一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心elisa試劑盒及其製備方法

2023-12-10 04:00:56

專利名稱：一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心elisa試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物樣品檢測領域，涉及一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心 ELISA試劑盒及其製備方法。
背景技術：
肺癌是人類發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，全球每年肺癌發生超過150萬例，其中80%為非小細胞肺癌(NSCLC)。非小細胞型肺癌，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌，與小細胞癌相比其癌細胞生長分裂較慢，擴散轉移相對較晚。儘管診治技術日新月異，肺癌的5 年生存率仍不到15%。要提高肺癌患者的生存率，早期診斷尤其重要。單克隆抗體具有高度特異性，在腫瘤診斷和治療方面都成為當前的研究熱點。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒。本發明的另一目的是提供該ELISA試劑盒的製備方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，包含如下組成保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1，抗 SPC-Al兔多克隆抗體包被的96孔酶標板，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，抗體稀釋液 1 % PBS,洗液，終止液2M H2SO4, TMB底物顯色液，陽性對照SPC_A1裂解液，陰性對照人AB 血清或胎牛血清和空白對照1% PBS0所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，優選包含如下組成保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1 5-10 μ L，抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的酶標板1塊，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG 5-10 μ L，抗體稀釋液為 PBS 40_50mL，洗液 40_50mL，終止液 2Μ H2SO4 8-IOmL, TMB底物顯色液A、B液各8-10mL，陽性對照SPC_A1裂解液400-600 μ L，陰性對照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白對照1 % PBS l_2mL。其中，所述的保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1濃度為200mg/L。所述的抗SPC-Al兔多克隆抗體的通過如下方法製備首次免疫用IX IO8個 SPC-Al細胞對紐西蘭兔進行耳緣靜脈注射，其後隔一周加強免疫一次，免疫劑量為3 X IO8 個細胞，每次免疫前均進行耳緣靜脈採血，間接ELISA法檢測血清抗體效價，待抗體滴度達大於或等於1 300000後進行腹主動脈放血，將兔血37°C放置lh，再轉入4°C過夜，待血液充分收縮後迅速分離血清，並於4°C，3000r/min離心30min，收集上清，利用ftOtein A親和層析法進行純化，純化後效價為1 150 000-1 170 000。 所述的抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的酶標板通過如下方法製備用pH9. 6的碳酸鹽包被緩衝液將純化後抗SPC-Al兔多克隆抗體稀釋成目的濃度0. 63 μ g/mL ；將稀釋好的抗體溶液混勻後加入微孔中，100 μ L/孔，4°C過夜；洗板3次；加入3% BSA封閉液，300 μ L/ 孔，4°C過夜；洗板3次。所述的pH 9. 6 的碳酸鹽包被緩衝液=Na2CO3 1. 59g, NaHCO3 2. 93g，加 ddH20 至 1L， 最後用IOM NaOH調節pH至9. 6，混勻。所述的洗液配方為2.Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · Iffl2O ；0. 2g KCl ； 0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL吐溫-20，臨用前加ddH20至IL ；SPC-Al裂解液製備方法為 將SPC-Al鋪於六孔板中，濃度為1 X IO6個/mL ；待細胞鋪滿孔底後，棄培養液，加4°C預冷 1% PBS洗兩遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震蕩器上；30min後，用槍頭刮取貼壁細胞，收集裂解液於1.5mL EP管中，13000g離心IOmin ；留取上清，分裝後_20°C保存。