包括含有嵌入性假核苷酸(ipn)的嵌入性核酸(ina)的擴增阻斷劑的製作方法

2023-12-10 07:57:27

專利名稱：：包括含有嵌入性假核苷酸(ipn)的嵌入性核酸(ina)的擴增阻斷劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及檢測核酸的檢測法，並且具體地涉及使用DNA擴增阻斷劑的改善的檢測法。本發明還涉及新型DNA擴增阻斷劑，以及適用於特異性和靈敏性檢測核酸中的5-甲基胞嘧啶鹼基的方法。
背景技術：
：目前有許多方法可以用於檢測特異的核酸分子。這些方法典型地依賴於目標核酸和核酸探針之間的序列-依賴性雜交，所述核酸探針在長度上可以從短的核苷酸(20個鹼基或更少)到幾千個鹼基(kb)的序列。從一組核酸序列中擴增特異的序列最廣泛應用的方法是聚合酶鏈式反應(PCR)方法(DieffenbachC和DvekslerGeds.PCRPrimerALaboratoryManual.ColdSpringHarborPress，PlainviewNY)。在這種擴增方法中，互補鏈長度通常為15-30個核苷酸並且在要擴增區域兩端的寡核苷酸，被用來在變性的單鏈DNA上起始DNA合成。使用熱穩定性DNA聚合酶，變性、引物雜交和DNA鏈合成的連續循環使得引物之間的序列進行指數擴增。通過首先用反轉錄酶將RNA複製成DNA以產生cDNA拷貝，可以擴增RNA序列。擴增的DNA片段可以通過許多方法檢測，包括凝膠電泳、印跡、標記探針雜交、使用允許後續鑑定的標記引物(例如通過酶連接的檢測)、使用當與靶點DNA雜交時產生信號的螢光-標記引物(例如Beacon和TaqMan系統)。除了PCR，已經開發了許多其它檢測和擴增特異的核酸序列的技術。一個實例是連接酶鏈式反應(BaranyFGeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193(1991))。對於直接檢測，目標核酸最通常基於大小從凝膠電泳上分離，並且在與同所述目標序列互補的探針雜交之前，轉移到固體支持物上(DNA和RNA印跡)。所述探針可以是天然核酸或類似物，諸如肽核酸(PNA)或鎖定核酸(LNA)。探針可以直接標記(例如用32P)，或者可以使用間接的檢測。間接方法通常依賴於將「標記」諸如生物素或洋地黃毒苷結合到探針中，並且然後通過諸如酶-連接底物轉化或化學發光的方法檢測所述探針。另一種廣泛應用的直接檢測核酸的方法是「夾心式」雜交法。在這種方法中，將捕獲探針偶聯到固體支持物上，並且在溶液中，將目標核酸與結合的探針雜交。洗去未結合的目標核酸，並且使用與目標序列雜交的第二探針檢測結合的核酸。檢測可以使用上文列出的直接或間接的方法。「分支DNA」信號檢測系統是應用夾心式雜交原理的實例(UrdeaMS等.BranchedDNAamplificationmultimersforthesensitive，directdetectionofhumanhepatitisviruses.NucleicAcidsSympSer.1991；(24)197-200)。應用核酸雜交進行核酸序列的直接檢測的快速發展領域是DNA微點陣領域(YoungRABiomedicaldiscoverywithDNAarrays.Cell1029-15(2000)；WatsonANewtools.Anewbreedofhightechdetectives.Science289850-854(2000))。在這一方法中，將可以從寡核苷酸到更長的序列如cDNA克隆範圍的單一核酸種類固定到格子模式的固體支持物上。然後，將標誌的或標記的核酸群體與點陣雜交，並且定量與點陣中每點雜交的水平。儘管可以利用其它的檢測系統，但是最常見地將放射活性-或螢光-標記的核酸(例如cDNAs)用於雜交。目前，檢測DNA中甲基化變化(如在前列腺癌GSTP1基因啟動子中發現的甲基化變化)的選擇方法依賴於在DNA亞硫酸氫鹽修飾後PCR擴增這樣的序列。在亞硫酸氫鹽處理的DNA中，胞嘧啶被轉化成尿嘧啶(並且因此在PCR過程中被擴增為胸腺嘧啶)，而甲基化的胞嘧啶不反應，並且保持為胞嘧啶(FrommerM，McDonaldLE，MillarDS，CollisCM，WattF，GriggGW，MolloyPL和PaulCL.Agenomicsequencingprotocolwhichyieldsapositivedisplayof5-methylcytosineresiduesinindividualDNAstrands.PNAS891827-1831(1992)；ClarkSJ，HarrisonJ，PaulCL和FrommerM.Highsensitivitymappingofmethylatedcytosines.NucleicAcidsRes.222990-2997(1994))。因此，在亞硫酸氫鹽處理後，在序列上，含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA將不同於相應的未甲基化的DNA。可以選擇引物而非選擇性地擴增目的基因組區域，以確定其甲基化狀態，或者可以設計引物而選擇性地擴增其中具體的胞嘧啶被甲基化的序列(HermanJG，GraffJR，MyohanenS，NelkinBD和BaylinSB.Methylation-specificPCRanovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands.PNAS939821-9826(1996))。檢測胞嘧啶甲基化的備選方法包括用限制性酶消化，其切口被位點-特異性DNA甲基化封閉或未被之封閉，之後對目的區域進行DNA印跡和雜交探測。這種方法受到環境的限制，其中有顯著比例(一般＞10％)的DNA在所述位點被甲基化，並且其中存在足夠的DNA，大約1-5μg，以允許用於檢測。使用其切口被位點-特異性DNA甲基化封閉的限制性酶消化，之後使用在所述限制性酶位點兩側的引物進行PCR擴增。這種方法可以使用更少量的DNA，但是由於除DNA甲基化之外的原因引起的完全的酶消化的任何缺少都可能導致假陽性信號。現在，本發明人研發了使用嵌入性核酸(INAs)的方法，其適用於靈敏地並且特異性地檢測甲基化的核酸，其可以極大地減少與甲基化特異性PCR(MSP)反應相關的問題。應用一種出乎意料的INAs特性來實行本發明。
發明內容在第一方面，本發明提供一種擴增阻斷劑，其包括含有兩種或多種能夠阻斷或減少核酸擴增的內部嵌入性假核苷酸(IPNs)的嵌入性核酸(INA)。優選地，INA在長度上為約15-50個，更優選地約18-35個核苷酸或核苷酸類似物，具有2-10個，優選地2-6個位於內部的IPNs。然而，應該理解，可以使用具有多於10個IPNs的更長的INAs。本發明人已經發現，位於在寡核苷酸3′或5′端2個或多個鹼基處的IPNs提供良好的DNA聚合酶的阻斷活性。不同於其它抑制策略，諸如向寡核苷酸加入3種起始-雙脫氧鹼基以停止延伸，按照本發明的阻斷劑不需要化學實體的3′或5′定位而起作用。優選地，在所述核苷酸的3′或5′端，所述INA不含IPNs。IPN優選地選自1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。優選地，嵌入性假核苷酸選自(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺或(R)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。更優選地，IPN是(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。用於本發明實例的一個IPN實例是(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。然而，應該理解，還可以使用其它化學形式的IPNs。按照本發明的阻斷劑適合用於任何擴增形式，諸如PCR和等溫擴增方法。由於PCR是目前保健科學工業所用的優選方法，所以，本發明人使用PCR提供本發明的實例。然而，應該理解，本發明不限於PCR或任何其它擴增形式。在第二方面，本發明提供按照本發明第一方面的阻斷劑阻斷或減少核酸擴增的應用。在第三方面，本發明提供一種檢測核酸分子目標區域甲基化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈上未甲基化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；和進行擴增反應，其中如果所述目標區域被甲基化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域未被甲基化，那麼將沒有擴增產物。在第四方面，本發明提供一種檢測核酸分子目標區域甲基化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈上甲基化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行聚合酶擴增反應，其中如果所述目標區域未被甲基化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域被甲基化，那麼將沒有擴增產物。