一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法

2023-11-01 15:33:32

專利名稱：一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及材料製備技術領域，尤其涉及一種兩步法鹽析純化重組絲 蛋白的方法。
背景技術：
桑蠶絲除了作為紡織原料外，由於其優越的力學性能和相對良好的生 物相容性，近年來，以絲素蛋白為基材的各種細胞生長支架材料的研究應 運而生，成為組織工程中的一個熱門研究領域。桑蠶絲素蛋白的分子一級
結構具有高度的重複性，其中70y。由Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser胺基酸序列 組成，是絲素蛋白結晶區域的主要構成單元，為蠶絲蛋白提供良好的熱穩 定性、強度和彈性模量；而Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr 、 Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Val-Gly-Tyr等序列組成絲素蛋白的半結晶區，為蠶 絲蛋白提供良好的伸展能力和彈性。隨著對桑蠶絲素蛋白的基因和分子結 構的深入研究，利用基因重組方法來合成類絲狀蛋白質材料已經成為了可 能。專利號為200610049415.3，名稱為"一種重組動物絲-RGD融合蛋白及 其生物合成方法"發明專利製得了重組動物絲一RGD融合蛋白SEQ ID NO: 1。 由於重組絲蛋白的後續應用開發需要大量且具有一定純度的原料，而 外源基因在表達過程中必然伴有宿主以及其它基因的表達，所以從多種雜 蛋白體系中純化出目的融合蛋白顯得尤其重要，而採用親和層析雖然可以 製得高純度的重組蛋白，但工藝複雜，成本高且不適於大量製備。

發明內容
本發明的目的是提供工藝簡單、成本低、操作方便的一種兩步法鹽析 純化重組絲蛋白的方法，該方法包括下列步驟(1) 將含有目的基因表達質粒的大腸桿菌經發酵培養和IPTG誘導表 達後，離心收集菌體，將其重懸於裂解緩衝液中，冰浴並超聲波破碎後， 離心收集上清，調節pH至6.0後，添加(朋4)2304至20%飽和度，並於37°C 靜置2小時後離心收集上清液；
(2) 將步驟(1)所得的上清液調至pH6.0，添加(NH4)2S04至40X飽 和度，並於37。C靜置2小時後離心收集沉澱，經過真空乾燥後得重組絲蛋 白粉末。
步驟(1)中所述的發酵培養，其所用的發酵培養基是TB液體培養基。 步驟(1)中所述的IPTG的濃度是1 mM，誘導時間4小時。 步驟(1)中所述的誘導表達後離心收集菌體，其離心是在4'C， 8000 rpm， 20 min。
步驟(l)中所述的裂解緩衝液是pH8.0， 50mmol/LNaH2P04， 300mmol/L NaCl， 10咖ol/L咪唑。
步驟(1)中所述的超聲波破碎後離心是4。C， 14500 rpm， 10 min。 步驟(1)中所述的調節pH是用HC1和1N NaOH溶液調節pH值。 步驟(l)中所述的37。C靜置2小時後離心是4。C， 12000 rpm， 20min。 步驟(2)中所述的離心是4T:， 12000 rpm， 20 min。
本發明的有益之處在於，本發明的方法製備的每升培養基可以生產重 組絲蛋白lg左右，與現有技術(對照例)相比，提高20倍，大大提高了 重組蛋白的生產效率。


