提純硫醚抗生素的方法
2023-12-10 07:51:57 2
專利名稱：提純硫醚抗生素的方法
背景技術：
細菌對治療人類疾病常規抗生素的抗藥性已經增長到了國際性臨界水平。一個重要因素是治療非致命感染抗生素的廣泛使用。近年來，人們更加關注一類被稱為硫醚抗生素的具有前景的新型細菌素。當前，硫醚抗生素已經廣泛應用於食品工業。硫醚抗生素具有顯著的商業價值並且應用廣泛，其可實施的製備方法具有顯著的經濟效益。
細菌素是由細菌產生的、對一定範圍相關細菌表現出生長抑制活性的抗微生物蛋白。硫醚抗生素是由某些細菌產生的多肽抗微生物劑，由於其多肽特性與生物活性硫醚抗生素與其它抗生素相區別。例如作為某些食品防腐劑的乳酸鏈球菌肽具有非常規的胺基酸殘基，羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。乳酸鏈球菌肽，一種富含賴氨酸的硫醚抗生素，對人類與牲畜無毒，耐高溫在很低濃度下具有抑菌性。不幸的是，儘管硫醚抗生素用途廣泛並且具有獨特而優選的特性，由於缺乏經濟可行的高純度離析方法，其應用受到了限制。
對在乳品加工業使用乳酸鏈球菌肽的可能性進行分析，說明了缺乏經濟可行提純方法的影響。近來，人們已經認識到乳酸鏈球菌肽對乳品工業的潛在價值，特別是此價值與乳酸鏈球菌肽具有的幫助抵抗奶牛乳腺炎感染的能力有關。乳酸鏈球菌肽提供的益處大部分源於其減弱或者消除「抑制周期」規律的潛力。「抑制周期」是建立的一個時間段，即在奶牛乳腺炎感染的治療過程中，感染奶牛生產的牛奶必須廢棄。因此，與傳統抗生素治療相比，使用乳酸鏈球菌肽治療乳腺炎感染奶牛的牛奶可以更快地恢復使用。
不幸的是，採用現有製備與提純方法商業製備的乳酸鏈球菌肽認定為食品級質量，達不到藥物應用的有效純度。當向奶牛給藥時，上述乳酸鏈球菌肽含有造成免疫響應的肽雜質。由於缺少可以選擇性去除上述雜質的有效提純方法，由乳酸鏈球菌肽治療乳腺炎所獲得的價值不足以彌補現有方法的實施。因此，人們仍舊需要一種提高硫醚抗生素純度並且在商業規模應用可行的方法。
為了商業可行，提純方案必須具備相對高的產率，相對低的成本。關於硫醚抗生素的製備，相對簡單廉價的線路是培養可以自然表達或者人工設計表達所需細菌素的有機體。然而，不可避免的是，硫醚抗生素必須從有機體共同表達的、在初始製品中作為汙染雜質的無數蛋白質中分離出來。由於硫醚抗生素是多肽，具有與其它蛋白質相同的生化特徵，因此，設計能夠識別硫醚抗生素與其它蛋白質或者肽雜質的實施方案，仍舊是一個挑戰。
基於待提純的蛋白質通常敏感於此類處理的事實，在蛋白質提純方案中，少有例外地避免使用蛋白酶或者具有與蛋白酶相似活性的酶。例如，由於胰蛋白酶識別此類殘基，可以在殘基位置上斷裂含有此類殘基的蛋白質或者多肽，因此，在含有內部賴氨酸或者精氨酸殘基的肽提純方法中，不能使用胰蛋白酶。此外，採用蛋白酶基提純方案，蛋白質的純度與回收率逆向相關。這意味著，在增加重要蛋白質回收率的條件下，雜質趨於得不到充分的消化。
發明概述本發明公開了從含有硫醚抗生素的天然或者部分提純的溶液提純硫醚抗生素的方法。儘管硫醚抗生素的共同結構特徵說明，本發明公開的提純方法對於硫醚抗生素類的其它成員具有有效性，但是在優選具體實施方式
中硫醚抗生素是乳酸鏈球菌肽。本發明方法包括下列步驟生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培養混合物；在使酶的選擇蛋白水解活性最佳化的條件下培養上述混合物；從而在保證硫醚抗生素完全未經消化同時，消化含有硫醚抗生素溶液中的非硫醚抗生素蛋白質、多肽和肽成份。
