一種hTAZ融合基因及構建的慢病毒和促成骨的應用的製作方法

2023-12-10 03:18:46

專利名稱：一種hTAZ 融合基因及構建的慢病毒和促成骨的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於MSC誘導分化技術領域，涉及一種hTAZ融合基因及構建的慢病毒和促成骨的應用。
背景技術：
目前骨質疏鬆症的研究，多是針對增強的破骨細胞骨吸收作用給予骨吸收抑制劑 (雌激素、孕激素、選擇性雌激素受體調節劑、雙膦類藥物、降鈣素等)，輔助以促進成骨的礦化劑(鈣劑，活性維生素D等)。雖然雌激素補充替代(estrogen replacement therapy, ERT)對增加絕經後骨量(bone mineral density, BMD)效果明顯，也能減少骨質疏鬆症患者骨折的發生率，但是其也增加了患者罹患乳腺癌、子宮內膜癌的發生率，更因其可以對血脂代謝產生影響，增加了患者心肌梗塞、中風、深靜脈血栓，肺栓塞的發生率。雙膦類 (bisphosphonates, BP)藥物被破骨細胞吸收後幹擾破骨細胞的多個生化過程，抑制骨吸收，可以增加骨量，降低脆性骨折的發生率。但其也存在著誘發視力模糊，食道、胃潰瘍，腎功能不全，血栓栓塞等併發症的危險。維生素D可以促進腸道、腎臟鈣的吸收，但單獨使用效果不理想。單純補鈣效果也不明顯，骨密度(BMD)僅能增加1. 13% 2. 05%，而且一旦停藥效果不能持續，且效果與劑量間關係不大。最新的研究表明，骨質疏鬆症所引起的成骨活性減低，骨量減少常常伴發有骨髓中成脂活性增加，脂肪組織集聚。骨髓中成骨細胞和成脂細胞的共同祖細胞-骨髓間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSC)成脂分化增強，成骨分化減弱是導致骨質疏鬆的另一種主要機制。骨髓MSC的分化同時受到成骨分化因子-Rimt相關轉錄因子2 (Runx2)和成脂分化基因_過氧化物61±曾殖體激 舌受體(peroxisome proIiferator-actiν ated receptors, PPAR)調控。現有的研究表明，Runx2在骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等上遊分子的作用下促進下遊Osterix等分子的表達，進而促進MSC分化為成骨細胞。 而 PPAR 和 CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, C/EBP)等分子在其它調節因子的作用下促進脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding protein, aP2)等下遊基因的表達，進而促進MSC成脂分化。組蛋白去乙醯化酶(sirtuin typel, SIRT1)被激活後能抑制PPARy的生成， 抑制 MSC 成月旨分化(Wang H, Qiang L, Farmer SR. Identification of a domain within peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulating expression of a group of genes containing fibroblast growth factor 21that are selectively repressed by SIRTl in adipocytes. Mol Cell Biol. 2008 ；28(1) : 188-200)。龐婷婷等提出可將SIRTl作為切入點，利用高表達SIRTl開展抑制MSC成脂、促進成骨的研究，其實驗結果尚未見公開報導。Fan Q等著眼於骨髓間充質幹細胞成骨與成脂分化平衡，選擇CCAAT/ 增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, C/EBP- α )為靶基因，研究它在細胞成骨-成脂轉分化過程中的調節作用。他們發現過表達C/ΕΒΡα可以抑制BMP-2誘導的C3H10T1/2細胞的成骨分化，進而提出通過抑制C/ΕΒΡα的表達而達到促進骨形成，抑制脂肪異常增生的研究，但其進一步的實驗結果也未見報導。羥固醇(Oxysterols)、淫羊藿酮(Epimedium-derivedflavonoids)、三七總皂苷 (Panax notoginseng saponins)等化合物和中藥提取物均被報導具有抑制MSC成脂分化， 促進其成骨分化的作用，但其作用機理並未被研究透徹。