Glp-1受體激動劑生物學活性測定方法

2023-12-10 06:17:57

專利名稱：：Glp-1受體激動劑生物學活性測定方法
技術領域：
：本發明涉及生物活性測定方法，更具體的說涉及GLP-I受體激動劑的生物活性測定方法。
背景技術：
：糖尿病已成為威脅人類生命健康的重大疾病，糖尿病藥物研究中GLP-I受體激動劑佔據著越來越重要的地位藥品評價.2009，24(1):32-33；藥品評價.2008，5(11):504-505;GLP-l受體激動劑主要有胰高血糖素樣肽_1(GLP-I)、促胰島素分泌肽(Exendin-4)、人GLP-I類似物利拉魯肽(Liraglutide)，其生物學活性的測定由於沒有活性測定國際標準品而成為一大難點中國生物製品學雜誌.2004，17(1):29-31。GLP-I受體激動劑的生物學功能主要是特異性地與胰島細胞的GLP-I受體相互作用，引起相應的信號通路改變，誘導胰島素的分泌。根據這些生物學功能，測定其生物學活性目前主要有三大類動物實驗ChinJChinPharmacolTher2004,9(5):527_531、澱粉酶釋放分析實驗及細胞測定實驗。動物實驗通常需要模型動物，不易獲取、成本高，而且只能統計分析是否有活性，只能進行定性分析；澱粉酶釋放分析實驗的敏感性較差，線性關係不好，僅能作為半定量實驗。細胞測定實驗包括第二信使(cAMP)酶鏈免疫反應分析實驗藥物分析雜誌。2006,26(12):1691-1693和化學發光物測定實驗南開大學學報.2007,40(1):92_98。前者是對信號通路改變過程中cAMP的測定，但由於cAMP在細胞內不穩定存在，易被降解，且cAMP可由多種途徑產生，因此專一性不高；再者，使用到的RIN-5F細胞並不是對GLP-I受體這一類激動劑都靈敏，沒有普遍的適用性。化學發光物測定實驗需要構建特定的細胞，使之能分泌特定的酶催化底物化學發光，需要花費大量的成本和較高的技術力量生物化學與生物物理進展.2004，31(4)36-40；生物技術通報.2007，3:118_121。而且這兩者都只是對中間產物的測定，並不是針對GLP-I受體激動劑的生物學功能(誘導分泌胰島素)這一原理設計的。相比較而言，本發明的設計就緊密結合這個藥理學原理來設計，專一的對終產物胰島素進行測定，更能體現出藥品的實際效果，使得方法更合理、更科學、更實用。其優勢具體表現在首先，本方法可得到GLP-I受體激動劑促進分泌胰島素的效應曲線，以此測定GLP-I受體激動劑的生物學活性，能夠得出相對精確的效價。而現有的通過模型動物的方法只能定性的確定GLP-I受體激動劑是否有促進分泌胰島素的作用。其次，本方法中測定關鍵物是胰島素，它是GLP-I受體激動劑與GLP-I受體相互作用後，引起相應的信號通路改變，誘導的最終產物，穩定性高，基本不受細胞內其它物質的影響。且本發明的設計緊密結合GLP-I受體激動劑的藥理學原理，專一針對終產物胰島素，更能體現出藥品的實際效果，使得方法更合理、更科學、更實用。而現有的實驗方法，不論是以cAMP，還是以化學發光物為目標檢測物的細胞試驗方法，這兩者都只是對中間產物的測定，易降解，不穩定，且中間產物有多種產生途徑。再者，化學發光物測定法所需的細胞需要特定構建，才能使之能分泌能被檢測的化學發光物質，需花費大量的成本、較高的技術力量和較長的時間。而本發明用到的Min-6細胞培養條件簡單，生長容易，便於操作。
發明內容本法系根據GLP-I受體激動劑可以促進小鼠胰島瘤細胞(Min-6)分泌胰島素的作用，用小鼠/大鼠胰島素試劑盒定量分泌的胰島素，于波長450nm，參比波長590nm處測定其吸光度，可得到GLP-I受體激動劑誘導Min-6細胞分泌胰島素的效應曲線，以此測定GLP-I受體激動劑生物學活性。由於GLP-I受體激動劑作用於Min-6細胞有一定的葡萄糖濃度要求，本發明通過調節培養基葡萄糖的濃度，在加標準品供試品前使用無糖的培養基培養靶細胞，並用高糖測定培養基溶液稀釋標準品供試品，提高Min-6細胞的敏感度。本發明中稀釋標準品和供試品的測定培養基的葡萄糖濃度優選為25mM至75mM，更優選為50mM。本法對於用消化液製成的細胞懸液的濃度有一定的要求；在本發明中，細胞懸液的密度優選為5XIO5個/ml。本法對於細胞加入無糖DMEM培養基後的培養時間有一定的要求；在本發明中培養時間優選為1-6小時，更優選為2-4小時。