利用色素蛋白創造家蠶彩色繭的方法

2023-12-10 04:01:31

專利名稱：利用色素蛋白創造家蠶彩色繭的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、生物工程領域，特別是涉及利用色素蛋白創造家蠶彩色繭的一 種方法。
背景技術：
生物體能呈現各種各樣的顏色，從而構成繽紛多彩的生物世界。生物體的顏色主要取 決於兩個方面的因素組織或器官特殊的光學結構和色素物質的存在，即結構色和化學色。 家蠶絲蛋白的特殊空間結構賦予了蠶絲珍珠般的光澤，而小分子色素物質的存在則使蠶繭 呈現出不同的顏色。正是雍容典雅的光澤、輕盈舒適的觸感、良好的衣料懸垂性和曲線性、 適中的吸水性以及對人體肌膚的親和性等固有的優良特性，使得蠶絲被譽為"纖維皇后"。既然是纖維中的"皇后"，為何蠶絲纖維在五大纖維(棉、麻、毛、絲和人造纖維) 中並沒有佔有很大的市場份額呢？這是由於除了擁有數不勝數的優點以外，天然的蠶絲也 具有一些目，無法彌補的缺點①目前蠶業生產中使用的家蠶品種多為白繭品種，其繅制 的生絲用於織布前需要進行染色，而目前蠶絲染色技術尚不夠成熟，容易造成染斑、泛黃 和脆化；②由於蠶絲的本質是蛋白質，其耐熱性、耐曬性能較差，紫外線輻射和染色過程 中使用到的苦味酸等化學物質均會引起絲色泛黃。具有如此優良特性的蠶絲卻因為上述兩 個方面的缺點而無法更加全面的推廣使用，這不論對蠶業工作者還是對人類的健康，都是 一個不小的損失和遺憾。所以，中外的眾多學者以解決這兩個難題為耙標，從不同的角度 進行了不同程度的探討研究。如提高染色技術、對繭絲蛋白進行改性等都是一些直接而實 用的思路，但是長久以來都沒能有效地克服蠶絲的缺點。另一種可行的思路就是利用天然 的有色繭品種或創造新的彩色繭品種，獲得的蠶繭繅絲後不需印染而直接應用於織物。目前飼養的實用品種幾乎全為白繭品種，其實家蠶的繭色豐富多彩，大致可分為黃紅 繭系和綠繭,兩大類。黃紅繭系包括淡黃、金黃、肉色、紅色、蒿色、鏽色等，其繭色源 於桑葉中的類胡蘿蔔素和葉黃素類色素，前者包括p-胡蘿蔔素和新生p-胡蘿蔔素，後者包 括葉黃素、蒲公英黃質、紫黃質、次黃嘌呤黃質等，其色素分布於絲膠中。綠色繭系的色 素則是來自於體內生成的黃酮類色素，其色素分布於絲膠及絲素中。不管是黃紅繭系還是 綠色繭系，其繭色的形成都由一個或多個複雜的基因控制、涉及到一個紛繁複雜的通路並 受到多種因素的影響。色素物質要從桑葉到達絲腺內與絲物質結合，必須要經過家蠶的消 化道、透過消化管壁、經過血液、透過絲腺壁而最終與絲素或絲膠結合。在這個過程中， 消化道中消化液的作用、中腸壁的透過能力與透過部位、血液的氧化能力、色素物質的移動速度、絲腺壁的透過性、絲腺的吸收部位以及色素物質與絲蛋白的結合能力等均會直接 影響到繭色的形成。此外，避開家蠶繭色形成的複雜性不談，即使桑葉中的色素全部都能 夠順利地"過五關斬六將"，進入絲腺並最終形成有色蠶繭，對於家蠶繭色來說，仍然存 在著兩個關鍵而難以彌補的問題①桑葉中的色素種類有限，即使它們能全部進入絲腺參 與有色繭的形成，形成的彩繭種類也最多只能包含黃紅繭系和綠色繭系的所有顏色，而這 些顏色在自然界的所有顏色中僅僅只佔了很小的一部分；②除了綠色繭的部分色素存在於 絲素中以外，天然彩色繭中的色素幾乎都存在於絲膠之中，而絲膠在蠶絲中只起到保護和 粘著的作用，在繅絲過程中隨著脫膠作用而部分流失，其內的色素對絲織品的顏色非但沒 有貢獻，反而成了一種汙染，這也是人們在長期以來的品種選育中利用白繭而淘汰有色繭 的最主要原因。到目前為止，改變和創造有色蠶繭的思路包括以下幾種①通過分子遺傳工程改造繭 色基因；②添食色素；③利用已有的彩色繭品種育成新的彩繭品種； 突變篩選。這些方 法都能在一定程度上改變或創造家蠶有色繭，但其產生的彩色繭都無法擺脫顏色種類受 限、色素結合不穩定等天然彩繭所具有的缺陷。家蠶基因組框架圖和精細圖的先後公布，為家蠶基因和分子水平的研究提供了一個更 為廣闊的平臺，也為現代蠶業的發展注入了新的生機和活力。