在一種優選的形式中，所述方法還包括在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第三和第四阻斷劑，所述第三和第四阻斷劑與第一和第二阻斷劑區域的內部區域互補；和提供第三和第四引物，其與第三和第四阻斷劑區域的外部區域以及第一和第二引物區域的內部區域互補。在另一種優選的形式中，所述方法還包括提供按照本發明第一方面的一種或多種其它阻斷劑，所述阻斷劑針對所述核酸分子上的一個或多個區域。優選地，核酸分子上的區域與修飾的核酸模板上的一個或多個區域對應。所述方法還可以包括提供按照本發明第一方面的三種或更多種阻斷劑，所述阻斷劑針對與第一和第二引物區域之間的區域互補的第一或第二鏈。在第五方面，本發明提供一種檢測核酸分子目標區域轉化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈上未轉化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域被轉化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域未被轉化，那麼將沒有擴增產物。在第六方面，本發明提供一種檢測核酸分子目標區域轉化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸分子第一鏈上轉化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域未被轉化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域被轉化，那麼將沒有擴增產物。在第七方面，本發明提供一種檢測核酸分子目標區域狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與具有不理想狀態的修飾的核酸模板第一鏈上的目標區域互補；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域具有理想的狀態，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域具有不理想的狀態，那麼將沒有擴增產物。在第八方面，本發明提供一種檢測核酸分子目標區域狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與具有理想狀態的修飾的核酸模板第一鏈上的目標區域互補；在擴增反應中提供按照本發明第一方面的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域具有不理想的狀態，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域具有理想的狀態，那麼將沒有擴增產物。優選地，所述狀態是甲基化、突變或單核苷酸多態性。在第九方面，本發明提供一種阻斷或減少核酸擴增的方法，其包括在核酸擴增反應中提供一種阻斷劑，其包括含有兩種或多種內部IPNs的INA核酸，其中所述阻斷劑與目的核酸序列互補；和進行擴增反應，以致所述阻斷劑與目的核酸序列結合，並且阻斷或減少在目的序列處或在接近目的序列處的擴增。在第十方面，本發明提供一種阻斷或減少核酸擴增的方法，其包括在核酸擴增反應中提供按照本發明第一方面的阻斷劑，其中所述阻斷劑與目的核酸序列互補；和進行擴增反應，以致所述阻斷劑與目的核酸序列結合，並且阻斷或減少在目的序列處或在接近目的序列處的擴增。在一種有效的形式中，擴增檢測是PCR形式的聚合酶擴增。所述核酸分子可以是DNA或RNA。優選地，所述核酸分子是DNA。在一種優選的形式中，甲基化狀態是甲基化的。在另一優選的形式中，甲基化狀態是未甲基化的。優選地，潛在的鹼基化位點是在3′側連鳥嘌呤(G)的胞嘧啶(C)，在本領域中叫作CpG雙聯體。修飾試劑優選地選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。更優選地，所述試劑是亞硫酸氫鈉，這是一種在水的存在下將胞嘧啶修飾成尿嘧啶的試劑。亞硫酸氫鈉(NaHSO3)易於與胞嘧啶的5，6-雙鍵反應，形成易於脫氨基的磺化的胞嘧啶反應中間體，並且在水的存在下，形成尿嘧啶亞硫酸鹽。如果需要，可以在弱鹼條件下將亞硫酸基去除，導致尿嘧啶的形成。因此，潛在地，所有胞嘧啶都將被轉化成尿嘧啶。然而，由於受到甲基化保護，任何甲基化的胞嘧啶不能被修飾試劑轉化。在一種優選的形式中，一種或多種阻斷劑針對核酸分子上一種或多種潛在的甲基化位點。在另一種優選的形式中，阻斷劑不與核酸分子上潛在的甲基化位點結合。在一種更常見的形式中，本發明人發現，可以通過將探針/阻斷劑雜交到DNA區域上，而阻滯聚合酶沿DNA片段的移動。這在PCR中(Saiki等，(1998)Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science239487-491)，或其它擴增方法中引起某些序列擴增的抑制，諸如但不限於，連接酶鏈式反應(LCR，BaranyF.(1991)GeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193)，和等溫擴增方法，包括鏈置換擴增(SDA，Walker等，(1992)IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestriction/DNApolymerasesystem.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89392-396)，基於核酸序列的擴增(NASBA，Kievitis等，(1991)NASBATMisothermalenzymaticinvtronucleicacidamplificationoptimisedforthediagnosisofHIV-1.J.Virol.Methods35273-286)，基於轉錄的擴增((TAS)Kwoh等(1989)Transcription-basedamplificationsystemanddetectionofamplifiedhumanimmunodeficiencyvirustype1withabead-basedsandwichhybridizationformat.ProcNatlAcadSciUSA.41173-7)，解旋酶鏈式反應(HCR，VincentandKong，(2004)Helicase-dependentisothermalDNAamplification.EMBOReports5(8)1-6)，滾環式擴增(RCA，FireA.和XuS.Q.，(1995)RollingreplicationofshortDNAcircles.Proc.Natl.Acad.SciUSA924641-4645)，自動維持序列複製(3SR，Guatelli等，(1990)Isothermal，inviroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodelledafterretroviralreplication.Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874-1878)。使用修飾的3』寡核苷酸序列如加入3』雙脫氧核苷酸已經表現出終止聚合酶延伸。出乎意料地，發現IPN分子不必位於寡核苷酸的3』末端，而是實際上可以位於INA內部，並且仍然阻斷聚合酶的延伸。表明如果INA引物具有位於其內部的多個IPNs，那麼DNA聚合酶很難轉移/降解已經雜交到給出的基因組區域的INA引物。INA中的IPNs有效地作用為聚合酶進程的阻斷劑。INAs這種未曾意料到的特性意味著人們可以阻斷區域中未甲基化的序列擴增，並且只擴增甲基化的序列。另外，不同於其它防止聚合酶延伸的方法，諸如在3』端加成雙脫氧核苷酸，本發明人發現IPN分子可以位於內部，並且不必在3』就產生阻斷作用。因此，在甲基化和未甲基化序列的混合群體中，人們可以去除所有的背景。本發明還適用於『實時』檢驗的檢測法。在其最簡單的形式中，本發明涉及應用INA阻斷劑區分地擴增以最少兩種狀態存在的人或動物或植物或微生物基因組的任何需要區域。這兩種狀態備選地位於同一基因座，但是在人或動物或植物或微生物樣品水平上，通常內含在細胞的混合群體中，其中在一種群體中存在一種具體的基因組狀態，並且在另一種群體中存在一種不同的基因組狀態。將『乾草堆中的針』作為比喻，本發明允許針的擴增，並且阻斷組成乾草堆的所有乾草的擴增。在實用分子術語中，這意指下述內容如果針是出現在癌細胞中的具體甲基化基因組序列，而正常細胞在同一基因座上具有未甲基化的序列，那麼本發明允許通過阻斷不需要的未甲基化序列的擴增而擴增並且顯現甲基化的序列。相反地也可以應用。如果正常細胞具有甲基化的基因組序列，並且癌細胞具有未甲基化的序列，那麼本發明也允許通過阻斷甲基化序列而擴增並且顯現未甲基化的序列。本發明的優點在於它允許在巨大量的不需要的實體中檢測低水平的實體。用信號與噪聲的比例來說，在疾病中，通常的情形是在數千正常細胞(噪聲)中有很少的癌細胞(信號)。