一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法
2023-11-01 05:31:57
專利名稱：一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法
技術領域：
本發明屬於材料化學和食品安全檢測領域，涉及一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，更具體涉及一種在磁性材料表面製備孔雀石綠的分子印跡材料，並應用於養殖水體及水產品中痕量孔雀石綠的分離富集，結合拉曼增強技術進行快速檢測孔雀石綠。
背景技術：
孔雀石綠(Malachite green , MG),為金屬光澤的深綠色結晶狀固體,屬於三苯甲烷類染料，它可用作殺菌劑、驅蟲劑。在水產養殖業用來預防魚的水黴病、鰓黴病、小瓜蟲病等，而且為了使鱗受損的魚延長生命，在運輸過程中和存放池內也常用。具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，因此美國、日本、英國等國家早已禁止其用於水產品養殖業，我國農業部也於2002年將其列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》。但由於孔雀石綠在控制真菌感染和寄生蟲侵襲等方面的顯著效果，而且價格低廉，加之宣傳力度不夠等原因，使得不少業戶還在小範圍使用。2005年5月歐盟檢出我國出口水產品中三苯甲烷類藥物殘留，給我國水產品出口帶來很大影響，因此，對於孔雀石綠的監控格外重要，是近年來食用水產品衛生安全中重點監控的有機汙染物。測定水產品中孔雀石綠等常用的方法有多種，如:分光光度法、薄層色譜法、液相色譜法(LC)、免疫分析法、氣質聯用法(GC -MS )、液質聯用法(LC-MS)等(Roybal JE等，Journal of AOAC International , 1995, 78 (2): 453-457 ;那廣水等，海洋環境科學，2008，27(2): 95-108 ;趙春城等，中國食品衛生雜誌，2009，21 (1): 23-27)。這些方法檢測靈敏度高，但存在需要複雜精密儀器，對樣品分離淨化步驟相對繁瑣，對操作技術要求聞等不足。分子印跡是製備對某一特定化合物具有選擇性識別能力的聚合物的過程，該化合物叫做模板分子(Template Molecular)或者印跡分子(Imprinted Molecular)。分子印跡技術則是指為了獲得在空間和結合位點(Biding Site)上與某一分子(模板分子、印跡分子)完全匹配的聚合物的製備技術。分子印跡聚合物作為新型的高效的分子識別材料，有優越的特異識別性能和高效的選擇性的優點，又具有製備簡單、成本低廉、功能預構、堅固耐用的特點，非常適用於複雜體系中目標化合物的選擇性分離與分析。作為一種高選擇性和高親和性分離材料，分子印跡聚合可克服生物或環境樣品基體複雜、預處理手續繁雜等不利因素，為樣品的採集、富集和分析提供了極大的方便。表面分子印跡技術是在特定載體表面進行修飾製備分子印跡聚合物的一種方法。使印跡位點處於分子印跡聚合物表面，它能克服空間位阻的影響，使模板分子容易接近分子印跡的識別位點，以解決由包埋法得到的分子印跡結合位點不均一、可接近性差、識別動力學慢等問題。磁性分離是依據物質的磁性差異，在磁場作用力的驅動下，把磁性組分從非磁性組分混合物中分離出來的一種分離技術。預先製備一種磁性載體顆粒作為運載工具，藉助於磁性分離裝置，對目標分子進行負載、運載和卸載等分離操作，從而實現目標分子的磁性分離過程。將表面印跡技術與磁性納米材料結合，可以結合表面印跡技術的選擇性和特異識別性與磁性納米材料可磁分離的特點，實現快速、特異分離富集食品中危害因子，有望實現待測物質快速分離和現場應用。拉曼光譜技術具有無須樣品製備、不受水分子的幹擾、可以進行無創快速檢測，檢測設備輕便等特點。表面增強拉曼光譜技術使其檢測限提高了 4至10個數量級，甚至可達十萬億分之一(10_12 g/g)，不僅在物質分子結構分析方面，而且在痕量化學物質快速檢測方面也越來越顯示出巨大的潛力。本發明將磁性分子印跡材料用於實際樣品中孔雀石綠的分離與富集，可以把孔雀石綠從水體和水產品提取液中將孔雀石綠分離，除去影響基質；利用拉曼光譜增強技術實現對富集後的洗脫進行快速檢測，可用於現場快速檢測養殖水體和水產品存儲水體，用於水產品中孔雀石綠的檢測。對於養殖水體檢測靈敏度達到0.5 PPb0