尤其是家蠶轉基因等技術的 日趨成熟，使得利用現代生物技術創造新型生物素材成為家蠶後基因組時代和現代農業技 術體系中的重要課題。但是生物技術所研究的對象和靶標是基因和蛋白質，對於一般的非 蛋白且沒有固定結合蛋白的色素物質卻是束手無策。自然界中的天然色素，尤其是生物體 中的色素，絕大多數是烯類等非蛋白的物質，它們分散或集中的固定於某一組織或器官上， 在相應輔基存在的條件下使生物體著色。但是，也有少部分色素物質例外，即色素蛋白， 這一類色素多屬於綠色螢光蛋白(GFP)家族的成員，它們在本質上是純的蛋白質，由單 個基因表達，而且不需要任何的輔基，僅僅依靠分子內源性的發色基團而呈現出不同的顏 色。這類色素蛋白存在於珊瑚礁相關的海洋生物之中，鮮豔的色彩是珊瑚礁等相關的海洋 生物包括從海綿到魚類等的最引人注目的特性，而這些鮮豔的色彩均是取決於一種或幾種 色素蛋白在其體內的表達情況。基於以上考慮，本研究發明利用轉基因的方法，將上述決定珊瑚礁等相關的海洋生物 顏色的蛋白質的基因轉入家蠶中，令其在絲腺中特異的與絲素蛋白融合表達，則可以巧妙 地避開一般色素物質進入絲蛋白的複雜通路而難以人為操控的難題來創造色彩豐富的彩 色繭。另外，本研究發明由於外源色素蛋白是在絲素中融合表達，會穩定均勻地存在於絲 素分子中，色素蛋白在繅絲過程中並不會因為脫膠而流失，而且色素蛋白的顏色種類豐富， 利用這種方法可以突破繭色受限於桑葉色素的極限而大大地擴展家蠶繭色的種類。發明內容本發明的目的在於提供一種利用色素蛋白創造家蠶彩色繭的路線方法。該路線方法利 用家蠶轉基因技術，尤其是滯育品種的轉基因技術，在家蠶絲素中融合表達決定珊瑚礁等 相關海洋生物體顏色的色素蛋白，從而創造出新的有色蠶繭。本發明首次利用色素蛋白創造家蠶有色繭，並通過家蠶轉基因技術獲得了多種顏色的 新型蠶繭，尤其是獲得了一批在家蠶中從未出現過的、利用現有技術也無法實現的彩色繭。 本發明巧妙地突破了人為控制家蠶繭色的技術瓶頸，建立了一種可靠而高效的創造新型彩 色繭的技術路線方法，為利用現代生物技術創造新的生物素材提供了一種新的方法。本發明利用色素蛋白創造新型彩色繭的方法，依次通過以下步驟實現(1) 色素蛋白基因的獲取選取珊瑚礁或其它相關海洋生物體的相應組織提取基因組或 合成相關的CDNA，擴增出表達色素蛋白的基因片段，或者直接向有關生物公司購買含有色 素蛋白基因的載體；(2) 家蠶轉基因載體的構建依據目前家蠶公知公用轉基因技術的要求，構建piggyBac 表達載體，以眼和神經特異的啟動子3xp3啟動的紅色螢光蛋白(DsRed)作為篩選標記，與 家蠶絲素重鏈啟動子啟動獲得的色素蛋白基因實現融合表達；(3) 家蠶胚胎顯微注射用白色繭家蠶品種作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後在產卵後3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul的重組轉座載體質粒和輔助載體 質粒從蠶卵腹面中央注入已經解除滯育的蠶卵中，並用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小 孔；(4) 轉基因蠶的篩選將注射完成的蠶卵在35-37W的甲醛蒸氣中消毒5min後，置於25 °C、相對溼度85%以上的條件下，進行催青直到孵化，詞養孵化出來的蟻蠶，將當代(GO) 的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體，即獲得相應 顏色蠶繭的轉基因個體；(5) 彩色蠶繭轉基因品系材料的獲得將篩選到的轉基因陽性個體詞養至上簇採繭並進 一步自交選純，即獲得能穩定遺傳的彩色蠶繭轉基因品系材料。上述步驟中，h表示小時，min表示分鐘。用家蠶絲素重鏈啟動子啟動色素蛋白基因 融合表達的方法，本發明專利申請人已於2006年7月14日申請專利(申請號 200610054442.x)，現已公開。本發明的優點是本發明首次實現了利用色素蛋白創造有色蠶繭，將素材創新的設想與家蠶轉基因技術 有機地結合，巧妙地突破了人為控制家蠶繭色的技術瓶頸。