一種利用蛋白a的高密度包被磁珠純化抗體的方法

2023-11-01 03:56:37

專利名稱：一種利用蛋白a的高密度包被磁珠純化抗體的方法
技術領域：
本發明涉及一種抗體純化的方法，具體涉及一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法。
背景技術：
單克隆抗體是B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交形成的雜交瘤細胞產生的，其重鏈和輕鏈所形成的結構域可以識別和結合特異抗原。1997年FDA批准第一個治療淋巴癌的嵌合單克隆抗體藥物Rituxan Anti-⑶20抗體上市，至2007年，FDA已批准了 20多種治療性單克隆抗體藥物，約一半用於治療癌症，多個已成為年銷售額超十億美元的「炸彈藥物」。全球單克隆抗體藥物的市場增長十分迅猛，約有200多種單抗處於臨床實驗階段，佔整個臨床生物技術藥品總數的三分之一多，其中四分之一在臨床三期或等候批准。單抗藥物已成為全球生物製藥領域發展的主旋律。·單抗藥物的迅猛發展對抗體純化工業提出了新的挑戰。目前，主流的抗體純化生產主要包括以下步驟1、發酵液澄清；2、抗體捕獲；3、抗體精細純化；4、抗體濃縮洗濾；5、抗體過濾除菌/製劑。在抗體捕獲階段，主要應用蛋白A親和層析技術從發酵上清液中提取抗體。蛋白A是一種從金黃葡萄球菌細胞膜上提取的蛋白，具有5個IgG結合結構域，能特異性地與抗體Fe端結合。現階段最常用的蛋白A親和層析介質是通過將蛋白A用化學偶聯的方法固定在瓊脂糖凝膠表面製成親和填料，然後裝填成層析柱。將含有抗體的發酵上清液用泵加壓注入層析柱中，抗體被層析填料上固定的蛋白A捕獲，被捕獲的抗體可以通過洗脫溶液的衝洗從蛋白A親和填料上解離，達到純化及濃縮的目的。然而，以上抗體純化過程存在以下缺點I、發酵溶液需進行澄清操作。單抗通常採用哺乳動物細胞無血清懸浮培養的方法進行製備，發酵液中存在大量細胞，容易對層析系統造成堵塞。因此在層析操作之前需經過離心或過濾操作，去除發酵液中的細胞。工業上大規模的澄清操作通常需要流式離心機或是超濾系統，耗時長、價格高昂而且日常維護複雜。2、層析操作耗時長，儀器昂貴。由於填料可承受的壓力及流速有限，因此單位時間內可處理的樣品量受限於層析柱的大小及填料性質。大型的層析設備及蛋白A親和純化填料非常昂貴，且基本依賴進口，是抗體純化工業的瓶頸。3、層析系統不能處理高粘度樣品。由於受限於填料可承受的壓力，因此高粘度的樣品(如血清或高蛋白濃度樣品)均需要經過稀釋及過濾才能應用於層析操作，造成樣品體積的放大及目標產物的稀釋。4、蛋白A親和層析填料在反覆衝洗的過程中容易發生蛋白A配體的脫落。蛋白A在瓊脂糖基質上是通過共價偶聯實現固定。比較先進的填料為實現蛋白A配基朝向的一致性而達到提高配基利用率的目的，均採用單點定向固定法，即蛋白A與瓊脂糖之間只通過一個共價鍵進行連接，但這種單點固定的方法使蛋白A容易在反覆的層析柱衝洗過程中發生脫落。而蛋白A是高致敏原，容易在人體內引起免疫反應，美國食品及藥品監督管理局(FDA)對單抗藥物中蛋白A配基的殘留量有嚴格的限定。蛋白A脫落現象也影響了親和填料的有效載量及使用壽命。近年來，隨著磁性分離技術的發展，蛋白A包被的超順磁性磁珠越來越多地應用於免疫檢測及小規模的免疫親和純化領域。蛋白A包被磁珠純化技術無需複雜的層析設備，對樣品的澄清度沒有限制，只需要簡單的磁性吸附步驟即可很方便快捷地從單抗表達產物中分離單抗，有效解決了傳統層析技術的不足之處。但由於目前市面上出現的蛋白A包被磁珠的抗體結合效率相對於傳統的瓊脂糖填料仍有很大的差距，因此仍未能大規模地應用於抗體純化工業。

發明內容