所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒的製備方法，包含如下步驟(1)單克隆抗體NJ001-1的製備取8-10周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 石蠟油，IOd後分別腹腔注射生長良好的保藏號為CCTCC N0:C201172的雜交瘤細胞 NM001-11 X IO6/只，1-2周後抽吸腹水，37°C Ih後，4°C過夜，次日將腹水離心，經I^rotein G 親和層析柱純化，得到純化的單克隆抗體NJ001-1，抗體經甘油與水比例為1 1的液體進行溶解，終濃度為200mg/L ；(2)抗SPC-Al兔多克隆抗體的製備首次免疫用IX IO8個SPC-Al細胞對紐西蘭兔進行耳緣靜脈注射，其後隔一周加強免疫一次，免疫劑量為3 X IO8個細胞，每次免疫前均進行耳緣靜脈採血，間接ELISA法檢測血清抗體效價，待抗體滴度達大於或等於1 300 000後進行腹主動脈放血，將兔血37°C放置lh，再轉入4°C過夜，待血液充分收縮後迅速分離血清，並於4°C，3 000r/min離心30min，收集上清，利用I^rotein A親和層析法進行純化， 純化後效價為 1 150 000-1 170 000，濃度為 14. 77 μ g/mL ；(3)抗SPC-Al兔多克隆抗體包被酶標板用pH 9. 6的碳酸鹽包被緩衝液將純化後抗SPC-Al兔多克隆抗體稀釋成目的濃度0. 63 μ g/mL ；將稀釋好的液體充分混勻後加入微孔中，100 μ L/孔，4°C過夜；洗板3次，200 μ L/孔；加入3 % BSA封閉液，300 μ L/孔，4°C 過夜；洗板3次，200 μ L/孔；_20°C保存；(4)洗液、SPC-Al 裂解液、1 % PBS 的配製洗液2. Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 2g KCl ；0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL 吐溫-20，臨用前加 ddH20 至 IL ； SPC-Al裂解液製備方法將SPC-Al鋪於六孔板中，濃度為IX IO6個/mL ；待細胞鋪滿孔底後，棄培養液，加4°C預冷1 % PBS洗兩遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震蕩器上； 30min後，用槍頭刮取貼壁細胞，收集裂解液於1.5mL EP管中，13 OOOg離心IOmin ；留取上清，分裝後 _20°C保存；1%PBS :8g NaCl ；2. 2g KCl ； 1. 44g Na2HPO4 ；0. 24g KH2PO4JnddH2O 至 800mL ；(5)試劑盒組裝上述製備的保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1 5-10 μ L，抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的酶標板1塊，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 5-10 μ L，抗體稀釋液為1 % PBS 40_50mL，洗液 40-50mL,終止液2M H2SO4 8-IOmL, TMB底物顯色液A、B液各8_10mL，陽性對照SPC-Al裂解液400-600 μ L，陰性對照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白對照1 % PBS l_2mL組裝成試劑盒。所述的pH 9. 6 的碳酸鹽包被緩衝液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加 ddH20 至 1L， 最後用IOM NaOH調節pH至9. 6，混勻。本發明的有益效果本發明在成功製備了能特異性識別非小細胞肺癌的單抗NJ001-1的基礎上，首先通過Western blot證實了肺腺癌患者血清中NJ001-1相關靶抗原的表達水平明顯高於健康體檢者；然後免疫紐西蘭兔製備並純化得到高效價的抗SPC-Al的多克隆抗體，聯合該多抗和NJ001-1單抗建立雙抗體夾心ELISA試劑盒，最後利用該試劑盒對大量的臨床樣本進行檢測和分析。結果顯示，該試劑盒用於非小細胞肺癌的檢測具有很好的特異性、精密度和穩定性，有望在臨床檢測中發揮重要作用。目前市面上無國家FSDA批准的非小細胞肺癌抗原ELISA檢測試劑盒，採用現有電化學發光方法檢測非小細胞肺癌，與本ELISA檢測方法比較，更敏感的化學發光法進行檢測，結果顯示本發明試劑盒用於非小細胞肺癌的檢測時敏感度和特異性均優於化學發光法。


圖1間接細胞ELISA法分析單抗NJ001-1與多種腫瘤細胞及非腫瘤細胞的反應性。圖2血清中NJ001-1相關靶抗原的蛋白免疫印跡結果及灰度分析；A :2、3和6為三位健康體檢者的血清樣本，4和5為兩位肺腺癌患者的血清樣本， 1為SPC-Al細胞裂解液(陽性對照)；B 1為肺腺癌患者，2為健康體檢者，3為陽性對照。圖3抗SPC-Al多克隆抗體的效價檢測。圖4棋盤法確定包被抗體和NJ001-1的最佳工作濃度。生物材料樣品的保藏信息雜交瘤細胞株NM001-1於2011年8月31日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢，武漢大學，保藏號為CCTCC NO :C201172。