發明內容
本發明的目的在於提供一種具有磁響應分子印跡聚合物的合成方法，及利用合成的磁性分子印跡聚合物分離富集實際樣品中孔雀石綠，並結合拉曼增強光譜技術進行檢測的方法。合成的磁性分子印跡聚合物具有快速吸附、特異性吸附、物理和化學穩定、可磁性快速分離等特點。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
一種孔雀石綠磁性分子印跡材料結合拉曼增強技術用於水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，包括如下步驟:
(一)磁性納米材料合成；
(二)磁性納米材料的矽烷化；
(三)二氧化矽包覆磁性納米材料的乙烯基修飾；
(四)磁性納米材料分子印跡層的製備；
(五)磁性印跡材料用於孔雀石綠的分離富集；
(六)拉曼增強試劑的合成；
(七)利用孔雀石綠分離富集及結合拉曼增強技術檢測；
步驟(一):磁性納米材料為超順磁磁材料，可採用水熱法合成納米尺寸磁性材料或化學共沉澱法合成納米尺寸超順磁磁材料:
(1)水熱法合成的具體步驟如下:
稱取1.3g-2.0g的六水合氯化高鐵，加到40-60 mL的乙二醇中，攪拌溶解，後加入4.5g-5.4 g乙酸鈉和1.0-1.5 g聚乙二醇2000，攪拌混合I小時，將混合均勻的黃色溶液轉移至IOOmL帶有聚四氟乙烯的高壓反應釜，至於200攝氏度烘箱加熱反應10_15h ;冷卻至室溫，所得黑色溶液利用磁鐵分離，用高純水洗滌6遍，無水乙醇洗滌6遍，至於真空乾燥箱60度乾燥至恆重，得到磁性納米材料；
(2)化學共沉澱法合成的具體步驟如下:
稱取四水合氯化亞鐵1.59g-l.98g和六水合氯化高鐵4.32g-5.4g，溶解於超聲和通氮除氧的超純水80-100 mL，機械攪拌溶解，其中Fe37Fe2+的摩爾比為2:1 ;升高溫度至80攝氏度，在快速攪拌條件下加入10-15 mL濃氨水,反應1-1.5h ;冷卻至室溫,磁分離,用超純水和無水乙醇各洗滌7遍，真空60度乾燥至恆重，得到磁性納米材料；步驟二:磁性納米材料矽烷化包覆的具體步驟如下::
稱取300 mg-500 mg的磁性納米材料超聲分散於50-70 mL的異丙醇中，加入4_6 mL的超純水再超聲10-15min，隨後加入5_7mL氨水和2_3 mL的四乙氧基矽烷，室溫反應12h ；所得顆粒產物磁性分離，水洗7遍，真空60度乾燥至恆重；
步驟三:二氧化娃包被磁性納米材料的乙烯基化修飾的具體步驟如下:
稱取200-300 mg的二氧化矽包被磁性材料分散於50-60 mL的無水甲醇或無水乙醇中超聲10-15min，在快速攪拌條件下慢慢滴加Y -甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷(MPS)，室溫攪拌下反應24h，產物磁性分離，無水甲醇或無水乙醇洗滌7遍，真空乾燥至恆重；
步驟四:孔雀石綠磁性納米材料分子印跡層的製備:
以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發劑；稱取100-200 mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散於30-40 mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯0.5mL-Ι.0 mL超聲混勻；甲基丙烯酸66μ -132μ 與模板0.091 g-0.182 g在乙腈30-40 mL中預組裝l_2h ;把磁顆粒與預組裝溶液混合後,加入偶氮二異丁腈20-40 mg,超聲5min,通氮除氧IOmin ;密封后,移到搖床300轉每min, 5(TC預聚合反應6h,6(TC聚合24h ;得到聚合物，磁分離後，水洗5遍，無水乙醇洗滌5遍，真空乾燥後，再用甲醇乙酸(v/v，9/1)溶液索氏提取72h，甲醇提取8h後，60°C真空乾燥至恆重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物；