本法對於檢測樣品加入細胞培養基後的培養時間有一定的要求；在本發明中培養時間優選為4-6小時。附圖1為GLP-I(7-36)生物學活性測定實驗結果。附圖2為Exendin-4生物學活性測定實驗結果。附圖3為葡萄糖濃度為16.7mM時，GLP-I標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖4為葡萄糖濃度為25mM時，GLP-I標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖5為葡萄糖濃度為50mM時，GLP-I標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖6為葡萄糖濃度為75mM時，GLP-I標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖7為葡萄糖濃度為16.7mM時，Exendin-4標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖8為葡萄糖濃度為25mM時，Exendin-4標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖9為葡萄糖濃度為50mM時，Exendin-4標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖10為葡萄糖濃度為75mM時，Exendin-4標準品與安慰劑生物活性對比圖。附圖11為其他實驗條件不變的情況下，改變無糖培養基的培養時間，測定細胞分泌胰島素的對比圖。附圖12為其他實驗條件不變的條件下，改變細胞種板密度，測定細胞分泌胰島素的對比圖。附圖13為其他條件不變的情況下，改變加標準品後的培養時間，測定細胞分泌胰島素的對比圖。附圖14為其他條件不變的情況下，加標準品後的培養時間為4小時和8小時的對比圖。具體實施例方式實施例1用本法測定重組人胰高血糖素類多肽-1(7-36)(GLP-1(7-36))的生物學活性試劑與材料(I)DMEM高糖培養基取DMEM高糖培養基粉末1袋(規格為1L)，加水溶解並稀釋至1000ml，其中丙酮酸鈉終濃度為lmmol/L、HEPES終濃度為0.5%，加青黴素IO5IU和鏈黴素105IU、碳酸氫鈉3.7g，溶解後，混勻，除菌過濾，4°C保存。(2)完全培養基量取胎牛血清10ml，加DMEM高糖培養基90ml，4°C保存。(3)測定培養基(50mM葡萄糖)DMEM高糖培養基88ml，加10%BSA2ml、250mM葡萄糖溶液10ml。(4)10%BSA取BSA10g，WIOOml水溶解並稀釋至100ml，除菌過濾，_20°C保存。(5)PBS取氯化鈉8.0，氯化鉀0.20g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸氫二鉀0.24g，加水溶解並稀釋至1000ml，經121°C15分鐘滅菌。(6)消化液取2.5g胰酶、乙二胺四乙酸二鈉0.2g、氯化鈉8.0，氯化鉀0.20g，磷酸氫二鈉1.152g，磷酸氫二鉀0.2g，加水溶解並稀釋至1000ml，除菌過濾，-20°C保存。(7)250mM葡萄糖溶液取葡萄糖(H2O)Ig,加20ml無糖DMEM培養基溶解後，混勻，除菌過濾，4°C保存。(8)靶細胞株小鼠胰島瘤細胞(Min-6)由上海市糖尿病研究所贈送，本室傳代並保存。(9)RAT/MOUSEINSULINKIT試劑盒LINCO公司生產，貨號EZRMI-I3K(10)標準品、供試品大腸桿菌為宿主細胞表達的重組人胰高血糖素類多肽-1(7-36)凍幹製劑標準品溶液的製備取重組人胰高血糖素類多肽-1(7-36)標準品，用測定培養基稀釋至500ug/ml。在1.5ml離心管中，做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。在無菌條件下操作。供試品溶液的製備取重組人胰高血糖素類多肽-1(7-36)供試品，用測定培養基稀釋至500ug/ml。在1.5ml離心管中，做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。在無菌條件下操作。實驗方法使Min-6細胞在完全培養基培養基中，37°C、5%二氧化碳條件下培養。取對數生長期的細胞，用PBS洗後，消化液消化製成細胞懸液，調整細胞密度至5.OXIO5個/ml。