具體實施例方式1、以下實施例中所涉及的細胞及主要試劑人肺癌細胞系SPC-A1、A549、 NCI-H460、NCI-H520,人肝癌細胞系H印G2，人乳腺癌細胞系ZR-75-30，人結腸癌細胞系 Colo205及人胚肺成纖維細胞系WI-38購自中國科學院細胞庫；SP2/0小鼠骨髓瘤細胞系由本實驗室保存；6-8周齡和8-10周齡雌性BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物公司。 RPMI 1640、DMEM、胎牛血清、0. 25%胰蛋白酶、聚乙二醇、次黃嘌呤胸腺嘧啶核苷(HT)、氨基喋呤次黃嘌呤胸腺嘧啶核苷(HAT)、人AB血清和石蠟油購自美國Gibco ^witrogen公司； FITC標記的羊抗鼠IgG及可溶型單組分TMB底物溶液購自北京天根公司；小鼠Ig亞型測定試劑盒購自美國Santa Cruz公司；Western blot顯色劑購自美國Cell Signaling公司；肺炎性假瘤組織、肺癌組織及乳腺癌組織由江蘇省人民醫院病理科提供；Model 550型酶標儀購自Bio-Rad公司。2. 5Kg的雄性紐西蘭兔購自上海斯萊克實驗動物公司。BSA購自Biosharp公司；GAPDH抗體購自碧雲天公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司；Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit 購自默克公司。2、以下實施例中所涉及的細胞培養方法為上述細胞分別生長於含10%胎牛血清、青黴素和鏈黴素各100U/mL的DMEM或RPMI1640培養液中，37°C、5% CO2恆溫培養箱中培養。人外周血單個核細胞(PBMC)獲自健康獻血者，採用常規淋巴細胞分離液分離。3、標本收集2007年10月至2011年6月病理科確診的肺癌患者303例，其中195 例為肺腺癌，作為實施例6-8中的肺腺癌組，69例為肺鱗癌，作為實施例6-8中的肺鱗癌，肺腺癌組和肺鱗癌組合併作為非小細胞肺癌組；39例為小細胞肺癌，作為實施例6-8中的小細胞肺癌組；同時收集50例肺良性疾病患者，作為實施例6-8中的肺良性疾病組和500例健康體檢者作為實施例6-8中的健康體檢組。臨床病理參數見表1，隨訪至2011年10月。表1不同組別的臨床病理參數
權利要求
1.一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於包含如下組成保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體 NJ001-1，抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的96孔酶標板，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，抗體稀釋液1 % PBS,洗液，終止液2M H2SO4, TMB底物顯色液，陽性對照SPC_A1裂解液，陰性對照人AB血清或胎牛血清和空白對照1% PBS0
2.根據權利要求1所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於包含如下組成保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體 NJOOl-15-ΙΟμ L，抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的酶標板1塊，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG 5-10 μ L，抗體稀釋液 PBS 40_50mL，洗液 40_50mL，終止液 2Μ H2SO4 8_10mL，TMB 底物顯色液A、B液各8-10mL，陽性對照SPC-Al裂解液400-600 μ L，陰性對照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白對照1% PBS l_2mL。
3.根據權利要求2所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於所述的保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1濃度為200mg/L，使用時稀釋度為1 4 000。
4.根據權利要求2所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於所述的抗SPC-Al兔多克隆抗體的通過如下方法製備首次免疫用1 X IO8個SPC-Al細胞對紐西蘭兔進行耳緣靜脈注射，其後隔一周加強免疫一次，免疫劑量為3 X IO8個細胞，每次免疫前均進行耳緣靜脈採血，間接ELISA法檢測血清抗體效價，待抗體滴度達大於或等於1 300 000後進行腹主動脈放血，將兔血37°C放置lh，再轉入4°C過夜，待血液充分收縮後迅速分離血清，並於4°C，3000r/min離心30min，收集上清，利用I^rotein A親和層析法進行純化，純化後效價為1 150 000-170 000。
5.根據權利要求4所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於所述的抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的酶標板通過如下方法製備用pH 9. 6的碳酸鹽包被緩衝液將純化後抗SPC-Al兔多克隆抗體稀釋成目的濃度0. 63 μ g/mL ；將稀釋好的抗體溶液混勻後加入微孔中，100 μ L/孔，4°C過夜；洗板3次；加入3% BSA封閉液，300 μ L/ 孔，4°C過夜；洗板3次。
6.根據權利要求5所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於所述的PH9. 6的碳酸鹽包被緩衝液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加ddH20至1L，最後用IOM NaOH調節pH至9. 6，混勻。
