區別於正常細胞特有的靶點，可以作為腫瘤疫苗或者用於擴增腫瘤特異性T細胞應用於腫瘤免疫治療藥物的製作中。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。