一種測定杭白芍花粉活力的方法
2023-12-10 02:21:51 2
一種測定杭白芍花粉活力的方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定杭白芍花粉活力的方法，包括：收集杭白芍的花粉；將所述的花粉置於培養基的表面進行離體培養；離體培養結束後統計花粉萌發率；所述培養基的組成為：蔗糖80～150g/L，硼酸15～30mg/L，瓊脂8～10g/L；所述離體培養的時間為2.5～3.5h。本發明對藥用杭白芍花粉的離體培養條件進行了探索，為其花粉活力的測定提供了一種簡單、快速、可行、可靠的方法，為將藥用杭白芍和北方觀賞芍藥進行雜交，培育出具備浙江特色、適應浙江氣候的觀賞芍藥新品種起到了鋪墊和促進作用。
【專利說明】一種測定杭白芍花粉活力的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物花粉活力測定領域，尤其涉及一種測定杭白芍花粉活力的方法。【背景技術】
[0002]芍藥是中國傳統花卉，栽培歷史已近4000年，早在《詩經?鄭風》中便有記載:「維士與女，伊其相謔，贈之以勺藥」。芍藥被譽為「花相」，和「花王」牡丹相齊名，具有很好的觀賞價值和藥用價值。芍藥性喜光照和冷涼，不耐高溫和潮溼，故我國華北地區的菏澤、洛陽等地是芍藥、牡丹之鄉，觀賞品種眾多，花型、花色、株型豐富多彩，可廣泛用於花境、盆栽或切花觀賞。
[0003]浙江省因氣候溼熱，本土觀賞芍藥品種培育幾乎為零，即使引進北方品種，也多因氣候不適及病蟲害嚴重導致觀賞效果大打折扣。但浙江省自古便有種植藥用芍藥的記載，如現今的金華市磐安縣等地生產的杭白芍屬於著名的中藥材「浙八味」之一，其根狀莖品質好，具備補血柔肝、平肝止痛、斂陰收汗等功效；杭白芍的花朵為紫紅、粉紅、粉白或純白色，也具備很好的觀賞價值；同時，杭白芍在浙江本地栽培歷史悠久，對浙江省的溼熱氣候具一定的適應性。
[0004]傳統觀賞芍藥很多品種的花型極度重瓣，雄蕊多瓣化，無花葯，更無花粉；也有部分品種具備花葯，但花粉量很少，這些都為利用人工雜交授粉培育新品種帶來阻礙。相比較而言，杭白芍在各方面形態特徵和生態習性上更接近芍藥的野生原種。例如，因其根狀莖長期供作藥用，花型的篩選多不被重視，多為單瓣型或荷花型，雄蕊和花葯清晰，花粉量極大，是很好的父本材料。因此，將藥用杭白芍作為父本，北方觀賞芍藥品種作為母本，有望培育出既具備良好的觀賞價值、又能夠適應浙江省溼熱氣候的觀賞芍藥新品種，從而解決浙江地區觀賞芍藥品種極度匱乏的窘狀。
[0005]具較高花粉生活力，是選擇父本的重要指標。杭白苟的花粉活力不詳，有關其測量工作至今未有報導。因此，建立一套有效測定杭白芍花粉活力測定的方法，可為浙江杭白芍和北方觀賞芍藥的雜交育種工作帶來很大的促進效應。
[0006]目前對於花粉活力的測定主要有3類方法，分別為花粉染色法、田間授粉法、花粉離體萌發法。花粉染色法是使用化學試劑對花粉進行染色，根據染色後花粉顏色的深淺判斷活力狀況，方法快速、簡便，主要有K2-KI染色法、醋酸洋紅染色法、TTC染色法等。在《芍藥花粉生活力測定與雜交親本選擇初步研究》、《芍藥花粉活力測定方法的研究》、《芍藥花粉活力和柱頭可授性的研究》、《長期儲藏芍藥花粉生活力測定方法研究》等文獻中，便已記載利用染色法來測定不同花型觀賞芍藥品種的花粉活力。但能夠被染色的花粉卻未必能夠萌發，不一定會伸出花粉管，因此能夠被染色卻又無法生出花粉管的花粉，在雜交授粉後也未必能夠受精結實，故染色法測定的花粉活力往往偏高。田間授粉法是直接在田間進行雜交育種實驗，待果實成熟後計算結實率。該方法最為原始、直接和可靠，但也最為費時費工，受季節和天氣影響較大，難以滿足培育新品種的迫切需求。