按照本發明的阻斷劑技術完成了兩件事；它抑制了噪聲，並且另外從這兩種類型的細胞的基因組中擴增了信號。儘管本發明人已經列出了在下列實例中所示的5種基因的數據，但是本發明是一般的，並且適用於人或動物或植物或微生物基因組的任何部分，不管是它編碼的還是不是它編碼的，只要所述基因組部分以兩種狀態存在。儘管本發明可以用於任何情形，諸如檢測SNPs和遺傳突變，但是它在尋找基因組靶點的甲基化狀態中具有非常有效的應用。在整個說明書中，除非上下文另外需要，應該理解，詞語「包括(comprise)」，或者諸如「comprises」或「comprising」的變化意味著包括一個指定的元件、整數或步驟，或者一組元件、整數或步驟，但是不排除任何其它的元件、整數或步驟，或者一組元件、整數或步驟。包含在本說明書中的文獻、法案、材料、裝置、論文等的任何討論完全是出於提供本發明的內容的目的。不應該被視作是承認任何或所有的這些內容形成部分現有技術基礎，或者是在本說明書每一權利要求的優先權日之前在澳大利亞存在的與本發明相關領域中的普通常識。為了更清楚地理解本發明，參考下述附圖和實例，將描述優選實施方案。附圖簡述圖1顯示INA阻斷劑方案的示例性詳細內容，提供了在兩輪DNA擴增中使用的引物和阻斷劑的位置的概括圖。圖2顯示INA阻斷劑方案怎樣工作的示例性詳細內容，提供了在包括甲基化或未甲基化DNA序列的兩輪DNA擴增中使用的引物和阻斷劑的位置的概括圖。由於這一實例用於舉例說明的目的，所以阻斷劑和引物序列通常不用於真正的檢測中。基因組DNA序列(SEQIDNO17)；亞硫酸氫鹽處理的甲基化序列(SEQIDNO18)；亞硫酸氫鹽處理的未甲基化序列(SEQIDNO19)；PCR引物#2(SEQIDNO20)；PCR引物#1(SEQIDNO21)；甲基阻斷劑#2(SEQIDNO22)；甲基阻斷劑#1(SEQIDNO23)；非甲基阻斷劑#2(SEQIDNO24)；非甲基阻斷劑#1(SEQIDNO25)。圖3是顯示PCR引物和甲基化的INA阻斷劑與各種亞硫酸氫鹽處理的DNA型雜交的示例。A.未轉化的序列(SEQIDNO26)；B.亞硫酸氫鹽處理的甲基化的序列(SEQIDNO27)；C.亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的序列(SEQIDNO28)；D.局部未轉化的序列(SEQIDNO29)；PCR引物#1(SEQIDNO30)；甲基阻斷劑#1(SEQIDNO31)。圖4是顯示PCR引物和未甲基化的INA阻斷劑與各種亞硫酸氫鹽處理的DNA型雜交的示例。A.未轉化的序列(SEQIDNO26)；B.亞硫酸氫鹽處理的甲基化的序列(SEQIDNO27)；C.亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的序列(SEQIDNO28)；D.局部未轉化的序列(SEQIDNO29)；PCR引物#1(SEQIDNO30)；非甲基阻斷劑#1(SEQIDNO32)。圖5是顯示PCR引物和未轉化的INA阻斷劑與各種亞硫酸氫鹽處理的DNA型雜交的示例。A.未轉化的序列(SEQIDNO26)；B.亞硫酸氫鹽處理的甲基化的序列(SEQIDNO27)；C.亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的序列(SEQIDNO28)；D.局部未轉化的序列(SEQIDNO29)；PCR引物#1(SEQIDNO30)；未轉化的阻斷劑#1(SEQIDNO33)。圖6顯示使用常規PCR、MSP技術，或者圖3，4和5中列出的INA阻斷劑和引物組合，在瓊脂糖凝膠電泳上顯現的預計擴增產物。結果表示為使用各種擴增/檢測方法，相對於確定系列的已知DNA標記，在凝膠上檢測到的預計擴增產物的位置和大小的圖示。圖7顯示對亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA樣品應用INA阻斷劑技術的數據。將GSTP1啟動子區的INA阻斷劑和PCR引物的用於9種基因組DNA樣品(表3所述)，以評估所述啟動子區的甲基化狀態。圖8顯示將阻斷劑和PCR引物用於表2所述的11種基因組DNA樣品，靠近CDKN2B、CXCL-2、GSN和HIC-1的基因組區域的擴增結果和推斷的甲基化狀態。結果是將阻斷劑和PCR引物用於表3所述的11種基因組DNA的結果，並且表示在CDKN2B、CXCL-2、GSN和HIC-1基因座周圍的人基因組區域的擴增產物。實施本發明的方式材料和方法INA/IPN定義嵌入性核酸(INAs)是一類獨特的DNA結合分子。INAs包含核苷酸和/或核苷酸類似物以及嵌入性假核苷酸(IPN)單體。INAs對於互補DNA具有非常高的親和力，對於位於內部的IPNs穩定性達到10度，並且對於末端位置的IPNs穩定性達到11度。INA本身是一種選擇性分子，相對於互補的RNA，其優選與DNA雜交。已經表明，與寡核苷酸引物相比，INAs與RNA的結合效率低約25倍。然而，常規寡核苷酸、寡核苷酸類似物和PNAs對於RNA和DNA具有相等的親和力。因此，INAs是第一種真正選擇性的DNA結合劑。另外，對於互補DNA，INAs具有比其它天然DNA分子更高的特異性和親和性。另外，在富含AT的環境中，IPNs更好地穩定DNA，這使得它們在外因基因組學研究領域中特別有用。典型地，IPNs作為突起或末端插入物位於INA分子中。IPN主要是在核酸雙聯體中能夠與核鹼基共同堆積的平面(雜)聚芳香族化合物。INA分子還顯示出抗核酸外切酶攻擊。這使得這些分子特別可以用作使用諸如phi29的酶的擴增的引物。由於phi29具有內在的核酸外切酶活性，用作擴增模板的引物必須在它們的3』末端進行特異性修飾，以防止酶降解。然而，可以加入沒有進一步修飾的INA分子。INAs可以用於常規PCR擴增反應，並且作為常規的引物。然而，INAs對於DNA模板具有更高的特異性，這使得它們理想地用於模板有限並且反應的靈敏性很重要的情形中。在富含AT的環境中，INAs最好地穩定DNA，這使得它們特別可以用於擴增亞硫酸氫鹽處理的DNA序列。這是由於這樣的事實，即，在亞硫酸氫鹽轉化後，所有的胞嘧啶殘基都被轉化為尿嘧啶，並且隨後在PCR或其它擴增後被轉化成胸腺嘧啶。因此，亞硫酸氫鹽處理的DNA是非常富含T的。INA中增加的IPN分子數目導致INA/DNA雙聯體增加的穩定性。INA中IPNs越多，INA/DNA雙聯體的熔融溫度越高。出乎意料地，當多個IPNs位於核苷酸分子中時，儘管INA對於其互補DNA具有非常高的特異性，在擴增反應中，包含IPNs導致對PCR聚合酶延伸的抑制。因此，如果INAs被設計成具有多個IPNs，那麼它們在使用常規寡核苷酸不會發生的PCR擴增反應中作用為阻斷劑。本申請人先前已經研發了一類嵌入性假核苷酸，當結合到寡核苷酸或寡核苷酸類似物中時，其形成嵌入性核酸(INA)(WO03/051901，WO03/052132，WO03/052133和WO03/052134，通過參考結合於此)，所述嵌入性核酸具有新型和有用的特點，作為寡核苷酸的補充或替代。現在已經發現，寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以被修飾成包括一個或多個嵌入性假核苷酸(IPN)，而形成核酸擴增的阻斷劑。所述嵌入性假核苷酸優選地選自1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺(phosphoramidite)。優選地，所述嵌入性假核苷酸選自(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺，或(R)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以選自DNA，RNA，鎖定核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，MNA，altritolnucleicacid(ANA)，己糖醇核酸(HNA)，嵌入性核酸(INA)，環己基核酸(CNA)以及它們的混合物和它們的雜化物，以及它們的磷原子修飾，諸如但不限於硫代磷酸鹽、甲基磷酸鹽(methylphospholates)、亞磷醯胺、phosphorodithiates、phosphoroselenoates、磷酸三酯和phosphoboranoates。非天然存在的核苷酸包括，但不限於包括在下列各項中的核苷酸DNA，RNA，PNA，INA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2』-NH)-TNA，(3』-NH)-TNA，α-L-核糖-LNA，α-L-木糖-LNA，β-D-木糖-LNA，α-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，雙環-DNA，6-氨基-雙環-DNA，5-表-雙環-DNA，α-雙環-DNA，三環-DNA，雙環[4.3.0]-DNA，雙環[3.2.1]-DNA，雙環[4.3.0]醯胺-DNA，β-D-吡喃核糖基-NA，α-L-吡喃來蘇糖基-NA，2』R-RNA，α-L-RNA或α-D-RNA，β-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用來連接核苷酸，諸如但不限於甲基亞氨基甲基、formacetate、thioformacetate以及包括醯胺的連接基團。