TAZ,又稱含有Wff功能域的轉錄調節因子1 (WW domain containing transcriptional regulator 1，WWTR1)。TAZ分子氨基端含有一個Wff結構域，該結構域可以和ftO-Pro-X-Tyr (PPXY)基序結合，羧基端含有一個捲曲螺旋結構域(coiled-coil)，該結構域可以和轉錄調節的核心分子結合而發揮轉錄調節作用。MSCs成骨、成脂分化中的關鍵轉錄因子Runx2和PPAR γ均含有PPXY基序，因此TAZ可以與Runx2和PPAR γ結合而發揮轉錄調節作用。Hong等的研究初步證實，TAZ與PPARy相結合，可以抑制脂肪細胞脂質結合蛋白 (ALBP/aP2)啟動子所引起的aP2的轉錄，穩定表達的TAZ可以抑制3T3-L1細胞成脂分化； 而同時骨髓來源的MSCs在TAZ基因抑制(knockdown)後成骨作用減弱，成脂作用增強。上述實驗證實TAZ是成骨分化和成脂分化之間關鍵的「調節器」分子。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種hTAZ融合基因及構建的慢病毒和促成骨的應用，構建出可表達的hTAZ基因慢病毒表達載體及hTAZ慢病毒，可應用於促hMSC的成骨分化和骨質疏鬆症防治。本發明是通過以下技術方案來實現一種hTAZ融合基因，在hTAZ基因的5'端依次連接Kozak序列、Shine-Dalgarno 序列和attBl序列，在其3 『端連接attB2序列；hTAZ融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1 所示。所述的hTAZ融合基因應用於hMSC的促成骨分化，或應用於hMSC成脂細胞的成骨分化。一種hTAZ載體，通過attB重組位點將SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入 PD0NR221 載體，稱為 pENTR-hTAZ 載體。一種hTAZ載體，通過LR重組反應將含有SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入 pLenti6/V5-DEST 載體，稱為 pLenti6/V5_hTAZ 載體。一種hTAZ慢病毒，是由包裝質粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG表達的蛋白包裹含有 PLenti6/V5-hTAZ載體的基因組；該hTAZ慢病毒是將pLenti6/V5-hTAZ表達質粒與包裝質粒pLPl、pLP2和pLP/ VSVG混合感染宿主細胞，經培養後裂解而產生。所述的hTAZ慢病毒轉染hMSC或hMSC成脂細胞後促其成骨分化的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明在hTAZ融合基因的基礎上構建載體pLenti6/V5-hTAZ本發明構建的pLenti6/V5-hTAZ表達質粒是一種高效的hTAZ表達質粒，該質粒在目的基因hTAZ上下遊含有Lambda噬菌體重組序列_att，該序列的特異重組反應允許目的
4腸桿菌、杆狀病毒和酵母等原核和真核載體之間通過重組反應轉移穿梭，同時能保持讀框的正確性和方向性，有利於hTAZ基因功能的分析和蛋白質的表達。相對於國內外其它實驗室構建的基因載體在原核擴增、真核表達時需要繁複的酶切鑑定具有反應簡便、高保真的優點。
2、本發明同時生產出高效安全的hTAZ慢病毒病毒載體具有轉染效率高的優點。目前約85%的基因治療臨床實驗採用病毒載體。常用的病毒載體包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等，但是這些載體存在著潛在的致癌性、自身免疫原性以及目的基因容量小等的缺點。在基因治療中廣泛應用的逆轉錄病毒載體存在的主要問題，是無法高效轉導非分裂期細胞，而腺病毒載體雖然能轉導非分裂期細胞，但在體內不能實現目的基因穩定的長期表達，且反覆應用容易引起免疫反應。慢病毒載體具有可感染分裂細胞及非分裂細胞，轉移基因片段容量較大，目的基因表達時間較長，不易引發宿主免疫反應等諸多優點，以慢病毒載體系統的安全性甚至超過了目前臨床試驗正在使用的致癌性逆轉錄病毒載體。因此，慢病毒載體已成為基因治療中載體研究的熱點。本發明中生產的hTAZ基因慢病毒是基於第3代慢病毒載體系統為基礎的慢病毒生產體系，具有高效安全的特點。3、本發明構建的hTAZ慢病毒在hMSC成脂-成骨轉分化中抑制成脂、促進成骨的作用骨質疏鬆症患者骨髓內存在MSCs分化的失衡，過高的成脂活性和脂細胞聚集危害到成骨細胞的形成和骨形成。若能阻斷MSCs向脂細胞分化的過程，或將骨髓中的脂細胞和潛在的「成脂前體細胞」轉分化為成骨細胞，可能會達到抑制成脂，促進成骨的作用。本發明細胞轉分化實驗證實hTAZ基因慢病毒對hMSC成脂-成骨轉分化具有促進作用可以將已成脂分化的hMSC細胞分化誘導為成骨細胞，同時可以促進未分化hMSC細胞成骨分化。可考慮將TAZ基因及其表達載體與緩釋基質載體相結合(gene activated matrix, GAM)，通過局部注射的方式應用於骨質疏鬆症患者的股骨頸、腰椎或橈骨遠端，以起到促進成骨，預防骨折的作用。