[0007]人工給予花粉萌發的條件，讓其能夠生長花粉管，根據萌發比率來測定花粉活力，是可靠、便捷的方法，這就是花粉的離體萌發法。已多有論文報導利用離體萌發法來測量北方觀賞芍藥品種的花粉活力，如《長期儲藏芍藥花粉生活力測定方法研究》、《不同花型芍藥的花粉生活力測定和比較研究》、《培養基成分對芍藥花粉萌發及花粉管生長的影響》、《三種貯藏溫度條件下芍藥花粉的儲藏特性》、《不同條件下芍藥花粉的貯藏壽命》、《芍藥花粉超低溫保存4年後的生活力檢測》、《芍藥花粉離體萌發培養基組分的優化》等。這些報導涉及到培養基的固態或液態形式、不同的成分配比等，但研究材料基本都是北方的觀賞芍藥品種，有關南方地區藥用型芍藥的花粉活力報導從未出現。
[0008] 申請人:通過花粉活力觀測的實踐發現，杭白芍花粉萌發的培養基成分配比和有效觀測時間等，與傳統的觀賞芍藥品種相比具有差異，且花粉在培養過程中存在著較為嚴重的下陷現象，這在以往的報導中未見到涉及。因此，建立一套適合杭白芍花粉活力測定的科學方法，具顯著的理論和實踐意義，可更好的推動浙江本土的藥用杭白芍與北方觀賞芍藥品種的雜交育種工作，以求能夠早日獲得具備自主智慧財產權和浙江地域特色的觀賞芍藥新品種。
【發明內容】
[0009]本發明提供了一種測定杭白芍花粉活力的方法，可以快速、準確地測定杭白芍的花粉活力。
[0010]—種測定杭白苟花粉活力的方法,包括:收集杭白苟的花粉；將所述的花粉置於培養基的表面進行離體培養；離體培養結束後統計花粉萌發率；
[0011]所述培養基的組成為:鹿糖80?150g/L,硼酸15?30mg/L,瓊脂8?10g/L ；
[0012]所述離體培養的時間為2.5?3.5h。
[0013]花粉的離體萌發法是測定花粉活力的有效方法，結果可重複性高，一般包括如下步驟:收集花粉，將花粉置於培養基上進行離體培養，在顯微鏡下觀察花粉萌發情況，統計花粉萌發率。
[0014]花粉的萌發能力是反映花粉活力的指標之一，因花粉只有萌發並長出花粉管，才能穿過花柱，進入子房，完成受精作用。花粉的萌發能力通常以花粉萌發率來表示，通過統計花粉的萌發率可以測定花粉的活力。
[0015]離體培養的培養基、培養時間是影響測定準確率的主要因素，不同種、品種的植物，其花粉所適宜的培養基的成分往往差異很大，本發明培養基為固體培養基，有利於後續顯微鏡的觀察，且由水、蔗糖、硼酸和瓊脂組成。其中，蔗糖為花粉萌發的主要營養物質來源，硼酸則能夠促進花粉的萌發和花粉管的持續伸長，而蔗糖和硼酸只有在適宜的濃度範圍內，才能夠使花粉良好的萌發。優選的，所述蔗糖的濃度為100g/L，所述硼酸的濃度為20g/L。
[0016]其次，本發明針對杭白芍的花粉在培養過程中存在的下陷現象，對離體培養的培養基中的瓊脂含量以及培養時間進行控制，來提高花粉活力測定的準確性。所述離體培養的時間優選為3h，培養基中，所述瓊脂的濃度優選為8g/L。另外，本發明的離體培養時間還兼顧了花粉萌發的群體效應，如果培養時間較短，則花粉萌發量少，不能夠如實反映花粉活力。在本發明的離體培養時間內，杭白芍的花粉萌發率趨於穩定。此外本發明所述的杭白芍產自浙江省金華市磐安縣。[0017]所述收集花粉的方法為:採集杭白芍的花葯，置於乾燥的器皿中乾燥24?48小時，直至花粉完全開裂，然後收集花粉，其中，所述的花葯最好取自內層花瓣略綻開、花葯隱約可見時的杭白芍的花朵。
[0018]離體培養時，可將未凝固的培養基加入到凹形載玻片的球形凹面內，為對焦清晰，提高統計的準確性，應儘可能保持培養基的表面平整，待培養基凝固後，再將花粉接種至培養基的表面即可。