發明詳述硫醚抗生素是一組含有非常規的胺基酸、核醣體合成的、翻譯後修飾的肽。此類胺基酸包括硫醚胺基酸羊毛硫氨酸(Lan)和/或甲基羊毛硫氨酸(Dhb)，外加許多修飾的殘基，例如2，3-二脫氫丙氨酸(Dha)和2，3-二脫氫α-氨基丁酸(Dhb)。這些殘基在結構中的出現及其對硫醚抗生素活性的影響已經成為顯著的研究課題。
經發現，例如，絲氨酸(對應Dha)和蘇氨酸(對應Dhb)特定序列脫氫生成了帶有可以與鄰近親核基團反應的親電子中心的修飾胺基酸。當鄰近半胱氨酸殘基的硫醇基團(-SH)攻擊Dha的雙鍵時，生成了硫醚羊毛硫氨酸。作為這些分子內部鍵橋出現的結果，硫醚抗生素成為含有許多羊毛硫氨酸環的多環結構。人們認定，這些羊毛硫氨酸環的存在對於硫醚抗生素的許多重要特性至關重要，其中包括，例如肽穩定的持續性與熱滅活的耐受性。
本發明是基於申請人令人意想不到的發現在未造成硫醚抗生素可測蛋白水解並產生針對蛋白質與多肽雜質的選擇蛋白水解活性的條件下，天然或者部分提純硫醚抗生素製品可以經受蛋白酶處理。此條件的應用提供了提純硫醚抗生素的有效方法。
有關硫醚抗生素對蛋白酶消化敏感的現有技術文獻匯集於此。此類的一些報導特別涉及充分研究的硫醚抗生素，乳酸鏈球菌肽。例如，Gross等人(J Am Chem Soc93(18)(1971)4634-4635)報導，乳酸鏈球菌肽具有胰蛋白酶敏感性。隨後，Wilimowska-Pelc發表了批駁性報導(Acta Microbiol Pol A8(1)(1976)71-77)。最近，Chan等人(Int Food Microbiol 390(2001)267-281)報導，乳酸鏈球菌肽可以經受胰蛋白酶消化，只是消化速率遞減。總之，熟悉現有技術相關內容的本領域技術人員不能預測出鑑別處理條件的任何確定性；在此條件下，基本上未降解溶液中硫醚抗生素的同時，通過蛋白水解酶反應，選擇性降解出現在天然或者部分提純硫醚抗生素溶液中非硫醚抗生素蛋白質、多肽和肽雜質。此發現對於改進的、成本可行的高純硫醚抗生素提純方法的長期需求特別重要，此提純方法可以生成適合藥用的硫醚抗生素製劑。
本發明有效的蛋白酶消化條件是以選擇性為特徵。也就是，為含有攙雜硫醚抗生素和蛋白水解酶培養物確定的條件是，在此條件下蛋白水解酶選擇性地降解非硫醚抗生素雜質。用於調節這些選擇性條件可改變的參數包括改變的PH範圍、減少的蛋白酶與硫醚抗生素比率、降低的溫度等。用於使蛋白水解酶選擇性操作最優化的可改變參數的上述列舉並不全面，因此，本領域技術人員可以發現經改變可以影響所需目標的其它參數。
本領域技術人員可以容易地確定對於特殊蛋白水解酶的最佳條件。如果商業生產，生產者通常會在與酶共同運輸的包裝材料上提供上述信息。此外，憑經驗確定此條件只是一件涉及常規實驗的事情。
然而，最佳的條件不是需要的選擇性條件。對於所給蛋白水解酶的最佳培養條件下，硫醚抗生素以及蛋白質或者肽雜質都會被降解。總的來說，選擇性條件是由經驗確定的。此確定的起點是生產者提供的最佳條件。如果在此條件下，硫醚抗生素與雜質都被降解，此條件可以「向下調節」，達到選擇性條件。例如，如下文所述，據報導，胰蛋白酶的最佳pH大約是8.0。然而，在培養的其它條件都相同的情況下，說明書中記載的最佳選擇性條件包括pH範圍大約在5.50-6.25。