步驟五:拉曼增強試劑的合成:所用拉曼增強試劑為銀納米溶膠或金納米溶膠，可以通過檸檬酸酸鈉還原硝酸銀溶液或者通過鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液獲得。檸檬酸酸鈉還原:200 mL含有36 mg硝酸銀的水溶液加熱至沸騰,劇烈攪拌下,加入4 mL 1%朽1檬酸鈉的水溶液，反應60-90min ;撤去熱源，攪拌下冷卻至室溫，放於冰箱4度避光保存；鹽酸羥胺還原法:室溫條件，90 mL 1.11 mM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入10 mL鹽酸羥胺/氫氧化鈉(15 mM/30 mM)混合液，反應持續30min，所得溶液放於冰箱保存；或檸檬酸酸鈉還原氯金酸水溶液獲得:0.7 mLl%檸檬酸鈉快速加入至100 mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液，攪拌下回流lh，所得溶液放於冰箱4度避光保存；
步驟六:利用孔雀石綠分離富集及結合拉曼增強技術檢測:
1)水樣品中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下:孔雀石綠磁性印跡材料經2mL無水甲醇，2 mL超純水活化後，加入至待測水體5 mL,振蕩5min，磁分離，棄去清液，I mL的超純水淋洗，磁分離，棄去清液，用200μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測；
2)水產品中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下::
a.提取:稱取5g搗碎的勻漿的海鮮肉於50mL離心管，加入15mL乙腈，振蕩提取2min,超聲提取2min,振蕩提取2min,6000 rpm離心5min,收集清液；再加入10 mL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉澱，振蕩2min,超聲2min,振蕩2min,5000 rpm離心5min,合併清液，即得提取液；
b.淨化:把約25mL的提取液分次加至活化後的3 g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2 mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過活化的3 g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2 mL乙腈淋洗。把濾液移至100 mL梨形瓶，45°C旋轉蒸發至0.9-1.1 mL後,殘液加入3 mL的超純水超聲振蕩提取，收集溶液；再加入2 mL超純水超聲振蕩提取， 收集溶液；溶液經0.2 um的過濾後，收集溶液；C.分離富集:孔雀石綠磁性印跡材料經2 mL甲醇，2 mL水活化後，加入至提取後溶液中，振蕩5min,磁分離,棄去清液，ImL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測；
步驟七:結合拉曼增強技術檢測:取40-100μ 銀膠或金膠，加入0.1-1M，10-25 μ (NaCl或KCl或KBr或KI)溶液，再加入30-75 μ 的待測液，混勻，取30-50 μ 於承載凹槽，雷射聚集，拉曼光譜檢測；
本發明點顯著優點:本發明的方法合成的孔雀石綠磁性分子印跡聚合物材料，可以從養殖水體中快速分離和富集痕量的孔雀石綠，可以快速的從水產品提取液中分離富集孔雀石綠簡化傳統操作步驟，結合拉曼光譜技術進行拉曼增強檢測，可以快速得到檢測結果，可望用於現場快速檢測水體中和水產品中孔雀石綠。本發明的磁性分子印跡材料結合了分子印跡技術的專一識別性能和磁性材料在磁場下快速分離的優點，減少了傳統樣品檢測前處理中操作過程複雜和耗時的弱點。