本發明的優點是(l)植物的葉、果由於含有葉綠素、花青素，以及某些植物含有的胡蘿蔔素，都是綠色、紅色的，而動物大多以植物為食，所以藍色很少出現在常見的生物體中。家蠶也不例外， 所以家蠶只有黃紅繭系和綠色繭系。根據配色的原理，只有同時存在紅、綠、藍三種基本 色調時，才可以相互搭配而調出各種各樣的顏色。本發明利用色素蛋白創造出藍色的蠶繭， 為實現蠶繭色彩的全面多樣化創造了條件。(2) 本發明中使用的表達形式為家蠶絲素重鏈融合表達，令色素與繭絲的主體——絲素 ——融合表達，在絲腺分泌絲素的時候色素蛋白就能穩定均勻地分布在絲素之中，再經過 吐絲過程的壓搾結晶，使得色素物質與絲素牢固的結合，即使在繅絲和生絲精煉的過程中 色素蛋白並不會因為脫膠而流失。用這種蠶絲生產出的纖維織物，勿需印染即可直接應用 於織布，將大大簡化紡服工藝，節約大量的生產成本。(3) 由於蠶絲結構緻密，雖然在染色時比較容易著色，但染料與蠶絲的結合併不是很穩 定，容易造成絲織物的脫色和掉色現象。而本發明中的色素蛋白乃是與絲素徹底的融合， 而且所使用的色素蛋白對熱、去垢劑、還原劑、離液劑、極端PH值和蛋白酶等都具有強 的抵抗能力，能夠達到絲織物永不退色的效果。(4) 蠶絲染整工藝中所使用的試劑和染料多為酸或鹼，這些化學物質不但會影響蠶絲的 品質，還會危害人類的健康。本發明所創造的彩色繭則可以越過染整這一個步驟，不但保 證了蠶絲的品質，而且為人類的健康提供了保障。(5) 本發明中使用的色素蛋白基本上都屬於GFP家族，GFP家族的螢光和非螢光的色素 蛋白的吸收光譜都覆蓋了紫外光區域並以紫外等短波為主。用這種材料做成的織物可以吸 收紫外線從而降低紫外線對人類的傷害。(6) 色素蛋白可高效地吸收紫外線並將其轉化為另一種長波段的光或者熱能，用這種材 料做成的織物可能具有獨特的光學特性和更廣泛的用途。本發明所使用的方法一次性解決了家蠶繭色顏色種類少、色素結合不穩定兩大重要難 題，可簡化絲織物的紡服工藝，消除染整工藝對蠶絲品質和人類健康的危害，將為本來就 享有"纖維皇后"的美譽的蠶絲增添新的優良特質。
具體實施例方式實施例l:利用實用家蠶品種"碧波"(白色繭品種)作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後 於產下後3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和 眼睛特異啟動子啟動的紅色螢光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的綠色螢光蛋白(綠色熒 光性色素蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入1500粒蠶卵中，用無毒 膠水封住注射口，經3596的甲醛蒸氣中消毒5min以後，置於25'C、相對溼度85%以上的髙 溼度環境中催青孵化，將孵化的73頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的40頭GO代蠶蛾，通過自交或回交共獲得27蛾圈Gl代蠶卵，用0]^1^1)3 電動宏觀螢光顯微 鏡觀察篩選27蛾圈G1代蠶卵並獲得3個陽性蛾圈，共18頭轉基因蠶。將獲得的18頭轉 基因蠶詞養至上簇採繭，共獲得18個呈現出不同程度的淡綠色的蠶繭。 實施例2:利用實用家蠶品種"洞庭"(白色繭品種)作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後 於產下後3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和 眼睛特異啟動子啟動的紅色螢光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的藍色螢光蛋白(藍色熒 光性色素蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入1800粒蠶卵中，用無毒 膠水封住注射口，經36W的甲醛蒸氣中消毒5min以後，置於25'C、相對溼度85%以上的高 溼度環境中催青孵化，將孵化的150頭G0代蟻蠶用人工詞料收集飼養至化蛾，獲得的100 頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得62蛾圈G1代蠶卵，用0^!