另外，核酸和核酸類似物可以包括一種或多種嵌入性假核苷酸。優選地，所述阻斷劑是含有形成阻斷性INAs的兩種或多種內部IPNs的DNA寡核苷酸。當IPNs位於用於特異性檢測甲基化位點的INA分子中時，本發明人發現，避免將IPN位於潛在的CpG位點之間是有效的。這是由於這樣的事實，即，當CpG位點用IPN分離時，獲得的INA的特異性減少。基因組核酸基因組核酸可以是從植物，動物，微生物諸如細菌、真菌、酵母菌和病毒獲得的DNA或RNA。優選地，所述核酸是DNA，更優選地是來自動物或人的基因組DNA，或者動物或人細胞的感染劑的核酸。DNA的亞硫酸氫鹽處理下文列出有效的亞硫酸氫鹽處理核酸的示例性流程。該流程導致基本上保持所有的DNA得到處理。在本文中，這種方法也叫作人類遺傳指紋(HumanGeneticSignatures，HGS)方法。應該理解，樣品或試劑的體積和用量可以變化。關於亞硫酸氫鹽處理的優選方法可以在US10/428310或PCT/AU2004/000549中找到，其通過參考結合於此。向2μgDNA(如果需要，其可以用適宜的限制性酶預先消化)中，加入2μl(1/10體積)3MNaOH(50ml水中6g，新鮮製備)，終體積為20μl。由於亞硫酸氫鹽試劑優選地與單鏈分子反應，所以，這一步驟將雙鏈DNA分子變性成單鏈形式。將混合物在37℃溫育15分鐘。在高於室溫的溫度溫育可以用來提高變性的效率。溫育後，連續加入208μl2M偏亞硫酸氫鈉(7.6g在20ml水與416ml10NNaOH中；BDHAnalaR#10356.4D；新鮮製備)和12μl10mM醌醇(0.055g在50ml水中，BDHAnalR#103122E；新鮮製備)。醌醇是一種還原劑，並且幫助減少試劑的氧化。還可以使用其它還原劑，例如，二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、醌(氫醌)或其它適當的還原劑。將樣品用200μl礦物油覆蓋。礦物油覆蓋防止試劑的蒸發和氧化，但不是必要的。然後將樣品在55℃溫育過夜。備選地，樣品可以在熱循環儀中循環，如下溫育4個小時或過夜，如下步驟1，55℃/2hr，在PCR儀中循環；步驟2，95℃/2min。步驟1可以在從約37℃-約90℃的任何溫度下進行，並且時間可以在5分鐘-8小時變化。步驟2可以在從約70℃-約99℃的任何溫度下進行，並且時間可以在1秒鐘到60分鐘或更長時間變化。在用偏亞硫酸氫鈉處理後，去除油，如果DNA濃度低，那麼加入1μltRNA(20mg/ml)或2μl糖原。這些添加劑是任選的，並且可以用於通過與目標DNA共同沉澱而提高得到的DNA產量，特別是當DNA以低濃度存在時。當核酸量＜0.5μg時，通常需要應用添加劑作為更有效沉澱核酸的載體。如下進行異丙醇清理處理將800μl水加入到樣品中，混合，然後加入1ml異丙醇。水或緩衝液將反應容器中亞硫酸氫鹽的濃度減少到所述鹽不會隨目的靶點核酸一起沉澱的水平。稀釋一般為約1/4-1/1000，只要鹽的濃度稀釋到需要的範圍之下，如本文公開的那樣。再次混合樣品，並且置於4℃最少5分鐘。將樣品在微量離心機中離心10-15分鐘，並且將沉澱用70％ETOH洗滌2x，每次都振蕩。洗滌處理去除與核酸一起沉澱的任何殘留的鹽。乾燥所述沉澱，然後重懸在適當體積的T/E(10mMTris/0.1mMEDTA)pH7.0-12.5中，諸如50μl。發現pH10.5的緩衝液特別有效。將樣品在37℃-95℃溫育1min-96hr，這是懸浮核酸所需要的。阻斷劑生產在ChristensenUB，PedersenEBIntercalatingnucleicacidscontaininginsertionsof1-O-(1-pyrenylmethyl)glycerolstabilisationofdsDNAanddiscriminationofDNAoverRNA.NucleicAcidsRes.2002Nov15；30(22)4918-25中可以找到適用於生產INA阻斷劑的方法，其通過參考結合於此。阻斷劑當在本文中定義時，『阻斷劑』是一種嵌入性核酸(INA)，其含有兩種或多種能夠阻斷或減少核酸擴增的內在的嵌入性假核苷酸(IPNs)。當在本文中定義時，『甲基阻斷劑』是設計成靶向最初在其未處理的基因組狀態中被甲基化的轉化的核酸區域的阻斷劑。當在本文中定義時，『非甲基阻斷劑』是設計成靶向在其未處理基因組狀態中沒有被甲基化的轉化的核酸區域的阻斷劑。當在本文中定義時，『轉化的阻斷劑』是設計成靶向轉化的核酸區域的阻斷劑。當在本文中定義時，『未轉化的阻斷劑』是設計成靶向基因組核酸區域(即，沒有通過亞硫酸氫鹽或其它處理而被轉化)的阻斷劑。在GSTP1基因示例性實例中使用的INA阻斷劑的實例如下MB-15』TYTTCGGTTAGYTTGCGCGGCGAYTTTCGGYGGA(SEQIDNO1)UB-15』TYTTTGGTTAGYTTGTGTGGTGAYTTTTGGYGGA(SEQIDNO2)NCB-15』CYCCCGGCCAGYCTGCGCGGCGAYCTCCGGYGGA(SEQIDNO3)MB-25』TTAYTAACGAAAYACTYACGACGACGAAACYTCC(SEQIDNO4)UB-25』TTAYTAACAAAAYACTYACAACAACAAAACYTCC(SEQIDNO5)NCB-25』TGGYTGGCGAAGYACTYGCGGCGGCGAAACYTGC(SEQIDNO6)MB-35』TTYAGGGCGTYTTTTTYTGCGGTCGACGTYT(SEQIDNO7)UB-35』TTYAGGGTGTYTTTTTYTGTGGTTGATGTYT(SEQIDNO8)NCB-35』CCYAGGGCGCYCCCTCYTGCGGCCGACGCYC(SEQIDNO9)MB-45』ATYAATCCCGCCYCCGCTYCCGCCCCAYATA(SEQIDNO10)UB-45』ATYAATCCCACCYCCACTYCCACCCCAYATA(SEQIDNO11)NCB-45』GTYGGTCCCGCCYCCGCTYCCGCCCCAYGTG(SEQIDNO12)其中Y指定為IPN。優選地，IPN是以(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺的形式。MB是甲基化的阻斷劑UB是未甲基化的阻斷劑NCB是未轉化的阻斷劑標碼『Y』表示IPN在序列中的位置，並且被包含在序列的鹼基計數中。PCR引物用於舉例說明的引物如下GSTP1-1TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQIDNO13)GSTP1-2AACCTAATACTACTAATTAACCCCAT(SEQIDNO14)GSTP1-3GGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTT(SEQIDNO15)GSTP1-4ACTAAAAACTCTAAACCCCATCCC(SEQIDNO16)第1輪INA阻斷性PCRGSTP1-1/2+適當的阻斷劑1/2第2輪INA阻斷性PCRGSTP1-3/4+適當的阻斷劑3/4。DNA的常規亞硫酸氫鹽修飾和給定基因組區域產物的顯現這包括用亞硫酸氫鹽處理DNA樣品，然後是PCR擴增步驟。PCR步驟的產物，也就是凝膠上條帶的顯現，不會告知研究者DNA是否在這一步驟被甲基化，只是告知樣品中存在對於具體基因區域的亞硫酸氫鹽處理的DNA。PCR和顯現後，產物還需要用限制性酶消化，以觀察特定位點是否被所述酶切割，(並且因此是否被甲基化)，或者DNA條帶或片段需要測序，以確定在特定的組織樣品中所述基因區域是否被甲基化。PCR條帶的測序將表明，CpG雙聯體如在所述區域中的每一個C是否被甲基化。由於只有大於10％的樣品被甲基化，甲基化才能在測序儀上可靠地和常規地檢測出來，所以這種方法缺乏靈敏性。例如，在具體的組織樣品中，如果樣品中90％的細胞在研究區域具有未甲基化的DNA，並且10％的細胞具有甲基化的DNA，那麼上述常規方法將缺少準確確定甲基化模式的靈敏性。此外，進行這種現有技術方法是非常勞動密集型的並且費時的。甲基化特異性PCR(MSP)儘管MSP已經得到甲基化研究團體的廣泛接受，但是MSP具有在文獻中記錄的很多很嚴重的局限或缺點。這些局限或缺點包括I.這種方法很傾向於假陽性信號，特別是如果在正常的和癌症細胞的混合群體中存在少量具有甲基化DNA區域的癌細胞，由於腫瘤的異源性，大多數癌症組織的也存在這樣的情況。為了易於舉例說明，正常細胞在未甲基化狀態具有它們等價的區域。當用亞硫酸氫鹽處理時，假陽性信號表現為DNA局部未轉化的結果。因此PCR引物擴增DNA的未轉化區域(見圖3，4和5區域D)，並且因此，人們得到他們相信為甲基化的答案，但是實際上，那只是沒有被亞硫酸氫鹽處理轉化的基因區域。由於可能包括未轉化的INA阻斷劑，其將阻斷未轉化DNA區域的擴增，所以，INA阻斷劑沒有這種問題。如果使用INA阻斷劑技術得到陽性結果，那麼所述信號將是完全轉化的DNA的結果。因此，使用按照本發明的阻斷劑，消除了假陽性PCR信號。II.