圖1為pD0NR221載體的質粒圖譜；圖2為pENTR-hTAZ載體的雙酶切鑑定結果圖；圖3為表達載體pLenti6/V5-hTAZ的雙酶切鑑定結果圖；圖4為Wfestern blot檢測hTAZ在轉染MC3T3-E1細胞後的表達結果圖；圖5-1 5-2為未進行成脂誘導前、進行成脂誘導後的油紅0紅染的結果圖；圖6為RT-PCR檢測成脂誘導細胞的PPAR γ和aP2表達的結果圖；圖7為Wfestern Blot檢測hTAZ病毒感染脂肪細胞後hTAZ表達的的結果圖；圖8為特異茜素紅S染色hTAZ病毒感染脂肪細胞後檢測成骨分化能力的結果圖；圖9為特異茜素紅S染色hTAZ病毒感染脂肪細胞後檢測成骨分化能力的定量分析圖。
具體實施例方式鑑於TAZ處於決定骨髓MSC分化方向的中心，具有和成脂分化關鍵分子PPAR γ和成骨分化關鍵分子Runx2結合，同時抑制PPAR γ調控的成脂分化，並促進Rimx2調控的成骨分化的作用；本發明的目的在於克隆得到hTAZ基因，構建出可表達的hTAZ基因慢病毒表達載體，並生產出可用於轉染的高滴度的hTAZ慢病毒，為骨質疏鬆症的基因治療打下基礎。下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。1、可表達hTAZ基因克隆載體pLenti6/V5_hTAZ質粒的構建1)獲得兩端含有重組位點attB及信號肽的hTAZ基因片段首先設計並人工合以下PCR擴增hTAZ基因的引物對P 上遊引物Pl:gggg acaast ttstacaaaa aascassct t cgaaggagat aga accatg； a atccggcctc ggcgc ；下遊引物P2:gggg acctct ttstacaasa aasctgggt C ttacagccag gttagaaagg gc ；其中上遊引物Pl劃線標註的序列依次為attBl序列、Shine-Dalgarno序列和 Kozak序列；下遊引物P2劃線標註的序列為attB2序列；在目的基因hTAZ上下遊構建Lambda噬菌體重組序列_att，att序列的特異重組反應允許目的基因通過BP、LR重組反應在大腸桿菌、杆狀病毒和酵母等原核和真核載體之間轉移穿梭，同時能保持讀框的正確性和方向性，有利於hTAZ基因功能的分析和蛋白質的表達；提取培養好的Hela細胞的mRNA，以提取的mRNA作為模板，參照!Iomega (USA)說明書合成cDNA，S卩1μ g mRNA為模板加入引物oligo-dT12-18，放入70°C水浴IOmin後立即轉移入冰中，加入反轉錄酶AMV-RT，41°C水浴中60min，反轉錄合成cDNA ；然後以合成的cDNA為模板，以引物對P作為引物，利用Platinum Taq DNA高保真聚合酶合成attB-hTAZ。具體的PCR反應如下，在25 μ L體系中加入IOX反應緩衝液 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4 μ L，模板 cDNA2 μ L，上遊引物(10 μ mol/L) 2 μ L，下遊引物 (10μπιο1/ 2μ L，Platinum Taq DNA 高保真聚合酶 1U，補水至 25 μ L ；PCR循環設置，94°C， 5min ；94°C，30s ；53°C, 30s ；72°C, Imin ；30 個循環；PCR 獲得 attB-hTAZ 融合基因。取1 2μ 1 PCR產物進行凝膠電泳鑑定，檢測結果如圖1所示，可以檢測到含有attB重組位點的重組hTAZ片段，可見在1電泳道IOOObp與2000bp之間的1279bp的 attB-hTAZ融合基因，其具體的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。使用北京天根公司膠回收試劑盒(貨號DP209)回收PCR片段將PCR產物從瓊脂糖凝膠中切下，稱重。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴lOmin。將溶膠液加入已平衡過的吸附柱CA2中，12，000rpm(13，400g)離心30 60s。向吸附柱中加入600 μ 1 漂洗液PW，12，OOOrpm(13, 400g)離心30 60s，共漂洗兩次。將吸附柱CA2放入收集管中， 向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩衝液EB，室溫放置anin。12，OOOrpm(13, 400g)離心 anin後收集DNA溶液。