^118 電動宏觀螢光顯微 鏡觀察篩選62蛾圈G1代蠶卵並獲得15個陽性蛾圈，共120頭轉基因蠶。將獲得的120 頭轉基因蠶飼養至上簇採繭，共獲得113個呈現出不同程度的藍色的蠶繭。實施例3:利用實用家蠶品種"872"(白色繭品種)作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後於 產下後3-6h,用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼 睛特異啟動子啟動的紅色螢光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的黃色螢光蛋白(黃色螢光 性色素蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入2000粒蠶卵中，用無毒膠 水封住注射口，經37M的甲醛蒸氣中消毒5min以後，置於25'C、相對溼度85%以上的高溼 度環境中催青孵化，將孵化的142頭GO代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的99頭 GO代蠶蛾，通過自交或回交共獲得45蛾圈G1代蠶卵，用01ympus⑧電動宏觀螢光顯微鏡 觀察篩選45蛾圈G1代蠶卵並獲得12個陽性蛾圈，共80頭轉基因蠶。將獲得的80頭轉 基因蠶飼養至上簇採繭，共獲得69個呈現出不同程度的黃色的蠶繭。實施例4:利用實用家蠶品種"871"(白色繭品種)作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後於 產下後3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼 睛特異啟動子啟動的紅色螢光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的洋紅色色素蛋白(洋紅色 非螢光性色素蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入2500粒蠶卵中，用 無毒膠水封住注射口，經35免的甲醛蒸氣中消毒5min以後，置於25'C、相對溼度85%以上 的高溼度環境中催青孵化，將孵化的200頭G0代蟻蠶用人工飼料收集詞養至化蛾，獲得 的180頭GO代蠶蛾，通過自交或回交共獲得87蛾圈Gl代蠶卵，用01ympus②電動宏觀熒 光顯微鏡觀察篩選87蛾圈G1代蠶卵並獲得20個陽性蛾圈，共150頭轉基因蠶。將獲得的150頭轉基因蠶飼養至上簇採繭，共獲得134個呈現出不同程度的紅色的蠶繭。 實施例5:利用實用家蠶品種"秋白"(白色繭品種)作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後 於產下後3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和 眼睛特異啟動子啟動的紅色螢光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的藍色色素蛋白(藍色非 螢光性色素蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入2300粒蠶卵中，用無 毒膠水封住注射口，經35先的甲醛蒸氣中消毒5min以後，置於25'C、相對溼度85%以上的 高溼度環境中催青孵化，將孵化的106頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的 89頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得53蛾圈G1代蠶卵，用01ympus⑧電動宏觀螢光顯 微鏡觀察篩選53蛾圈G1代蠶卵並獲得8個陽性蛾圈，共82頭轉基因蠶。