圖1分別為本發明實施例和對照例中重組絲蛋白的十二烷基硫酸鈉一 聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)照片。
圖1中1泳道一蛋白質分子量標準；2泳道一對照例中的重組絲蛋白， 分子量為22 KD; 3泳道一實施例中的重組絲蛋白，分子量為22 KD。
具體實施例方式
4下面結合實施例詳細說明本發明的技術方案。 實施例
(1) 將含有目的基因(對應的胺基酸序列為n個SEQ ID NO: 1)的 表達質粒(pET30a(+)-SilkRGD(n)，具體參考專利200610049415. 3，名稱 為"一種重組動物絲-RGD融合蛋白及其生物合成方法")的大腸桿菌在1L TB液體培養基中發酵培養0. 5小時，並經IPTG (1 mM)誘導表達4小時後， 離心(4'C， 8000 rpm， 20 min)收集菌體，將菌體重懸於裂解緩衝液(pH 8.0， 50簡1/L NaH2P04 , 300 mmol/L NaCl， 10 mmol/L咪唑)中，冰浴 並超聲波破碎，離心(4°C， 14500 rpm， 10 min)收集上清，用HC1和1N Na0H溶液調節pH至6.0後，添加(NH4) 2304至20%飽和度，並於37。C靜置 2小時後離心(4°C， 12000 rpm， 20 min)收集上清液；
(2) 用HC1和1N NaOH溶液調節步驟(1)所得上清液的pH至6. 0， 添加(朋4)2S04至40%飽和度，並於37T靜置2小時後離心(4。C ， 12000 rpm， 20 min)收集沉澱，經過真空乾燥後得l g重組絲蛋白粉末。
對照例
為獲取高純度重組蛋白的親和層析法。
將含有目的基因表達質粒的大腸桿菌(取與實施例1相同情況下的大 腸桿菌)在1L TB液體培養基中發酵培養0. 5小時，並經IPTG IPTG (1 mM) 誘導表達4小時後，離心(4°C, 8000 rpm， 20 min)收集菌體，將菌體重 懸於裂解緩衝液(pH8. 0， 50mmol/LNaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 10iranol/L 咪唑)中，冰浴並超聲波破碎，，離心(4"C， 14500 rpm， 10 min)收集上 清後，上樣於Ni-NTA柱(購自德國QIAGEN公司)，用相同柱床體積的洗滌 緩衝液(pH 8. 0， 50 mmol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L咪唑) 洗柱3次，最後用同樣柱體積的洗脫緩衝液(pH8.0， 50 mmol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl， 250 mmol/L咪唑)洗脫，收集含目的蛋白的洗脫溶液， 將洗脫溶液放入透析袋中，於4。C下透析三天，冷凍乾燥後得60 mg重組 絲蛋白粉末。
實施例結合圖1:圖1分別為本發明實施例和對照例中製備的重組絲蛋白的SDS-PAGE圖。圖l中l泳道一蛋白質分子量標準；2泳道一對照 例中的重組絲蛋白，分子量為22KD; 3泳道一實施例中的重組絲蛋白，分 子量為22 KD。採用兩步法鹽析純化能夠得到純度較高的重組絲蛋白。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯 然，本發明不限於以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術 人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本 發明的保護範圍。序列表
SEQ ID NO 1:
15 Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 30 Pro Gly Val Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 40 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ala Ser
權利要求
1、一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法，其特徵在於包括步驟如下(1)將含有目的基因表達質粒的大腸桿菌經發酵培養和IPTG誘導表達後，離心收集菌體，將其重懸於裂解緩衝液中，冰浴並超聲波破碎後，離心收集上清，調節pH至6.0後，添加(NH4)2SO4至20％飽和度，並於37℃靜置2小時後離心收集上清液；(2)將步驟(1)所得的上清液調至pH6.0，添加(NH4)2SO4至40％飽和度，並於37℃靜置2小時後離心收集沉澱，經過真空乾燥後得重組絲蛋白粉末。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的發酵培養， 其所用的發酵培養基是TB液體培養基。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的IPTG的 濃度是l mM，誘導時間4小時。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的誘導表達 後離心收集菌體，其離心是在4'C， 8000 rpm， 20 min。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的裂解緩衝 液是pH 8.0， 50 ramol/L NaH2P04， 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑。
6、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的超聲波破 碎後離心是4。C， 14500 rpm， 10 min。
7、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的調節pH 是用HC1和1N Na0H溶液調節pH值。
8、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中所述的37。C靜 置2小時後離心是4。C, 12000 rpm， 20 min。
9、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的離心是4°C， 12000 rpm， 20 min。
全文摘要
本發明公開了一種兩步法鹽析純化重組絲蛋白的方法，(1)將含有目的基因表達質粒的大腸桿菌經發酵培養和IPTG誘導表達後，離心收集菌體，將其重懸於裂解緩衝液中，冰浴並超聲波破碎後，離心收集上清，調節pH至6.0後，添加(NH4)2SO4至20％飽和度，並於37℃靜置2小時後離心收集上清液；(2)將步驟(1)所得的上清液調至pH 6.0，添加(NH4)2SO4至40％飽和度，並於37℃靜置2小時後離心收集沉澱，經過真空乾燥後得重組絲蛋白粉末。本發明的有益之處在於，本發明的方法製備的每升培養基可以生產重組絲蛋白1g左右，與現有技術(對照例)相比，提高20倍，大大提高了重組蛋白的生產效率。
文檔編號C12P21/02GK101487037SQ20091009619
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者吳娟紅, 吳羅傑, 姚菊明, 凱 沈, 範科傑 申請人:浙江理工大學