[0019]適宜的培養溫度有利於杭白芍花粉快速的萌發，優選的，所述離體培養的溫度為23?28 °C，更優選為25 °C。
[0020]在花粉的離體培養過程中，為了防止所述培養基中水分的蒸發影響花粉的萌發，離體培養時，保持環境的相對溼度為80%?85%，優選為80%。
[0021]花粉離體培養一段時間後，將負載花粉的載玻片置於顯微鏡下觀察，以花粉管長度達到花粉粒直徑的I倍及以上的花粉視為萌發，統計萌發率。所述的顯微鏡具體可採用Olympus BH-2螢光顯微鏡，更有利於統計杭白芍花粉的萌發率。
[0022]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0023]本發明的方法測定結果穩定可靠，探明了杭白芍花粉萌發的較為適合的培養基、培養條件、培養時間、觀測條件等，首次為供於製藥的杭白芍提供了測定花粉活力的快速、可靠方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為適合採集杭白芍花粉、觀測花粉活力時的花瓣張開程度。
[0025]圖2為利用3種瓊脂粉含量的培養基對杭白芍花粉進行培養，其花粉接種後隨時間進程的萌發率變化圖。
[0026]圖3為杭白芍花粉接種後隨時間進程的萌發圖；
[0027]A:接種Ih後的花粉萌發情況；B:接種3h後的花粉萌發情況；
[0028]C:接種5h後的花粉萌發情況；D:接種6h後的花粉萌發情況。
[0029]圖4為將杭白芍的花粉接種在用培養皿盛放的培養基上，在解剖鏡下觀測花粉萌發的圖像；
[0030]A:培養皿底部沒有墊黑布時的觀測；B:培養皿底部墊有黑布時的觀測。
[0031]圖5為凹面載玻片的培養基上表面為平面和凸起球面時，杭白芍花粉萌發觀測的對應圖；
[0032]A:凹面載玻片上培養基為平面時的剖面圖；B:凹面載玻片上培養基為凸起球面時的剖面圖；C為A圖情況下所對應的杭白芍花粉萌發觀測圖；D為B圖情況下所對應的杭白芍花粉萌發觀測圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結合【具體實施方式】進一步闡釋本發明。
[0034]I杭白芍花葯的採集
[0035]選取植株健壯、無病蟲害的杭白芍為採集對象(本試驗所選擇的杭白芍產地為浙江省金華市磐安縣)，在其內層花瓣略微綻開、隱約可見內部金黃色花葯時為採集時間(圖I)。選擇4月中下旬無風晴天上午9~10時採集花葯，用尖嘴鑷子夾緊若干雄蕊的花絲，取下花葯，將花葯放入硫酸紙袋內儲存。
[0036]2花粉的乾燥
[0037]將硫酸紙攤開置於乾燥潔淨的培養皿中，通過擠壓將硫酸紙與培養皿內壁緊密接觸。將花葯均勻撒在硫酸紙上，避免花葯之間的垛疊。將培養皿置於盛有變色矽膠的密封乾燥器中，乾燥24~48小時，花粉散出待用。
[0038]3花粉萌發培養基的建立
[0039]選擇蔗糖100g/L和硼酸20mg/L，以蒸餾水作為溶劑。瓊脂粉的使用量和無水氯化鈣的使用與否，會在很大程度上影響萌發效果和觀測，故需確立該二者的配比。
[0040]3.1瓊脂粉使用量的選擇
[0041]在培養基中分別加入瓊脂粉5g/L、8g/L和10g/L，在後期的花粉萌發中發現:加5g/L瓊脂粉的培養基質地較軟，花粉粒在培養2.5h後開始下陷，花粉粒和花粉管均逐漸被培養基表層覆蓋，導致花粉生活力還沒有達到穩定值時，便已經看不清部分花粉萌發出的花粉管，從而使得花粉萌發率的統計值較真實值而偏小(圖2)。