在下文的實施例部分中，使用了廣泛研究的硫醚抗生素乳酸鏈球菌肽。然而，如上所述，硫醚抗生素類成員具有許多相同的結構特徵，經鑑別，其中一些結構特徵是相對耐受蛋白水解的原因。例如，在這方面還特別提到了羊毛硫氨酸環。因此，儘管實施例部分主要集中在硫醚抗生素乳酸鏈球菌肽，但是可以認定，由於存在定義的結構特徵，本文建立的原則適用於所有的硫醚抗生素。其它硫醚抗生素包括，例如枯草菌素、表皮素、gallidermin、誘變素、pep5、epicidin、epilancin、溶細胞素、乳鏈球菌素、葡萄球菌素、salvaricin、乳桿菌素、鏈球菌素、sublancin、carnocin、variacin、cypemycin、connamycin、耐久酶素、血管緊張肽轉化酶抑制肽、mersacidin、actagurdine。
本發明方法非常特別地適合存在於天然或者部分提純發酵液中硫醚抗生素的蛋白水解提純。例如，在乳酸鏈球菌肽發酵中，採用GC/MS/MS肽分析，已經鑑別出與乳酸鏈球菌肽共同提純的40多種肽。下文的實施例部分清晰地展示了胰蛋白酶降解共同提純雜質的有效性。
據報導，對於胰蛋白酶的蛋白水解活性，最佳pH值是在大約8.0。在培養的其它條件都相同的情況下，說明書中記載的最佳選擇性條件包括pH值範圍在大約5.50-6.25。相似的條件屬於其它蛋白酶的選擇性範圍，其中包括，例如肽鏈內切酶Arg-C、嗜熱菌蛋白酶、V8蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、梭菌蛋白酶、賴氨醯肽鏈內切酶、肽鏈內切酶Asp-N、腸肽酶、或者凝血因子Xa。優選的是，由其它蛋白酶選擇性消化乳酸鏈球菌肽雜質的條件包括pH值範圍在大約5.50-6.25。在優選的具體實施方式
中，pH值是5.80。對於胃蛋白酶，pH值3.5在選擇性界限以內。
如選擇性消化非硫醚抗生素雜質所述，可以通過多種方式實現選擇性蛋白酶消化條件。這些條件可以包括，例如低蛋白酶與硫醚抗生素的比率、降低的溫度、改變的pH值等。可以單獨或者組合改變多種相關參數。
在完成蛋白水解消化後，需要去除蛋白酶。消化後促使去除蛋白酶特別常規的方法是，提供附著在固體載體的蛋白酶(例如瓊脂糖或者磁性珠)。採用此種形式，消化後固體載體容易從培養混合物中分離。此外，可以採用簡單的分篩柱步驟，實現蛋白酶的去除。蛋白水解消化後去除蛋白酶的其它技術在本領域眾所周知，其中包括層析法技術，例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水性層析法。
應當注意，儘管消化雜質後需要去除蛋白酶，但是在所有的實際應用中都不需要這樣做。例如，如果提純的硫醚抗生素趨於被食物產品消耗，就不必為了滿足相關規定去除蛋白酶。例如，對於某些食品應用，胰蛋白酶已經被授予了公認的安全資格(GRAS)。
實施例在中性到弱鹼pH值與胰蛋白酶與乳酸鏈球菌肽高比率的條件下乳酸鏈球菌肽敏感於胰蛋白酶的蛋白水解乳酸鏈球菌肽含有2個蛋白水解酶胰蛋白酶潛在目標的內部賴氨酸殘基。為了確定乳酸鏈球菌肽是否可以被胰蛋白酶消化，從來自發酵罐的乳酸鏈球菌肽製品、或者部分提純的乳酸鏈球菌肽製備消化反應混合物，然後，在使胰蛋白酶活性最佳化的條件下，將反應混合物暴露於胰蛋白酶。上述條件包括反應的pH值為7.0，並且乳酸鏈球菌肽與胰蛋白酶的比率為10∶1(重量比)。將樣品在30℃下培養，從零時間起每隔24小時取出等份試樣用於分析。SDS-PAGE的考馬斯藍色染色表明，在使用的條件下乳酸鏈球菌肽被胰蛋白酶降解。此外，在各個時間點對乳酸鏈球菌肽的定量HPLC分析顯示，暴露於胰蛋白酶後24小時，乳酸鏈球菌肽的回收率開始降低。經過96小時處理，超過90％的乳酸鏈球菌肽被降解。