除非在常規亞硫酸氫鹽處理(不是靈敏的方法)後所述區域已經先測序過，否則研究者不會首先得知靶點CpG位點是否被甲基化。因此，某個CpG位點可能是未甲基化的或者是甲基化的，並且除非所述區域得到測序，否則針對所述具體CpG設計的MSP引物將產生假陰性反應，或者低估所述基因的甲基化程度。此外，由於可以針對不含CpG二核苷酸的區域設計PCR引物，所以，按照本發明的INA阻斷劑技術克服了這一局限。因此，不管基因甲基化與否，PCR引物都將結合。III.如果所述序列只含有小的甲基化區域，例如，在所述序列的第一部分，並且這沒有延伸到序列的全長，那麼使用MSP將產生假陰性結果。這是由於這樣的事實，即，儘管第一MSP引物將與互補CpG位點結合，但是由於第二區域是未甲基化的，所以第二MSP引物不結合。由於PCR引物可以針對將要擴增的區域而設計，不管它們是否被甲基化，所以，阻斷劑沒有如上文已經描述的這種問題。IV.由於反應依賴PCR酶在甲基化的C或未甲基化的T鹼基的3』末端鹼基終止(primeoff)的能力，所以MSP很難最優化。因此，對於不同基因區域的不同的MSP反應可能在MSP引物和轉化的靶點區域之間具有很不相同的雜交溫度(最佳Tm)。如果一個基因區域含有非常密集的CpG島，並且其它基因區域具有少得多的CpG’s，那麼來自CpG島的基因區域可能具有70℃的Tm，而其餘的基因區域可能具有50℃的Tm。因此，如果MSP反應在高嚴緊度進行，那麼具有70℃Tm的基因將產生PCR產物，而具有50℃Tm的MSP反應將不能產生擴增產物。因而，由於每個孔將具有不同的最佳Tm，並且擴增與否將以不可預料的方式而不同，所以，幾乎不可能進行多個MSP反應(每個在同一96孔平板或384孔PCR平板的不同的孔中)，並且從另一端得到靈敏的結果。此外，由於在按照本發明的阻斷劑技術中的PCR引物可以針對沒有CpGs的基因區域設計，所以多個不同基因的最佳Tm要容易控制得多，甚至在相對密集的CpG島中也容易控制得多。通常可能在沒有CpG二核苷酸的島內找到可以作為PCR引物的起始位點的小區域。V.MSP只檢測每一引物在某個具體CpG位點甲基化的存在，因此MSP反應只在每個基因區域的兩個位點報告。這總是一種記錄很好的批評。它沒有告訴研究者關於PCR引物之間的區域甲基化狀態的任何事情。阻斷劑INAs可以平均含有3-4個CpG位點，因此，每個基因使用4個阻斷劑，本發明可以用來審查平均12-16個CpG位點的甲基化狀態。結果阻斷劑策略本發明首先通過下述擴增檢測進行舉例說明。圖1中，PCR引物#1和阻斷劑#1與來自目的基因組區域的亞硫酸氫鹽處理的DNA雜交。那麼，Taq聚合酶從PCR引物#1延伸一直到它結合在上端DNA鏈上的阻斷劑#1，在這一點上酶終止。如果由於某種原因，酶繞過了阻斷劑#1，那麼酶將複製DNA的上鏈，並且產生互補鏈，該互補鏈產生用於PCR引物#2的結合位點。因此，加入與PCR#2內部序列互補的阻斷劑。那麼這確保沒有基因組區域的擴增。由於亞硫酸氫鹽處理的DNA的性質，當現在DNA基本上由3鹼基基因組組成時，擴增效率，特別是通過PCR的擴增效率減小。因此，為了最大的靈敏性，可以進行第二輪PCR。第二輪PCR將反應的靈敏性至少提高了5個數量級，因而使得所述方法理想地用於檢測發生在少量細胞亞群中的DNA甲基化變化，諸如發生在臨床樣品中癌症和正常細胞的混合群體中很少量的癌症細胞中的DNA甲基化變化。在這一點上，加入在PCR引物#1和引物#2內部的第三和第四PCR引物(PCR引物#3和引物#4)以及兩外兩種阻斷劑(阻斷劑#3和阻斷劑#4)。因此，每一PCR引物具有一種與所述PCR引物內部序列互補的阻斷劑序列。因此，對於每一目的基因組區域，總共合成4種PCR引物。如果需要檢測甲基化DNA序列的存在，將使用4種未甲基化的阻斷序列來阻斷未甲基化DNA的擴增。另外，為了保證所述序列通過亞硫酸氫鹽處理被完全轉化(一個與一些亞硫酸氫鹽處理反應相關的潛在問題)，可以使用另外第四種未轉化的序列來阻斷只有部分轉化的DNA區域的擴增。在這一點上，在每次PCR(或其它的擴增)反應中，將存在2種PCR引物，2種未甲基化的阻斷劑和2種未轉化的阻斷劑。相反，如果需要檢測未甲基化DNA序列的存在，可以使用4種甲基化的阻斷劑來阻斷甲基化DNA的擴增。另外，為了保證所述序列通過亞硫酸氫鹽處理被完全轉化，可以使用另外第四種未轉化的序列來阻斷只有部分轉化的DNA區域的擴增。同樣，在每次PCR反應中，將存在2種PCR引物，2種甲基化的阻斷劑和2種未轉化的阻斷劑。應該理解，阻斷劑可以用來阻斷核酸的任何擴增。阻斷劑特異性擴增圖2顯示示範目的的正常的和亞硫酸氫鹽處理的人工DNA序列，靶向不含CpG區域的PCR引物#1和引物#2，以及與它們適當的靶點區域雜交的4種阻斷劑序列(兩種甲基化的和兩種未甲基化的)的序列。PCR引物和INA阻斷劑與未轉化的DNA(野生型)的雜交在圖3中，由於不充分的序列相似性，PCR引物#1隻與B、C和D雜交，不與未轉化的序列A雜交。同樣由於不充分的序列相似性，甲基-阻斷劑只與亞硫酸氫鹽處理的甲基化的序列B結合，不與未轉化的、未甲基化的或者局部未轉化的DNA序列結合。然後，Taq聚合酶將開始延長B、C和D所示的序列。然而，在B情形中，酶將到達甲基阻斷劑，但將不能越過所述甲基-阻斷劑，因此沒有形成產物。在C情形中，由於TpG位點的錯配鹼基沒有阻斷劑結合，因此Taq將產生需要的PCR片段。在D情形中，由於不充分的序列相似性，沒有阻斷劑結合，因此將獲得PCR產物，但是這一產物將含有未轉化的序列。PCR引物和阻斷劑與轉化的甲基化DNA序列的雜交在圖4中，由於不充分的序列相似性，PCR引物#1隻與B、C和D雜交，不與未轉化的序列A雜交。同樣由於不充分的序列相似性，非甲基-阻斷劑只與亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的序列C結合，不與未轉化的、甲基化的或者局部未轉化的DNA序列結合。然後，Taq聚合酶將開始延長B、C和D所示的序列。在C情形中，酶將到達非甲基阻斷劑，但將不能越過所述非甲基-阻斷劑，因此沒有形成產物。在B情形中，由於在CpG的錯配鹼基沒有阻斷劑結合，因此Taq將產生需要的PCR片段。在D情形中，由於不充分的序列相似性，沒有阻斷劑結合，因此將獲得PCR產物，但是這一產物將含有未轉化的序列。PCR引物和阻斷劑與局部未轉化的DNA序列的雜交在圖5中，由於不充分的序列相似性，PCR引物#1隻與B、C和D雜交，不與未轉化的序列A雜交。同樣由於不充分的序列相似性，未轉化的阻斷劑只與未轉化的序列A和局部未轉化的序列D結合，不與甲基化的或者未甲基化的DNA序列結合。然後，Taq聚合酶將開始延長B、C和D所示的序列。在D情形中，酶將到達非轉化的阻斷劑，但將不能越過所述非轉化的阻斷劑，因此沒有形成產物。在B和C情形中，由於在CpG和TpG位點的錯配鹼基序列沒有阻斷劑結合，因此Taq將產生需要的PCR片段。因此，未轉化的阻斷劑可以與適當的阻斷劑和引物一起加入在圖3和圖4中列出的情形中，以防止局部未轉化序列的擴增，這是常規MSP的主要問題。方法學比較圖6顯示使用常規亞硫酸氫鹽PCR、甲基化特異性PCR(MSP)和INA阻斷劑技術，將在瓊脂糖凝膠上觀察到的條帶模式的圖示。使用常規亞硫酸氫鹽PCR，不管樣品是否含有甲基化的序列，正常組織相對癌症組織，都將觀察到條帶(兩組中的泳道1)。這種具體的方法只檢測到樣品中亞硫酸氫鹽處理的DNA的存在，並且必須進一步處理才能確定甲基化狀態，通常通過雙脫氧測序進行確定。使用MSP檢測甲基化DNA序列，由於正常組織不被甲基化，所以在來自正常組織樣品的泳道2將不會觀察到條帶。然而，在癌症組織樣品的泳道2將觀察到條帶。使用針對未甲基化序列的MSP引物，在正常組織樣品中(泳道3)將觀察到條帶，但是在癌症組織樣品中(見泳道3)沒有觀察到條帶。使用甲基化阻斷劑的INA阻斷劑，在正常組織(泳道4)中將觀察到條帶，但是在癌症組織(見泳道4)中沒有觀察到條帶。使用未甲基化的阻斷劑，在癌症組織(泳道5)中觀察到條帶，但是在正常組織(見泳道5)中沒有觀察到條帶。應用到亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA樣品的阻斷劑技術圖7顯示，當未甲基化的阻斷劑加入到PCR反應混合物中時，使用亞硫酸氫鹽轉化的DNAHeLa細胞系、來自臨床樣品的T細胞和乳腺癌細胞系T47D2，產生陽性PCR信號。表1@.通過常規亞硫酸氫鹽PCR測得的甲基化，常規亞硫酸氫鹽PCR只檢測大於10％的樣品含有甲基化序列的甲基化。$當通過常規亞硫酸氫鹽測序對T47D2測序時，發現第一半部分序列被甲基化而第二半部分序列沒有被甲基化。從全血中純化T-細胞、B-細胞和CD34+細胞樣品獲得於在澳大利亞雪梨RoyalNorthShoreHospital進行白細胞除去法的患者。樣品先獲得道德委員會的批准。按照製造者的用法說明，使用FicollPaqueplus(AmershamBiosciences#17-1440-03；PiscatawayNJ)濃縮白血細胞。按照製造者的用法說明，分別使用CELLectionCD2Dynabeads(Dynal#116.03；LakeSuccessNY)，DynabeadsCD19(PanB)Dynal#111.43和DynalCD34祖先細胞收集系統(Dynal#113.01)，從白細胞群體分離T-細胞、B-細胞和CD34+細胞。