2)利用BP重組反應構建克隆質粒pENTR-hTAZ將IOOfmol attB-hTAZ與IOOfmol pD0NR221載體(其質粒圖譜如圖2所示)在 BP克隆酶複合物作用下進行BP重組反應於一潔淨的1. 5ml離心管中順序加入IOOfmol attB-hTAZ PCR產物，IOOfmol PD0NR221質粒。用PH8. O的TE緩衝液稀釋至8 μ 1混合均勻。而後在離心管中加入2 μ L 的BP Clonase II酶，混勻後於25°C孵育2h。attB-hTAZ中的attB重組位點和pD0NR221 中的attP重組位點發生重組反應，成功生成的載體稱為pENTR-hTAZ載體；將1 μ 1 BP反應物與50 μ 1 DH5 α感受態細菌混合，熱休克法轉化DH5 α細菌。 將菌液塗於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB培養板，倒置放於37°C孵箱，待12h後挑選陽性克隆。挑選陽性克隆，提取質粒後，對提取的pENTR-hTAZ質粒進行測序鑑定。採用M13測序引物進行測序。M13上遊(-20)引物gtaaaacgacggccag，下遊引物 gtcatagctgtttcctgg ；PCR 反應條件:95V 5min ；96°C 20s, 50°C 10s,60°C 4min，30 個循環。 測序反應鑑定pENTR-hTAZ質粒中的hTAZ序列正確無誤。3)利用LR重組反應構建表達質粒pLenti6/V5_hTAZ將IOOng 質粒 pENTR-hTAZ 與 150ng pLenti6/V5_DEST 載體質粒混合，加入 4 μ 1 LR克隆重組酶II複合物(美國hvitrogen公司)，25°C孵育lh，進行LR重組反應，成功重組而生成的載體稱為表達載體pLenti6/V5-hTAZ ；將獲得的表達載體pLenti6/V5_hTAZ轉化One Shot Stbl3感受態Ε. coli，以含有 100 μ g/ml氨苄西林的LB培養板篩選陽性克隆，挑取5個陽性克隆，擴增，提取質粒DNA進行BamH I.Xho I雙酶切鑑定和測序鑑定；雙酶切鑑定的電泳結果如圖3所示，其中泳道1為Marker，泳道2 6為5個陽性克隆所提取的質粒的酶切，可以看到5個陽性克隆均含有1279bp的目的片段hTAZ ；而提取的質粒經測序鑑定，目的片段hTAZ的序列保持一致，所挑取的克隆為陽性克隆。4)表達載體pLenti6/V5_hTAZ的表達鑑定以脂質體轉染法，將表達載體pLenti6/V5-hTAZ轉染小鼠成骨細胞MC3T3-E1 (中科院上海細胞庫)，以含有10 μ g/ml的殺稻瘟菌素(Blasticidin)培養基篩選pLenti6/ V5-hTAZ轉染的重組MC3T3-E1細胞。挑選pLenti6/V5-hTAZ成功轉染的細胞，每IO6細胞加300 μ 1裂解液裂解細胞， 抽提蛋白，定量。取40 μ g上樣，進行SDS-聚丙稀醯胺凝膠電泳，蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，lh。5%脫脂奶粉封閉Ih後加兔抗人TAZ抗體(美國Cell Signaling公司)，37°C，lh， 洗膜。羊抗兔化6二抗(武漢博士德公司)，371，111，洗膜。以β-actin的檢測作為內參照，ECL發光系統(美國Pierce公司)檢測反應蛋白，X線膠片顯影。檢測結果如圖4所示，泳道1為作為對照的未進行轉染的MC3T3-E1細胞，泳道2 為成功轉染pLenti6/V5-hTAZ載體的MC3T3-E1細胞，對比泳道1、2，可以明顯的看到hTAZ 基因在宿主細胞中得到了表達；這表明所構建的表達載體pLenti6/V5-hTAZ可在MC3T3-E1 中高表達hTAZ。2. hTAZ慢病毒的生產1)目的基因hTAZ載體和包裝質粒共轉染病毒生成細胞以獲得hTAZ慢病毒