在低pH值與胰蛋白酶與乳酸鏈球菌肽低比率的條件下乳酸鏈球菌肽耐受於胰蛋白酶的消化肽分析已經鑑別出與乳酸鏈球菌肽共同提純的40多種肽。經鑑別，這些肽都可作為乳球菌發酵的產物。由於已經認定，在中性到弱鹼pH值與胰蛋白酶與乳酸鏈球菌肽高比率的條件下乳酸鏈球菌肽經受了胰蛋白酶的蛋白水解，所以改變條件試圖鑑別出胰蛋白酶不降解乳酸鏈球菌肽而降解乳酸鏈球菌肽樣品中肽雜質的條件。在室溫下將含有濃度為11mg/ml乳酸鏈球菌肽製品與濃度為27.5ug/ml USP級胰蛋白酶的反應混合物過夜培養(重量比為400∶1)。混合物的PH值範圍在5.25-6.5。儘管乳酸鏈球菌肽與雜質的最低水解率出現在小於PH值5.50，但是定量的HPLC分析顯示，乳酸鏈球菌肽的最佳回收率出現在小於或者等於PH值6.25。這些實驗結果說明，涉及稀釋的胰蛋白酶與範圍在5.50-6.25PH值的條件是，對於胰蛋白酶消化乳酸鏈球菌肽損失最小化、並且從乳酸鏈球菌肽製品去除肽雜質的最佳條件。
為了進一步優化從胰蛋白酶消化的乳酸鏈球菌肽製品去除肽雜質的條件，製備2升濃度為4.55mg/ml部分提純的乳酸鏈球菌肽，然後，加入含有25mg USP級胰蛋白酶的10mM檸檬酸，在30℃下保持PH值5.80培養16個小時。HPLC分析顯示，乳酸鏈球菌肽的總回收率大約為95％。此外，採用分子量隔斷膜連續去除胰蛋白酶，產生了87.5％乳酸鏈球菌肽回收率和0.38％胰蛋白酶回收率。
為了確定在消化雜質過程中不溶解的胰蛋白酶處理乳酸鏈球菌肽製品是否有效，而不僅是乳酸鏈球菌肽本身，使用1.6ml與珠狀瓊脂糖結合的TPCK處理的不溶性胰蛋白酶，處理製備成濃度為9.55mg/ml的1.6升部分提純的乳酸鏈球菌肽。在30℃下培養6小時後，採用離心方式去除不溶解的胰蛋白酶，乳酸鏈球菌肽的總回收率是大約90％。
胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽保留了抗微生物活性採用逆向HPLC柱測定其可動性，採用SDS-PAGE測定其遷移性，可以判斷得出，在上述條件下，使用胰蛋白酶處理乳酸鏈球菌肽製品，沒有影響乳酸鏈球菌肽的物理結構。為了證實乳酸鏈球菌肽的生物活性也未經改變，採用生命體外滅菌活性分析法。採用96孔平板分析法，測定胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽針對乳腺炎離析物無乳鏈球菌(菌株#20)的抗微生物活性，並且細菌生長作為ELISA讀出器上的吸光率讀數進行讀取。這些實驗證實，胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽的抗微生物活性與未經胰蛋白酶處理對照的活性沒有顯著區別。
胰蛋白酶處理減少了存在於攙雜乳酸鏈球菌肽的炎性因子向牛乳房內注入攙雜的乳酸鏈球菌肽，作為部分炎性反應在牛奶中刺激產生了高含量的體細胞。如表1所示，注入30mg部分提純乳酸鏈球菌肽的非乳腺炎奶牛具有大幅增長的體細胞數量。相反，採用注入胰蛋白酶提純的乳酸鏈球菌肽處理乳區的奶牛，由此奶牛獲得牛奶的體細胞數量要少很多，與只用緩衝液處理乳區的奶牛的體細胞數量相比在統計學上沒有區別。