圖1為孔雀石綠磁性分子印跡聚合物製備示意 圖2為製備的磁性分子印跡聚合物透射電鏡 圖3為銀膠拉曼增強試劑透射電鏡 圖4為金納米顆粒拉曼增強試劑透射電鏡 圖5為不同孔雀石綠標準溶液拉曼增強譜圖，濃度分別為:0，2 ng/mL，5 ng/mL, 10 ng/mL,20 ng/mL,50ng/mL,100 ng/mL,200ng/mL,500ng/mL ; 圖6為加標0.5ppb孔雀石綠的養殖水經分子印跡材料富集洗脫後拉曼檢測圖譜。
具體實施例方式應用本發明的內容，採用孔雀石綠為模板分子，在磁性顆粒合成磁性表面分子印跡聚合物，並應用於養殖水體中的孔雀石綠的分離富集，結合表面增強拉曼進行快速檢測。下面通過具體實施示例對本發明的技術方案做進一步說明，但是不能以此限制本發明的範圍。實施例1
以孔雀石綠為模板，製備磁性表面分子印跡聚合物(其製備示意圖參見圖1)，包括如下步驟:
a.採用水熱法合成磁性納米材料:
稱取1.35 g的六水合氯化高鐵，加到40 mL的乙二醇中，攪拌溶解，後加入3.6 g乙酸鈉和0.2 g聚乙二醇2000，攪拌混合lh，將混合均勻的黃色溶液轉移至50 mL帶有聚四氟乙烯的高壓反應釜，至於200攝氏度烘箱加熱反應IOh ;冷卻至室溫，所得黑色溶液利用磁鐵分離，用高純水洗滌6遍，無水乙醇洗滌6遍，至於真空乾燥箱60度乾燥至恆重，得到磁性納米材料；
b.磁性納米材料矽烷化包覆:
稱取300 mg的磁性納米材料超聲分散於50 mL的異丙醇中，加入4 mL的超純水再超聲15分鐘，隨後加入5 mL氨水和2 mL的四乙氧基矽烷，室溫反應12小時；所得顆粒產物磁性分離，水洗7遍，無水乙醇洗3遍，60度真空乾燥至恆重；
c.二氧化矽包被磁性納米材料的乙烯基化修飾:
稱取200 mg的二氧化娃包被磁性材料分散於50 mL的無水乙醇中超聲15分鐘,在快速攪拌條件下慢慢滴加3 mL Y-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷(MPS)，室溫機械攪拌下反應24小時，產物磁性分離，乙醇洗滌7遍，60度真空乾燥至恆重；
d.孔雀石綠磁性納米材料分子印跡層的製備:
以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發劑；稱取100 mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散於30 mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯1.0mL超聲混勻；甲基丙烯酸132 uL與模板0.182 g在乙腈30mL中預組裝2小時；把磁顆粒與預組裝溶液混合後，加入偶氮二異丁腈40 mg，超聲5分鐘，通氮除氧10分鐘；密封后，移到搖床以300轉每分鐘震蕩，50°C預聚合反應6小時，60°C聚合24小時；得到聚合物，磁分離後，水洗5遍，無水乙醇洗滌5遍，真空乾燥後，再用200 mL甲醇/乙酸(9/1，ν/ν)溶液索氏提取72小時洗脫模板，用150 mL甲醇提取8小時後，60 1:真空乾燥至恆重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物(其透射電鏡圖見圖2)；
實施例2:
應用孔雀石綠磁性分子印跡材料分離富集養殖水體中孔雀石綠和分離富集水產品提取液中的孔雀石綠，具體步驟如下:
a.活化:稱取10mg孔雀石綠磁性分子印跡材料於5 mL離心管中，經2 mL無水甲醇，磁性分離後，倒去廢液；用2 mL水振蕩活化後，磁性分離倒去廢液，得到活化好的孔雀石綠磁性分子印跡材料；
b.養殖水體(為淡水魚存儲所用水體)中孔雀石綠的分離富集:將待測水體過0.22微米的水膜後，取待測濾液水體10 mL，加入活化好的孔雀石綠磁性分子印跡材料振蕩5分鐘，磁分離，棄去清液；2 mL的超純水淋洗，磁分離，棄去清液；用200 uL甲醇乙酸(v/V, 9/1)洗脫2分鐘，收集洗脫液待測；
c.水產品中孔雀石綠的分離富集:
提取:稱取5 g搗碎的勻漿的蝦肉於50 mL離心管，加入15 mL乙腈，振蕩提取2分鐘，超聲提取2分鐘，振蕩提取2分鐘，6000 rpm離心5分鐘，收集清液；再加入10 mL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉澱，振蕩2分鐘，超聲2分鐘，振蕩2分鐘，5000 rpm離心5分鐘，合併清液；