將3 μ g 的 pLenti6/V5-hTAZ 表達質粒 9 μ g 的包裝質粒 pLPl，pLP2，pLP/VSVG ViraPower Packaging Mix (美國 Invitrogen 公司，產品名 ViraPower Bsd Lentiviral Support Kit，貨號K4970-00)(共12 μ g質粒)按照1 3比例混合，加入1. 5ml無血清的 Opti-MEM I 培養液中。同時將 36 μ 1 脂質體Lipofectamine 2000加入 1. 5ml 的 Opti-MEM I 培養基中輕柔混合，並室溫放置5min。輕柔混合稀釋的DNA與稀釋的Lipof ectamine 2000， 室溫孵育20min以形成複合物。最後將DNA-Lipofectamine 2000加入培養有人胚腎細胞(中科院上海細胞庫)的培養瓶中，於含有5% CO2的371培養箱中培養。24h後，去掉原細胞培養液，更換為無抗生素的10%胎牛血清的Opti-MEM I培養液。更換培養液後48h 收取含有病毒的細胞培養液，4°C離心3000轉15min，收集培養上清，以0. 45 μ m Millex-HV 或聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)濾膜過濾，去除細胞碎屑，收穫病毒。 存於-80°C備用。2)確定生產出hTAZ慢病毒的滴度將生產出的hTAZ慢病毒10倍體積比倍比稀釋，在多陽離子化合物海美溴銨 (hexadimethrine bromide, Polybrene)的協同作用下轉染人纖維肉瘤HT1080細胞。以殺稻瘟毒素(Blasticidin)篩選穩定表達hTAZ的細胞(說明培養的條件和殺稻瘟毒素的濃度)，由於hTAZ慢病毒含有Blasticidin抗性基因(該基因是存在於 PLenti6/V5-hTAZ載體上)，因此可以在殺稻瘟毒素篩選壓力下存活。殺稻瘟毒素(Blasticidin)篩選12天。用1 %結晶紫染色，根據倍比稀釋慢病毒溶液在篩選培養板上形成的克隆平均數確定病毒的滴度。滴度檢測結果顯示本發明所獲得的hTAZ慢病毒滴度可達7 X IO6轉導單位(transducing units, TU)/毫升(ml)。而培養上清經超高速離心26，000rpm，90min，4°C，可將病毒滴度濃縮至6X IO8TU/ ml ο3.驗證hTAZ慢病毒在hMSC成脂-成骨轉分化中抑制成脂、促進成骨的作用hMSC (美國 Cambrex-Lonza 公司，貨號 P0PT-2501)以 Poietics MSC 培養液(美國 Cambrex-Lonza公司，貨號PT-3001)於含有5% CO2的37°C培養箱中培養，每3天更換一次
培養液。在hMSC培養基中(Poietics MSC培養液)加入成脂誘導劑1 μ M地塞米松，0. 2mM 吲哚美辛，0. lmg/ml胰島素和ImM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤誘導hMSC成脂分化。每3天
更換一次培養液。成脂誘導分化21天後見hMSC分化為細胞漿內含有大量油紅0紅染的脂肪顆粒， 證實細胞已分化為脂肪細胞；在圖5-1、圖5-2所示分別為未進行成脂誘導前、進行成脂誘導後的油紅0紅染的結果圖，經過對比可以證實細胞已分化為脂肪細胞；同時提取成脂誘導前、後的細胞mRNA， RT-PCR檢測見成脂分化標誌分子PPAR γ和aP2表達情況，檢測結果如圖6所示，可以看出經過21天的成指誘導後，PPARy和aP2表達升高，進一步證實細胞已分化為脂肪細胞；取7X 106TU/ml轉導單位的pLenti6/V5-hTAZ慢病毒Iml加入到成脂分化誘導21 天的hMSC中。24h後將含有病毒的培養液更換為普通hMSC培養液，24h後向轉染後的細胞培養皿中加入成骨分化誘導劑IOOnM地塞米松，IOmM β-甘油磷酸和50μΜ L-抗壞血酸。 以後每3天更換一次含有成骨分化誘導劑的hMSC培養液，成骨分化誘導21天。