加細胞懸液於96孔培養板中IOOul/孔，CO2培養箱培養40h。除去細胞上清，加PBS200ul/孔，棄去上清，再加PBS200ul/孔，棄去上清，如此清洗2次後，加入無糖DMEM培養基IOOul/孔，繼續培養4h。除去細胞上清，加PBS清洗2次，加入稀釋好的不同濃度(500ug/ml-250ug/ml-125ug/ml-62.5ug/ml_31.25ug/ml_15.6ug/ml_7.8ug/ml_3.9ug/ml)的標準品及供試品溶液IOOul/孔，每個濃度做2個平行，同時設立測定培養基對照，在37°C、5%二氧化碳條件下繼續培養2h。收集上清，稀釋5倍後，用胰島素試劑盒檢測。檢測波長為450nm，參比波長為590nm。最後用四參數回歸計算法進行數據分析，計算，得出誘導胰島素50%最大刺激反應的稀釋倍數。單位定義以能誘導胰島素50%最大刺激反應的稀釋倍數為8000個單位(即AU)。供試品效價(AU/ml)=標準品效價X(A供試品/A標準品)X(ED50供試品/ED50標準品)A供試品、A標準品供試品、標準品預稀釋倍數ED5tl供試品、ED5tl標準品供試品、標準品半效量稀釋倍數結果如圖1，數據如下標準品ED50標準品=25.384,A標準品=0.8，標準品效價=8000AU/mltableseeoriginaldocumentpage6供試品(批號2OO8O6Ol)=ED50供試品=20.965,Amtsh=0.2tableseeoriginaldocumentpage6供試品(批號2OO8O7Ol)=ED50供試品=24.041，Amtsh=0.2tableseeoriginaldocumentpage6供試品(批號20080706)=ED50供試品=25.149，Amtsh=0.2tableseeoriginaldocumentpage6formulaseeoriginaldocumentpage7實施例2用本法測定Exendin-4生物學活性。實驗材料、方法與實施例1操作基本相同。供試品溶液的製備取Exendin-4供試品，用測定培養基稀釋至50ug/ml。在1.5ml離心管中，做2倍系列稀釋。實驗結果見圖2，數據如下標準品※度ug/ml25062.515.633.910.9760.2440.061橫坐標135791113OD值0.824~0.764一0.5950.4370.392~0.3570.349_0.8240.7440.5810.4370.35T"0.34~0.3420.8240.7540.5880.4370.3730.3490.346供試品tableseeoriginaldocumentpage8如圖2所示，樣品和標準品曲線平行，有線性，根據ED5tl，在確定標準品效價後即可測定樣品效價，證明了方法的可行性。實施例3稀釋用測定培養基在不同葡萄糖濃度條件下測定標準品GLP-I(7-36)的生物活性的結果對比。實驗材料、方法與實施例1操作基本相同(無供試品)。測定培養基的葡萄糖濃度分別配置為17.5mM，25mM，50mM及75mM。實驗結果見圖3、4、5和6。由圖3、4、5和6的對比可知，提高葡萄糖的濃度有利於細胞分泌胰島素，不同濃度的標準品分泌胰島素的量表現出明顯的量效關係，與安慰劑的對比更趨於明顯。實施例4稀釋用測定培養基在不同葡萄糖濃度條件下標準品Exendin-4的生物活性測定結果對比。實驗材料、方法與實施例2操作基本相同(無供試品)。測定培養基的葡萄糖濃度分別配置為17.5mM，25mM，50mM及75mM。實驗結果見圖7、8、9和10，其對比結果和實施例3相似，都顯示出了提高葡萄糖濃度有助於提高測定生物活性的精確性，而其測量效果在50mM時最佳。實施例5改變細胞加入無糖DMEM培養基後的培養時間，細胞分泌胰島素的測定結果對比。實驗材料方法與實施例1基本相同(無供試品，無8個稀釋度)，取重組人GLP-I(7-36)標準品，用測定培養基稀釋至500ug/ml，進行測定。改變細胞加入無糖DMEM培養基後的培養時間，分別在培養2、4、5、6、12、16、20、24、30小時後，測量細胞胰島素的分泌情況，其實驗結果見圖11。從圖中可以明顯看出培養2小時、4小時後產胰島素量最高，最有利於定量檢測。實施例6改變細胞的密度，細胞分泌胰島素的測定結果對比。