將獲得的82頭 轉基因蠶飼養至上簇採繭，共獲得75個呈現出不同程度的藍色的蠶繭。實施例6:利用實用家蠶品種"碧波"(白色繭品種)作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後 於產下後3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色螢光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的深紅色色素蛋白的重 組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入2100粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，經 36%的甲醛蒸氣中消毒5min以後，置於25'C、相對溼度85%以上的高溼度環境中催青孵化， 將孵化的96頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的81頭G0代蠶蛾，通過自交 或回交共獲得43蛾圈Gl代蠶卵，用OlympusS電動宏觀螢光顯微鏡觀察篩選53蛾圈Gl 代蠶卵並獲得3個陽性蛾圈，共24頭轉基因蠶。將獲得的24頭轉基因蠶飼養至上簇採繭， 共獲得24個呈現出不同程度的深紅色的蠶繭。
權利要求
1、利用色素蛋白創造家蠶彩色繭的方法，其特徵在於依次通過以下步驟實現(1)色素蛋白基因的獲取選取珊瑚礁或其它相關海洋生物體的相應組織提取基因組或合成相關的cDNA，擴增出表達色素蛋白的基因片段，或者直接向有關生物公司購買含有色素蛋白基因的載體；(2)家蠶轉基因載體的構建依據目前家蠶公知公用轉基因技術的要求，構建piggyBac表達載體，以眼和神經特異的啟動子3xp3啟動的紅色螢光蛋白(DsRed)作為篩選標記，與家蠶絲素重鏈啟動子啟動獲得的色素蛋白基因實現融合表達；(3)家蠶胚胎顯微注射用白色繭家蠶品種作為原始材料，將初產下的卵解除滯育後在產卵後3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul的重組轉座載體質粒和輔助載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經解除滯育的蠶卵中，並用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔；(4)轉基因蠶的篩選將注射完成的蠶卵在35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min後，置於25℃、相對溼度85％以上的條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體，即獲得相應顏色蠶繭的轉基因個體；(5)彩色蠶繭轉基因品系材料的獲得將篩選到的轉基因陽性個體飼養至上簇採繭並進一步自交選純，即獲得能穩定遺傳的彩色蠶繭轉基因品系材料。上述步驟中，h表示小時，min表示分鐘。
全文摘要
一種利用色素蛋白創造家蠶彩色繭的方法，用家蠶轉基因技術，尤其是滯育品種的轉基因技術，在家蠶絲素中融合表達決定珊瑚礁等相關海洋生物體顏色的色素蛋白，從而創造出新的有色蠶繭。由於外源色素蛋白是在絲素中融合表達，會穩定均勻地存在於絲素分子中，色索蛋白在繅絲過程中不會因為脫膠而流失，而且色素蛋白的顏色種類豐富。本發明所使用的方法一次性解決了家蠶繭色顏色種類少、色素結合不穩定兩大難題，可簡化絲織物的紡服工藝，消除染整工藝對蠶絲品質和人類健康的危害。
文檔編號C12N15/11GK101255423SQ20081006949
公開日2008年9月3日 申請日期2008年3月21日 優先權日2008年3月21日
發明者向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 趙愛春, 成 魯 申請人:重慶拓桑生物科技有限公司