為了克服上述的現有抗體純化方法的缺點，本發明的目的在於提供一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法。本發明的目的通過下述技術方案實現 一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，包括以下步驟(I)將蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗體的表達產物加入到反應容器中，攪勻，室溫下孵育5 15min，磁珠在溶液中呈均勻分布狀態；在該過程中磁珠與抗體結合；(2)在反應容器外部或內部施加磁場，使磁珠沿磁場方向運動並貼在容器壁上(見圖I)或磁體上(見圖2)；(3)從反應容器中轉移出上清液；在該過程中，抗體隨磁珠貼在容器壁上或磁體上，其餘成分被轉移出反應容器；(4)將洗滌緩衝液加入反應容器中，撤去磁場，使磁珠重新均勻分散於洗滌緩衝液中；重複步驟(2) (3)，完成一次磁珠洗滌；(5)重複步驟(4)洗滌磁珠2 4次，徹底洗去磁珠上的非特異吸附物質；(6)將洗脫緩衝液加入反應容器中，撤去磁場，使磁珠重新均勻分散於洗滌緩衝液中，室溫下孵育5 15min ;該操作是將磁珠上的抗體洗脫下來；(7)施加磁場使磁珠貼壁，轉移反應容器中的溶液，調節溶液的pH值至中性，得到純化後的抗體。步驟(I)中的蛋白A的高密度包被磁珠已經申請專利，即是中國專利申請201210107107. 7 (申請號)實施例I得到的交聯有固定化SL-PA融合蛋白的磁珠。步驟(I)所述的含有抗體的表達產物可以是血清、細胞表達液或腹水。步驟(2)和(7)所述的施加磁場，其磁通量為100(Γ10000高斯，作用時間為l-5min。步驟(4)所述的洗滌緩衝液含有O. 0Γ0. 5Μ的磷酸緩衝液、I 500mM的NaCl，餘量為水，pH值6 9。步驟(6)所述的洗脫緩衝液含有O. 0Γ4Μ的胺基酸，pH值I. 9飛；所述的胺基酸為甘氨酸、賴氨酸或精氨酸中的一種以上。步驟(7)所述的調節pH值是用IM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液調節。使用後的磁珠重複步驟(4)，洗滌至pH值為中性後可重複用於抗體純化。本發明的機理是
磁性材料的磁性隨溫度的變化而變化，在低溫時材料的磁性很難被改變；而當溫度升高時，材料將變成「順磁體」，其磁性很容易隨周圍的磁場改變而改變。如果溫度進一步提高，或者磁性顆粒的粒度很小時，即便在常溫下，磁體的極性也呈現出隨意性，難以保持穩定的磁性能，這種現象就是超順磁效應。超順磁性磁珠能在外部磁場的作用下迅速聚集，當磁場撤離後即可重新分散而不帶有剩磁。本發明即利用磁珠的這一特性使其作為一種新型的分離純化基質用於生物活性物質的分離純化技術上。
本發明基於利用SLP將功能蛋白定向固定的方法，獲得具有固定化蛋白A配基的超順磁性磁珠(見專利201210107107. 7實施例I)。利用該磁珠對抗體的高效特異性結合，從血清或抗體表達產物中捕獲抗體，然後利用磁性分離器將磁珠-抗體複合物從混合液中分離，經過對磁珠複合物的多次洗滌，去除磁珠表面的非特異吸附物質，最後用洗脫緩衝液使抗體與磁珠解離並釋放到洗脫緩衝液中，達到純化抗體的目的。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果I、本發明使用磁珠親和分離技術進行抗體純化，比傳統的抗體親和層析技術具有更快的抗體捕獲速度(〈15分鐘)；此外，純化操作無需複雜的層析系統，樣品無需進行澄清處理，可以直接對粘度較大的樣品進行純化操作。2、與現有的磁珠親和分離技術相比，本發明由於使用了獨特的SLP固定化技術製備的蛋白A包被磁珠，抗體結合效率大幅提高，蛋白A配基的脫落率達到極低水平，使磁珠分離技術在單克隆抗體大批量純化中的應用成為可能。3、本發明的純化方法節省了發酵液澄清步驟。本發明採用磁珠與樣品直接混合孵育的方式從樣品中捕獲抗體，對樣品的澄清度及粘度沒有特殊要求，可以省去傳統抗體層析純化工藝中樣品澄清過濾的步驟，節省了相應的生產時間及設備需求。