所用的序列和引物在表2中列出。PCR預混合物製備如下未甲基化的混合物甲基化的混合物對照反應X2Master混合物12.5μl12.5μl12.5μl(Promega)100ng/μlPCR#11μl1μl1μl100ng/μlPCR#21μl1μl1μl100ng/μl阻斷劑#13μl(U)3μl(M)-100ng/μl阻斷劑#23μl(U)3μlM)-水3.5μl3.5μl9.5μl表2按照圖1所述的原理，在HybaidPX2熱循環儀中進行兩輪PCR擴增。向第一輪PCR的每個反應管中加入1μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA。PCR進行如下。95℃3分鐘1個循環95℃1分鐘55℃2分鐘30個循環72℃2分鐘72℃10分鐘1個循環在完成第一輪PCR後，將1μl第一輪PCR反應混合物轉移到第二輪擴增管中，並且重複上述PCR程序。然後將10μlPCR反應混合物在2％瓊脂糖凝膠上分離。這些樣品的常規亞硫酸氫鹽基因組測序表明，對於這一具體的基因組區域，HeLa細胞DNA系完全被甲基化。然而，T-細胞DNA表現出缺少甲基化，常規亞硫酸氫鹽基因組測序的結果只有10％。使用限制性酶Taq1(切割TCGA)和BstU1(切割CGCG)限制性消化擴增的產物揭示擴增子中的甲基化。這表明，在低水平甲基化序列的檢測上，INA阻斷劑技術明顯地優於常規亞硫酸氫鹽基因組測序。另外，當通過常規亞硫酸氫鹽測序對T47D2DNA測序時，發現第一半部分序列是甲基化的而第二半部分序列沒有甲基化。可以在圖7A和7B中看出，使用未甲基化的阻斷劑和甲基化的阻斷劑，檢測到一條條帶。如果使用MSP，由於對於第二MSPPCR引物的起始位點將是未甲基化的，因而引物不會結合，所以這種具體的樣品將產生假陽性條帶。使用甲基化的INA阻斷劑，所有的結果與使用常規亞硫酸氫鹽測序得到的結果一致。臨床檢測結果圖8和表3顯示關於來自11種不同的細胞系樣品或臨床樣品的4種基因組區域(CDKN2B，CXCL-2，GSN和HIC-1)的阻斷劑實驗的結果。所用的阻斷劑和實驗流程如下對於每一目的基因區域，PCR預混合物製備如下未甲基化的混合物甲基化的混合物X2Master混合物12.5μl12.5μl(Promega)100ng/μlPCR#11μl1μl100ng/μlPCR#21μl1μl200ng/μl阻斷劑#11.5μl(U)1.5μl(M)200ng/μl阻斷劑#21.5μl(U)1.5μl(M)200ng/μl阻斷劑#31.5μl(U)1.5μl(M)200ng/μl阻斷劑#41.5μl(U)1.5μl(M)水3.5μl3.5μl按照圖1所述的原理，在HybaidPX2熱循環儀中進行兩輪PCR擴增。向第一輪PCR的每個反應管中加入1μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA。PCR進行如下。95℃3分鐘1個循環95℃1分鐘55℃2分鐘30個循環72℃2分鐘72℃10分鐘1個循環在完成第一輪PCR後，將1μl第一輪PCR反應混合物轉移到第二輪擴增管中，並且重複上述PCR程序。然後將10μlPCR反應混合物在2％瓊脂糖凝膠上分離。表3CL-表示物質來源於細胞系。Pa-表示細胞獲得於患者。ND-未確定No-通過直接測序PCR產物，沒有檢測到甲基化混合-不是所有的CpG位點甲基化或者甲基化局限在擴增子的一個區域內是-通過直接測序擴增子檢測到甲基化。除少量甲基化在粒細胞中表現出弱條帶之外，幾乎在所有樣品中，發現基因組區域CDKN2B和CXCL-2未被甲基化。通過對選擇樣品的獨立擴增之後再對PCR產物直接測序而證實這一結果。在CDKN2B或CXCL-2任一PCR片段中，直接的DNA測序沒有顯示有甲基化。直接測序的靈敏性是這樣的，除非大於10％的擴增物質是甲基化的，否則序列將被讀作是未甲基化的。因此，在粒細胞樣品中CXCL-2弱條帶的存在是在這一樣品中通過阻斷劑檢測而檢測到的很低的甲基化水平的指示。在對於GSN基因組區域測序的所有樣品中，觀察到的混合的甲基化模式與阻斷劑檢測的結果一致。這一基因組區域的甲基化模式在PCR擴增子的全長中變化，並且在許多情形中，並不是所有的CpG二核苷酸都被甲基化，或者在單個CpG位點觀察到未甲基化和甲基化序列的混合物。對於BL13、Hela和LNCaP細胞系，觀察到癌症過度甲基化(HypermethylatedInCancer，HIC-1)基因的甲基化，所有CpG位點都顯示出100％的甲基化。有趣地是，正常SMC(樣品6)細胞系是沒有顯示HIC-1基因甲基化的唯一的細胞系。來自消除了白血病的患者的粒細胞和T-細胞(樣品9和10)通過阻斷劑檢測表現出混合的甲基化，並且儘管對於大部分的PCR擴增子表現出未甲基化，但是這也可能是由於直接測序方法缺乏靈敏性。從所述結果可以看出，按照本發明的阻斷劑檢測是檢測人基因組不同區域的甲基化模式的有力工具。本領域的技術人員應該理解，可以對本發明進行許多改變和/或改進，如在具體實施方案中廣泛描述的不背離本發明的精神或範圍的那些。因此，在所有方面，本實施方案視作是示例性的，並且不是限制性的。序列表110人類遺傳標記控股有限公司120擴增阻斷劑13020557624216097170PatentInversion3.1210121134212DNA213人工的4001tyttcggttagyttgcgcggcgaytttcggygga34210221134212DNA213人工的4002tytttggttagyttgtgtggtgayttttggygga34210321134212DNA213人工的4003cycccggccagyctgcgcggcgayctccggygga34210421134212DNA213人工的4004ttaytaacgaaayactyacgacgacgaaacytcc34210521134212DNA213人工的4005ttaytaacaaaayactyacaacaacaaaacytcc34210621134212DNA213人工的4006tggytggcgaagyactygcggcggcgaaacytcc34210721131212DNA213人工的4007ttyagggcgtytttttytgcggtcgacgtyt31210821131212DNA213人工的4008ttyagggtgtytttttytgtggttgatgtyt31210921131212DNA213人工的4009ccyagggcgcyccctcytgcggccgacgcyc312101021131212DNA213人工的40010atyaatcccgccyccgctyccgccccayata312101121131212DNA213人工的40011atyaatcccaccyccactyccaccccayata312101221131212DNA213人工的40012gtyggtcccgccyccgctyccgccccaygtg312101321127212DNA213人40013tttgttgtttgtttattttttaggttt272101421126212DNA213人40014aacctaatactactaattaaccccat262101521126212DNA213人40015ggatttgggaaagagggaaaggtttt262101621124212DNA213人40016actaaaaactctaaaccccatccc2421017211111212DNA213人工的40017cgggtgacccctctcccctgccctgtgaagcgggtgccggcgcgccgaggccgcgaagtt60cgctgcctgcgcggcgactccggggaatggggccacctgcagcatctcccg11121018211112212DNA213人工的40018cgggtgattttttttttttgttttgtgaagcgggtgtcggcgcgtcgaggtcgcgaagtt60cgttgtttgcgcggcgatttcggggaatggggttaatttgtagtatttttcg11221019211112212DNA213人工的40019tgggtgattttttttttttgttttgtgaagtgggtgttggtgtgttgaggttgtgaagtt60tgttgtttgtgtggtgattttggggaatggggttaatttgtagtattttttg1122102021120212DNA213人工的40020tttttttttttttgttttgt202102121124212DNA213人工的40021taccccaattaaacatcataaaaa242102221117212DNA213人工的40022gaagcgggtgtcggcgc172102321117212DNA213人工的40023gcgccgctaaagcccct172102421117212DNA213人工的40024gaagtgggtgttggtgt172102521118212DNA213人工的40025acacctactaaaacccct182102621149212DNA213人工的40026cgggtgacccctctcccctgccctgtgaagcgcctgccgccgcccccga492102721149212DNA213人工的40027cgggtgattttttttttttgttttgtgaagcgcctgtcgtcgttttcga492102821149212DNA213人工的40028tgggtgattttttttttttgttttgtgaagtgtttgttgttgtttttga492102921150212DNA213人工的40029cgggtgattttttttcccctgccctgtgaagcgcctgccgtcgcccccga502103021111212DNA213人工的40030ccactaaaaaa112103121114212DNA213人工的40031aaacagcagcaaaa142103221114212DNA213人工的40032aaacaacaacaaaa142103321114212DNA213人工的40033ggacggcggcgggg142103421129212DNA213人工的40034gattyttgcgyacgcgyttcgtatytttg292103521127212DNA213人工的40035tttttggtttagttgaaaaaggaattt272103621130212DNA213人工的40036gttyaacgaytcggtcgtytcggttyattg302103721130212DNA213人工的40037ttaggagtttttttttagaagtaatttagg302103821128212DNA213人工的40038ccycgcgccgcgyacgctyaaccyaaac282103921132212DNA213人工的40039acttccaaaaactatgtgaccttctccactaa322104021131212DNA213人工的40040aactccgttyaaaaytccgcgccgyacttyc312104121125212DNA213人工的40041aaaccctaaaaccccaactacctaa252104221129212DNA213人工的40042gattyttgtgyatgtgytttgtatytttg292104321130212DNA213人工的40043gttyaatgayttggttgtyttggttyattg302104421128212DNA213人工的40044ccycacaccacayacactyaaccyaaac282104521131212DNA213人工的40045aactccattyaaaaytccacaccayacttyc312104621129212DNA213人工的40046gactyccgcgyacgcgytccgcacycctg292104721130212DNA213人工的40047gctyaacgayccggccgcytcggccyactg302104821128212DNA213人工的40048ccycgcgccgcgygcgctyggccyagac282104921131212DNA213人工的40049gactccgttygggaytccgcgccgygcttyc312105021131212DNA213人工的40050ggtttyacgayagcgttttyttcgtagygcg312105121129212DNA211人工的40051attgaaatgttttttagagaagtaatttt292105221132212DNA213人工的40052gaygcggcgggtytttcgtytttcgttttyag322105321122212DNA213人工的40053gtgggtttaagggatttgattt222105421132212DNA213人工的40054ycccgaaactccayaatcgatcyccgaatytc322105521124212DNA213人工的40055accccttttatacataattaaaac242105621128212DNA213人工的40056yctaaaayaacccgaayatcccgaacyc282105721125212DNA213人工的40057aactaacaaaaaactacctataacc252105821131212DNA213人工的40058ggtttyatgayagtgttttytttgtagygtg312105921132212DNA213人工的40059gaygtggtgggtyttttgtyttttgtttytag322106021132212DNA213人工的40060ycccaaaactcycaaatcaatcyccaaatytc322106121128212DNA213人工的40061yctaaaayaacccaaayatcccaaacyc282106221131212DNA213人工的40062ggttcyacgayagcgcctcyctcgcagygcg312106321132212DNA213人工的40063gaygcggcgggcytctcgcytcccgctccyag322106421132212DNA213人工的40064ycccggagctccaygatcgatcyccgagtytc322106521128212DNA213人工的40065yctggaayagcccggaygtcccgggycc282106621130212DNA213人工的40066gttygggttcgtcgytcgttcgtygtttyg302106721127212DNA213人工的40067ttgtaaaatgggttggtagttgtattt272106821127212DNA213人工的40068gttyagcgtytcgtcgtatygttaygg272106921122212DNA213人工的40069ttgaaaaggatgtgttgatgtt222107021128212DNA213人工的40070aytcgacccgyacaaayacgcgacayac282107121122212DNA213人工的40071aatcttaaaaacatctaaattc222107221131212DNA213人工的40072ycccgcccatcyccgcccaayaccgaaayac312107321121212DNA213人工的40073acaaaaaacccaatctacaac212107421130212DNA213人工的40074gttygggtttgttgyttgtttgtygtttyg302107521127212DNA213人工的40075gttyagtgtyttgttgtatygttaygg272107621128212DNA213人工的40076aytcaacccayacaaayacacaacayac282107721131212DNA213人工的40077ycccacccatcyccacccaayaccaaaayac312107821130212DNA213人工的40078gctygggctcgccgyccgctcgtygcctyg302107921127212DNA213人工的40079gctyagcgcyccgccgtatygtcaygg272108021128212DNA213人工的40080aytcgacccgyacaggygcgcggcaygc282108121131212DNA213人工的40081ycccgcccatcyccgcccaaygccggggyac312108221130212DNA213人工的40082gyttttyggggcgtgtyaggtcgttttygg302108321124212DNA213人工的40083ggtaattgtttttaaaagggttat242108421131212DNA213人工的40084gygttaggcggttyagggcgtcgtyacggyt312108521124212DNA213人工的40085gtttttattttagagggtagttgg242108621128212DNA213人工的40086tayaccgayacgcctccyatcgtatcyc282108721129212DNA213人工的40087attaaactaattatcatacaccaccaaaa292108821129212DNA213人工的40088cttyatacgcgcgayaaaaayaacgtytc292108921130212DNA213人工的40089atataaataaaatccaacaccaaactaaac302109021130212DNA213人工的40090gyttttyggggtgtgtyaggttgttttygg302109121131212DNA213人工的40091gygttaggtggttyagggtgttgtyatggyt312109221128212DNA213人工的40092tayaccaayacacctccyatcatatcyc282109321129212DNA213人工的40093cttyatacacacaayaaaaayaacatytc292109421130212DNA213人工的40094gyccctyggggcgtgcyaggccgccctygg302109521131212DNA213人工的40095gygccaggcggccyagggcgccgcyacggyc312109621128212DNA213人工的40096tgygccggygcgcctccyatcgtgtycc282109721129212DNA213人工的40097cttygtgcgcgcggyaagagyggcgtytc29權利要求1.