淨化:把約25 mL的提取液分次加至活化後的3g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2 mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過活化的3 g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2 mL乙腈淋洗。把濾液移至100 mL梨形瓶，45 °C旋轉蒸發至I mL後，殘液加入3 mL的超純水超聲振蕩提取，收集溶液；再加入2 mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液；溶液經0.2 um的過濾後，收集溶液；
分離富集:活化後孔雀石綠磁性印跡材料，加入至提取後溶液中，振蕩5分鐘，磁分離，棄去清液，I mL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 uL甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2分鐘，收集洗脫液待測；
實施例3: 結合表面增強拉曼光譜技術檢測孔雀石綠，具體步驟如下:
a.表面拉曼增強粒子的合成
所用拉曼增強試劑為銀納米溶膠或金納米溶膠，可以通過檸檬酸酸鈉還原硝酸銀溶液或者通過鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液或檸檬酸酸鈉還原氯金酸獲得。檸檬酸酸鈉還原:200mL含有36mg硝酸銀的水溶液加熱至沸騰，劇烈攪拌下，加入4 mL 1%檸檬酸鈉的水溶液，反應60分鐘；撤去熱源，攪拌下冷卻至室溫，放於冰箱4度避光保存(其透射電鏡圖如圖3 );鹽酸羥胺還原法:室溫條件，90 mL 1.1lmM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入IOmL鹽酸羥胺/氫氧化鈉(15mM/30mM)混合液，反應持續30分鐘，所得溶液放於冰箱保存；金納米顆粒合成，0.7毫升1%檸檬酸鈉快速加入至IOOmL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液，攪拌下回流I小時，所得溶液放於冰箱保存(其透射電鏡圖如圖4)；
b.表面增強拉曼檢測孔雀石綠:
取40uL銀膠，加入10 uL 0.2 M(NaCl或KCl或KBr或者KI)溶液，再加入30 uL的待測液，混勻，取30uL於承載凹槽，雷射聚集，拉曼光譜檢測；雷射功率為60mW，積分IOs ；(不同濃度孔雀石綠標準溶液的拉曼檢測圖參見圖5，用於待測檢出信號的比對，當待測物出現孔雀石綠的特徵峰即認為有孔雀石綠檢出。)
實施例4:
一種孔雀石綠磁性分子印跡材料結合拉曼增強技術用於水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，包括如下步驟:
步驟一:採用化學共沉澱法合成納米尺寸超順磁磁材料:
化學共沉澱法合成的具體步驟如下:稱取四水合氯化亞鐵1.78g和六水合氯化高鐵4.32g，溶解於超聲和通氮除氧的超純水100 mL,機械攪拌溶解，其中Fe3+/Fe2+的摩爾比為2:1 ;升高溫度至80攝氏度，在快速攪拌條件下加入15 mL濃氨水，反應Ih ;冷卻至室溫，磁分離，用超純水和乙醇各洗滌7遍，真空60度乾燥至恆重，得到磁性納米材料；
步驟二:磁性納米材料娃燒化包覆的具體步驟如下:稱取500 mg的磁性納米材料超聲分散於70 mL的異丙醇中,加入6 mL的超純水再超聲12min,隨後加入6mL氨水和3 mL的四乙氧基矽烷，室溫反應12h ;所得顆粒產物磁性分離，水洗7遍，真空60度乾燥至恆重；
步驟三:二氧化娃包被磁性納米材料的乙烯基化修飾的具體步驟如下:稱取300 mg的二氧化娃包被磁性材料分散於60 mL的甲醇或乙醇中超聲15min,在快速攪拌條件下慢慢滴加Y -甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷(MPS)，室溫攪拌下反應24h，產物磁性分離，甲醇洗滌7遍，真空乾燥至恆重；