4、本發明的純化方法解決了傳統抗體純化層析工藝耗時長，儀器昂貴的問題。本發明的純化方法無需昂貴的進口層析設備，只需要簡單的磁場(由永磁體或電磁體提供均可)即可進行磁珠的分離及收集。由於磁珠具有納米級的直徑，因此能提供極大的捕獲面積，在15分鐘內即可達到與抗體的飽和吸附。5、本發明的純化方法解決了現有抗體親和磁珠載量低的問題。本發明採用以SLP功能蛋白固定化技術製備的具有納米級直徑的蛋白A包被磁珠為原料，具有數倍於一般蛋白A磁珠產品的抗體結合效率，每毫克磁珠抗體結合量高達250 μ g，使磁珠純化技術的大規模使用更經濟更高效。


圖I是利用反應容器外部的磁場進行磁珠固液分離的示意圖。圖2是利用反應容器內部的磁場進行磁珠固液分離的示意圖。圖3是實施例I的純化方法中各步驟產物的SDS-PAGE檢測結果圖；其中，humanIgG-人源IgG標準品對照，S-純化前的人血清，F-純化後的人血清，WUW2-磁珠與人血清反應後的兩次洗滌上清，El-洗脫產物。圖4是實施例I磁珠純化產物的western blot驗證結果圖，左圖為SDS-PAGE電泳圖，右圖為對應的Western blot螢光顯色圖；其中，M-蛋白質標準分子量，I-人血清樣品，2 5_磁珠從人血清中純化的洗脫產物，6-人源IgG標準品。
圖5是實施例2中兩種純化方法得到的人IgGl的SDS-PAGE檢測結果圖；其中，M-蛋白標準分子量，f 2-SL-PA磁珠純化產物，3-親和層析純化產物。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例I利用SL-PA磁珠從人血清中提取人源IgG，包括以下步驟SL-PA磁珠製備方法見中國專利申請《一種利用SLP將功能蛋白定向固定的方法》(專利申請號:201210107107. 7)實施例I。
(I)取SL-PA磁珠IOOmg,加入5ml離心管中，再加入5ml洗漆緩衝液(pH值7. 5,含有50mM磷酸緩衝液和150mM NaCl ;下同),振蕩重懸,放置於磁性分離器上2min,待固液分離後吸去上清液。重複此步驟一次；(2)將洗滌後的磁珠與3ml人血清(購自廣州蕊特生物科技有限公司)(即純化前的人血清S)混合均勻，室溫孵育lOmin，期間不時震蕩以保持磁珠與血清的均勻混合；(3)將離心管放置於磁性分離器上2min，待固液分離後吸去上清液(F)；(4)加入5ml洗滌緩衝液，振蕩重懸，放置於磁性分離器上2min，待固液分離後吸去上清液(Wl)。重複此步驟2次(第二次洗滌上清液為W2)；(5)加入3ml洗脫緩衝液(含有O. IM甘氨酸，pH值2. 5)，混合均勻，室溫孵育IOmin,期間不時震蕩以保持磁珠與溶液的均勻混合；(6)將離心管放置於磁性分離器上2min，待固液分離後收集上清液，此上清液為含有人IgG的純化產物。上清液中馬上加入100 μ I IM Tris溶液(pH 8. O)調節溶液pH值至中性，即為洗脫產物El ；(7)將步驟(6)的純化產物用超純水進行透析或超濾，收集透析或超濾產物，用真空冷凍乾燥機製成凍乾粉。純化產物可用於進一步精細純化操作。人源IgG的純化效果(I)磁珠純化各步驟產物的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測結果見如圖3。從圖3可以看出，SL-PA磁珠從人血清中的純化產物電泳條帶(El)與人源IgG標準品的電泳條帶一致，純度與標準品一致。通過測定280nm處光吸收值計算洗脫產物中人IgG總量為23. 14mg,即每毫克磁珠結合人IgG的量為231. 4 μ g。整個純化流程耗時少於40min，樣品血清無需進行稀釋及過濾，純化操作無需層析系統。而採用傳統的抗體親和層析法處理相同體積的血清樣品，需要將血清原液稀釋5^10倍，經過O. 22 μ m孔徑濾膜過濾，由層析系統將樣品加壓，使樣品流入蛋白A親和純化層析柱，樣品中的人IgG與蛋白A配基結合，然後再經過衝洗層析柱去除未結合的雜蛋白，最後用洗脫緩衝液將結合在層析柱上的抗體洗脫而得到純化後的抗體，全過程耗時超過3小時，需要昂貴的層析系統及過濾裝置。(2)純化產物的驗證以小鼠抗人IgG單克隆單體(購自美國ABcam公司)為一抗，以羊抗小鼠IgG-HRP (購自武漢博士德公司)為二抗，進行蛋白質免疫印跡檢測(Westernblot)，驗證SL-PA磁珠純化產物是否為人IgG，結果如圖4。
從圖4可以看出，磁珠從人血清中純化的洗脫產物與人源IgG標準品具有相同的免疫印跡顯色結果，證明此純化產物為人源IgG。(3)純化產物中蛋白A殘留量測定取SL-PA磁珠從人血清中純化的人IgG產物，並以蛋白A親和純化層析柱(HiTrapMabSelect Iml ;美國GE Iifesciences公司)從人血清中純化的人IgG產物為對照組,用蛋白AELISA檢測試劑盒(ProteinAELISAKit，美國R印IiGen公司)檢測產物中蛋白A殘留量。結果如下表
權利要求
1.ー種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)將蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗體的表達產物加入到反應容器中，攪勻，室溫下孵育5 15min ； (2)在反應容器外部或內部施加磁場； (3)從反應容器中轉移出上清液； (4)將洗滌緩衝液加入反應容器中，撤去磁場；重複步驟(2) (3)一次； (5)重複步驟(4)洗滌磁珠2 4次； (6)將洗脫緩衝液加入反應容器中，撤去磁場，室溫下孵育5 15min； (7)施加磁場使磁珠貼壁，轉移反應容器中的溶液，調節溶液的pH值至中性，得到純化後的抗體； 步驟(4)所述的洗滌緩衝液含有O. ΟΓΟ. 5Μ的磷酸緩衝液、r500mM的NaCl，餘量為水，pH值6 9 ； 步驟(6)所述的洗脫緩衝液含有O. 0Γ4Μ的胺基酸，pH值I. 9 5。
2.根據權利要求I所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特徵在於步驟(6)所述的洗脫緩衝液所含的胺基酸為甘氨酸、賴氨酸或精氨酸中的ー種以上。
3.根據權利要求I所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特徵在於步驟(I)所述的含有抗體的表達產物是血清、細胞表達液或腹水。
4.根據權利要求I所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特徵在於步驟(2)和(7)所述的施加磁場，其磁通量為100(Γ10000高斯，作用時間為l_5min。
全文摘要
本發明公開了一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，該方法包括以下步驟將磁珠和含有抗體的表達產物加入到反應容器中，在反應容器外部或內部施加磁場，然後轉移出上清液；將洗滌緩衝液加入反應容器中，撤去磁場；重複洗滌磁珠2~4次；然後加入洗脫緩衝液，撤去磁場，室溫下孵育5~15min；施加磁場使磁珠貼壁，轉移出溶液，調節溶液的pH值至中性，得到純化後的抗體。本發明使用磁珠親和分離技術進行抗體純化，比傳統的抗體親和層析技術具有更快的抗體捕獲速度；此外，純化操作無需複雜的層析系統，樣品無需進行澄清處理，可以直接對粘度較大的樣品進行純化操作；再者，使用了獨特的蛋白A包被磁珠，抗體結合效率大幅提高，蛋白A配基的脫落率達到極低水平。
文檔編號C07K1/14GK102838674SQ20121035228
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者任輝, 張曙光, 韓藍青, 烏韋·斯萊泰, 安德烈亞斯·布韋特萊瑟, 劉藹珊 申請人:海狸納米科技(蘇州)有限公司