一種擴增阻斷劑，其包括含有兩個或多個能夠阻斷或減少核酸擴增的內部嵌入性假核苷酸(IPNs)的嵌入性核酸(INA)。2.按照權利要求1的阻斷劑，其中所述INA在長度上約15-50個核苷酸或核苷酸類似物，具有2-6個位於內部的IPNs。3.按照權利要求2的阻斷劑，其中所述INA在長度上約18-35個核苷酸或核苷酸類似物，具有2-6個位於內部的IPNs。4.按照權利要求1-3中任一項的阻斷劑，其中所述IPNs位於寡核苷酸3′或5′端2個或多個鹼基處。5.按照權利要求1-4中任一項的阻斷劑，其中所述INA在寡核苷酸的3′或5′端不含IPNs。6.按照權利要求1-5中任一項的阻斷劑，其中所述IPN選自1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。7.按照權利要求6的阻斷劑，其中所述IPN選自(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺或(R)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。8.按照權利要求7的阻斷劑，其中所述IPN是(S)-1-(4，4』-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。9.按照權利要求1-8中任一項的阻斷劑用於阻斷或減少核酸擴增的應用。10.一種檢測核酸分子目標區域甲基化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈上未甲基化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域被甲基化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域未被甲基化，那麼將沒有擴增產物。11.一種檢測核酸分子目標區域甲基化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈上甲基化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域未被甲基化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域被甲基化，那麼將沒有擴增產物。12.按照權利要求10或11的方法，其還包括在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第三和第四阻斷劑，所述第三和第四阻斷劑與第一和第二阻斷劑區域的內部區域互補；和提供第三和第四引物，其與第三和第四阻斷劑區域的外部區域以及第一和第二引物區域的內部區域互補。13.按照權利要求10-12中任一項的方法，其還包括提供一種或多種其它的按照權利要求1-8中任一項的阻斷劑，其針對所述核酸分子上一個或多個區域。14.按照權利要求13的方法，其中所述核酸分子上的區域與所修飾的核酸模板的一個或多個區域相對應。15.按照權利要求10-14中任一項的方法，其還包括提供三種或多種按照權利要求1-8中任一項的阻斷劑，其針對與第一和第二引物區域之間的區域互補的第一或第二鏈。16.一種檢測核酸分子目標區域轉化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈上未轉化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域被轉化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域未被轉化，那麼將沒有擴增產物。17.一種檢測核酸分子目標區域轉化狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與所修飾的核酸分子第一鏈上轉化的目標區域互補；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域未被轉化，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域被轉化，那麼將沒有擴增產物。18.按照權利要求10-17中任一項的方法，其中所述目標區域是3′側連鳥嘌呤(G)的胞嘧啶(C)。19.按照權利要求10-18中任一項的方法，其中所述修飾試劑選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。20.按照權利要求19的方法，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉。21.按照權利要求10-20中任一項的方法，其中所述核酸分子是DNA或RNA。22.按照權利要求21的方法，其中所述核酸分子是DNA。23.按照權利要求10-22中任一項的方法，其中所述擴增檢測是PCR。24.一種檢測核酸分子目標區域狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與具有不理想狀態的修飾的核酸模板第一鏈上的目標區域互補；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域具有理想的狀態，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域具有不理想的狀態，那麼將沒有擴增產物。25.一種檢測核酸分子目標區域狀態的方法，其包括在某種條件下，用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理所述核酸分子，以形成修飾的核酸模板；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第一阻斷劑，所述第一阻斷劑與具有理想狀態的修飾的核酸模板第一鏈上的目標區域互補；在擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的第二阻斷劑，所述第二阻斷劑與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈下遊上的區域互補；提供第一引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈上目標區域上遊的核酸區域互補；提供第二引物，其與所修飾的核酸模板第一鏈的互補第二鏈上第二阻斷劑區域下遊的核酸區域互補；進行擴增反應，其中如果所述目標區域具有不理想的狀態，那麼將有擴增產物，並且如果所述目標區域具有理想的狀態，那麼將沒有擴增產物。26.按照權利要求24或25的方法，其中所述狀態是甲基化、突變或單一核苷酸多態性。27.一種阻斷或減少核酸擴增的方法，其包括在核酸擴增反應中提供一種阻斷劑，其包括含有兩種或多種內部IPNs的INA核酸，其中所述阻斷劑與目的核酸序列互補；和進行擴增反應，以致所述阻斷劑與目的核酸序列結合，並且阻斷或減少在目的序列處或在接近目的序列處的擴增。28.一種阻斷或減少核酸擴增的方法，其包括在核酸擴增反應中提供按照權利要求1-8中任一項的阻斷劑，其中所述阻斷劑與目的核酸序列互補；和進行擴增反應，以致所述阻斷劑與目的核酸序列結合，並且阻斷或減少在目的序列處或在接近目的序列處的擴增。29.按照權利要求27或28的方法，其還包括提供第二對引物，其與位於第一對引物的互補區域之間的核酸區域互補。30.按照權利要求27-29中任一項的方法，其中所述核酸分子是DNA或RNA。31.按照權利要求30的方法，其中所述核酸分子是DNA。32.按照權利要求27-31中任一項的方法，其中在提供阻斷劑之前，在某種條件下將核酸用修飾胞嘧啶鹼基但是不修飾5-甲基-胞嘧啶鹼基的試劑處理，以形成含有潛在的甲基化位點的修飾的核酸模板。33.按照權利要求32的方法，其中所述修飾試劑選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。34.按照權利要求33的方法，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉。35.按照權利要求27-34中任一項的方法，其中一種或多種阻斷劑針對核酸分子上的一個或多個潛在的甲基化位點。36.按照權利要求27-34中任一項的方法，其中一種或多種阻斷劑不與核酸分子上的潛在的甲基化位點結合。全文摘要一種擴增阻斷劑，其包括含有兩個或多個能夠阻斷或減少核酸擴增的內部嵌入性假核苷酸(IPNs)的嵌入性核酸(INA)。所述擴增阻斷劑阻斷或減少核酸擴增的應用。文檔編號C12Q1/68GK101056883SQ200580038260公開日2007年10月17日申請日期2005年9月9日優先權日2004年9月10日發明者道格拉斯·斯彭切爾·米勒申請人:人類遺傳標記控股有限公司