誘導21天之後，對pLenti6/V5-hTAZ慢病毒感染後的成骨分化效果進行檢測。如圖7所示的脂肪細胞在hTAZ病毒感染前(non-transduced)、空病毒對照感染後(Lenti-mock)和hTAZ慢病毒感染後(Lenti-TAZ) 10天的Western Blot檢測結果，可見 hTAZ慢病毒感染後(Lenti-TAZ)細胞內hTAZ蛋白表達明顯增強。用特異性茜素紅S 染色(Osteogenesis Quantitation Kit 購自美國 Millipore 公司，貨號ECM815)確定細胞鈣化的程度。茜素紅S可以螯合礦化組織的鈣並沉積於細胞表面，利用10%乙酸析取螯合的茜素紅S並比照吸光度標準曲線，可對細胞的成骨分化進行定量分析。 具體方法如下細胞用PBS洗2遍，95%乙醇固定lOmin，0. 2%茜素紅作用20min， 水洗3遍，晾乾。在接種有細胞的M孔板每孔中加入400 μ L 10%乙酸室溫下孵育30min， 用細胞刮將細胞輕輕掛下移至1. 5mL的離心管中，渦旋30s。85°C加熱lOmin，將離心管移至冰上5min, 20，000g離心15min。離心結束後將400 μ L上清移至新的1. 5mL的離心管中。 每個離心管中加入150μ L 10%氫氧化銨。將標準品和待測樣品各取150μ L放入96板中， 用0D405的濾光片檢測吸光度值。根據標準曲線計算出待測樣品的茜素紅S的濃度。染色結果如圖8所示，hTAZ慢病毒感染細胞(Ienti-TAZ)的成骨分化能力較空病毒對照感染組(Lenti-mock)和未感染組(non-transduced)茜素紅S染色明顯增強 (10X20)。(圖中未染色部分為未能成骨分化，表面未沉積礦化物的細胞。)定量比色法茜素紅S染色檢測結果如圖9所示，hTAZ慢病毒感染細胞組 (Ienti-TAZ)染色數值較空病毒對照感染組(Lenti-mock)和未感染組(non-transduced) 有顯著性升高(P <0.01)。鑑於所製備的hTAZ基因慢病毒對hMSC成脂-成骨轉分化的促進作用，提示hTAZ 基因慢病毒在治療骨質疏鬆症骨折中的潛在應用價值。骨質疏鬆症患者的骨質中存在著 hMSC成脂分化增強，成脂分化減弱的情況，其椎體、股骨頸和橈骨遠端易於發生脆性骨折， 在高齡患者中往往會造成嚴重的家庭負擔和社會負擔。hTAZ基因慢病毒可以促進骨髓中由hMSC分化而來的脂肪細胞轉分化為成骨細胞，並能促進未分化的hMSC分化為成骨細胞。 因此可以考慮將攜帶hTAZ基因的慢病毒通過局部注射的方法應用於易於發生脆性骨折的機體局部，達到預防並治療骨質疏鬆症骨折的作用；所購建並生產的hTAZ基因載體和慢病毒具有廣闊的研究前景和應用價值。
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權利要求
1.一種hTAZ融合基因，其特徵在於，在hTAZ基因的5'端依次連接Kozak序列、 Shine-Dalgarno序列和attBl序列，在其3'端連接attB2序列；hTAZ融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2.權利要求1所述的hTAZ融合基因應用於hMSC的促成骨分化，或應用於hMSC成脂細胞的成骨分化。
3.一種hTAZ載體，其特徵在於，通過attB重組位點將SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入PD0NR221載體，稱為pENTR-hTAZ載體。
4.一種hTAZ載體，其特徵在於，通過LR重組反應將含有SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入pLenti6/V5-DEST載體，稱為pLenti6/V5_hTAZ載體。
5.一種hTAZ慢病毒，其特徵在於，是由包裝質粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG表達的蛋白包裹含有pLenti6/V5-hTAZ載體的基因組；該hTAZ慢病毒是將pLenti6/V5-hTAZ表達質粒與包裝質粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG混合感染宿主細胞，經培養後裂解而產生。
6.權利要求5所述的hTAZ慢病毒轉染hMSC或hMSC成脂細胞後促其成骨分化的應用。
全文摘要
本發明公開了一種hTAZ融合基因及構建的慢病毒和促成骨的應用，在hTAZ基因的5′端依次連接Kozak序列、Shine-Dalgarno序列和attB1序列，在其3′端連接attB2序列；hTAZ融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。細胞轉分化實驗證實hTAZ基因慢病毒對hMSC成脂-成骨轉分化具有促進作用可以將已成脂分化的hMSC細胞分化誘導為成骨細胞，同時可以促進未分化hMSC細胞成骨分化。
文檔編號C12N15/63GK102517311SQ20111037770
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者尹思, 尹戰海, 張璟, 李曙明, 李萌, 邱裕生 申請人:西安交通大學