實驗材料方法與實施例1基本相同(無供試品，無8個稀釋度)，取重組人GLP-I(7-36)標準品，用測定培養基稀釋至500ug/ml，進行測定。細胞用PBS洗後，調整消化液消化製成細胞懸液的密度，其細胞密度調整為5XIO5個/ml，5.5XIO5個/ml，6.0XIO5個/ml，6.5XIO5個/ml，7.0XIO5個/ml，7.5XIO5個/ml，8.0XIO5個/ml和9.0XIO5個/ml，其結果見圖12。從圖中可以明顯看出當細胞濃度為5X105時，產胰島素量最高，最有利於檢測。實施例7改變加入標準品後的培養時間，細胞分泌胰島素的測定結果對比。實驗材料方法與實施例1基本相同(無供試品，無8個稀釋度)，取重組人GLP-I(7-36)標準品，用測定培養基稀釋至500ug/ml，進行測定。在加入500ug/ml標準品後，分別在37°C、5%二氧化碳條件下，繼續培養0.5、1、2、3、4、6及16小時後，進行檢測，實驗結果如圖13所示。從圖中可以明顯看出4小時到6小時之間有明顯的跳躍，選這樣的時間點比較合適，實施例8加入標準品後的繼續培養8小時，與實施例1中培養時間為4小時的細胞胰島素分泌情況進行對比。實驗材料方法與實施例1基本相同(無供試品)，取重組人GLP-I(7-36)標準品，用測定培養基稀釋至500ug/ml，進行測定。在加入500ug/ml標準品後，在37°C、5%二氧化碳條件下，繼續培養8小時後，進行檢測。其結果如圖14所示。從圖中可知，繼續培養8小時後(大於6小時)，不同標準品濃度的點落在斜線上的趨於減少少，大量的點落在兩端(上、下平臺)，不利於檢測，所以4-6小為佳。權利要求一種GLP-1受體激動劑生物活性檢測方法，其步驟包括(a)培養合適的檢測用靶細胞株；(b)製備若干個稀釋濃度的GLP-1受體激動劑標準品溶液及供試品溶液(c)取對數生長期細胞菌株，經過處理過程，加入步驟(b)中製備的標準品及供試品溶液，並繼續培養；(d)收集上清稀釋後，用胰島素試劑盒檢測得到GLP-1受體激動劑誘導檢測細胞分泌胰島素的效應曲線；(e)計算GLP-1受體激動劑的活性。2.如權利要求1中所述的方法，其特徵在於所述的GLP-I受體激動劑為GLP-1，Exendin-4,或它們的類似物。3.如權利要求1中所述的方法，其特徵在於步驟(a)中所述的檢測用靶細胞株為小鼠胰島瘤細胞株Min-6。4.如權利要求1中所述的方法，其特徵在於步驟(b)中所述的若干稀釋度的GLP-I受體激動劑標準品及供試品溶液由高葡萄糖濃度溶液配置稀釋。5.如權利要求1中所述的方法，其特徵在於步驟(c)中所述的處理過程包括(a)用PBS洗後，加入消化液消化製成細胞懸液，並調整細胞密度，加細胞懸液於培養板，繼續培養；(b)除去細胞上清，加PBS清洗，加入無糖DMEM培養基，繼續培養；(c)除去細胞上清，加PBS清洗，加入稀釋後的標準品溶液及供試品溶液，繼續培養；6.如權利要求1中所述的方法，其特徵在於步驟(d)中所用的檢測波長為450nm，參比波長為590nm。7.如權利要求1中所述的方法，其特徵在於步驟(e)中，所述的計算GLP-I受體激動劑的方法為四參數回歸計算法。8.如權利要求4中所述的方法，其特徵在於所述的高葡萄糖溶液葡萄糖濃度範圍為25mM至75mM09.如權利要求8中所述的方法，其特徵在於所述的高葡萄糖溶液葡萄糖濃度為50mM。10.如權利要求5步驟(a)中所述的方法，其特徵在於所述的細胞密度為5X105個/mlο11.如權利要求5步驟(b)中所述的方法，其特徵在於所述的繼續培養時間為1至6小時。12.如權利要求11中所述的方法，其特徵在於所述繼續培養時間為2至4小時。13.如權利要求5步驟(c)中所述的方法，其特徵在於所述的繼續培養時間為4至6小時。全文摘要本發明涉及生物活性測定方法，更具體的說涉及GLP-1受體激動劑的生物活性測定方法。本法系根據GLP-1受體激動劑可以促進小鼠胰島瘤細胞(Min-6)分泌胰島素的作用，用小鼠/大鼠胰島素試劑盒定量分泌的胰島素，並通過一系列條件優化過程來提高測定的精確度，于波長450nm，參比波長590nm處測定其吸光度，得到GLP-1受體激動劑誘導Min-6細胞分泌胰島素的效應曲線，以此測定GLP-1受體激動劑生物學活性。文檔編號C12Q1/02GK101798588SQ200910265928公開日2010年8月11日申請日期2009年12月21日優先權日2009年12月21日發明者李克堅,梁成罡,蔡永青,陳霞申請人:上海華誼生物技術有限公司