其它蛋白酶表現出針對乳酸鏈球菌肽以外雜質的選擇活性在上述最佳條件下，乳酸鏈球菌肽比較耐受於胰蛋白酶的蛋白水解。為了測定在相似條件下乳酸鏈球菌肽是否也耐受其它蛋白水解酶，在保持PH值5.8下部分提純的乳酸鏈球菌肽分別暴露於胃蛋白酶、凝血酶、V8蛋白酶(Endo Gluc)、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、或者梭菌蛋白酶。也在PH值3.5的條件下實施暴露於胃蛋白酶。實驗結果顯示，乳酸鏈球菌肽耐受於上述酶的蛋白水解消化。PH值5.8下的胃蛋白酶和凝血酶對於雜質也都表現出效率低下。PH值3.50條件下胃蛋白酶有效地消化了乳酸鏈球菌肽的雜質，而未能消化乳酸鏈球菌肽。這些實驗結果證明，在低PH值與如胰蛋白酶處理所述的乳酸鏈球菌肽與蛋白酶比率的條件下，其它蛋白酶也表現出針對乳酸鏈球菌肽以外雜質的選擇活性。
方法胰蛋白酶消化在由25mM乙酸鈉、6mM三羥甲基氨基甲烷乙酸、5mM CaCl2構成的PH值7.0的50ml緩衝液中，實施對乳酸鏈球菌肽(50mg)的胰蛋白酶消化。加入1ml USP級胰蛋白酶(5mg/ml)，然後，在30℃下培養。隨後，在24、48、72和96小時，加入500ul等分試樣的胰蛋白酶。在實驗過程的每個時間點上，取出2ml等分試樣用於進一步分析，其中100ul試樣立即加入血液瓊脂平板以測定汙染。剩餘的1.8ml試樣在-20℃下儲存，直到實驗結束進行SDS-PAGE和HPLC分析。
蛋白酶消化為了用可溶的胰蛋白酶處理乳酸鏈球菌肽，將由發酵產品獲得的2升部分提純的乳酸鏈球菌肽製備成濃度為4.55mg/ml溶液，並加入10mM檸檬酸緩衝液和5mMCaCl2。在加入25mg的USP級胰蛋白酶後，在30℃下過夜培養反應混合物。乳酸鏈球菌肽與胰蛋白酶的重量比是大約400∶1(重量比)。使用NaOH調節消化反應的PH值，使其範圍在5.25-6.50。採用SDS-PAGE和HPLC測定乳酸鏈球菌肽的回收率與純度。通過使用3N HCl使PH值降低至3.0，終止消化反應。基於上述實驗結果，在涉及其它蛋白酶的所有後續反應中選擇並使用PH值5.80。
在如胰蛋白酶所述與PH5.8的條件下基本進行消化實驗，使用胃蛋白酶(EC3.4.2 3.1)、凝血酶(EC3.4.21.5)、V8蛋白酶(EC3.4.21.19)、枯草桿菌蛋白酶(EC3.4.21.62)、木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、嗜熱菌蛋白酶(EC3.4.24.27)、或者梭菌蛋白酶(EC3.4.22.8)。也可以在PH值3.5下進行胃蛋白酶消化。為了採用與固體基質連接的胰蛋白酶進行胰蛋白酶消化，加入10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸，製備成濃度為9.5mg/ml的PH值5.50的1.6升部分提純的乳酸鏈球菌肽溶液。然後，加入1.6ml與珠狀瓊脂糖(SigmaChemical Company)結合的TPCK處理的胰蛋白酶，在30℃頻繁攪拌的條件下將反應混合物培養6小時。採用大約4000個重力離心7分鐘，去除不溶性胰蛋白酶。獲得含有乳酸鏈球菌肽的上清液，用於HPLC分析。
乳腺注入在第4、5、6次擠奶後，採用在乳區注入載體、未經處理的乳酸鏈球菌肽、胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽(30mg/10ml)的方式，處理非乳腺炎的奶牛。在擠奶以前、過程中、或過程後記錄牛奶的體細胞數量。高體細胞數量表明了炎性反應。採用帶有不相等平方差的兩側T-實驗對照，進行統計分析。