步驟四:孔雀石綠磁性納米材料分子印跡層的製備:以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發劑；稱取200 mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散於40mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯1.0 mL超聲混勻；甲基丙烯酸132 PL與模板0.182 g在乙腈40 mL中預組裝Ih ;把磁顆粒與預組裝溶液混合後，加入偶氮二異丁腈40mg,超聲5min,通氮除氧IOmin ;密封后,移到搖床300rpm/min, 50°C預聚合反應6h,60°C聚合24h;得到聚合物，磁分離後，水洗多遍，乙醇洗滌多遍，真空乾燥後，再用甲醇乙酸溶液索氏提取72h，甲醇提取8h後，60°C真空乾燥至恆重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物(其透射電鏡圖如圖2)；其中步驟二到步驟三如圖1所示；
步驟五:拉曼增強試劑的合成:所用拉曼增強試劑為銀納米溶膠，通過鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液獲得。鹽酸羥胺還原法:室溫條件，90 mL 1.11 mM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入10 mL鹽酸輕胺/氫氧化鈉(15 mM/30 mM)混合液,反應持續30min,所得溶液放於冰箱保存；或檸檬酸酸鈉還原氯金酸水溶液獲得:0.7 mLl%檸檬酸鈉快速加入至100 mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液，攪拌下回流lh，所得溶液放於冰箱4度避光保存；
步驟六:利用孔雀石綠分離富集及結合拉曼增強技術檢測:
1)水樣品(所用水體為海水)中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下:孔雀石綠磁性印跡材料經2 mL甲醇,2 mL水活化後,加入至待測水體5 mL,振蕩5min,磁分離,棄去清液,I mL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測(加標至0.5ng/ml孔雀石綠的養殖水經磁性分子印跡材料分離富集檢測的拉曼增強譜圖參見圖6)；
2)水產品中分離富集孔雀石綠的具體步驟如下::
a.提取:稱取5g搗碎的勻漿的蝦肉於50mL離心管，加入15mL乙腈，振蕩提取2min，超聲提取2min,振蕩提取2min,6000 rpm離心5min,收集清液；再加入10 mL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉澱，振蕩2min,超聲2min,振蕩2min,5000 rpm離心5min,合併清液，即得提取液；
b.淨化:把約25mL的提取液分次加至活化後的3 g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過活化的3 g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2 mL乙腈淋洗。把濾液移至100 mL梨形瓶，45°C旋轉蒸發至I mL後，殘液加入3 mL的超純水超聲振蕩提取,收集溶液；再加入2 mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液；溶液經0.2 um的過濾後，收集溶液；
c.分離富集:孔雀石綠磁性印跡材料經2mL甲醇，2 mL水活化後，加入至提取後溶液中，振蕩5min,磁分離,棄去清液，ImL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200 μ 甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脫2min，收集洗脫液待測；
步驟七:結合拉曼增強技術檢測:取100 μ 銀膠或金膠，加入25 μ KCl溶液，再加入75 μ 的待測液，混勻，取5 0μ 於承載凹槽，雷射聚集，拉曼光譜檢測；雷射功率為60mW，積分IOs ；(將待測物檢出拉曼光譜與圖5進行比對，出現孔雀石綠特徵峰即為孔雀石綠檢出)。