[0042]加8g/L和10g/L瓊脂粉的培養基較為結實，可以將下陷時間延後至花粉接種的4h之後，從而使得花粉粒和花粉管在花粉萌發率較為穩定的3h左右可以保持清晰可辨，易於觀測和計數(圖3中B)。但在5h後，花粉粒和花粉管依舊會下陷，逐漸被培養基表層覆蓋，看不清花粉管的萌發，較難觀測；同時花粉管過長而出現盤結糾纏，已經不適宜於觀測萌發率(圖3中C);6h後花粉粒和 花粉管明顯被培養基覆蓋，仍然位於培養基表面的花粉管伸長更長，且部分花粉出現幹縮縊裂，不適合觀測(圖3中D)。
[0043]因此，5g/L的瓊脂粉用量過少，而加8g/L和10g/L瓊脂粉是較為合適的，且二者的培養基在花粉下陷時間和程度上無明顯差距。以節約為原則，選擇8g/L的瓊脂粉最合適。
[0044]3.2無水氯化鈣的選擇與否
[0045]部分研究表明，鈣離子能夠在一定程度上促進花粉管的萌發，故在一些植物的花粉活力測定的培養基中會加入鈣離子，多為硝酸鈣或氯化鈣。在培養基中加入25mg/L的無水氯化鈣和不加入氯化鈣，對比結果發現:不加無水氯化鈣的培養基中花粉具備較高且穩定的萌發率，為前述的63.301%。加入無水氯化鈣的培養基中，花粉萌發率反而很低，即使在觀測值最高的時刻，即接種後的3h，萌發率也僅為21.057%，其餘時間均在20%以下(表1)。
[0046]表1鈣離子的使用對杭白芍花粉萌發率的影響
[0047]
【權利要求】
1.一種測定杭白芍花粉活力的方法，包括:收集杭白芍的花粉；將所述的花粉置於培養基的表面進行離體培養；離體培養結束後統計花粉萌發率；其特徵在於， 所述培養基的組成為:鹿糖80?150g/L,硼酸15?30mg/L,瓊脂8?10g/L ； 所述離體培養的時間為2.5?3.5h。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的杭白芍產自浙江省金華市磐安縣。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述蔗糖的濃度為100g/L。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述硼酸的濃度為20mg/L。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述瓊脂的濃度為8g/L。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，離體培養的溫度為23?28°C。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，離體培養時，保持環境的相對溼度為80?85%。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述離體培養的時間為3h。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基處於凹面載玻片的球形凹面內，所述培養基的上表面保持平整。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，統計花粉萌發率時，採用OlympusBH-2光學顯微鏡觀察花粉萌發情況。
【文檔編號】G01N21/84GK103837534SQ201410064915
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月25日 優先權日:2014年2月25日
【發明者】夏宜平, 張佳平, 吳昀, 李丹青, 王冠群, 阮婷立 申請人:浙江大學