乳酸鏈球菌肽的生物活性採用抗微生物分析法，使用96孔平板分析，測定針對乳腺炎離析物無乳鏈球菌(菌株20)、乳酸鏈球菌肽的活性。測試樣品平行稀釋到M17 10％乳糖介質中，然後，與等體積的104cfu/ml混合。室溫下培養66小時後，在ELISA讀取器450nm處讀取平板數據。含有細胞生長的孔會給出高吸光率的讀數。使用四參數曲線擬合軟體分析上述數據。
表1胰蛋白酶處理的乳酸鏈球菌肽的炎症減弱
權利要求
1.一種提純硫醚抗生素的方法，其中包括(a)提供含有待提純硫醚抗生素的溶液；(b)提供蛋白水解酶；(c)生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培養混合物，然後，在保證硫醚抗生素基本未經消化並使非硫醚抗生素蛋白或者多肽雜質選擇性降解最佳化的條件下培養上述混合物。
2.權利要求1的方法，還包括在消化後去除或者滅活水解蛋白酶的步驟。
3.權利要求1的方法，其中(a)步驟提供的溶液是發酵產物。
4.權利要求1的方法，其中硫醚抗生素選自乳酸鏈球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、誘變素、pep5、epicidin、epilancin、溶細胞素、乳鏈球菌素、葡萄球菌素、salvaricin、乳桿菌素、鏈球菌素、sublancin、carnocin、variacin、cypemycin、connamycin、耐久酶素、血管緊張肽轉化酶抑制肽、mersacidin、actagurdine。
5.權利要求1的方法，其中硫醚抗生素是乳酸鏈球菌肽。
6.權利要求5的方法，其中蛋白水解酶是胰蛋白酶。
7.權利要求6的方法，其中使選擇性降解最優化的條件包括pH值在5.5-6.25之間。
8.權利要求1的方法，其中蛋白水解酶選自胰蛋白酶、肽鏈內切酶Arg-C、嗜熱菌蛋白酶、V8蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、梭菌蛋白酶、賴氨醯肽鏈內切酶、木瓜蛋白酶、肽鏈內切酶Asp-N、腸肽酶、凝血因子Xa、胰凝乳蛋白酶。
9.權利要求8的方法，其中使選擇活性最優化的條件包括pH值在5.5-6.25之間。
10.權利要求1的方法，其中蛋白水解酶是胃蛋白酶。
11.權利要求10的方法，其中使選擇活性最優化的條件包括pH值大於4.5。
12.權利要求1的方法，其中蛋白水解酶連接在固體支撐物上。
13.權利要求1的方法，其中蛋白水解酶的有效用量是硫醚抗生素/蛋白水解酶的重量比為約400∶1的。
全文摘要
本發明公開了從含有硫醚抗生素的天然或者部分提純的溶液提純硫醚抗生素的方法。儘管硫醚抗生素的共同結構特徵說明，本發明公開的提純方法對於硫醚抗生素類的其它成員具有有效性，但是在優選具體實施方式
中硫醚抗生素是乳酸鏈球菌肽。本發明方法包括下列步驟生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培養混合物；在使選擇性蛋白水解活性最佳化的條件下培養上述混合物。
文檔編號C12N9/70GK1703518SQ200380101155
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月7日 優先權日2002年10月9日
發明者理察·T.·考格林, 約瑟夫·H.·克雷布 申請人:伊莫西爾有限公司