權利要求
1.一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述檢測方法是結合分子印跡技術和磁性分離功能，在磁性納米材料表面製備孔雀石綠的分子印跡材料，用於痕量孔雀石綠分離富集，結合拉曼增強技術進行檢測，包括如下步驟: (一)磁性納米材料的合成； (二)磁性納米材料的矽烷化； (三)二氧化矽包覆磁性納米材料的乙烯基修飾； (四)磁性納米材料分子印跡層的製備； (五)拉曼增強試劑的合成； (六)磁性印跡材料用於孔雀石綠的分離富集； (七)利用孔雀石綠分離富集及結合拉曼增強技術檢測。
2.根據權利要求1所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述磁性納米材料為超順磁磁材料，可採用水熱法合成納米尺寸磁性材料或化學共沉澱法合成納米尺寸超順磁磁材料。
3.根據權利要求2所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於:所述水熱法合成的步驟如下:稱取1.3g-2.0g的六水合氯化高鐵，加到40-60mL的乙二醇中，攪拌溶解，後加入4.5g-5.4g乙酸鈉和1.0-1.5g聚乙二醇2000,攪拌混合Ih,將混合均勻的黃色溶液轉移至IOOmL帶有聚四氟乙烯的高壓反應釜，置於200°C烘箱加熱反應10-15h ；冷卻至室溫，所得黑色溶液利用磁鐵分離，用高純水洗滌6遍，無水乙醇洗滌6遍，置於真空乾燥箱60°C乾燥至恆重，得到磁性納米材料。
4.根據權利要求2所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於:所述化學共沉澱法合成的步驟如下:稱取四水合氯化亞鐵1.59g-l.98g和六水合氯化高鐵4.32g-5.4g，溶解於超聲和通氮除氧的超純水80-100mL，機械攪拌溶解，其中Fe3+/Fe2+的摩爾比為2:1 ;升高溫度至801:，在快速攪拌條件下加入10-151^濃氨水，反應1-1.5 h;冷卻至室溫，磁分離，用超純水和無水乙醇各洗滌7遍，真空60°C乾燥至恆重，得到磁性納米材料。
5.根據權利要求1所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述磁性納米材料娃燒化的具體步驟如下:稱取300mg-500mg的磁性納米材料超聲分散於50-70mL的異丙醇中，加入4-6mL的超純水再超聲10-15 min,隨後加入5_7mL氨水和2_3mL的四乙氧基矽烷，室溫反應12 h ;所得顆粒產物磁性分離，水洗7遍，真空60°C乾燥至恆重。
6.根據權利要求1所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述二氧化矽包覆磁性納米材料的乙烯基修飾的具體步驟如下；稱取200-300mg的二氧化矽包被磁性材料分散於50-60mL的無水甲醇或無水乙醇中超聲10-15min,在快速攪拌條件下慢慢滴加Y-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷，室溫攪拌下反應24 h，產物磁性分離，甲醇或乙醇洗滌7遍， 真空乾燥至恆重。
7.根據權利要求1所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述磁性納米材料分子印跡層的製備步驟如下:以孔雀石綠為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯體，乙腈為致孔劑，乙烯基修飾的磁性納米顆粒為載體，偶氮二異丁腈為引發劑；稱取100-200mg乙烯基修飾的磁性納米顆粒超聲分散於30-40mL的乙腈中，加入乙二醇二甲基雙丙烯酸酯0.5mL-l.0mL超聲混勻；甲基丙烯酸66ML-132ML與模板`0.091g-0.182g在乙腈30-40mL中預組裝1_2 h ;把磁顆粒與預組裝溶液混合後，加入偶氮二異丁腈20-40mg,超聲5min,通氮除氧IOmin ;密封后,移到搖床300rpm/min, 50°C預聚合反應6h，60°C聚合24h ;得到聚合物，磁分離後，水洗5遍，無水乙醇洗滌5遍，真空乾燥後，再用甲醇乙酸溶液索氏提取72h，甲醇提取8h後，60°C真空乾燥至恆重；得到孔雀石綠磁性分子印跡聚合物。