7.根據權利要求2所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於所述的洗液配方為:2. Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · Iffl2O ；0. 2g KCl ；0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL吐溫-20，臨用前加ddH20至IL ；SPC-Al裂解液製備方法為將 SPC-Al鋪於六孔板中，濃度為1 X IO6個/mL ；待細胞鋪滿孔底後，棄培養液，加4°C預冷1 % PBS洗兩遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震蕩器上；30min後，用槍頭刮取貼壁細胞，收集裂解液於1.5mL EP管中，13 OOOg離心IOmin ；留取上清，分裝後_20°C保存。
8.權利要求1所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒的製備方法， 其特徵在於包含如下步驟(1)單克隆抗體NJ001-1的製備取8-10周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL石蠟油，IOd後分別腹腔注射生長良好的保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞NM001-1 IXlO6/只，1-2周後抽吸腹水，37°C Ih後，4°C過夜，次日將腹水離心，經ftOtein G親和層析柱純化，得到純化的單克隆抗體NJ001-1，抗體經甘油與水比例為1 1的液體進行溶解， 終濃度為200mg/L ；(2)抗SPC-Al兔多克隆抗體的製備首次免疫用IXIO8個SPC-Al細胞對紐西蘭兔進行耳緣靜脈注射，其後隔一周加強免疫一次，免疫劑量為3 X IO8個細胞，每次免疫前均進行耳緣靜脈採血，間接ELISA法檢測血清抗體效價，待抗體滴度達大於或等於1 300 000 後進行腹主動脈放血，將兔血37°C放置lh，再轉入4°C過夜，待血液充分收縮後迅速分離血清，並於4°C，3 000r/min離心30min，收集上清，利用I^rotein A親和層析法進行純化，純化後效價為 1 150 000-1 170 000，濃度為 14. 77μ g/mL ；(3)抗SPC-Al兔多克隆抗體包被酶標板用pH9.6的碳酸鹽包被緩衝液將純化後抗 SPC-Al兔多克隆抗體稀釋成目的濃度0. 63 μ g/mL ；將稀釋好的液體充分混勻後加入微孔中，IOOyL/孔，4°C過夜；洗板3次，200yL/孔；加入3% BSA封閉液，300 μ L/孔，4°C過夜； 洗板3次，200 μ L/孔；-20°C保存；(4)洗液、SPC-Al裂解液、PBS的配製洗液2. Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 2g KCl ；0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL 吐溫-20，臨用前加 ddH20 至 IL ；SPC-Al裂解液製備方法將SPC-Al鋪於六孔板中，濃度為IX IO6個/mL ；待細胞鋪滿孔底後，棄培養液，加4°C預冷1 % PBS洗兩遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震蕩器上；30min後，用槍頭刮取貼壁細胞，收集裂解液於1. 5mL EP管中，13 OOOg離心IOmin ； 留取上清，分裝後-20°C保存；1% PBS :8g NaCl ；2. 2g KCl ；1. 44g Na2HPO4 ；0. 24g KH2PO4 ；力口 ddH20 至 800mL ；(5)試劑盒組裝上述製備的保藏號為CCTCCNO :C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1 5-10 μ L，抗SPC-Al兔多克隆抗體包被的酶標板1塊， 辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 5-10 μ L，抗體稀釋液1 % PBS 50mL,洗液40_50mL，終止液 2M H2SO4 8-IOmL, TMB 底物顯色液 A、B 液各 8_10mL，陽性對照SPC-Al 裂解液 400-600 μ L， 陰性對照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白對照1 % PBS l_2mL組裝成試劑盒。
9.根據權利要求8所述的用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的pH 9. 6的碳酸鹽包被緩衝液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加ddH20 至1L，最後用IOM NaOH調節pH至9. 6，混勻。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測非小細胞肺癌的雙抗體夾心ELISA試劑盒及其製備方法。該試劑盒，包含如下組成保藏號為CCTCC NOC201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌單克隆抗體NJ001-1，抗SPC-A1兔多克隆抗體包被的96孔酶標板，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，抗體稀釋液1％PBS，洗液，終止液2M H2SO4，TMB底物顯色液，陽性對照SPC-A1裂解液，陰性對照人AB血清或胎牛血清和空白對照1％PBS。與現有檢測方法比較，該試劑盒用於非小細胞肺癌的檢測具有最好的敏感性(59.1％)和特異性(4.4％)，同時具有較好的精密度和穩定性。
文檔編號G01N33/574GK102507943SQ20111034394
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者潘世揚, 王芳, 黃珮珺 申請人:潘世揚