8.根據權利要求1所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述拉曼增強試劑的合成如下:所用拉曼增強試劑為銀納米溶膠或金納米溶膠，銀膠可以通過檸檬酸酸鈉還原硝酸銀溶液或者通過鹽酸羥胺還原硝酸銀溶液獲得，金納米顆粒可通過檸檬酸鈉還原氯金酸溶液獲得；所述檸檬酸酸鈉還原的具體步驟如下:200mL含有36mg硝酸銀的水溶液加熱至沸騰，劇烈攪拌下，加入4 mL 1%檸檬酸鈉的水溶液，反應60-90min ；撤去熱源，攪拌下冷卻至室溫，放於冰箱4°C避光保存；所述鹽酸羥胺還原法的具體步驟如下:室溫條件，90 mL 1.1lmM硝酸銀溶液在攪拌的條件下快速加入IOmL鹽酸羥胺/氫氧化鈉混合液，反應持續30min,所得溶液放於冰箱保存；金納米顆粒合成:0.7 mL 1%朽1檬酸鈉快速加入至IOOmL微沸的0.01%氯金酸水溶液，攪拌下回流lh，所得溶液放於冰箱保存；所述鹽酸羥胺/氫氧化鈉混合液中，鹽酸羥胺濃度為15mM，氫氧化鈉的濃度為30mM。
9.根據權利要求1 所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述磁性印跡材料用於孔雀石綠的分離富集，是用於水體中或水產品中的孔雀石綠的分離富集; 所述水體中孔雀石綠 的分離富集方法如下:孔雀石綠磁性印跡材料經2mL甲醇，2mL水活化後，加入至待測水體5mL,振蕩5min,磁分離,棄去清液,ImL的超純水淋洗,磁分離，棄去清液，用200uL甲醇乙酸洗脫2min，收集洗脫液待測；按體積比計，所述甲醇:乙酸=9:1 ; 所述水產品中孔雀石綠的分離富集方法如下: a.提取:稱取5g搗碎的勻漿的海鮮肉於50mL離心管，加入15mL乙腈，振蕩提取2min,超聲提取2min,振蕩提取2min,6000rpm離心5min,收集清液；再加入IOmL的乙腈至離心管，玻璃棒搗碎離心管沉澱，振蕩2min,超聲2min,振蕩2min, 5000rpm離心5min,合併清液，即為提取液； b.淨化:把提取液分次加至活化後的3g中性氧化鋁柱，收集濾液；再2mL乙腈淋洗收集；把濾液再次過活化的3g的中性氧化鋁柱，收集濾液，用2mL乙腈淋洗，把濾液移至IOOmL梨形瓶，45°C旋轉蒸發至0.9-1.1mL後，殘液加入3mL的超純水超聲振蕩提取，收集溶液；再加入2mL超純水超聲振蕩提取，收集溶液；溶液經0.2um的過濾後，收集溶液； c.分離富集:孔雀石綠磁性印跡材料經2mL甲醇，2mL水活化後，加入至水產品提取溶液中，振蕩5min,磁分離,棄去清液,ImL的超純水淋洗,磁分離,棄去清液,用200μ 甲醇乙酸洗脫2分鐘，收集洗脫液待測；按體積比計，所述甲醇:乙酸=9:1。
10.根據權利要求1所述的一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，其特徵在於，所述結合拉曼增強技術檢測的具體方法為:取40-100μ 銀膠或金膠，加入0.1-1M 10_25μ 鹽溶液再加入30-75PL的待測液，混勻，取30_50μ 於承載凹槽，雷射聚集，拉曼光譜檢測；所述鹽溶液為NaCl、KCl、KBr、KI溶液中的任一種。
全文摘要
本發明提供一種水體及水產品中孔雀石綠的檢測方法，是一種在磁性材料表面製備孔雀石綠的分子印跡材料，並應用於養殖水體及水產品中痕量孔雀石綠的分離富集，結合拉曼增強技術進行快速檢測，屬於材料化學和食品安全檢測領域。本發明的磁性分子印跡材料結合了分子印跡技術的專一識別性能和磁性材料在磁場下快速分離的優點，減少了傳統樣品檢測前處理中操作過程複雜和耗時的弱點；利用拉曼增強技術實現快速檢測，有望用於養殖水體中孔雀石綠的現場快速樣品處理和檢測。
文檔編號G01N21/65GK103105386SQ20131003180
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者楊黃浩, 張曉龍, 林立森, 鄭琤, 田中群 申請人:福州大學